评估非小细胞肺癌患者接受PD-1抑制剂效果的方法

本发明涉及生物信息学，具体涉及一种用于评估非小细胞肺癌患者接受pd-1抑制剂效果的方法。

背景技术：

1、随着免疫检查点的发现及免疫检查点抑制剂（icis）的临床应用标志着肿瘤免疫治疗领域的里程碑式进展，以阻断免疫检查点重新激活免疫细胞抗肿瘤免疫反应的免疫治疗在nsclc（非小细胞肺癌）患者的治疗中取得了显著进展。免疫检查点抑制剂的应用显著延长了患者的生存期，然而肿瘤细胞与肿瘤微环境中多种免疫细胞在肿瘤发生发展过程中持续处于相互作用和动态变化状态，限制了其临床获益最大化。肿瘤细胞pd-l1的表达受细胞因子、化疗、放疗等多种因素动态调控，传统组织活检难以实现对该动态过程的纵向监测，因此开发一种高效准确的评估预测nsclc患者ici治疗反应的方法至关重要。

2、中国发明专利cn119152926b公开了一种通过原发肿瘤预测肺癌新辅助免疫治疗后预后的预测模型及其构建方法，利用多种空间高通量测序生物信息学技术解析新辅助免疫治疗后原发病灶的关键免疫细胞亚群、免疫微环境拓扑特征结构和三级淋巴小体相关功能细胞亚群，提出通过原发病灶预测针对nsclc的新辅助免疫治疗后预后的预测模型，更加准确地表征了免疫治疗后的空间肿瘤免疫微环境改变，能够通过真正影响免疫效果的细胞靶点，更加精确地预测nsclc新辅助免疫治疗后的预后，但是数据收集，统计分析较复杂。中国发明专利申请cn117219274a公开了一种免疫性心肌炎预测模型的构建方法及免疫性心肌炎预测系统，从使用了免疫检查点抑制剂的非心肌炎患者和心肌炎患者的电子病历中获取数据，对经处理后的数据进行logistic回归分析，构建检测免疫性心肌炎的nomogram预测模型，但是不涉及非小细胞肺癌患者的免疫治疗预测，预测影响数据不同。

技术实现思路

1、为了开发一种高效准确的评估预测nsclc患者接受pd-1抑制剂效果的方法，本发明的第一个方面提供了一种用于评估非小细胞肺癌患者接受pd-1抑制剂效果的方法，通过ici患者治疗前后%pd-l1+plt的变化值、ici治疗基线外周血plr、ici治疗基线%pd-l1+plt三个参数经多元logistic回归分析联合构建预测模型，进行非小细胞肺癌患者接受pd-1抑制剂效果的评估；

2、所述预测模型的公式如下：

3、

z=

β0+

β1

x1 +

β2

x2+

β3

x3

4、

x1：治疗前后%pd-l1+ plt的变化值；

x2：：ici治疗基线%pd-l1+plt；

x3：ici治疗基线外周血plr；

5、

β0

=-0.2046，β1

=0.1448，

β2

=-0.01819，

β3

=-0.006702；

6、所述ici患者治疗前后%pd-l1+plt的变化值为ici患者治疗前后外周血中pd-l1阳性血小板所占比值的变化值；

7、所述ici治疗基线外周血plr为接受ici治疗的患者基线外周血中血小板和淋巴细胞的比值；

8、所述ici治疗基线%pd-l1+plt为接受ici治疗的患者基线外周血中血小板标记抗体细胞群在血小板细胞群中所占比例。

9、本发明通过对接受pd-1抑制剂治疗的nsclc患者进行前瞻性观察性队列研究，采用全光谱流式细胞术对患者接受治疗前后的pd-l1阳性血小板所占比值进行测定，观察其治疗基线结果及动态变化规律，并与组织学免疫检查点分子评估以及临床长期随访的治疗反应进行对比关联。构建更加高效准确的nsclc患者ici治疗反应的早期预测模型，可实现对治疗反应的早期、精准预测，为液体活检在免疫治疗效果评估中的临床应用提供了新策略。

10、作为一种实施方式，所述预测模型的auc值≥0.8865；灵敏度≥79.2%，特异度≥89.7%。

11、作为一种实施方式，所述ici患者治疗前后%pd-l1+plt的变化值采用全光谱流式细胞仪测量患者接受治疗前后的pd-l1阳性血小板所占比例得到。

12、作为一种实施方式，所述接受ici治疗的患者为接受治疗后有反应患者。

13、作为一种实施方式，所述预测模型的构建方法包括以下步骤：

14、采集外周静脉血样标本，分离外周静脉血样标本的血小板血浆；

15、血小板血浆进行血常规检测和用全光谱流式细胞仪检测；

16、对全光谱流式细胞仪输出的荧光信号进行圈门分类，得到%pd-l1+plt，tps数据；血常规检测得到外周血血小板计数及淋巴细胞计数；

17、对得到的数据进行统计学分析，采用spearman相关性分析计算病理活检tps（pd-l1肿瘤细胞阳性比例分数）结果与外周血%pd-l1+ plt之间的相关性，采用多元logistic回归分析得到nsclc患者ici治疗反应的预测模型。

18、作为一种实施方式，所述外周静脉血样标本的来源包括健康志愿者的一次外周静脉采血，接受ici治疗的nsclc患者的两次外周静脉采血和未接受ici治疗的nsclc患者的两次外周静脉采血。

19、作为一种实施方式，所述接受ici治疗的nsclc患者的两次外周静脉采血的时间间隔为接受ici治疗的两个疗程。

20、作为一种实施方式，所述接受ici治疗的nsclc患者的两次外周静脉采血第一次为患者接受第一次ici治疗前一日采集，第二次为患者接受两个疗程（42天）ici治疗之后采集（即为拟进行第三个疗程ici治疗前一日）。

21、作为一种实施方式，所述未接受ici治疗的nsclc患者的两次外周静脉采血第一次为患者入院后拟接受抗肿瘤治疗前一日采集，第二次为与第一次间隔时间42天进行采集。

22、作为一种实施方式，所述分离外周静脉血样标本的血小板血浆的方法包括以下步骤：将外周静脉血样标本置于乙二胺四乙酸二钾抗凝采血管中，2小时内送至实验室，200-400g高速常温离心4-6min，分离上层得到血小板血浆。

23、作为一种实施方式，所述分离外周静脉血样标本的血小板血浆的方法包括以下步骤：将外周静脉血样标本置于乙二胺四乙酸二钾抗凝采血管中，2小时内送至实验室，300g高速常温离心5min，分离上层得到血小板血浆。

24、作为一种实施方式，所述全光谱流式细胞仪检测的方法包括以下步骤：

25、健康志愿者的血小板血浆为对照组，nsclc患者的血小板血浆为实验组；

26、向对照组和实验组的血小板血浆中加入血小板标记抗体，抗cd41a、抗cd42b、抗cd61、抗cd62p，向实验组的血小板血浆中加入免疫检查点分子标记抗体抗pd-l1，震荡混匀，避光孵育；

27、孵育后洗涤，离心，重悬，震荡后上机检测；

28、确定外周血血小板的细胞群，用于后续统计学分析使用，实现全光谱流式细胞仪检测。

29、作为一种实施方式，所述全光谱流式细胞仪检测的方法具体包括以下步骤：

30、取20μl健康志愿者的血小板血浆为对照组，20μl nsclc患者的血小板血浆为实验组；

31、向对照组和实验组的血小板血浆中加入血小板标记抗体，抗cd41a（pe） 5μl、抗cd42b（rb488） 5μl、抗cd61（rb780） 5μl、抗cd62p（apc-cy7） 5μl，向实验组的血小板血浆中加入免疫检查点分子标记抗体抗pd-l1（pe） 5μl，震荡混匀5s，避光孵育15min；

32、孵育后加入1-2mlpbs洗涤，1050g常温离心5min，500µlpbs重悬，震荡5s后上机检测；

33、先根据前向角散射光与侧向角散射光圈定外周血血小板的大致位置（图1a，图2a），再分别利用血小板特异性抗体抗cd41a（图1b，图2b）、抗cd42b（图1c，图2c）、抗cd61（图1d，图2d）确定血小板细胞群；根据血小板活化标志抗体抗cd62p圈定活化血小板细胞群；由于免疫检查点分子pd-l1在血小板上连续表达，使用fmo圈门设定pd-l1阳性表达血小板的阈值区间（图1e-g），进而确定pd-l1阳性表达血小板占总血小板的比值（图2e-g），用于后续统计学分析使用，实现全光谱流式细胞仪检测。

34、作为一种实施方式，所述%pd-l1+plt为cd41a（+）pd-l1（+）细胞群、cd42b（+）pd-l1（+）细胞群、cd61（+）pd-l1（+）细胞群在血小板细胞群中所占比例的平均值。

35、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

36、（1）本发明所述用于评估非小细胞肺癌患者接受pd-1抑制剂效果的方法，可以为临床提供一种比肿瘤组织活检评估更加简便可行且高效的方法，可实现长期监测患者治疗周期的适应性免疫反应变化。

37、（2）本发明所述用于评估非小细胞肺癌患者接受pd-1抑制剂效果的方法，有助于为ici治疗的抗肿瘤作用及耐药机制提供新的见解，这些机制具有潜在的治疗价值，为发现新的治疗靶点克服ici治疗耐药提供新的辅助方案。

38、（3）本发明所述用于评估非小细胞肺癌患者接受pd-1抑制剂效果的方法，通过整合ici患者治疗前后%pd-l1+plt的变化值、ici治疗基线外周血plr、ici治疗基线%pd-l1+plt三个参数，构建预测nsclc患者ici治疗预后的血小板相关模型，能更早更准确地判断ici治疗的抗肿瘤效果。

39、（4）本发明所述用于评估非小细胞肺癌患者接受pd-1抑制剂效果的方法，其中的液体活检中血小板pd-l1动态变化有望成为免疫治疗效果的早期预警或监测标志物，增强其在ici治疗预后中的预测价值，还可进一步完善ici的抗肿瘤作用机制。

40、（5）本发明所述用于评估非小细胞肺癌患者接受pd-1抑制剂效果的方法，可实现对治疗反应的早期、精准预测，为液体活检在免疫治疗效果评估中的临床应用提供了新策略。