一种副结核MAPSA1单抗胶体金试纸的制作方法

本发明涉及免疫检测，公开了一种副结核mapsa1单抗胶体金试纸。

背景技术：

1、副结核分枝杆菌感染可导致反刍动物发生慢性肠道消耗性疾病，病原排出呈低水平、间歇性特征，早期样本中目标抗原含量低，常规培养周期长，分子检测依赖仪器和核酸提取条件，难以满足基层现场筛查需要。胶体金免疫层析试纸因操作简便、判读直观、无需大型仪器，常被用于副结核快速检测。常规胶体金试纸通常以样本垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫为主体结构，在结合垫上负载胶体金标记抗体，在检测线上固定捕获抗体，样本加入后随层析液向前迁移，目标抗原与胶体金标记抗体结合后再被检测线捕获形成可见色带，质控线用于判断层析过程是否正常。

2、现有副结核抗原检测试纸多采用单一识别模式或常规夹心免疫模式，抗体筛选重点集中于结合强度和交叉反应控制，样本预处理多依赖通用缓冲液、普通封闭蛋白和常规表面活性剂。对于血清、乳汁或粪便浸提液等样本，脂质微团、黏多糖、宿主免疫球蛋白、补体蛋白及颗粒杂质会与目标抗原、膜材或胶体金颗粒发生非特异接触，造成抗原被包埋、迁移受阻或膜面背景加深。部分试纸通过增加抗体包被量、提高胶体金标记量或延长反应时间来增强弱阳性显色，但此类方式容易带来金颗粒聚集、层析速度不均、检测线拖尾和阴性背景升高，难以兼顾复杂样本中的低丰度抗原捕获与清晰判读。

3、现有技术的主要技术问题在于：副结核相关一号抗原在复杂样本中常处于低丰度、部分包埋或局部构象变化状态，单一表位识别或常规双抗体夹心体系对目标抗原的可及性和捕获稳定性不足，导致弱阳性样本在层析过程中难以形成稳定免疫复合物，检测线显色浅、重复性差，阴阳性边界不清。该问题并非单纯增加胶体金颗粒、提高抗体浓度或采用通用封闭液即可解决，因为抗原暴露不足、抗体构象损失和基质干扰同时存在，任一环节未被处理均会限制检测线处复合物沉积。亟需形成一种围绕目标抗原暴露、双表位协同捕获和标记抗体稳定迁移的胶体金试纸结构，使复杂样本中的副结核相关一号抗原能够在层析过程中被稳定识别和固定。

技术实现思路

1、针对现有副结核相关一号抗原胶体金检测试纸在复杂样本中存在目标抗原可及性不足、局部构象变化后捕获稳定性差、弱阳性样本检测线显色不稳定的缺陷，本发明提供了一种副结核mapsa1单抗胶体金试纸，通过样本预处理组合物、双表位单克隆抗体识别体系和抗体构象保护成分的配合，使复杂样本中的副结核mapsa1抗原在层析过程中能够被稳定释放、结合和捕获。

2、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种副结核mapsa1单抗胶体金试纸，包括底板以及依次搭接设置于所述底板上的样本垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述胶体金结合垫负载有胶体金标记的第一mapsa1单克隆抗体，所述第一mapsa1单克隆抗体为针对mapsa1天然构象表位的单克隆抗体；所述硝酸纤维素膜上设置检测线和质控线，所述检测线固定有第二mapsa1单克隆抗体，所述第二mapsa1单克隆抗体为针对mapsa1线性表位或半构象表位的单克隆抗体，且所述第一mapsa1单克隆抗体与所述第二mapsa1单克隆抗体对应的抗原决定簇彼此不重叠；所述样本垫负载有样本预处理组合物，所述样本预处理组合物包括蛋白解聚成分、非离子型表面活性保护成分和异嗜性抗体阻断成分；所述胶体金结合垫还负载有抗体构象保护成分。

3、样本加入样本垫后，样本预处理组合物先与样本中的蛋白聚集物、脂质微团、宿主免疫球蛋白及其他非目标基质成分接触，使被样本基质遮蔽的mapsa1抗原暴露出可被抗体识别的区域。样本继续沿层析方向迁移至胶体金结合垫时，mapsa1抗原与胶体金标记的第一mapsa1单克隆抗体结合，形成带有胶体金标记的抗原抗体复合物。该复合物继续迁移至硝酸纤维素膜检测线时，由固定于检测线的第二mapsa1单克隆抗体进行再次捕获。由于第一mapsa1单克隆抗体识别mapsa1天然构象表位，第二mapsa1单克隆抗体识别mapsa1线性表位或半构象表位，且二者对应的抗原决定簇彼此不重叠，目标抗原能够在不同表位之间形成夹心式结合结构。抗体构象保护成分在胶体金结合垫干燥保存和复溶迁移过程中维持第一mapsa1单克隆抗体的空间结合状态，减少抗体活性位点因干燥或复溶而发生不可逆遮挡。

4、进一步地，在上述技术方案中，所述第一mapsa1单克隆抗体由保持mapsa1天然空间构象的免疫原筛选获得，所述第二mapsa1单克隆抗体由包含mapsa1保守线性区段或经复性处理的mapsa1片段筛选获得。

5、具体实施中，保持mapsa1天然空间构象的免疫原能够保留抗原表面由空间折叠形成的构象表位，使筛选获得的第一mapsa1单克隆抗体适于识别样本中未发生明显变性的mapsa1抗原。包含mapsa1保守线性区段或经复性处理的mapsa1片段用于筛选第二mapsa1单克隆抗体，使该抗体能够识别经样本处理或迁移过程后仍稳定存在的线性表位或半构象表位。检测过程中，两类抗体分别对应不同抗原状态下的可识别区域，减少单一表位失去可及性时造成的捕获中断。

6、进一步地，在上述技术方案中，所述蛋白解聚成分包括氨基酸型缓冲组分、多羟基化合物和温和盐组分，所述非离子型表面活性保护成分包括聚氧乙烯类表面活性剂或烷基糖苷类表面活性剂，所述异嗜性抗体阻断成分包括非免疫同源动物免疫球蛋白、聚合免疫球蛋白片段或异嗜性抗体阻断蛋白。

7、具体实施中，氨基酸型缓冲组分为样本中的抗原抗体反应提供适宜的离子环境，多羟基化合物参与维持蛋白水化层，温和盐组分调节样本中蛋白复合物之间的静电接触，使被宿主蛋白或黏附性基质包埋的mapsa1抗原更容易暴露。聚氧乙烯类表面活性剂或烷基糖苷类表面活性剂通过降低疏水颗粒与膜材、胶体金颗粒之间的非特异接触，改善样本沿层析方向的迁移状态。非免疫同源动物免疫球蛋白、聚合免疫球蛋白片段或异嗜性抗体阻断蛋白与样本中的异嗜性抗体优先结合，减少其在胶体金标记抗体和检测线抗体之间形成非目标桥连。

8、进一步地，在上述技术方案中，所述抗体构象保护成分包括糖类玻璃化保护组分、蛋白稳定组分和抗胶体金聚集组分，所述糖类玻璃化保护组分、蛋白稳定组分和抗胶体金聚集组分共同负载于胶体金结合垫的干燥基质内。

9、具体实施中，胶体金结合垫在制备后通常处于干燥状态，胶体金标记的第一mapsa1单克隆抗体在干燥和复溶之间经历水化环境变化。糖类玻璃化保护组分在干燥基质内形成保护性固态网络，蛋白稳定组分维持抗体分子周围的亲水微环境，抗胶体金聚集组分限制胶体金颗粒在干燥和复溶过程中的近距离接触。样本液到达胶体金结合垫后，上述组分随液体复溶，使胶体金标记抗体以分散状态释放，并保留其对mapsa1天然构象表位的结合能力。

10、进一步地，在上述技术方案中，所述硝酸纤维素膜在检测线以外的膜面区域负载有抗基质封闭组合物，所述抗基质封闭组合物包括惰性蛋白封闭组分、多糖阻隔组分和弱电荷屏蔽组分。

11、具体实施中，硝酸纤维素膜具有蛋白吸附能力，复杂样本中的脂肪球、色素颗粒、补体蛋白及其他非目标蛋白可能在检测线以外区域滞留。惰性蛋白封闭组分占据膜面非特异吸附位点，多糖阻隔组分在膜面形成亲水阻隔层，弱电荷屏蔽组分降低带电基质成分与膜材之间的静电吸附。样本迁移过程中，非目标基质成分在检测线以外区域的滞留减少，胶体金标记复合物更集中地参与检测线处的特异性捕获。

12、进一步地，在上述技术方案中，所述第一mapsa1单克隆抗体通过其非抗原结合区与胶体金颗粒表面连接，所述第二mapsa1单克隆抗体通过固相固定组分固定于检测线，且所述第一mapsa1单克隆抗体和第二mapsa1单克隆抗体分别来源于不同杂交瘤细胞株或不同重组抗体序列。

13、具体实施中，第一mapsa1单克隆抗体通过非抗原结合区与胶体金颗粒表面连接，使其抗原结合区朝向外部液相，减少胶体金颗粒表面对抗原结合区域的空间遮挡。第二mapsa1单克隆抗体通过固相固定组分固定于检测线，使其在膜面形成稳定的捕获带。第一mapsa1单克隆抗体和第二mapsa1单克隆抗体来源于不同杂交瘤细胞株或不同重组抗体序列，可使二者在抗原识别区域上形成区分，避免同一抗原决定簇竞争结合。

14、进一步地，在上述技术方案中，所述样本垫为分层负载结构，沿样本流动方向依次设置样本接收层和抗原释放层，所述样本接收层负载所述非离子型表面活性保护成分和异嗜性抗体阻断成分，所述抗原释放层负载所述蛋白解聚成分。

15、具体实施中，样本接收层位于样本进入试纸的前端，可使非离子型表面活性保护成分和异嗜性抗体阻断成分先与样本中的脂质、疏水颗粒及异嗜性抗体接触，减少其随液流进入后续免疫反应区域时造成干扰。抗原释放层位于样本接收层之后，使经过初步基质分散和抗体干扰阻断的样本继续与蛋白解聚成分接触，促使mapsa1抗原从蛋白复合物或黏附性基质中释放。该分层负载结构使样本预处理过程按照层析方向分段进行，避免各预处理组分在样本进入初期集中释放造成反应环境波动。

16、进一步地，在上述技术方案中，所述胶体金结合垫包括靠近样本垫一侧的复溶保护区和靠近硝酸纤维素膜一侧的标记抗体释放区，所述复溶保护区负载糖类玻璃化保护组分和抗胶体金聚集组分，所述标记抗体释放区负载胶体金标记的第一mapsa1单克隆抗体及蛋白稳定组分。

17、具体实施中，样本液由样本垫进入胶体金结合垫后，先经过复溶保护区，糖类玻璃化保护组分和抗胶体金聚集组分随液体溶出并进入标记抗体释放区周围的微环境，使胶体金标记抗体在释放前获得水化保护。样本液继续推进至标记抗体释放区时，胶体金标记的第一mapsa1单克隆抗体与蛋白稳定组分共同复溶并释放。该区域分配方式使保护组分和标记抗体释放过程在层析方向上衔接，减少胶体金标记抗体在初始复溶阶段发生局部聚集。

18、进一步地，在上述技术方案中，所述抗基质封闭组合物还负载于样本垫与硝酸纤维素膜的搭接过渡区域，所述搭接过渡区域设置有亲水迁移调节组分，所述亲水迁移调节组分为水溶性高分子成膜物或两性离子型亲水聚合物。

19、具体实施中，样本垫与硝酸纤维素膜的搭接过渡区域是样本从预处理材料进入膜材检测区域的界面位置，液流速度和基质成分分布容易发生变化。抗基质封闭组合物设置于该区域，可在样本进入硝酸纤维素膜前继续限制非目标基质成分与膜面的非特异吸附。水溶性高分子成膜物或两性离子型亲水聚合物形成亲水迁移界面，使样本液在搭接处保持连续润湿和均匀推进，减少局部滞留造成的膜面背景不均。

20、进一步地，在上述技术方案中，所述质控线固定有能够结合所述胶体金标记第一mapsa1单克隆抗体的抗物种抗体，所述样本垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫封装于带有加样孔、观察窗和样本流向限定结构的试纸卡壳内。

21、具体实施中，质控线固定的抗物种抗体能够与随层析液迁移的胶体金标记第一mapsa1单克隆抗体结合，使层析过程和标记抗体释放状态可通过质控线呈现。样本垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫封装于试纸卡壳内后，加样孔限定样本进入位置，观察窗对应检测线和质控线位置，样本流向限定结构限制样本沿设定方向迁移。检测过程中，样本从加样孔进入样本垫，经胶体金结合垫和硝酸纤维素膜迁移至吸水垫，完成预处理、标记抗体结合、检测线捕获、质控线结合和末端吸液过程。

22、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

23、1、通过在样本垫中负载蛋白解聚成分、非离子型表面活性保护成分和异嗜性抗体阻断成分，并将胶体金标记的天然构象表位单克隆抗体与检测线固定的线性表位或半构象表位单克隆抗体配合使用，使样本进入层析通道后先完成基质分散和干扰削弱，再进入双表位免疫识别过程。蛋白解聚成分使被脂质、黏多糖或宿主蛋白遮蔽的副结核相关一号抗原暴露出可结合区域，非离子型表面活性保护成分减轻样本中疏水颗粒对抗原及胶体金复合物迁移的影响，异嗜性抗体阻断成分降低宿主抗体与标记抗体之间的非特异桥连。天然构象表位单克隆抗体用于保持对未变性抗原的初始结合能力，线性表位或半构象表位单克隆抗体用于捕获经样本处理后仍保留保守识别区的抗原，使目标抗原即使存在局部构象改变，仍可通过另一抗原决定簇被检测线固定。上述结构使弱阳性样本中的目标抗原更容易形成连续免疫复合物，检测线色带边界更清楚，低丰度样本的漏判风险降低。

24、2、胶体金结合垫中的抗体构象保护成分对标记单克隆抗体在干燥、储存和复溶阶段的空间结构形成支撑，减少标记抗体在干膜状态下的活性损失及胶体金颗粒团聚。糖类玻璃化保护组分、蛋白稳定组分和抗胶体金聚集组分共同分布于结合垫基质内，可使胶体金标记抗体在样本液到达时以较均一状态释放并参与层析迁移。硝酸纤维素膜检测线以外区域设置抗基质封闭组合物，惰性蛋白封闭组分、多糖阻隔组分和弱电荷屏蔽组分共同减少乳汁脂肪球、粪便色素颗粒、血清补体蛋白及其他非目标组分在膜面的滞留。样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫经卡壳限定流向后，样本推进路径固定，复溶、结合、捕获和显色过程更稳定。该结构使膜面泛红、拖尾和质控异常减少，批间判读差异收窄，并保持胶体金试纸现场快速检测的基本操作形态。