基于虹鳟多群体SNP参考面板的低密度基因型填充方法

本发明涉及水产动物分子育种。更具体地说，本发明涉及一种基于虹鳟多群体snp参考面板的低密度基因型填充方法。

背景技术：

1、虹鳟（oncorhynchus mykiss）是全球养殖范围最广、经济价值最高的冷水性鱼类之一，在我国北方冷水资源丰富地区已形成规模化养殖产业。随着基因组学技术的快速发展，基于全基因组单核苷酸多态性（snp）标记的基因组选择、全基因组关联分析（gwas）、群体遗传结构解析和种质资源鉴定等分子育种技术，已成为虹鳟遗传改良和良种选育的核心手段。然而，虹鳟基因组庞大（约2.4 gb），对大规模养殖群体开展高覆盖度全基因组测序的成本极为高昂，严重制约了基因组育种技术在生产实践中的推广应用。

2、为降低基因型检测成本，低覆盖度全基因组测序（lcwgs）和低密度snp芯片两种策略被广泛采用。然而，这两种策略均面临共同的技术瓶颈：低覆盖度测序获得的覆盖全基因组的snp位点极其稀疏、缺失率高，难以直接用于高精度基因组评估；低密度snp芯片仅能检测固定数量的预设位点，标记密度有限，且不同版本芯片和不同参考基因组组装版本之间位点坐标和等位基因编码存在差异，导致跨平台、跨版本数据难以整合。基因型填充（genotype imputation）技术利用参考群体中的连锁不平衡信息和单倍型结构，将低密度基因型数据推断为高密度全基因组数据，是解决上述问题的有效途径。该技术在人类医学遗传学及牛、猪等畜禽育种中已有成熟应用，近年来在大黄鱼、鲤鱼等水产物种中也逐步开展探索。然而，虹鳟的基因型填充技术研究仍面临独特挑战。一方面，虹鳟引入我国的时间相对较短，不同引进群体与国内选育群体之间遗传背景差异较大，不同地理来源和育种历史群体间的等位基因频率和单倍型组成存在显著分化；另一方面，目前国际上缺乏专门针对虹鳟构建的多群体、大规模参考单倍型面板，单一参考群体难以兼顾不同来源目标样本的填充准确性。此外，低覆盖度测序数据与低密度芯片数据在数据格式、位点密度、基因型编码方式上差异较大，现有方法通常仅针对单一数据类型设计，缺乏一套兼容两种数据来源、且具有标准化操作流程和统一准确性评价体系的填充方案。

3、因此，亟需设计一种能够克服上述缺陷的技术方案。

技术实现思路

1、本发明的一个目的是提供一种基于虹鳟多群体snp参考面板的低密度基因型填充方法，旨在克服现有技术中低密度基因型数据填充准确率低、多群体适应性差及跨平台数据难以整合的缺陷。

2、为了实现本发明的这些目的和其它优点，根据本发明的一个方面，本发明提供了基于虹鳟多群体snp参考面板的低密度基因型填充方法，包括：s1：获取来自不同地理来源的多个虹鳟群体的高覆盖度全基因组测序数据，将测序数据比对至虹鳟参考基因组，进行snp检测，获得初始snp变异集合；s2：对初始snp变异集合中的snp位点进行基因型质量过滤，并基于最小等位基因频率、哈代-温伯格平衡p值、位点缺失率以及个体缺失率进行筛选，以筛选后保留的snp位点及对应样本构建虹鳟多群体snp参考面板；s3：获取待测虹鳟样本的低覆盖度全基因组测序数据或低密度snp芯片数据；s4：当待测数据为低覆盖度全基因组测序数据时，将待测数据比对至虹鳟参考基因组并进行变异检测，获得待测样本的初始基因型，对缺失基因型进行初级填充，获得初级高密度snp基因型数据，然后将初级高密度snp基因型数据与虹鳟多群体snp参考面板进行位点匹配，对匹配后的位点进行等位基因方向校正，获得待测样本的高密度snp基因型数据；当待测数据为低密度snp芯片数据时，将芯片snp位点定位至虹鳟参考基因组，并与虹鳟多群体snp参考面板进行位点匹配，对匹配后的位点进行等位基因方向校正，将校正后的数据转换为标准格式，作为待填充输入文件，然后基于虹鳟多群体snp参考面板对待填充输入文件进行基因型填充，获得待测样本的高密度snp基因型数据；s5：对高密度snp基因型数据根据填充质量值、位点缺失率、样本缺失率以及最小等位基因频率进行质量筛选，筛选后获得待测虹鳟样本的高密度snp基因型数据。

3、进一步地，s1中不同地理来源的虹鳟群体包括不少于4个地理来源的虹鳟群体，且每个地理来源的虹鳟群体的样本数量不少于10个；高覆盖度全基因组测序数据的测序深度不低于6倍覆盖度。

4、进一步地，在s2中，基因型质量过滤包括基于测序深度、fisher检验p值、变异质量值以及变异质量与深度的比值对初始snp变异集合中的snp位点进行过滤，获得第一过滤snp位点集合；然后采用plink软件对第一过滤snp位点集合进行筛选，保留双等位基因snp位点，并基于最小等位基因频率阈值、哈代-温伯格平衡p值阈值、位点缺失率阈值以及个体缺失率阈值进行筛选，获得第二过滤snp位点集合；以第二过滤snp位点集合中的snp位点及对应样本构建虹鳟多群体snp参考面板。

5、进一步地，在s3中，低覆盖度全基因组测序数据为测序深度低于6倍覆盖度的虹鳟样本全基因组测序数据，低密度snp芯片数据为虹鳟57k snp芯片检测获得的基因型数据；当获取的是低覆盖度全基因组测序数据时，采用fastp软件对低覆盖度全基因组测序数据进行质量控制，去除低质量序列及接头污染序列，获得待测虹鳟样本的清洁测序数据；当获取的是低密度snp芯片数据时，根据低密度snp芯片数据对应的芯片标记序列或芯片注释文件，将芯片snp位点定位至虹鳟参考基因组，获得待测虹鳟样本的芯片基因型数据。

6、进一步地，在s4中，当待测数据为低覆盖度全基因组测序数据时，将待测数据比对至虹鳟参考基因组，获得待测样本的比对结果文件；对比对结果文件进行排序和重复序列标记，获得标准化比对结果文件；采用basevar软件对标准化比对结果文件进行变异检测和基因型似然估计，获得待测样本在全基因组snp位点上的初始基因型；采用stitch软件，以虹鳟多群体snp参考面板作为参考数据，对初始基因型中的缺失基因型进行初级填充，获得初级高密度snp基因型数据；将初级高密度snp基因型数据与虹鳟多群体snp参考面板进行位点匹配，保留染色体编号、物理位置以及等位基因信息一致的snp位点，并对等位基因方向相反的位点进行等位基因翻转校正，对无法匹配、等位基因不一致以及多等位基因的位点予以剔除，获得待测样本的高密度snp基因型数据。

7、进一步地，在s4中，当待测数据为低密度snp芯片数据时，根据低密度snp芯片数据对应的芯片标记序列或芯片注释文件，将芯片snp位点定位至虹鳟参考基因组，获得各芯片snp位点在虹鳟参考基因组上的物理位置；将定位后的芯片snp位点与虹鳟多群体snp参考面板进行位点匹配，保留染色体编号、物理位置以及等位基因信息一致的snp位点，并对等位基因方向相反的位点进行等位基因翻转校正，对无法唯一定位、等位基因不一致、多等位基因以及缺失率高于阈值的位点予以剔除，获得校正后的芯片snp位点集合；将校正后的芯片snp位点集合对应的基因型数据转换为vcf格式或plink格式，作为待填充输入文件；采用beagle软件或stitch软件，以虹鳟多群体snp参考面板作为参考数据集，对待填充输入文件中的缺失位点进行基因型填充，获得待测样本的高密度snp基因型数据。

8、进一步地，在s5中，质量筛选包括位点筛选和样本筛选；位点筛选为：剔除填充质量值低于预设阈值的snp位点、剔除位点缺失率高于预设阈值的snp位点、剔除最小等位基因频率低于预设阈值的snp位点以及剔除等位基因方向无法确认的snp位点；样本筛选为：剔除样本缺失率高于预设阈值的待测虹鳟样本；筛选后保留的snp位点及对应样本构成待测虹鳟样本的高密度snp基因型数据。

9、进一步地，还包括对s5中高密度snp基因型数据进行准确性评价的步骤：选取具有高覆盖度全基因组测序数据的虹鳟个体作为验证样本，将验证样本的高覆盖度全基因组测序数据经变异检测获得的高置信snp基因型作为真实基因型；将验证样本的低覆盖度全基因组测序数据按照s3至s5的步骤进行处理，获得验证样本的待评价高密度snp基因型数据；将待评价高密度snp基因型数据与真实基因型进行逐位点比较，在位点水平上判断待评价基因型与真实基因型是否完全一致，计算全部分析位点中完全一致的位点所占比例，获得基因型一致率；在位点水平上将待评价基因型与真实基因型按照参考等位基因纯合型、杂合型以及替代等位基因纯合型分别赋值为0、1、2，计算全部分析位点上两组赋值结果的皮尔逊相关系数，获得基因型准确性；当基因型一致率高于第一预设阈值且基因型准确性高于第二预设阈值时，判定s5中高密度snp基因型数据通过准确性评价。

10、进一步地，还包括对s5中高密度snp基因型数据进行准确性评价的步骤：从低密度snp芯片数据的全部snp位点中随机抽取10%的snp位点作为掩蔽位点集合，将掩蔽位点集合对应的基因型从低密度snp芯片数据中删除，以删除后的剩余snp位点对应的基因型数据作为待填充输入数据；以虹鳟多群体snp参考面板作为参考数据集，对待填充输入数据进行基因型填充，获得掩蔽位点的填充基因型；将掩蔽位点的填充基因型与掩蔽位点在原始低密度snp芯片数据中的原始芯片基因型进行逐位点比较，计算全部分析位点中填充基因型与原始芯片基因型完全一致的比例，获得基因型一致率；当基因型一致率高于第三预设阈值时，判定s5中高密度snp基因型数据通过准确性评价。

11、本发明至少包括以下有益效果：

12、本发明通过构建多群体snp参考面板，配合低覆盖度测序或低密度snp芯片数据，即可经填充获得高密度全基因组基因型，相比直接进行高覆盖度全基因组测序，检测成本降低80%以上。本发明整合了来自中国、加拿大、美国、法国等多个地理来源的虹鳟群体高深度测序数据，参考面板涵盖全球主要养殖品系的代表性变异，能够适应不同遗传背景的目标样本，显著改善单一群体参考面板对不同来源样本填充精度不均的问题，具有较强的群体适用性和稳定性。本发明针对低覆盖度测序和低密度snp芯片分别建立了标准化预处理和填充流程，填补了两种数据源在统一框架下进行高密度填充的技术空白，解决了不同检测平台、不同参考基因组版本之间位点坐标和等位基因编码不一致的数据整合难题，为历史芯片数据与未来测序数据的联合分析提供技术支撑。本发明在参考面板构建、填充过程及最终结果中设置了多层级、多指标的质控参数，同时引入基因型一致率和基因型准确性双指标评价体系，配合下采样验证和位点掩蔽验证两种方案，确保填充结果的可靠性和可重复性，为后续基因组选择、全基因组关联分析和种质资源鉴定等应用提供高质量、标准化的基因型数据基础。

13、本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。