丝心蛋白纳米纤维稳定的复合载体及其制备方法与应用与流程

本发明属于化妆品活性物递送及药物制剂，具体涉及一种基于丝心蛋白纳米纤维三维网络与多相脂质体协同构建的复合载体，及其一步超声-自组装原位制备方法，以及该载体在水溶性、油溶性和难溶性多相活性物共载与透皮缓释中的应用。

背景技术：

1、纳米载体技术是现代功效护肤与经皮给药领域的核心技术之一。脂质体因其与细胞膜结构相似、生物相容性好、能够同时包裹水溶性和脂溶性活性物等优点，成为研究最广泛的纳米载体之一。现有技术已开发出薄膜分散法、乙醇注入法、高压均质法等多种成熟制备工艺，可分别包载水溶性与油溶性活性物，在美白、抗衰、修护类功效产品中得到大量应用。

2、然而，传统脂质体存在物理稳定性差、易聚集融合、药物泄漏快、货架期短等固有缺陷。其磷脂双分子层具有流动性大、结构刚性差的特点，在化妆品配方中易受温度、ph值、离子强度等因素影响，发生聚集、融合和破裂，导致包封的活性物泄漏，货架期通常只有3-6个月，严重限制了其在化妆品和医药产品中的大规模应用。

3、与此同时，天然蛋白质载体因其优异的生物相容性、可降解性和低免疫原性受到越来越多的关注。丝心蛋白（又称丝素蛋白，silk fibroin）是来源于天然蚕丝的结构蛋白，具备生物相容性好、可降解、无皮肤刺激性等优势，可通过自组装形成微球、纳米纤维、水凝胶等多种形貌的载体。现有研究表明，丝心蛋白可通过无定形化作用显著提升难溶性活性物的溶解度，同时具备良好的缓释与生物粘附性能，能够延长活性物在皮肤表面的停留时间，是极具潜力的天然递送基材。

4、然而单一丝心蛋白载体存在明显的应用局限。一方面，丝心蛋白微球、凝胶等载体脂溶性差，对视黄醇、神经酰胺、生育酚等油溶性活性物的包封率与负载量普遍偏低，无法满足脂溶性功效成分的递送需求；另一方面，致密的丝心蛋白基质透皮渗透能力弱，活性物难以高效穿透皮肤角质层到达作用部位，透皮效率不足，单独使用难以实现活性物的深层递送。

5、为了克服单一载体的局限性，研究者们开始探索将脂质体与丝心蛋白进行复合，期望通过二者的协同作用实现优势互补。目前，丝心蛋白-脂质体复合载体的研究主要经历了三个发展阶段：第一阶段是简单的物理共混，即将预先制备好的脂质体与丝心蛋白溶液混合；第二阶段是核-壳结构复合，即以丝心蛋白为内核、脂质体为壳层，或以脂质体为内核、丝心蛋白为壳层；第三阶段是网络结构复合，即利用丝心蛋白形成三维网络结构来包裹和稳定脂质体。然而，现有技术仍未能从根本上解决稳定性、包封率、透皮性与缓释性之间的矛盾。

6、然而现有丝蛋白-脂质体复合递送体系存在显著技术局限。中国专利申请cn119606765a公开的丝蛋白-卵磷脂包裹体采用加热搅拌法制备，仅能形成多空腔结构，无法构建纳米纤维网络限域效应；中国专利申请cn121159661a报道的丝心蛋白纤维聚集体载体通过“浓缩-稀释-温度培育”工艺制备，其纤维聚集体缺乏三维多孔网络结构；中国专利申请cn120465192a公开的丁香酚脂质体/壳聚糖/聚氧化乙烯纤维膜采用“预制备脂质体与纺丝液混合后纺丝”的工艺，脂质体在加工过程中易发生破裂，导致活性物泄漏。

7、综上，现有技术仍存在以下明显缺陷：

8、（1）脂质体储存稳定性差，货架期短：传统脂质体依靠磷脂双分子层形成囊泡结构，热力学稳定性不足，在化妆品复杂配方体系中易发生颗粒聚集、囊泡融合与活性物泄漏，长期储存粒径变化幅度大，无法满足产品货架期的质量要求。

9、（2）单一载体载药谱窄，难以覆盖多溶解性活性物：纯脂质体仅能高效包载水溶性与部分油溶性活性物，对光甘草定等难溶性活性物包封率极低；纯丝心蛋白微球对脂溶性活性物的负载能力有限，单一载体无法同时实现水相、脂相、难溶相三类活性物的高效共载。

10、（3）丝心蛋白-脂质体复合体系结构协同性弱，界面结合差：现有技术普遍采用“分别制备载体、后续物理共混”的思路，丝心蛋白未形成三维纳米纤维网络的结构性限域作用，二者仅为简单混合状态，界面结合力弱，易发生相分离与活性物泄漏，无法发挥材料间的性能协同效应。

11、（4）透皮效率与缓释性能存在固有矛盾：脂质体具备优异的透皮渗透能力，但活性物释放速度过快，无法实现皮肤长效作用；丝心蛋白基质缓释性能突出，但透皮渗透效率低，二者简单复配无法从结构层面破解“快速透皮”与“长效缓释”的性能矛盾，难以兼顾递送效率与作用时长。

12、因此，开发一种能够同时高效负载水溶性、油溶性和难溶性活性物、结构稳定、透皮与缓释协同、且适合规模化生产的蛋白-脂质体复合载体，具有重要的技术价值和市场前景。

技术实现思路

1、本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种丝心蛋白纳米纤维网络稳定的多相脂质体复合载体及其制备方法，以解决现有脂质体和丝心蛋白单一载体及二者简单复合体系中存在的储存稳定性差、三相活性物共载能力不足、透皮与缓释性能矛盾、制备工艺落后等技术问题。

2、为实现上述目的，本发明以纳米纤维限域稳定、三相分区共载、原位一体化制备为核心技术思路，从产品结构、载药机制、制备工艺三个维度构建完整技术方案。

3、本发明提供一种丝心蛋白纳米纤维网络稳定的多相脂质体复合载体，采用“外层纤维骨架-中层脂质囊泡-多相活性储库”的层级结构设计，包括：丝心蛋白纳米纤维三维网络骨架，限域于丝心蛋白纳米纤维三维网络骨架孔隙中的脂质体囊泡，活性物以及丝心蛋白纳米微球；具体如下：

4、（1）外层：丝心蛋白纳米纤维三维网络骨架

5、以天然蚕丝来源的丝心蛋白纳米原纤构建三维连续多孔网络，作为复合载体的支撑与缓释骨架。所述纳米纤维的直径为50-200 nm，三维网络骨架的孔隙率为60%-85%，孔隙尺寸与内部脂质体粒径精准匹配，通过物理限域效应阻止脂质体聚集融合。

6、优选地，所述丝心蛋白纳米纤维表面可进行两亲性修饰（如接枝卵磷脂基团），以增强纤维与脂质体磷脂膜的界面结合力，避免脂质体从网络中脱落。

7、所述丝心蛋白纳米纤维三维网络骨架的功能作用包括：提供机械支撑、缓释屏障与生物粘附性，延长载体在皮肤表面的停留时间，同时调控活性物释放速率。

8、（2）中层：限域型脂质体囊泡

9、所述脂质体囊泡为磷脂双分子层囊泡，被物理限域于丝心蛋白纳米纤维三维网络的孔隙中。脂质体粒径为80-200 nm。其功能作用包括：保留脂质体的透皮渗透特性，作为油溶性活性物的负载介质，同时包裹内水相承载水溶性活性物。

10、所述脂质体囊泡与丝心蛋白的质量比为1：（1~20），在保证脂质体载药量的同时维持纤维三维网络的骨架稳定性。

11、（3）核心：三相活性物分区共载体系

12、针对不同溶解性的活性物设计差异化负载位点，实现水溶性、油溶性、难溶性三类活性物的分区共载，互不干扰：

13、水溶性活性物包封于脂质体的内水相，通过水相包封机制实现负载，适配vc衍生物、多肽、烟酰胺、泛醇、乙酰基六肽-8、透明质酸寡糖等成分。

14、油溶性活性物增溶于脂质体的磷脂双分子层中，通过脂相增溶机制实现负载，适配视黄醇、生育酚、神经酰胺、千日菊（acmella oleracea）提取物等成分。

15、难溶性活性物预先负载于丝心蛋白纳米微球中，通过固体分散、无定形化处理提升溶解度与生物利用度。所述载药纳米微球粒径为20-200 nm，分散于脂质体囊泡内水相和/或丝心蛋白纳米纤维三维网络中，适配白藜芦醇、姜黄素、光甘草定等难溶性成分。

16、本发明创新采用一步“超声-自组装”联用的原位一体化制备工艺，利用丝心蛋白在丙二醇-水体系中的部分溶解-自组装特性，使纤维三维网络重构与脂质体原位形成在同一液相中同步完成，具体包括以下步骤：

17、（1）制备丝心蛋白纳米原纤分散液

18、采用酶解法从脱胶蚕丝中剥离丝心蛋白纳米原纤，经透析纯化后得到丝心蛋白纳米原纤分散液。控制丝心蛋白分子量为50-200 kda，分散液质量体积浓度为2%-6%（w/v），平衡纤维成丝性与自组装能力。

19、优选地，所述酶解法采用碱性蛋白酶与胰蛋白酶按质量比2：1组成的二元复合酶，总酶添加量为蚕丝干重的2%，于50℃恒温酶解12 h。

20、（2）制备负载难溶性活性物的丝心蛋白纳米微球

21、将难溶性活性物与丝心蛋白溶液混合均匀，通过超声诱导自组装制备负载难溶性活性物的丝心蛋白纳米微球，控制微球粒径为20-200 nm，实现难溶性活性物的预分散与无定形化。

22、（3）构建多相预混体系

23、将步骤（2）的载药丝心蛋白纳米微球与步骤（1）的丝心蛋白纳米原纤分散液搅拌混合均匀。向体系中加入含有磷脂与油溶性活性物的丙二醇-水混合溶液，以及水溶性活性物水溶液，控制体系中丙二醇体积占比为20%-30%（优选25%），达到触发丝心蛋白部分溶解但不完全溶解的临界状态。

24、优选地，所述磷脂为大豆卵磷脂。

25、（4）一步超声诱导原位一体化组装

26、将步骤（3）制备得到的预混体系置于冰水浴中，以200-400 w功率超声处理5-15min，全程控制体系温度不超过40℃，避免活性物氧化失活。通过单次超声能量输入同步完成四个核心过程：丝心蛋白纤维溶胀、脂质体囊泡原位形成、各类活性物均匀分散、丝心蛋白纤维三维网络重构，最终形成纤维三维网络限域脂质体的一体化结构。

27、优选地，所述超声功率为300-350 w，超声处理时间为10-15 min。

28、（5）冷却定容

29、超声结束后，将体系自然冷却至室温，用超纯水定容至目标体积，即得到丝心蛋白纳米纤维三维网络稳定的多相脂质体复合载体。

30、优选地，制备过程中控制脂质体与丝心蛋白的质量比为1：（10~12）。

31、有益效果

32、与现有技术相比，本发明具有以下突出的有益效果：

33、1、显著提升脂质体储存稳定性，大幅延长产品货架期：通过丝心蛋白纳米纤维三维网络的物理限域效应，将脂质体精准锚定在尺寸匹配的孔隙结构中，从结构层面阻止脂质体颗粒聚集、囊泡融合与沉降分层。配合纤维表面的两亲性修饰，可增强纤维与脂质体磷脂膜的界面结合力，避免脂质体从网络中脱落、体系发生相分离。

34、经加速稳定性试验验证，40℃/75% rh条件下储存30天，复合载体的粒径变化率小于10%，远低于未限域对照组50%以上的粒径增幅；同时体系的离心稳定性、zeta电位稳定性均显著提升，从根源上解决了传统脂质体在化妆品复杂配方中易泄漏、易变质的行业痛点，有效延长产品货架期。

35、2、实现三相活性物分区共载，全面拓展载药谱与包封效率：本发明提供了一种“水相-脂相-固相”三相分区负载策略，针对不同溶解性的活性物匹配专属负载位点：水溶性活性物包封于脂质体囊泡内水相、油溶性活性物增溶于磷脂双分子层、难溶性活性物经丝心蛋白纳米微球预分散后嵌入体系，突破了单一载体无法同时兼容多类型活性物的技术局限。

36、其中难溶性活性物通过丝心蛋白的固体分散与无定形化处理，溶解度与生物利用度得到显著提升。最终体系中水溶性、油溶性、难溶性活性物的包封率可分别达到80%、75%和60%以上，可实现多功效成分的协同递送，为多效合一的化妆品配方提供了核心载体支撑。

37、3、破解透皮与缓释的固有矛盾，实现递送性能协同增效：本复合载体并非两种材料的简单物理混合，而是通过一体化结构设计实现性能互补：内层脂质体保留类脂双分子层的透皮渗透特性，保障活性物高效穿透皮肤角质层；外层丝心蛋白纳米纤维网络形成缓释屏障，同时凭借自身生物粘附性延长载体在皮肤表面的停留时间，精准调控活性物释放速率，避免传统脂质体突释过快的问题。

38、二者协同作用下，既保留了脂质体的高透皮效率，又具备丝心蛋白的长效缓释能力，真正解决了“透皮快则作用短、缓释好则渗透差”的行业共性矛盾，显著提升活性物的皮肤利用度与作用时长。

39、4、原位一体化工艺简化高效，绿色环保易规模化：本发明创新采用一步“超声-自组装”联用制备工艺，利用丝心蛋白在丙二醇-水临界体系中的部分溶解-自组装特性，通过单次超声处理同步完成纤维溶胀、脂质体原位形成、活性物均匀分散、纤维网络重构四个核心过程，无需分别制备两种载体后再进行物理混合。

40、相比传统多步制备工艺，本方案工序大幅简化、生产周期显著缩短；反应以丙二醇-水为介质，条件温和（常温超声、无需高温），既避免了高温、高剪切对活性物的破坏，又减少了有机溶剂的使用，绿色环保；工艺参数可控性强，批次稳定性高，适配工业化规模化生产。同时，原位形成的一体化结构界面结合力远高于物理共混体系，从根源上规避了相分离的风险。

41、5、天然基材生物相容性优异，适配广泛应用场景：载体核心基材为天然蚕丝来源的丝心蛋白与生物源性磷脂，均具备优异的生物相容性与皮肤安全性，无细胞毒性与皮肤刺激性，符合化妆品原料的安全规范。该复合载体可适配水剂、精华、乳液、面霜等多种化妆品剂型，可广泛应用于美白、抗衰、修护、舒缓等多类功效护肤产品中，具备极高的产业落地与商业化应用价值。