一种血管化-炎症平衡型背部皮下深层脂肪脱细胞基质材料及其制备方法和应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种血管化-炎症平衡型背部皮下深层脂肪脱细胞基质材料及其制备方法和应用。

背景技术：

1、脂肪组织脱细胞基质是通过脱细胞、脱脂及核酸降解等处理，去除脂肪组织中的细胞、脂质及核酸成分后获得的细胞外基质材料。其通常能保留胶原、弹性蛋白、糖胺聚糖等细胞外基质关键成分，具备良好的生物相容性，在软组织修复、脂肪组织工程等领域具有重要的应用潜力。现有技术中，脂肪脱细胞基质通常从脱细胞效率、脱脂效率、可注射性、降解速度、力学支撑或成脂潜能等角度进行设计。已有公开方案涉及猪脂肪无细胞基质、脂肪组织细胞外基质制备、脂肪细胞外基质支架、网膜脱细胞基质软组织填充材料、可注射脱细胞基质微粒等。

2、然而，在软组织修复或皮下组织整合过程中，植入材料既需要避免引起过强的早期免疫相关组织反应，又需要在较长观察期限内支持血管形成及组织整合。不同解剖来源的脂肪组织在组织构成和细胞外基质特征方面可能存在差异，但现有脂肪脱细胞基质研究通常侧重制备工艺、可注射性、降解或力学性能，较少基于脂肪组织的具体解剖来源，对材料的早期免疫相关反应和长期血管形成相关反应进行平行比较和来源筛选。因此，如何通过原料解剖来源的选择，使脂肪脱细胞基质兼顾早期宿主反应控制与长期血管化相关组织整合，是有待解决的技术问题。

技术实现思路

1、针对现有脂肪脱细胞基质材料缺乏基于解剖来源选择来兼顾早期免疫相关组织反应和长期血管形成相关反应的问题，本发明提供一种猪背部皮下深层脂肪组织来源的血管化-炎症平衡型脱细胞基质材料及其制备方法和应用。

2、具体而言，本发明将猪背部皮下浅层脂肪、猪背部皮下深层脂肪和猪大网膜脂肪在相同工艺条件下制备为脱细胞基质，并进行小鼠皮下注射比较。注射后1周的cd86和cd206双重免疫荧光定量结果显示，猪背部皮下深层脂肪脱细胞基质组的cd86阳性面积和cd206阳性面积均显著低于猪大网膜脂肪脱细胞基质组；注射后3个月的cd31和α-sma双重免疫荧光定量结果显示，猪背部皮下深层脂肪脱细胞基质组的cd31阳性面积以及cd31与α-sma双阳性面积均显著高于猪背部皮下浅层脂肪脱细胞基质组和猪大网膜脂肪脱细胞基质组。上述结果表明，猪背部皮下深层脂肪脱细胞基质兼具相对较低的1周cd86/cd206免疫相关标志物信号和相对较强的3个月血管形成及血管成熟相关指标，据此将其确定为三种猪源脂肪组织中的优选脱细胞基质来源。

3、为了实现本发明上述的目的，本发明采取的技术方案是：

4、本发明的第一个方面，提供一种猪背部皮下深层脂肪组织来源的脱细胞基质的制备方法，包括以下步骤：

5、1）获取猪背部皮下深层脂肪组织，切块；

6、2）对切块后的猪背部皮下深层脂肪组织进行反复冻融处理；

7、3）加入缓冲液，匀浆破碎冻融后的猪背部皮下深层脂肪组织，离心收集沉淀；

8、4）将沉淀与脱脂试剂混合振荡，进行脱脂处理；

9、5）去除脱脂试剂，加入核酸酶进行核酸降解处理；

10、6）去除核酸酶，洗涤后冻干得到猪背部皮下深层脂肪组织来源的脱细胞基质。

11、在本发明的一些实施方式中，所述猪包括但不限于家猪、野猪以及相关品种。相关品种包括《国家畜禽遗传资源品种名录（2020）》中记载的83种地方猪种、38种培育品种和6种引入品种及配套系。猪的具体种类并不影响本发明的实施。

12、在本发明的一些实施方式中，步骤1）中，所述猪背部皮下深层脂肪组织为位于猪背部皮肤与背部骨骼肌之间的皮下脂肪组织中、最靠近背部骨骼肌的内层背膘组织。

13、在本发明的一些实施方式中，所述猪背部皮下深层脂肪组织在切块前去除血液、组织碎屑及表面杂质。

14、在本发明的一些实施方式中，所述切块后的大小为0.5～2cm3，优选为1 cm×1 cm×1 cm的小块。

15、在本发明的一些实施方式中，步骤2）中，所述反复冻融采用液氮速冻进行，重复2～5次，优选为3次。

16、在本发明的一些实施方式中，步骤3）中，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、hepes缓冲液或生理盐水。

17、在本发明的一些实施方式中，所述缓冲液与猪背部皮下深层脂肪组织的比例为（1～5）ml：1g。

18、在本发明的一些实施方式中，所述匀浆转速为10000～15000 rpm，匀浆时间为10～20 min。

19、在本发明的一些实施方式中，所述离心的转速为2000～4000 rpm，离心5～10min。

20、在本发明的一些实施方式中，步骤4）中，所述脱脂试剂包括异丙醇、乙醇、丙酮或其组合。

21、在本发明的一些实施方式中，所述脱脂试剂和沉淀的比例为（1～5）ml：1g。

22、在本发明的一些实施方式中，所述脱脂处理的温度为25～42℃。

23、在本发明的一些实施方式中，所述脱脂处理的时间为24～72 h。

24、在本发明的一些实施方式中，步骤5）中，所述核酸酶包括脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶。

25、在本发明的一些实施方式中，上述去除脱脂试剂和核酸酶的步骤采用缓冲液洗涤处理。

26、在本发明的一些实施方式中，所述洗涤为振荡洗涤2～10 min，重复6～8次。

27、本发明的第二个方面，提供一种猪背部皮下深层脂肪组织来源的脱细胞基质，由本发明第一个方面所述的制备方法制备得到。

28、在本发明的一些实施方式中，所述猪背部皮下深层脂肪组织来源的脱细胞基质具有以下质量特征中的一种或多种：残余dna含量小于50 ng/mg干重；甘油三酯残留量低于5mg/g干重；he染色和dapi染色未见明显完整细胞核残留；油红o染色未见明显脂滴残留；天狼猩红染色显示胶原纤维结构保留；扫描电子显微镜下呈现多孔细胞外基质结构；具有较高溶胀能力和适于组织长入的孔隙结构。在优选实施方式中，所述猪背部皮下深层脂肪脱细胞基质的残余dna含量约为10～30 ng/mg干重，甘油三酯残留量约为2～5 mg/g干重，溶胀率约为250～350%。

29、本发明的第三个方面，提供猪背部皮下深层脂肪组织来源的脱细胞基质在制备软组织修复材料、组织整合促进材料或血管化-炎症平衡型软组织整合材料中的应用。

30、在本发明的一些实施方式中，所述猪背部皮下深层脂肪组织来源的脱细胞基质包括由本发明第一个方面所述的制备方法制备得到的猪背部皮下深层脂肪组织来源的脱细胞基质。

31、本发明的第四个方面，提供一种软组织修复或组织整合材料，所述材料包括本发明第二个方面所述的猪背部皮下深层脂肪组织来源的脱细胞基质，以及药学上可接受的辅料。

32、在本发明的一些实施方式中，所述药学上可接受的辅料包括溶剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、ph值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂、载体中的至少一种。

33、上述药学上可接受的辅料通常被认可用于这一目的且作为药剂的非活性成分。有关药学上可接受的辅料的汇编可以在《药物赋形剂手册》（handbook of pharmaceuticalexcipients，第2版，由a. wade和p. j. weller编辑；american pharmaceuticalassociation 出版，washington and the pharmaceutical press，london，1994）；《中华人民共和国药典》（2020年版，四部，药用辅料品名目次）等工具书中找到。

34、在本发明的一些实施方式中，所述软组织修复或组织整合材料的形式包括多孔海绵状、颗粒状、粉末状、糊状或可注射形式。

35、本发明的有益效果是：

36、1、本发明通过三种猪源脂肪脱细胞基质的平行体内比较，获得了支持原料来源筛选的客观指标。注射后1周，猪背部皮下深层脂肪脱细胞基质组的cd86阳性面积和cd206阳性面积均显著低于猪大网膜脂肪脱细胞基质组，表明其cd86和cd206免疫相关标志物信号低于大网膜来源材料；注射后3个月，该组的cd31阳性面积以及cd31与α-sma双阳性面积均显著高于猪背部皮下浅层脂肪脱细胞基质组和猪大网膜脂肪脱细胞基质组，表明其在该时间点具有较强的血管形成及血管成熟相关反应。因此，本发明提供了一种比单纯高血管化反应材料更适合软组织整合需求的优选猪源脂肪脱细胞基质材料。

37、2、本发明从原料解剖来源出发，在相同制备工艺和体内评价条件下筛选猪背部皮下深层脂肪。该来源材料在相对较低的1周cd86/cd206免疫相关标志物信号与相对较强的3个月血管形成及血管成熟相关指标之间表现出相对平衡，适合作为血管化-炎症平衡型软组织整合材料。

38、3、本发明制备得到的猪背部皮下深层脂肪脱细胞基质具有良好的脱细胞和脱脂效果。该材料经苏木精-伊红染色和dapi染色未见明显完整细胞核残留，经油红o染色未见明显脂滴残留；残余dna含量小于50 ng/mg干重，甘油三酯残留量较低，说明本发明方法能够有效去除细胞、核酸及脂质成分，从而降低材料植入后由细胞残留或脂质残留引起不良宿主反应的风险。

39、4、本发明在去除细胞、核酸和脂质成分的同时，能够较好保留脂肪组织来源细胞外基质结构。猪背部皮下深层脂肪脱细胞基质经胶原染色可见胶原纤维结构保留，扫描电子显微镜下可见多孔细胞外基质网络结构，并具有一定溶胀性能和压缩力学响应。上述结构和物理性能有利于材料吸液、贴合宿主组织、支持宿主细胞进入及后续组织整合。

40、5、本发明通过注射后1周、2周、3周、4周及3个月的大体观察，以及1周、2周、3周和3个月的he染色及masson染色，记录材料植入后的时序性形态变化；进一步以1周cd86/cd206双重免疫荧光定量表征早期免疫相关标志物信号，并以3个月cd31/α-sma双重免疫荧光定量表征该时间点的血管形成及血管成熟相关反应，为其作为软组织整合材料或皮下修复辅助材料提供体内依据。

41、6、本发明的制备方法相对温和、流程清晰、可重复性较好。该方法包括脂肪组织获取、洗涤、切块、冻融、缓冲液匀浆、离心、异丙醇脱脂、dna/rna酶处理、洗涤及冻干等步骤，所得材料可进一步制备为多孔海绵状、颗粒状、粉末状、微粒状、糊状或可注射形式，便于根据皮下软组织整合、软组织修复辅助或组织填充后整合需求进行后续开发。