抗PAT转基因农作物金标检测试纸条的制备方法及应用

本发明属于生物技术应用领域，具体来说是一种抗pat转基因农作物金标检测试纸条的制备方法及应用。

背景技术：

1、伴随生物技术的快速发展，高产优质的转基因作物品种不断被培育应用于农业生产中，全球转基因作物种植面积与日俱增，其中耐除草剂是主要种植性状之一，也是极具推广应用前景的转化体性状。pat基因来源于绿产色链霉菌（streptomycesviridochromogenes），编码膦丝菌素乙酰转移酶（phosphinothricin acetyltransferase，pat）bar基因来源于土壤吸水链霉菌（streptomyces hygroscopicus），编码膦丝菌素乙酰转移酶（phosphinothricin acetyltransferase）；将乙酰辅酶a中的乙酰基转移到膦基菊酯的游离氨基，将膦基菊酯转化为非除草剂乙酰化形式，目前pat与bar基因已被广泛转化于多种作物中以赋予耐除草剂性。转基因作物在种植以及农产品加工过程中，不可避免的会与周围环境发生交流，其生物安全存在不确定性。生物安全评价是我国转基因作物产业化的关键环节，也是农业转基因生物安全管理所必不可少。转基因成分的筛查对于转基因安全评价具有重要作用。转基因成分检测在转基因生物安全监管中的作用越来越大，如何快速且简单的对转基因成分进行检测对于转基因生物安全的风险防范具有重要意义。

2、目前，转基因植物中pat/bar蛋白的检测技术主要有核酸检测法以及蛋白检测法。基于核酸水平的检测法需要进行核酸提取、纯化、扩增，步骤繁琐、耗时，且操作过程对检测设备以及操作人员要求较高，难以满足大规模现场快速检测。基于蛋白的检测技术以免疫层析试纸条技术应用最为广泛，免疫层析试纸条是一种将免疫反应与色谱层析相结合的快速免疫分析技术，操作过程省时省力、简便易学，成本低廉兼具普适性，是目前现场大范围筛查检测时的常用技术。

3、免疫层析试纸条主要由样品垫、结合垫、nc膜、吸收垫依次组装与底板相连，主要利用免疫反应以及色谱层析相结合对样品进行快速检测。胶体金制备简便、成本低廉，是免疫层析试纸条的主要示踪标记物，被广泛用于病原诊断、农药残留检测、食品检测等领域。现有技术方案以量子点或40 nm胶体金对pat/bar蛋白单克隆抗体进行偶联，喷于膜中形成结合垫，将样品垫、结合垫、划有质控线以及检测线的nc膜以及用于吸收多余液体的吸收垫按照顺序粘合与底板上，形成免疫层析试纸条，根据质控线与检测线呈现出的不同荧光强度或信号强度的变化从而对样品中的pat/bar蛋白进行定量检测。然而量子点偶联的蛋白单克隆抗体，荧光易猝灭，在定量时的准确性能较低，易受外界环境影响。另一方面传统的免疫层析试纸条中使用的纳米金颗粒尺寸较大、易凝聚、分散性差、非特异性干扰强，这些问题都导致检测效率低下，影响检测效果。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种抗pat转基因农作物的金标检测试纸条及制备方法和应用。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种抗pat转基因农作物的金标检测试纸条制备方法，所述试纸条包括聚氯乙烯（pvc）底板及依次固定在聚氯乙烯（pvc）底板上的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜（nc）和吸水垫，所述硝酸纤维素膜（nc）上设置有c线和t线，所述c线上包被有羊抗鼠igg的抗体，所述t线上包被有pat/bar单克隆抗体，所述金标垫中含有胶体金标记的pat/bar单克隆抗体，且pat/bar单克隆抗体与pat/bar单克隆抗体相互配对，所述金标垫与样品垫分别贴至聚氯乙烯底板的相应区域，金标垫与硝酸纤维素膜、样品垫与金标垫间有1-2mm的交联，所述pat/bar单克隆抗体和均为鼠抗；制备方法步骤包括：

3、s1.合成aunps：使用氯金酸与柠檬酸钠反应得到au溶液，调节au溶液ph值至7.2～7.4，获得高分散的aunps纳米颗粒；

4、s2.将aunps与pat/bar单克隆抗体在缓冲液中混合，经静置、离心弃上清、沉淀重悬、离心弃上清、沉淀复溶，完成au-peg与pat/bar单克隆抗体的偶联；

5、s3.使用玻璃纤维膜制作结合垫，结合垫喷金前进行预处理；

6、s4.使用aunps与pat/bar单克隆抗体的偶联物对结合垫进行喷金处理；

7、s5.使用pat/bar单克隆抗体以及igg羊抗鼠对硝酸纤维素膜（nc）进行划线处理，真空干燥；

8、s6.将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜（nc）、吸水纸、聚氯乙烯（pvc）底板组装成试纸条。

9、进一步的，步骤s1中，具体为：

10、将79 ml超纯水与1 ml 1%氯金酸溶液搅拌均匀后加热至60℃，得溶液a；将4 ml新制的1%柠檬酸钠溶液与0.5 ml单宁酸、15 ml超纯水混合均匀，加入0.5 ml 0.025 m 碳酸钾溶液调节ph至7.2～7.4，搅拌均匀后加热至60℃，得溶液b；将溶液a与溶液b混合均匀并在60℃持续搅拌直至溶液转为红色；进一步，加热至溶液沸腾，冷却后得到aunps。

11、进一步的，步骤s2中，具体为：将40 μl aunps、60 μl0.01m硼酸缓冲液、5 μl pat/bar单克隆抗体吹打混匀，静置40 min，加入10 μl封闭液，混匀后静置60 min；4℃5000rpm离心20 min，弃100 μl上清，加入100 μl 0.01m硼酸缓冲液吹打混匀，4℃ 5000rpm离心20 min，弃100 μl上清，加入100 μl复溶液，吹打混匀，完成aunps与pat/bar单克隆抗体的偶联。

12、进一步的，步骤s4中，喷金速度为5μl/cm。

13、进一步的，步骤s5中，pat/bar单克隆抗体以及igg羊抗鼠划线时，划线浓度为1.0mg/ml，划线速度为1.5μl/cm。

14、本发明试纸条在检查时，t线与c线同时有显色条带表示为阳性样品，样品中含有pat/bar蛋白；仅t线有显色条带表示为阴性样品，样品中无pat/bar蛋白；t线与c线均不显色的情况下，说明试纸条无效，不具备检测效果。

15、本发明的有益技术效果是：

16、1.现有胶体金免疫层析试纸条中使用的胶体金分散性差导致标记效果差、灵敏度受限，且容易出现假阳性。与现有技术相比，本发明通过设计一种兼具高灵敏度与特异性的胶体金免疫层析试纸条，用于转基因植物中pat/bar蛋白的现场快速检测，为转基因安全监管提供技术支撑。

17、2.本发明提供一种灵敏度高的转基因植物pat/bar蛋白的胶体金免疫层析试纸条及其使用方法，灵敏度达到1.563ng/ml，具有稳定性强，操作简便，可用于转基因植物中pat/bar蛋白的现场快速检测。

18、3.本发明试纸条采用单宁酸与柠檬酸钠共同作为还原剂制备的胶体金纳米颗粒（aunps）作为抗体的结合载体，aunps分散性好、尺寸小，提升胶体金与抗体的结合能力，可捕获结合更多抗体，增强检测灵敏度。