一种D-二聚体测定试剂盒及其制备方法与流程

本技术涉及医疗诊断的，尤其是涉及一种d-二聚体测定试剂盒及其制备方法。

背景技术：

1、d-二聚体是交联纤维蛋白在纤溶酶作用下产生的一种特异性降解产物，其水平升高是体内血栓形成和纤溶激活的标志。临床检测中，d-二聚体广泛用于深静脉血栓、肺栓塞以及弥散性血管内凝血等疾病的辅助诊断、排除和风险评估。现有d-二聚体测定试剂盒多采用免疫学检测原理，例如胶乳免疫比浊法。该类试剂通常包括缓冲液和包被抗d-二聚体抗体的胶乳试剂，样本中d-二聚体与抗体胶乳颗粒发生免疫凝集反应后引起浊度变化，由仪器读取反应信号并换算浓度。然而，现有液体胶乳试剂系统在长期储存和运输过程中，胶乳颗粒易发生自凝、聚集或抗体活性下降，导致空白背景升高、校准曲线漂移以及检测结果失真。同时，临床血液样本中可能存在异嗜性抗体、类风湿因子等干扰物质，易引发非特异性凝集，造成假阳性或假阴性结果。因此，有必要提供一种稳定性和抗干扰能力更好的d-二聚体测定试剂盒。

技术实现思路

1、为了提高测定试剂盒的稳定性和抗干扰能力，本技术提供一种d-二聚体测定试剂盒及其制备方法。

2、第一方面，本技术提供的一种d-二聚体测定试剂盒，采用如下的技术方案：

3、一种d-二聚体测定试剂盒，包括冻干试剂、缓冲液、补充试剂、样本稀释液和校准品；所述冻干试剂的原料包括包被鼠抗d-d抗体的胶乳颗粒、tris、牛血清白蛋白、聚乙二醇6000和防腐剂；所述缓冲液包括tris、氯化钠和防腐剂；所述补充试剂包括异嗜性抗体阻断剂、氯化钠和防腐剂；所述样本稀释液包括牛血清白蛋白、氯化钠和防腐剂；所述校准品为含d-d的人血浆冻干品。

4、通过采用上述技术方案，冻干试剂中的包被鼠抗d-d抗体的胶乳颗粒用于与样本中的d-二聚体发生特异性免疫凝集反应；tris维持反应体系ph稳定；牛血清白蛋白保护抗体活性并降低非特异吸附；聚乙二醇6000有助于维持冻干体系成型和复溶后的胶乳分散性；防腐剂抑制微生物污染；补充试剂中的异嗜性抗体阻断剂能够降低异嗜性抗体、类风湿因子等导致的非特异性凝集，从而减少假阳性或假阴性结果；校准品采用含d-d的人血浆冻干品，有利于提高校准体系的基质一致性和保存稳定性，因此该组合能够提高测定试剂盒的稳定性、准确性、抗干扰能力。

5、在一个具体的可实施方案中，所述冻干试剂由冻干前试剂液经分装冻干制得，所述冻干前试剂液按1l计，包括包被鼠抗d-d抗体的胶乳颗粒10-20ml、tris 20-100mmol/l、牛血清白蛋白0.2-1.0g/l、聚乙二醇6000 5-40g/l、防腐剂0.1-5.0g/l，余量为水。

6、通过采用上述技术方案，利用上述配比，该配方范围使冻干试剂在复溶后兼具较好的反应灵敏度、胶乳分散稳定性、抗体活性保持率和储存稳定性。

7、在一个具体的可实施方案中，所述补充试剂中异嗜性抗体阻断剂的浓度为0.1-2.0ml/l。

8、通过采用上述技术方案，通过将异嗜性抗体阻断剂的浓度控制在0.1-2.0ml/l范围内，能够有效阻断样本中异嗜性抗体、人抗鼠抗体、类风湿因子等干扰物与检测试剂中鼠源性抗体之间的非特异性结合，降低非特异性凝集反应。

9、在一个具体的可实施方案中，所述缓冲液中tris浓度为20-100mmol/l，氯化钠浓度为7-11g/l。

10、通过采用上述技术方案，限定了缓冲液中tris、氯化钠的浓度，提高了反应体系ph稳定性和离子强度稳定性，使检测结果具有较好的重复性和准确性。

11、在一个具体的可实施方案中，所述样本稀释液中牛血清白蛋白的浓度为2-10g/l，氯化钠的浓度为7-11g/l。

12、通过采用上述技术方案，牛血清白蛋白浓度控制在2-10g/l范围内，能够在样本稀释过程中起到蛋白保护和封闭作用，降低样本中蛋白、脂质、异嗜性抗体等成分对胶乳颗粒和抗体的非特异性吸附，从而提高稀释后样本的基质稳定性。

13、在一个具体的可实施方案中，所述含d-d的人血浆冻干品的原料包括d-d校准原料、tris-hcl、氯化钠、叠氮钠、牛血清白蛋白、蔗糖和甘露醇。

14、在一个具体的可实施方案中，所述含d-d的人血浆冻干品的制备方法包括以下步骤：将tris-hcl、氯化钠、叠氮钠、牛血清白蛋白、蔗糖和甘露醇加入超纯水中，接着加入d-d校准原料，搅拌混合均匀，然后再加入超纯水进行定容，最后先按每瓶1.0ml分装，再进行冻干，出料，得到含d-d的人血浆冻干品。

15、通过采用上述技术方案，先将tris-hcl、氯化钠、叠氮钠、牛血清白蛋白、蔗糖和甘露醇溶解形成保护性基质，再加入d-d校准原料并混匀定容，可以使d-d抗原充分分散在保护体系中，避免d-d校准原料直接冻干导致局部浓度过高、蛋白变性或复溶不均匀；随后进行分装冻干处理，能够降低水分含量，提高校准品在储存和运输过程中的稳定性，并使校准品复溶后具有较好的均一性和浓度准确性。

16、第二方面，本技术提供的一种d-二聚体测定试剂盒的制备方法，采用如下的技术方案：

17、一种d-二聚体测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

18、冻干试剂制备：向纯化水中依次加入tris、防腐剂、聚乙二醇6000、牛血清白蛋白，搅拌，接着调节ph为6.5-7.5，在20-30℃下混合后，将体系冷却至2-10℃，加入包被鼠抗d-d抗体的胶乳颗粒，搅拌，定容，先按每瓶4.0ml分装，再进行冻干，得到冻干试剂；

19、缓冲液制备：向纯化水中依次加入tris、氯化钠和防腐剂，搅拌，接着调节ph为6.5-7.5，温度为20-30℃，定容，得到缓冲液；

20、补充试剂制备：向纯化水中依次加入氯化钠、防腐剂，接着调节ph为6.4-7.4，在20-30℃下混合后，将体系冷却至2-10℃，加入异嗜性抗体阻断剂，搅拌，定容，得到补充试剂；

21、样本稀释液制备：向纯化水中依次加入氯化钠、牛血清白蛋白、防腐剂，搅拌，接着调节ph为6.5-7.5，温度为20-30℃，定容，得到样本稀释液；

22、组装：先将缓冲液、补充试剂、样本稀释液分别进行分装，再与冻干试剂、校准品组合，得到d-二聚体测定试剂盒。

23、通过采用上述技术方案，该制备方法能够减少制备过程中的胶乳聚集、抗体失活和组分间不利相互作用，提高试剂批间一致性、冻干成功率和检测稳定性。

24、在一个具体的可实施方案中，所述冻干包括预冻、升华干燥和解析干燥；所述预冻的温度为-35℃至-25℃，保温240-360min；所述升华干燥包括在-35℃至0℃、真空度1-10pa条件下进行；所述解析干燥包括在15-35℃、真空度0.5-2pa条件下进行。

25、通过采用上述技术方案，该冻干工艺能够获得外观良好、含水量低、复溶性好、胶乳颗粒分散稳定、抗体活性保持率高的冻干试剂，从而提高试剂盒在2-8℃长期保存、运输和复溶开瓶后的稳定性。

26、综上所述，本技术包括以下至少一种有益技术效果：

27、本技术中冻干试剂中的包被鼠抗d-d抗体的胶乳颗粒用于与样本中的d-二聚体发生特异性免疫凝集反应；tris维持反应体系ph稳定；牛血清白蛋白保护抗体活性并降低非特异吸附；聚乙二醇6000有助于维持冻干体系成型和复溶后的胶乳分散性；防腐剂抑制微生物污染；补充试剂中的异嗜性抗体阻断剂能够降低异嗜性抗体、类风湿因子等导致的非特异性凝集，从而减少假阳性或假阴性结果；校准品采用含d-d的人血浆冻干品，有利于提高校准体系的基质一致性和保存稳定性，因此该组合能够提高测定试剂盒的稳定性、准确性、抗干扰能力；

28、本技术中通过将异嗜性抗体阻断剂的浓度控制在0.1-2.0ml/l范围内，能够有效阻断样本中异嗜性抗体、人抗鼠抗体、类风湿因子等干扰物与检测试剂中鼠源性抗体之间的非特异性结合，降低非特异性凝集反应；

29、本技术中的方法，该制备方法能够减少制备过程中的胶乳聚集、抗体失活和组分间不利相互作用，提高试剂批间一致性、冻干成功率和检测稳定性。