用于测定的捕获珠的制作方法

背景技术：

技术实现思路

1、本公开提供了一种捕获珠，该捕获珠被配置用于收集在测定过程中产生的、由细胞暴露于扰动元件所诱导的细胞功能静态和动态变化的信息。 在一些实施方案中，本文所述捕获珠收集的信息将扰动元件引起的细胞功能变化与该细胞受到扰动的检测区域相关联。

2、生成此类信息的能力取决于将受扰动细胞产生的测序数据与测定开始前细胞沉积的检测区域进行回溯关联的能力。

3、在一些实施方案中，提供了一种用于测定的捕获珠，所述捕获珠包含：

4、附接于所述珠上的可检测标记或可检测标记集合，所述标记独特标识所述捕获珠；

5、多个捕获珠索引，用于编码可检测的标记或标记集合，所述标记或标记集合对于所述捕获珠是独特的，并且所述索引任选地通过接头附接其上；

6、多个附接在捕获珠索引上的一种或多种捕获元件。

7、在一些实施方案中，提供了一种映射测定装置，该装置包含多个检测区域，并且在每个检测区域中至少有一个捕获珠，其中所述映射测定装置将给定检测区域与所述映射的特定位置以及每个检测区域中所包含的捕获珠相关联，其中所述捕获珠包含：

8、附接于所述珠上的可检测标记或可检测标记集合，所述标记独特标识所述捕获珠；

9、多个捕获珠索引，用于编码可检测的标记或标记集合，对于所述捕获珠是独特的，并且任选地通过接头附接其上；

10、附接在捕获珠索引上的至少一种捕获元件。

11、在一些实施方案中，所述捕获珠中使用的可检测标记或可检测标记集合是光学可检测的。

12、在一些实施方案中，可检测的标记或标记集合包含不同的颜色和/或与不同的所述捕获珠相关的一种或多种颜色的不同强度。

13、在一些实施方案中，可检测标记或标记集合选自：与捕获珠相关的图像、代码、形状、颜色、可诱导颜色、文字、数字、符号、条形码、通用产品代码 (upc) 和材料。

14、在一些实施方案中，所述捕获珠上的任选接头是可释放的接头。

15、在一些实施方案中，捕获元件包含约6至约2,000个核苷酸。

16、在一些实施方案中，附接到多个相同捕获珠索引的捕获元件选自：待捕获的扰动组分的受体或配体，或者待捕获的扰动寡核苷酸中包含的相应寡核苷酸序列的互补寡核苷酸。

17、在一些实施方案中，捕获元件是寡核苷酸。

18、在一些实施方案中，捕获元件（例如寡核苷酸捕获元件）附接到寡核苷酸索引的近端和/或远端（其中近端与可释放的接头或珠相邻）。

19、在一些实施方案中，附接可以是直接的，或通过接头进行的。

20、在一些实施方案中，接头是可释放的接头。

21、在一些实施方案中，捕获元件是待捕获的扰动组分的受体或配体。  此类受体包括扰动组分的抗体或抗体结合片段；扰动组分的酶或酶受体；特定细胞因子或趋化因子的受体等等。

22、在一些实施方案中，捕获珠上的捕获元件是亲和素/链霉亲和素。

23、在一些实施方案中，捕获元件是生物素，其捕获经过修饰以含有亲和素/链霉亲和素基团的扰动组分。

24、在一些实施方案中，捕获珠索引附接到寡核苷酸捕获元件，该寡核苷酸捕获元件直接连接或通过可释放的接头连接。

25、在一些实施方案中，捕获元件是多聚胸腺嘧啶(poly-t)、多聚鸟嘌呤(poly-g)或多聚胞嘧啶(poly-c)。

26、在一些实施方案中，提供如上所述且由式i表示的捕获珠：

27、(w)r-cb-(l-x-q-q1)n (i)

28、其中：

29、cb是捕获珠；

30、l是一个任选可释放的接头；

31、w是光学可检测标记或光学可检测标记集合，所述标记独特标识捕获珠；

32、x是键或捕获元件；

33、q是捕获珠索引，其编码捕获珠上的光学可检测标记或光学可检测标记集合；

34、q1是捕获元件，其针对n个l-x-q-q1组中的每一个独立地选择；

35、n表示与珠结合的多个此类 (l-x -q-q1)组，并且

36、r是0到100的整数（或更大，取决于珠的大小和类型/大小）。

37、在一些实施方案中，r的范围为10至6.02 x 1016。在一些实施方案中，n的范围为约105至6.02 x 1017。

38、在一些实施方案中，只有相同的单个寡核苷酸索引的多个拷贝与捕获珠结合。

39、在一些实施方案中，x和q1是结合元件，捕获不同的靶标（例如，靶标扰动组分，如在测定过程中可由细胞释放的，和/或本文讨论的扰动寡核苷酸）。

40、在一些实施方案中，每个x和q1都是针对n个l-x-q-q1组中的每一个独立选择的。

41、在一些实施方案中，每个x和q1均选自与扰动寡核苷酸或裂解细胞释放的核酸或其他扰动组分上发现的功能互补的功能。

42、在一些实施方案中，每个q1都是寡核苷酸。

43、在一些实施方案中，x和q1之一捕获扰动寡核苷酸，另一者捕获扰动组分。

44、在一些实施方案中，提供具有式i-a的捕获珠：

45、(w)r -cb-[l´-x-q-q1-y]n ( i-a)

46、其中：

47、q是捕获珠索引；

48、x是键或捕获元件；

49、y是扰动组分pc或扰动寡核苷酸po；

50、q1是捕获元件，其中，当x不是键时，x和q1独立地是捕获元件，其中q1和x的每一个上的捕获元件与靶标上的相应功能基团互补；

51、y是扰动组分pc或扰动寡核苷酸；

52、l是可释放的接头；

53、且n、r和w的定义如上所述。

54、在一些实施方案中，提供由式i-b表示的寡核苷酸：

55、a-x1-q-q1-y (i-b)

56、其中：

57、pc是扰动组分；

58、q是捕获索引；

59、q1是与y上相应的官能团互补的捕获元件；

60、x1是与a上相应的官能团互补的捕获元件；

61、y是扰动组分pc或扰动寡核苷酸po；且

62、a是扰动组分pc或扰动寡核苷酸po。

63、在一些实施方案中，pc是mrna，且q1是poly-t。

64、在一些实施方案中，a是扰动寡核苷酸，且x1是所述扰动寡核苷酸上的官能团的互补基团。

65、在一些实施方案中，a是除mrna以外的核酸。

66、在一些实施方案中，提供了一种将来自溶液相捕获索引的序列数据与映射测定装置中的特定检测区域关联起来的方法，该溶液相捕获索引包含一个或多个捕获元件，其中至少一个所述元件结合有扰动组分，该方法包括：

67、a)通过可释放键，利用光学可检测标记或光学可检测标记集合（该标记对于该特定珠是独特的）对所述各捕获珠进行编码，其中所述捕获珠包含编码所述独特标记或标记集合的寡核苷酸索引，并进一步包含其上的捕获元件，其中所述捕获索引与该捕获珠可释放地结合；

68、b)将a)中编码的捕获珠添加到测定装置中要进行测定的检测区域；

69、c)生成一个注册表，其记录每个检测区域中的独特的珠；

70、d)在测定过程中，受到扰动的细胞存在的情况下进行检测；

71、e)裂解细胞并将至少一种核酸扰动组分捕获到捕获元件上；

72、f)从捕获珠中释放捕获索引；

73、g) 对捕获索引和核酸扰动组分进行测序，以提供捕获索引与捕获珠上标记之间的相关性；并且

74、h)通过参考注册表确定与该独特标记或标记集合相关的检测区域。

75、在一些实施方案中，相关性是通过图像进行的，该图像将每个光学可检测的捕获珠与映射上的一个位点对齐。

76、在一些实施方案中，所述捕获珠上的光学可检测标记可包括与该检测区域内待进行的测定相关的附加信息。 这些附加信息包括（仅作示例）：测定条件、测定期间细胞功能的变化、化合物合成中至少一个步骤所用的合成反应、合成过程中所用的一种或多种反应条件的标识、执行测定的技术人员、测定日期、测定溶液的ph值，或其组合。 每个检测区域中每个所述捕获珠上的独特光学可检测标记可以通过拍照、条形码、二维码等方式记录。

77、在一些实施方案中，可以通过添加到检测区域的微组分将此类附加信息包含在扰动珠上。 此类编码有此类附加信息的微组分在以下项中进行了描述：2023年5月9日提交的美国专利申请序列号18/195,049，题为“用于捕获基因组信息以进行功能和成像分析的高通量单细胞测定及其使用方法”，该专利申请要求享有2024年5月9日提交的美国临时专利申请序列号63/339,782的优先权；国际专利申请序列号pct/us24/23594，题为“用于多孔板测定装置的细胞转移组件”，申请日为2024年4月8日；和/或美国临时专利申请序列号63/494,621、63/494,628和63/494,636，均于2023年4月6日提交。上述每项申请的全部内容均以引用方式并入本文。

78、在一些实施方案中，微组分可以是不同的形状，也可以是相同形状但颜色不同，或者在置于其上不同的图像，例如不同的描述、条形码、信息、二维码等。在一些实施方案中，不同的微组分组合使用。 在一些实施方案中，不同的图像包含在同一微组分上，使得这些图像的组合构成一个独特的微组分。 参见，例如，图5c，其中该微组分含有4个象限，每个象限含有一个图像，例如图画、文字信息等；这些图像的组合对于该微组分而言是独特的。

79、在一些实施方案中，独特的微组分或独特微组分的组合可提供与给定检测区域独特地相联系的独特图像。 在一些实施方案中，每个使用的微组分都具有与其相联系的多个相同的独特寡核苷酸链。 在一些实施方案中，该独特链可逆地附接到微组分上。

80、在一些实施方案中，接头与独特的扰动珠组合使用。 在一些实施方案中，接头可逆地附接于微组分，且该接头以与用于扰动珠上的接头正交的释放方式释放。

81、在一些实施方案中，扰动珠上的扰动寡核苷酸仅编码由其合成的化合物的结构。在一些实施方案中，扰动寡核苷酸在其远端包含结合元件。 在一些实施方案中，微组分上的寡核苷酸链可具有结合至其的互补的寡核苷酸结合元件，从而允许与扰动寡核苷酸上的结合元件杂交。

82、在一些实施方案中，具有其上的独特标记或标记组合的单个微组分具有编码该标记的独特寡核苷酸链，该寡核苷酸链通过可切割的接头附接到微组分上，该可切割接头以与珠上使用的接头正交的方式进行切割。 在优选实施方案中，编码此类微组分的寡核苷酸链包含结合元件，该结合元件与扰动寡核苷酸远端上的结合元件互补，使得在释放时，来自微组分的寡核苷酸链将与扰动寡核苷酸远端的结合元件杂交。

83、在一些实施方案中，使用多个微组分，使得这些微组分的组合对于测定装置上的检测是独特的。 在一些实施方案中，微组分上的寡核苷酸链能够通过利用各组件上结合元件的独特组合，或者通过利用正交切割接头，与扰动寡核苷酸杂交，从而使所述寡核苷酸链能够被释放并依次与扰动寡核苷酸杂交。

84、在一些实施方案中，上述微组分可与标记或部分标记的扰动珠组合使用，该扰动珠编码或部分编码其上合成的化合物。  在一些实施方案中，用于合成化合物的反应序列中的一个或多个步骤由微组分或微组分的组合进行编码。  在一些实施方案中，独特的微组分的集合提供如上所述有关反应条件等的信息。

85、在一些实施方案中，通过拍照或录像记录独特的微组分或微组分组合，以使这些独特的微组分或微组分组合被发现的检查区域相关联。  在一些实施方案中，拍照或录像以数字形式记录。

86、此外，所述捕获珠上的标记或独特标记集合可以进一步汇编到所述库或注册表中，从而提供一套完整的信息，使技术人员将捕获珠与特定的检测区域相关联。  此外，捕获珠捕获的扰动组分将通过捕获珠索引被标识为源自该特定捕获珠。  反过来，通过映射将可检测标记与检测区域关联起来，可标识与该捕获珠一起使用的检测区域。  这使得能够追踪捕获的扰动组分，追溯回其来源的特定检测区域，以及识别引起扰动的扰动元件。

87、在一些实施方案中，只有相同的单个捕获珠索引寡核苷酸的多个拷贝与捕获珠结合。

88、在一些实施方案中，x和q1是相同的。

89、在一些实施方案中，x和q1是结合元件，用于捕获不同的靶标。  在一些实施方案中，x对扰动组分和/或扰动寡核苷酸的捕获是在切割可释放接头后实现的。

90、在一些实施方案中，捕获元件包含亲和素或链霉亲和素，扰动组分包含生物素；或者捕获元件包含生物素，扰动组分包含亲和素或链霉亲和素。  类似地，结合对可以是酶及其结合伴侣、细胞因子或趋化因子及其结合伴侣、抗体/其结合部分及其靶标。

91、当q上的捕获元件是寡核苷酸，并且其上已结合扰动寡核苷酸和/或核酸扰动组分（如mrna）时，x、q和q1的组合以及x1和q1捕获的组分允许一步进行多个信息组分的测序。

92、在一些实施方案中，扰动寡核苷酸还包含mrna捕获元件，使得在测定完成后，q1上附接有捕获珠索引-q1-扰动寡核苷酸-mrna。  例如，寡核苷酸索引（q）的远端附接的是poly-c基团（q1），而扰动寡核苷酸可以构建成一个末端具有poly-t基团，另一末端具有poly-g基团。  当扰动寡核苷酸从扰动珠上释放时，poly-g基团可以与q1的poly-c基团杂交。  当细胞裂解时，扰动寡核苷酸的poly-t基团将捕获裂解细胞释放的mrna的poly-a尾。

93、在一些实施方案中，捕获可以在捕获珠上进行，或在溶液中进行。

94、在一些实施方案中，扰动组分的捕获是在捕获珠上进行的。捕获珠具有式i-a：

95、(w)r -cb-[l-x-q-q1-y]n(i-a)

96、其中：

97、q是捕获珠索引；

98、x是键或捕获元件；

99、y是扰动组分pc或扰动寡核苷酸po；

100、q1是捕获元件，其中x和q1都独立地是捕获元件，当x是捕获元件时，其中q1和x的捕获元件都与靶标上的相应官能团互补（在这种情况下，对于q1而言，是扰动组分）；

101、其中

n、r、l和w的定义如上所述。

102、在一些实施方案中，接头是可释放的接头。

103、在一些实施方案中，当该接头被切割时，无论是在捕获扰动寡核苷酸和/或mrna之前还是之后，所得寡核苷酸由式i-b表示。

104、a-x1-q-q1-y (i-b)

105、其中，q、q1和y的定义如上所述，x1为捕获元件，y和a各自独立地为扰动组分或扰动寡核苷酸。 在一些实施方案中，扰动寡核苷酸在细胞裂解前被q1捕获。 然后，可释放键被切割，使x1能够在溶液相中捕获扰动组分a。 或者，捕获可以完全在溶液中进行。

106、无论哪种情况，捕获的扰动组分都通过捕获珠索引与捕获珠相关联，从而通过参考注册表来标识检查区域。

107、在上述描述中，对于n个l-x-q-q1组的每一个，x和q1的标识可以变化/不同。 然而，在所有情况下，捕获珠索引q都不会变化，因为它与珠上的标记或标记集合具有独特的关联性。 在一些实施方案中，扰动元件是扰动珠上的扰动化合物，该扰动化合物由扰动寡核苷酸编码。 在一些实施方案中，提供了一种用于标识测定装置中特定检测区域的方法，其中化合物扰动元件被释放，该方法包括：

108、a)在映射测定装置中多个检测区域的至少一部分进行测定，其中每个所述检测区域包含细胞、扰动珠（其包含扰动元件（例如化合物））以及对所述扰动元件（例如化合物）是独特的扰动寡核苷酸，和测定溶液；

109、b)在每个所述检测区域包含捕获珠，该捕获珠包含：

110、附接于所述珠上的光学可检测标记或光学可检测标记集合，所述标记独特标识所述捕获珠；

111、多个相同的捕获珠索引，所述索引对于所述捕获珠是独特的，并且任选地通过接头附接其上，其中所述索引编码独特标记或标记集合；和

112、附接于寡核苷酸索引的多个捕获元件；

113、c)通过将所述捕获珠上的独特光学可检测标记与所述映射的测定装置联系起来，从而关联和记录每个检测区域中的光学可检测标记或标记集合，从而在每个检测区域的捕获珠之间提供1:1的关系；

114、d)通过从所述扰动珠中释放至少一部分扰动元件来诱发扰动，从而使所述元件与所述细胞接触，并诱发所述细胞的功能变化，所述功能变化至少包括由所述细胞表达的一个或多个扰动组分所证明的变化；

115、e)从所述珠上释放所述独特的扰动寡核苷酸，并将所述扰动寡核苷酸捕获到捕获珠上；

116、f)裂解所述细胞，将所述扰动组分释放到所述测定溶液中，并将所述组分中的至少一种捕获到捕获珠索引或扰动寡核苷酸上；

117、g) 对包含捕获珠索引、扰动寡核苷酸和扰动组分的寡核苷酸进行测序；并且

118、h)通过参考上文c)中记录的关联，将捕获珠索引与特定检测区域的独特标记或标记集合关联起来，从而标识从中检索扰动组分的特定检测区域。

119、在一些实施方案中，上述方法还包括：

120、i)在测定期间中获取每个检测区域的图像；

121、j) 将图像与上文h)中定义的特定检测区域相关联；以及

122、k)评估测定期间由于细胞受到扰动而引起的细胞形态和/或细胞功能的变化。

123、在一些实施方案中，扰动元件无需包含扰动珠。 此类扰动元件可以包括但不限于，测定中的一种或多种条件，例如但不限于缓冲液、盐、ph值、温度、营养物质、氧气水平、氧化剂、物理应激和/或抗体、免疫细胞、sirna、病毒、细菌、真菌等的存在。 在这种情况下，由于缺少扰动珠，因此无需扰动寡核苷酸。 相反，可以将独特的寡核苷酸与一种或多种不同的非化合物扰动元件相联系（例如，通过可释放的接头与扰动珠联系，和/或在免疫细胞、病毒等的情况下与扰动元件本身联系，和/或通过将其添加至相应的检测区域），从而使基本原理保持不变——即释放（若为可释放附接）该扰动寡核苷酸（即编码该扰动元件和/或条件的寡核苷酸），并由捕获珠将其捕获，进而标识该扰动元件。

124、在一些实施方案中，所述捕获珠上的标记集合包含两个或多个标记。 在一些实施方案中，所述标记集合包含二至十五个成员。

125、在一些实施方案中，标记集合包含多个成员，这些成员组合起来标识它们所结合的捕获珠。

126、在一些实施方案中，扰动元件是从扰动珠释放的化合物。

127、在一些实施方案中，捕获珠在测定完成之前、期间或之后被定位在检测区域内。

128、在一些实施方案中，在从珠上移除寡核苷酸之前，先将上述捕获珠从检测区域移除。

129、在一些实施方案中，在测定之前将捕获珠添加到检测区域。 在一些实施方案中，在测定期间将捕获珠添加到检测区域。 在一些实施方案中，在测定完成后将捕获珠添加到检测区域。

130、在一些实施方案中，为给定的测定装置提供了注册表，该注册表含有每个捕获珠的每个独特标记或标记集和的记录、所述捕获珠在测定装置中所位于的具体检测区域以及在所述捕获珠上发现的独特寡核苷酸。

131、在一些实施方案中，注册表包含一张或多张数字照片，用于记录与每个检测区域联系的代码以及捕获珠上的光学可检测标记。

132、在一些实施方案中，标记集合包含具有相同颜色但不同强度的标记。

133、在一些实施方案中，数字摄影采用百万像素，其中每个检测区域的记录包含与其他检测区域不同的像素集合。 像素的使用使得能够区分细微的颜色色调以及同一种颜色在不同强度下的表现。

134、在一些实施方案中，提供了一种在包含多个检测区域的测定装置中进行测定的方法，该方法包括：

135、a.整合至各个待使用的检测区域：

136、a)扰动珠，其包含对该珠独特的相同扰动化合物的多个拷贝，和编码所述扰动化合物的多个相同的扰动寡核苷酸；

137、b)具有式i-a的捕获珠：

138、(w)r -cb-[l´-x-q-q1-y]n(i-a)

139、其中：

140、q是捕获珠索引；

141、x是键或q上的第二捕获元件；

142、q1是捕获元件，其中x和q1都独立地是捕获元件，当x是捕获元件时，其中q1和x上的捕获元件都与靶标上的相应官能团互补；

143、y是靶标，例如扰动组分和/或扰动寡核苷酸（例如，编码扰动元件，例如从扰动珠释放的扰动化合物）；

144、l´是可释放的接头；

145、w是光学可检测标记或光学可检测标记集合，所述标记独特标识捕获珠；

146、n表示与珠结合的多个此类(l´-x-q-q1)组，并且

147、r是0到100的整数（或更大，取决于捕获珠的大小和标记的类型/大小）。

148、c) 细胞；以及

149、d)测定溶液；

150、b.通过切断扰动珠上的至少一部分可释放接头来启动测定，从而释放每个检测区域中每个珠上的至少一部分扰动化合物和扰动寡核苷酸；

151、c.将扰动寡核苷酸捕获在所述捕获珠上的捕获元件上，其中所述扰动寡核苷酸任选地包含或被修饰为包含针对扰动组分的结合元件；

152、d.在测定完成后裂解细胞，从而从所述细胞中释放扰动组分，其中至少一部分通过x（当其为捕获元件时）或q1或扰动寡核苷酸被捕获在捕获珠上；

153、f. 分离捕获珠并切割可释放键，其中捕获珠索引及其上捕获的靶标被释放到溶液中；且

154、g.对捕获珠索引及其上捕获的寡核苷酸靶标进行测序。

155、在一些实施方案中，可释放的接头从捕获珠上的切割直到测定完成（包括细胞的裂解）后才会发生。

156、在一些实施方案中，所述捕获珠上的接头的切割是在切割扰动珠上的接头之后，但在裂解细胞之前进行的。

157、在一些实施方案中，切割捕获珠上的接头是在扰动寡核苷酸从扰动珠释放之前或同时进行，以便在测定溶液中进行扰动组分和/或扰动寡核苷酸的捕获。

158、在一些实施方案中，提供了一种制备捕获珠群体的方法，其中所述群体中的每个珠包含独特的标记或标记集合以及对该标记或标记集合特异的捕获珠索引，该方法包括：

159、a)选择经寡核苷酸结合位点功能化的珠群体；

160、b)将所述珠按大致相等的数量分装到多个反应容器中，其中反应容器的数量可以是任意整数（例如，最多12个）；

161、c)在每个反应容器中，将相同的第一标记施加至给定反应容器中的每个珠上，其中每个容器中使用的标记与其他容器中使用的标记不同；

162、d)将寡核苷酸链附接到所述寡核苷酸结合位点，其中对于共同容器中的每个珠，寡核苷酸链是相同的，但不同容器间的寡核苷酸链不同；

163、e)将珠汇集并混合直至均匀；

164、f)重复b)至e)的过程足够多次，使得所述群体中的几乎每个珠都被独特标记，并且几乎每个珠都包含独特的捕获珠索引，对于每个独立的反应步骤，所述捕获珠索引包含附接至先前的寡核苷酸链的寡核苷酸链。

165、在一些实施方案中，这种珠的群体的数量范围为10,000至10,000,000。