一种氮和/或碳的稳定同位素丰度的质谱定量检测方法

本发明属于质谱定量检测，具体涉及一种氮和/或碳的稳定同位素丰度的质谱定量检测方法。

背景技术：

1、稳定同位素（如15n、13c等）示踪技术已成为一种强大的研究工具，被广泛应用于医学、生物地球化学循环、食物网结构、生物迁徙及环境变化等诸多研究领域。元素分析仪-同位素比质谱仪（elemental analyzer-isotope ratio mass spectrometry，ea-irms）是测定固体和液体样品中c、n、o、h同位素组成的标准技术。然而，在面对极其珍贵或微量的生物样本时（如单个昆虫、微生物样本、考古残留物或法医微量证据），传统ea-irms方法面临挑战。

2、样品量有限是首要障碍。由于初始氦气载气流速（100 ml/min）与进入离子源时的流速（0.3 ml/min）存在显著差异，导致燃烧生成的目标气体损失约99.7%，样品利用率仅为0.3%。这种稀释效应严重限制了实际可用的样品量。为获得足够信噪比，确保质谱仪产生足够强度的离子流以获得高精度数据，ea-irms分析通常推荐：对于氮元素，需要20-90 μg的氮，以产生1000-6000 mv的信号强度；对于碳元素，需要25-50 μg的碳，以产生1000-6000mv的信号强度。然而对于许多稀有的考古样本、微小的刑侦样品和微量的生物样本而言，获取足够的材料是比较困难的。同时，记忆效应（memory effect）是ea-irms中一个众所周知的难题，特别是在连续分析同位素比值差异巨大的样品时。前一个样品在反应管及传输系统中的残留，会污染后续样品，导致其测量值发生漂移，严重降低测定的准确度和精密度。对于微量样品，其信号响应强度较低，受记忆效应的相对影响更为突出。

3、为提升样品传输效率并降低样品量需求，已有研究尝试对仪器进行改进。例如，polissar等通过低温捕集将样品燃烧气转移至低流速氦气流，结合毛细管柱送入质谱仪，实现了对 0.35 μg以上氮元素的高精度测量（优于1‰）（polissar pj, fulton jm,junium ck, turich cc, freeman kh. measurement of 13c and 15n isotopiccomposition on nanomolar quantities of c and n[j]. analytical chemistry,2009, 81(2): 755-763. doi: 10.1021/ac801370c.）。类似地，尹希杰等，通过缩小元素分析仪氧化管、还原管的管径，优化色谱柱条件，降低载气流速，降低氮同位素的检出限（尹希杰, 刘维维, 王永涛, 苏静, 李廷伟. 元素分析-同位素质谱联用测定微量氮元素同位素方法研究[j]. 质谱学报, 2021, 42(03): 346-352. doi: 10.7538/zpxb.2020.0051.）。然而，此类改进通常涉及硬件改造，如增设液氮冷阱（fry b, garritt r, tholke k,neill c, michener rh, mersch fj, brand w. cryoflow: cryofocusing nanomoleamounts of co2, n2, and so2 from an elemental analyzer for stable isotopicanalysis[j]. rapid communications in mass spectrometry, 1996, 10: 953-958.doi: 10.1002/(sici)1097-0231(19960610)10:8<953::aid-rcm534>3.0.co;2-0.）或减小反应器、水阱及传输管线等流路组件的直径（baczynski aa, brodie cr, kracht o,freeman kh. sequential measurement of 13c, 15n, and 34s isotopic composition onnanomolar quantities of carbon, nitrogen, and sulfur using nano-elementalanalysis/isotope ratio mass spectrometry[j]. rapid communications in massspectrometry, 2023, 37: e9444. doi: 10.1002/rcm.9444.），不仅操作复杂，也提高了技术门槛与成本。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明建立了一种氮和/或碳的稳定同位素（15n和/或13c）丰度的质谱定量检测方法。该方法是将15n丰度和/或13c丰度（以下以“at15n%”表示15n的丰度，以“at13c%”表示13c的丰度）已知的标准品，以及15n丰度和/或13c丰度未知的待测样品，分别与天然15n丰度和/或天然13c丰度的基质进行定量混合，使基质和样品混合物（以下以“基质-样品混合物”表示，包括：基质-标准品混合物，基质-待测样品混合物）中氮元素和/或碳元素的质量与at15n%和/或at13c%均处于仪器测量范围内，采用ea-irms测定基质-样品混合物的氮稳定同位素比（15n/14n）和/或碳稳定同位素比（13c/12c）。利用基质-标准品混合物的氮稳定同位素比和/或碳稳定同位素比的测定结果拟合标准曲线。继而根据基质-待测样品混合物的氮稳定同位素比和/或碳稳定同位素比的测定结果，利用标准曲线计算得到待测样品的15n丰度（at15n%）和/或13c丰度（at13c%）。

2、本领域公知，“天然丰度”指自然界中某一同位素在该元素所有同位素中所占的原子百分比。自然界中，15n的天然丰度为0.366%，13c的天然丰度为1.111%。“丰度”指特定物质中某一同位素在该元素所有同位素中所占的原子百分比。在本发明中，以“at15n%”表示15n的丰度，以“at14n%”表示14n的丰度，以“at13c%”表示13c的丰度，以“at12c%”表示12c的丰度。

3、在本发明中，“15n/14n”表示氮的15n和14n的同位素原子比，也简称为15n和14n的同位素比或氮稳定同位素比；“13c/12c”表示碳的13c和12c的同位素原子比，也简称为13c和12c的同位素比或碳稳定同位素比。

4、在本发明中，“样品”是相对于“基质”而言的，包括了标准品、待测样品、进入仪器的被检测物质。

5、在本发明中，“基质-样品混合物”表示由基质和样品混合后形成的混合物，包括基质和标准品混合后形成的混合物，以“基质-标准品混合物”表示；基质和待测样品混合后形成的混合物，以“基质-待测样品混合物”表示。

6、在本发明中，元素分析仪-同位素比质谱仪（elemental analyzer-isotope ratiomass spectrometry）分析法用ea-irms指代。

7、本发明的技术方案如下：

8、一种样品中氮和/或碳的稳定同位素丰度的质谱定量检测方法，其包括：

9、1）将15n丰度和/或13c丰度已知且15n丰度和/或13c丰度不同的系列标准品，分别以相同的质量与15n天然丰度和/或13c天然丰度的基质以相同的质量比进行定量混合，使基质的氮元素质量和标准品的氮元素质量的质量比≥20/1，且基质-标准品混合物中氮元素的总质量≤100.00μg，和/或，使基质的碳元素质量和标准品的碳元素质量的质量比≥8.3/1，且基质-标准品混合物中碳元素的总质量≤120.00μg，得到15n丰度和/或13c丰度不同的系列的基质-标准品混合物；

10、将15n丰度和/或13c丰度未知的待测样品与15n天然丰度和/或13c天然丰度的基质进行定量混合，使基质的氮元素质量和待测样品的氮元素质量的质量比与上述“基质的氮元素质量和标准品的氮元素质量的质量比”的比值相同，且基质-待测样品混合物中氮元素的总质量≤100.00μg，和/或，使基质的碳元素质量和待测样品的碳元素质量的质量比与上述“基质的碳元素质量和标准品的碳元素质量的质量比”的比值相同，且基质-待测样品混合物中碳元素的总质量≤120.00μg，得到基质-待测样品混合物；

11、2）采用ea-irms测定系列的基质-标准品混合物的氮稳定同位素比（15n/14n）和/或碳稳定同位素比（13c/12c）；

12、3）根据系列的基质-标准品混合物的氮稳定同位素比和/或碳稳定同位素比的测定结果，与其对应的标准品的15n丰度和/或13c丰度，拟合标准曲线；

13、4）采用ea-irms测定基质-待测样品混合物的氮稳定同位素比（15n/14n）和/或碳稳定同位素比（13c/12c）；

14、5）根据所述标准曲线，以测定的基质-待测样品混合物的氮稳定同位素比（15n/14n）和/或碳稳定同位素比（13c/12c）计算得到待测样品的15n丰度和/或13c丰度。

15、本领域技术人员可知，根据本发明，上述步骤2）、步骤3）和步骤4）的顺序可以调换，即，可以先测定基质-标准品混合物的15n/14n和/或13c/12c，然后拟合标准曲线，再测定基质-待测样品混合物的15n/14n和/或13c/12c；也可以是：先测定基质-标准品混合物的15n/14n和/或13c/12c，再测定基质-待测样品混合物的15n/14n和/或13c/12c，然后拟合标准曲线；还可以是：先测定基质-待测样品混合物的15n/14n和/或13c/12c，再测定基质-标准品混合物的15n/14n和/或13c/12c，然后拟合标准曲线。

16、在前期工作中获得，当进入仪器的被检测品中15n丰度（at15n%）不超过4.800%，13c丰度（at13c%）不超过11.000%时，15n和/或13c在检测仪器管路中的残留和记忆效应均较低，不会干扰后续样品的测定。因此根据本发明，应使基质-标准品混合物以及基质-待测样品混合物各自的at15n%均不超过4.800%，和/或，各自的at13c%均不超过11.000%。

17、根据本发明，对于基质-标准品混合物以及基质-待测样品混合物而言，其各自的氮元素总质量均最好≤100.00μg，优选为30~70μg；其各自的碳元素总质量均最好≤120.00μg，优选为40~100μg。

18、根据本发明，由于本方法检测和相应的计算中只涉及到元素本身，与基质和标准品使用的化学物质的具体组成无关，因此在配制基质-标准品混合物以及基质-待测样品混合物时，依据相应的元素质量比考虑即可。并且，鉴于相对于使用的物质总量而言，15n和14n的相对原子质量间的差异较小，13c和12c的相对原子质量间的差异较小，在按照本发明方法进行定量检测时，对化学物质称量、元素质量计算等时，都可以按照14n和/或12c的相对原子质量进行计算。

19、具体而言，对于配制的基质-标准品混合物以及基质-待测样品混合物而言，它们的基质氮元素和样品氮元素的质量比相同，且均应≥20/1，优选为92.44/1~20/1，更优为50/1~20/1。发明人通过研究发现，基质氮元素和样品氮元素的质量比≥20/1，当样品的15n丰度at15n%在0~100%变动时，基质-样品混合物的氮同位素比15n/14n在0~0.05范围内单调递增，且其15n丰度at15n%不会超过4.800%，15n在检测仪器管路中的残留和记忆效应均较低，不会干扰后续样品的测定。而且这样的情况下，氮同位素比15n/14n与样品的15n丰度近似符合的直线函数关系，有利于用简单线性回归拟合标准曲线。

20、对于配制的基质-标准品混合物以及基质-待测样品混合物而言，它们的基质碳元素和样品碳元素的质量比相同，且均应≥8.3/1，优选为91.45/1~8.3/1，优选为50/1~8.3/1，更优为20/1~8.3/1。发明人通过研究发现，基质碳元素和样品碳元素的质量比≥8.3/1，当样品的13c丰度at13c%在0~100%变动时，基质-样品混合物的碳同位素比13c/12c在0~0.1范围内单调递增，且其13c丰度at13c%亦不会超过11.000%，13c在检测仪器管路中的残留和记忆效应均较低，不会干扰后续样品的测定。而且碳同位素比13c/12c与13c丰度亦近似符合的直线函数关系，有利于用简单线性回归拟合标准曲线。

21、根据本发明，作为基质的化学物质可以是含有氮元素和/或碳元素的任何化学物质，优选氮元素和/或碳元素含量较高、理化性质稳定且易于获得的化学物质，例如：尿素、氨基酸（例如甘氨酸等）、核碱基（例如尿嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶）、硝酸盐（例如硝酸钠等）、碳酸盐（例如碳酸钠等）等。可以单一化学物质为基质，也可以将两种或两种以上的化学物质混合后作为基质，只要混合的化学物质之间不发生化学反应即可。基质中各元素的丰度均为天然丰度。

22、可以根据检测目的选择适当的基质。例如：如果只检测样品的氮稳定同位素丰度，可以尿素、氨基酸（例如甘氨酸等）、核碱基等为基质，也可以使用只含有氮元素的物质例如硝酸盐为基质。如果只检测样品的碳稳定同位素丰度，可以尿素、氨基酸（例如甘氨酸等）、核碱基等为基质，也可以使用只含有碳元素的物质例如碳酸盐为基质。当然，如果要检测样品的氮元素稳定同位素丰度和碳元素的稳定同位素丰度，可以将氮元素和碳元素的稳定同位素丰度检测分开进行，一次检测操作只检测一种元素的；也可以一次检测操作中将氮元素和碳元素的稳定同位素丰度同时检测出来，此时，基质中最好是同时含有氮元素和碳元素，例如，可以单一的尿素、氨基酸（例如甘氨酸等）、核碱基等为基质，也可以尿素和氨基酸（例如甘氨酸等）的混合物为基质，或将只含有氮元素的物质例如硝酸盐和只含有碳元素的物质例如碳酸盐混合后作为基质使用。

23、在本发明的一些实施方式中，基质中含有氮元素和碳元素，可以将基质中的氮元素和碳元素的原子数比设为1:(0.9~1.3)，例如为1:1，1:1.1，1:1.2等，这样氮元素和碳元素的质量比会在1:1左右，便于检测中的计算换算。在本发明的一个具体实施方案中，使用尿素和甘氨酸的混合物作为基质，优选将尿素和甘氨酸按照物质的量比（即摩尔比）1:(1.9~2.1)形成混合物作为基质。

24、作为标准品的化学物质可以是含有氮元素和/或碳元素的任何化学物质，优选理化性质稳定且易于制备成氮元素和/或碳元素为稳定同位素（即15n和13c）形式的化学物质，例如：尿素、氨基酸（例如甘氨酸、丝氨酸等）、核碱基（例如尿嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶）、硝酸盐（例如硝酸钠等）、碳酸盐（例如碳酸钠等）等。

25、根据本发明，所述系列标准品的15n丰度可以是0.366%~99.000%之间的等于或多于2个的不同的丰度值。根据本发明，所述系列标准品的13c丰度可以是1.111%~99.000%之间的等于或多于2个的不同的丰度值。例如每个元素的丰度可以是3个不同的丰度值，4个不同的丰度值，5个不同的丰度值，6个不同的丰度值，7个不同的丰度值等。从操作便宜性和拟合曲线的准确性出发，优选为4-8个不同的丰度值。

26、可以直接用15n标记率和/或13c标记率不同的同一化学物质组成所述系列标准品，例如将15n标记率分别为1%、5%、10%、20%和60%的5种硝酸钠（相当于其15n丰度分别为1%、5%、10%、20%和60%）作为系列标准品。

27、也可以用元素丰度均为天然丰度的化学物质与15n丰度为某固定值和/或13c丰度为某固定值的同一化学物质，将两者以不同的比例混合，形成不同15n丰度和/或不同13c丰度的系列混合物，以所述系列混合物作为所述系列标准品，例如，取15n丰度为天然丰度的硝酸钠，与15n丰度为99%的硝酸钠，将两者分别按照10:1，5:1，2:1，1:1和0.5:1的质量比进行混合，对应得到15n丰度为9.239%、16.648%、32.992%、49.399%和65.869%的系列混合物，将该系列混合物作为系列标准品。

28、上述15n丰度为某固定值的同一化学物质中的氮元素被15n标记，使15n丰度高于其天然丰度，优选其15n丰度是其天然丰度的至少10倍，例如至少20倍，至少30倍，至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少110倍、至少120倍，至少130倍，至少140倍、至少150倍、至少160倍、至少170倍、至少180倍、至少190倍、至少200倍、至少210、至少230倍，至少240倍、至少250倍、至少260倍、至少270倍等。优选其15n丰度至少为4.000%，例如为10.000%、20.000%、30.000%、40.000%、50.000%、60.000%、70.000%、80.000%、90.000%、91.000%、92.000%、93.000%、94.000%、95.000%、96.000%、97.000%、98.000%、99.000%等等。更优选其15n丰度本质上为100%。

29、同样的，上述13c丰度为某固定值的同一化学物质中的碳元素被13c标记，使13c丰度高于其天然丰度，优选其13c丰度是其天然丰度的至少10倍，例如至少20倍，至少30倍，至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍等。优选其13c丰度至少为12.000%，例如为12.000%、20.000%、30.000%、40.000%、50.000%、60.000%、70.000%、80.000%、90.000%、91.000%、92.000%、93.000%、94.000%、95.000%、96.000%、97.000%、98.000%、99.000%等等。更优选其13c丰度本质上为100%。

30、根据本发明，所述“本质上为100%”是指该化学试剂中，其氮元素理论上都是15n和/或其碳元素理论上都是13c。

31、根据本发明，用作基质和标准品的化学物质可以相同，除了两者在应用时，其中的氮元素和/或碳元素的稳定同位素15n和/或13c丰度是天然丰度的和非天然丰度的不同之外。

32、根据本发明，基质和标准品的化学物质也可以不相同。

33、同样，标准品可以是单一化学物质，也可以是两种或两种以上的化学物质混合后作为标准品，只要混合的化学物质之间不发生化学反应即可。

34、当待测样品的化学组成是已知的，只是不知其氮元素和/或碳元素的稳定同位素含量时，可以选择与待测样品化学组成相同的化学物质作为制备标准品的化学物质，这样能方便本发明检测的操作过程，即，可以按照基质-标准品混合物配制时使用的标准品质量和基质质量，对应取相同质量的待测样品与相同质量的基质配制基质-待测样品混合物，例如：取10μg标准品和50μg基质配制基质-标准品混合物，同样取10μg待测样品和50μg基质配制基质-待测样品混合物。

35、也可以根据待测样品中氮元素和/或碳元素的质量百分比，选择氮元素和/或碳元素质量百分比与之接近的化合物作为标准品，这样也能使计算相对简化。对于待测样品中的氮元素和/或碳元素的质量百分比，可以先用未被稳定同位素标记的待测样品，采用常规ea-irms方法测量出样品中氮元素和/或碳元素的质量百分比。对于dna和rna，其氮元素和碳元素的质量百分比是相对固定的，则可以直接通过理论计算获得，即根据碱基a、t、c、g和u的氮元素和碳元素的质量百分比计算近似值。

36、在本发明的一些实施方式中，对于检测dna和rna中的氮稳定同位素比和/或碳稳定同位素比，使用l-丝氨酸作为制备系列标准品的化学物质。在此情况下，以15n丰度不同和/或13c丰度不同的l-丝氨酸作为系列标准品。

37、根据本发明，可以采用非线性回归拟合标准曲线y=(cx+d)/(ax+b)（其中y为基质-标准品的氮元素同位素比15n/14n，x为标准品的15n丰度，或者，y为基质-标准品的碳元素同位素比13c/12c，x为标准品的13c丰度）和简单线性回归拟合标准曲线y=kx+b（其中y为基质-标准品的氮元素同位素比15n/14n，x为标准品的15n丰度，或者，y为基质-标准品的碳元素同位素比13c/12c，x为标准品的13c丰度），在单调递增的区间内，两者效果相当。从准确性上讲，非线性回归拟合标准曲线更优，从简洁易用上讲，简单线性回归拟合标准曲线更优，可以根据目的需要来选择。

38、在本发明的一个具体实施方式中，在将基质-标准品混合物以及基质-待测样品混合物中的基质氮元素和样品氮元素的质量比均配制为mn/mn=20/1时，通过非线性回归拟合的氮元素同位素比的标准曲线为：y=(0.0846x+0.7333)/(0.0243x+204.4000)，其中y为混合物中氮元素同位素比15n/14n，x为样品的15n丰度。因此，在将基质-待测样品混合物中的基质氮元素和样品氮元素的质量比配制为mn/mn=20/1时，就可以直接使用上述的标准曲线，采用ea-irms测定基质-待测样品混合物的氮稳定同位素比15n/14n，计算得到待测样品的15n丰度，而无需配制系列的基质-标准品混合物，采用ea-irms测定系列的基质-标准品混合物的15n/14n，建立标准曲线的步骤了。

39、在本发明的一个具体实施方式中，在将基质-标准品混合物以及基质-待测样品混合物中的基质氮元素和样品氮元素的质量比均配制为mn/mn=20/1时，通过简单线性回归拟合的氮元素同位素比的标准曲线为：y=0.0004x+0.0036，其中y为混合物中氮元素同位素比15n/14n，x为样品的15n丰度。因此，在将基质-待测样品混合物中的基质氮元素和样品氮元素的质量比配制为mn/mn=20/1时，就可以直接使用上述的标准曲线，采用ea-irms测定基质-待测样品混合物的氮稳定同位素比15n/14n，计算得到待测样品的15n丰度，而无需配制系列的基质-标准品混合物，采用ea-irms测定系列的基质-标准品混合物的15n/14n，建立标准曲线的步骤了。

40、在本发明的一个具体实施方式中，在将基质-标准品混合物以及基质-待测样品混合物中的基质碳元素和样品碳元素的质量比均配制为mc/mc=8.3/1时，通过非线性回归拟合的碳元素同位素比的标准曲线为：y=(0.1735x+2.0357)/(-0.1206x+201.7000)，其中y为混合物中碳元素同位素比13c/12c，x为样品的13c丰度。因此，在将基质-待测样品混合物中的基质碳元素和样品碳元素的质量比配制为mc/mc=8.3/1时，就可以直接使用上述的标准曲线，采用ea-irms测定基质-待测样品混合物的碳稳定同位素比13c/12c，计算得到待测样品的13c丰度，而无需配制系列的基质-标准品混合物，采用ea-irms测定系列的基质-标准品混合物的13c/12c，建立标准曲线的步骤了。

41、在本发明的一个具体实施方式中，在将基质-标准品混合物以及基质-待测样品混合物中的基质碳元素和样品碳元素的质量比均配制为mc/mc=8.3/1时，通过简单线性回归拟合的碳元素同位素比的标准曲线为：y=0.0009x+0.0096，其中y为混合物中碳元素同位素比13c/12c，x为样品的13c丰度。因此，在将基质-待测样品混合物中的基质碳元素和样品碳元素的质量比配制为mc/mc=8.3/1时，就可以直接使用上述的标准曲线，采用ea-irms测定基质-待测样品混合物的碳稳定同位素比13c/12c，计算得到待测样品的13c丰度，而无需配制系列的基质-标准品混合物，采用ea-irms测定系列的基质-标准品混合物的13c/12c，建立标准曲线的步骤了。

42、配制基质-标准品混合物和基质-待测样品混合物的具体方法和操作过程没有特别的限制，只要根据检测时使用的装样器皿的容积，选择使用的基质、标准品及其在水中的溶解度，配制出的基质-标准品混合物和基质-待测样品混合物中氮元素的质量比和/或碳元素的质量比，混合物中氮元素总质量和/或碳元素总质量符合前述要求，按照常规的实验方法进行配制即可。

43、在本发明的一个实施方式中，使用3.5×9.0 mm液体锡囊作为检测用容器时，按照尿素1.072 μg/μl和甘氨酸2.679 μg/μl配制以尿素-甘氨酸混合物为基质的基质水溶液，按照l-丝氨酸1.00 μg/μl配制系列标准品的水溶液。

44、根据本发明，对于氮稳定同位素丰度测定，本发明的定量测定方法，优选用于at15n%大于1.000%的待测样品，更优选用于at15n%大于等于4.800%的待测样品。

45、对于碳稳定同位素丰度测定，本发明的定量测定方法，优选用于at13c%大于1.741%的待测样品，更优选用于at13c%大于等于11.000%的待测样品。

46、根据本发明，ea-irms测定条件可以使用本领域中常规的元素测定条件，本领域技术人员可根据经验进行调节，且不会对检测结果产生实质影响。在本发明的一个实施方式中，ea-irms测定条件为：ea反应炉温度设为960 ℃，色谱柱温度设为65 ℃，载气（he）气体流量为100 ml/min；单个分析循环时间为500 s，采样延迟为13 s，进样2 s后向反应管中脉冲注入氧气。irms设为连续采集模式，积分时间为200 ms，峰对中前延迟采集15 s，峰对中后延迟采集30 s；采用动态稀释模式，n2和co2的稀释参考信号强度均设定为6000 mv。

47、本发明还提供一种用于氮和/或碳的稳定同位素丰度的质谱定量检测方法的试剂盒，其含有作为基质的化学试剂，和作为标准品的化学试剂。

48、根据本发明，作为基质的化学试剂含有氮元素和/或碳元素，且其氮元素的15n和/或碳元素的13c均为天然丰度。

49、根据本发明，作为标准品的化学试剂含有氮元素和/或碳元素，且其氮元素的15n丰度和/或碳元素的13c丰度均高于其各自的天然丰度。

50、优选作为标准品的化学试剂的15n丰度是其天然丰度的至少10倍，例如至少20倍，至少30倍，至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少110倍、至少120倍，至少130倍，至少140倍、至少150倍、至少160倍、至少170倍、至少180倍、至少190倍、至少200倍、至少210、至少230倍，至少240倍、至少250倍、至少260倍、至少270倍等。

51、优选作为标准品的化学试剂的15n丰度至少为4.000%，例如为10.000%、20.000%、30.000%、40.000%、50.000%、60.000%、70.000%、80.000%、90.000%、91.000%、92.000%、93.000%、94.000%、95.000%、96.000%、97.000%、98.000%、99.000%等等，更优选15n丰度本质上为100%。

52、优选作为标准品的化学试剂的13c丰度是其天然丰度的至少10倍，例如至少20倍，至少30倍，至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍等。

53、优选作为标准品的化学试剂的13c丰度至少为12.000%，例如为12.000%、20.000%、30.000%、40.000%、50.000%、60.000%、70.000%、80.000%、90.000%、91.000%、92.000%、93.000%、94.000%、95.000%、96.000%、97.000%、98.000%、99.000%等等，更优选13c丰度本质上为100%。

54、在本发明的一个实施方式中，作为标准品的化学试剂是一系列的氮元素被15n标记和/或碳元素被13c标记的15n丰度和/或13c丰度不同的同一化学物质，所述“一系列”是指具有等于或大于2个不同的15n丰度，和/或，等于或大于2个不同的13c丰度。这种情况下，所述化学试剂直接作为本发明检测方法中的系列标准品使用。

55、在本发明的一个实施方式中，作为标准品的化学试剂是15n丰度为某个固定值且高于其天然丰度和/或13c丰度为某个固定值且高于其天然丰度的化学物质。这种情况下，所述作为标准品的化学试剂需要与化学组成相同但元素丰度均为天然丰度的同一化学物质，以不同比例混合，形成不同15n丰度和/或不同13c丰度的系列混合物，以所述系列混合物作为本发明检测方法中使用的系列标准品。

56、根据本发明，作为基质的化学试剂可以是含有氮元素和/或碳元素的任何化学物质，优选氮元素和/或碳元素含量较高、理化性质稳定且易于获得的化学物质，例如：尿素、氨基酸（例如甘氨酸等）、核碱基（例如尿嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶）、硝酸盐（例如硝酸钠等）、碳酸盐（例如碳酸钠等）等。可以单一化学物质为基质，也可以将两种或两种以上的化学物质混合后作为基质，只要混合的化学物质之间不发生化学反应即可。

57、作为标准品的化学试剂可以是含有氮元素和/或碳元素的任何化学物质，优选理化性质稳定且易于制备成氮元素和/或碳元素为稳定同位素形式的化学物质，例如：尿素、氨基酸（例如甘氨酸、丝氨酸等）、核碱基（例如尿嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶）、硝酸盐（例如硝酸钠等）、碳酸盐（例如碳酸钠等）等。可以单一化学物质作为标准品，也可以是两种或两种以上的化学物质混合后作为标准品，只要混合的化学物质之间不发生化学反应即可。

58、基质和标准品的化学试剂可以相同，除了两者中的氮元素和/或碳元素的稳定同位素15n和/或13c的丰度是天然丰度的和非天然丰度的不同之外。基质和标准品的化学试剂也可以是不同的化学物质。

59、在本发明的一个实施方式中，所述试剂盒中作为基质的化学试剂是尿素和甘氨酸按照物质的量比1:(1.9~2.1)形成的混合物，所述作为标准品的化学试剂是一系列的氮元素被15n标记和碳元素被13c标记的15n丰度和13c丰度不同的l-丝氨酸，或者，所述作为标准品的化学试剂是15n丰度本质上为100%和13c丰度本质上为100%的l-丝氨酸。

60、本发明的氮和/或碳的稳定同位素丰度的质谱定量检测方法，为现有微量氮和/或碳的稳定同位素分析技术提供了一个替代方案。与依赖硬件改造的技术路径不同，本发明的方法聚焦于样品前处理与数学模型的创新，避免了复杂的仪器改装，使其更易于在常规ea-irms实验室中推广应用。