基于藻类多项光合荧光参数的除草剂识别与定量检测方法

本发明属于水污染检测，特别涉及基于藻类多项光合荧光参数的除草剂识别与定量检测方法。

背景技术：

1、除草剂作为农业生产中应用极为广泛的农用化学品，在过量施用、雨水淋溶、地表径流冲刷与突发泄漏排放等途径下极易汇入水体，现已成为地表水、饮用水源重点关注的典型污染物。由于多数除草剂兼具环境持久性、生物富集性与生物毒性，进入水体的除草剂不但会直接抑制水生生物生理活动、破坏水生态系统结构与功能，而且经过食物链富集还会危害人体健康，因此水体除草剂污染对水生态系统稳定及饮用水安全构成潜在威胁。鉴于此，实现水体除草剂现场快速识别与定量检测，对维护水生态系统健康、保障城乡饮用水安全具有重要作用与意义。

2、目前，水体中除草剂的检测主要依赖于高效液相色谱法、色谱-质谱联用法等传统实验室理化检测手段，这些方法虽然具备超痕量检测能力，但均存在样品前处理复杂、测试周期长、设备精密昂贵、无法现场使用等局限，难以满足水体除草剂现场快速筛查与监测预警需求。

3、相较于传统实验室理化检测方法，生物传感方法因无需复杂样品前处理、可通过监测生物体生理状态直接感知水质状况，在水污染现场快速筛查与水生态风险快速评估中逐渐发挥着不可替代的作用。而在众多水生生物中，藻类作为单细胞水生植物，因其个体小，藻细胞可与除草剂直接接触而对其极其敏感，是水生态系统中最容易受到除草剂毒害的一类水生生物。因此，藻类是水体除草剂污染生物传感检测的理想受试生物。

4、当以藻类对水体除草剂污染进行生物传感时，藻类生理状态的变化可直接反映水体除草剂的胁迫程度，其中，光合作用作为藻类重要的生理过程，是藻类生长繁殖的重要基础。且相关研究表明，除草剂可在短时间（5 min～2 h）内干扰光合作用的电子传递与能量转换过程，从而影响藻类的光合效率。因此，藻类光合作用为除草剂的快速检测提供了生物传感依据。在光合作用过程中，叶绿素会发出特征的荧光信号，且荧光特征与光合作用状态密切相关，据此发展起来的叶绿素荧光动力学技术作为一种无损、原位的活体藻类光合作用探测手段，能够快速获取叶绿素荧光诱导上升动力学（ojip）曲线及众多与藻类光合状态密切相关的光合荧光参数，从而为水体除草剂现场快速检测提供了有力的技术支撑。

5、已有研究表明，不同除草剂由于光合作用的影响机制存在差异，ojip曲线会呈现出差异化的响应模式。例如，除草剂阿特拉津通过抑制psii的电子传递，会导致ojip曲线中j点和i点显著升高；除草剂敌草快通过诱导活性氧产生、干扰电子传递，会导致ojip曲线的p点降低、j点升高；而除草剂草甘膦虽然不直接作用于psii，但通过抑制芳香族氨基酸的合成，会间接影响光合作用，从而导致ojip曲线中的j点和i点显著降低。基于光合影响机制的不同，由ojip曲线所衍生出的多种光合荧光参数对不同除草剂的响应特性也存在差异。同时，光合荧光参数的变化程度也与除草剂的暴露水平呈剂量依赖关系。因此，藻类ojip曲线中所蕴含的多种光合荧光参数为水体不同除草剂的快速识别与定量检测提供了丰富的指示信息。但当前，已有方法多采用单一光合荧光参数（如fv/fm、pi_abs等）表征除草剂的胁迫作用或毒性效应，由于单一光合荧光参数指示信息极其有限，且极易受环境干扰，难以实现具体除草剂污染种类的有效判别及相应除草剂含量的准确定量。而目前，仍缺乏利用藻类多项光合荧光参数进行除草剂定性识别与定量检测的有效方法。

6、鉴于此，针对上述问题，建立一种基于藻类多项光合荧光参数的除草剂识别与定量检测方法，实现水体除草剂污染的快速筛查、现场监测与预警，对推动藻类荧光生物传感向特异化与定量化发展、助力农业面源污染管控、保障饮用水安全具有重要作用及意义。

技术实现思路

1、鉴于上述技术所存在的问题，本发明的目的是提供基于藻类多项光合荧光参数的除草剂识别与定量检测方法。该方法基于藻类光合作用对除草剂具有快速、灵敏的响应特性，以与藻类光合作用密切相关的多项光合荧光参数为基础，通过优选出对除草剂响应具有灵敏、稳定、浓度依赖性的最优光合荧光参数组，构建光合荧光参数的雷达指纹图谱，进而基于图谱特征分别构建除草剂识别模型及定量分析模型，以此实现基于多项藻类光合荧光参数信息的水体除草剂种类识别及浓度定量检测，从而解决现有技术中仅以单一光合荧光参数进行分析指示信息极其有限，难以实现水污染中除草剂种类的有效判别及相应浓度准确定量检测问题。

2、本发明的技术方案如下所述：

3、一种基于藻类多项光合荧光参数的除草剂识别与定量检测方法，包括以下步骤：

4、步骤1：开展不同除草剂在不同浓度下对受试藻种的暴露实验。

5、以农业生产中广泛使用的典型除草剂为研究对象，对于每种除草剂，分别配制a个浓度不同的标准工作液，并将等细胞密度且等体积（为v1）的受试藻种悬浮液分别加入到相同体积（为v2）的各除草剂工作液中，获取不同除草剂在不同浓度下的系列胁迫藻样；同样将体积为v1的受试藻种悬浮液与体积为v2的去离子水混合，制备无除草剂暴露的空白对照藻样。每一浓度除草剂胁迫组及空白对照组均设置三个平行样。则对于每一份除草剂胁迫藻样及空白对照藻样，样品最终体积及样品中初始藻细胞密度都相同，进而将胁迫藻样与空白对照藻样统一放置于相同培养条件下同步培养。

6、其中，所用藻种为生长过程不易发生团聚且不易黏连成片状的淡水蓝藻或淡水绿藻中的一种。除草剂暴露实验前，所用受试藻种采用bg-11培养基扩大培养，培养条件设置为：温度25±1℃、光照强度120 μmol photons·m-2·s-1、光暗周期12 h:12 h，且当藻种培养至第3～5天进入指数生长阶段用于开展除草剂暴露实验。

7、每一除草剂胁迫藻样及空白对照藻样的培养条件与暴露实验前受试藻种扩大培养条件保持相同。

8、步骤2：测量待测藻样的快速叶绿素荧光诱导动力学ojip曲线。

9、当暴露时间为t时，在相同测量条件下，对每一除草剂胁迫藻样及空白对照藻样分别测量快速叶绿素荧光诱导动力学ojip曲线，以精准获取各除草剂胁迫藻样与空白对照藻样在激发光诱导下光合作用过程叶绿素荧光强度随激发时间变化的完整动力学特征。

10、步骤3：提取藻样ojip曲线所蕴含的26项jip-test光合荧光参数。

11、针对每一除草剂胁迫藻样及空白对照藻样，提取出ojip曲线中所蕴含的与藻类光合作用过程密切相关的26项jip-test光合荧光参数。所述26项jip-test光合荧光参数包括：fo、fj、fi、fm、area、fix area、hach area、fv、vj、vi、fm/fo、fv/fo、fv/fm、mo、sm、ss、n、psi_o、phi_eo、phi_do、phi_pav、abs/rc、tro/rc、eto/rc、dio/rc、pi_abs。

12、步骤4：计算每一光合荧光参数对除草剂的响应值。

13、针对每一除草剂胁迫藻样，根据公式（1）计算各光合荧光参数相对于空白对照藻样的变化率it，以其代表每一光合荧光参数对除草剂的响应值。

14、                    （1）

15、式中，rct为暴露时间为t时，空白对照藻样光合荧光参数r的测量值；rtt为暴露时间为t时，除草剂胁迫藻样光合荧光参数r的测量值；it为暴露时间为t时，除草剂胁迫藻样的光合荧光参数r相对于空白对照藻样的相对变化率。

16、步骤5：采用聚类降维-综合评分参数优选策略，筛选用于除草剂分析的最优光合荧光参数。

17、针对26项jip-test光合荧光参数在对除草剂进行响应时存在部分参数相互关联、信息冗余，进而影响除草剂分析精准性问题，采用“聚类降维-综合评分”参数优选策略，通过剔除冗余信息，筛选出相关性较低且适用于除草剂分析的最优参数组合。

18、该参数优选策略以每一光合荧光参数对除草剂响应的“稳定性、灵敏性、浓度依赖性”作为评价指标，各指标经min-max归一化后，采用critic客观赋权法，获得每一光合荧光参数对除草剂响应的综合得分；进而基于pearson相关系数矩阵对各参数进行层次聚类，以相关系数阈值0.9划分参数类群，结合每一参数的综合得分及其所代表的光合生理意义，在每个类群中保留综合得分高且代表不同光合生理意义的光合荧光参数，从而获得最优的参数组合。具体参数优选过程如下：

19、（1）每一光合荧光参数对每一种除草剂响应稳定性、灵敏性、浓度依赖性指标的计算：

20、1）稳定性指标（idsta）的计算：

21、稳定性指标用于表征同一暴露条件下平行样间参数响应的一致性。对于暴露时间为t时每一除草剂胁迫藻样的每一光合荧光参数，计算同一浓度除草剂胁迫下三个平行样间光合荧光参数响应值it的标准差（sd），以不同浓度除草剂胁迫下sd的中位数代表该光合荧光参数对该除草剂响应的整体波动性，并根据公式（2）将sd的中位数转换为该光合荧光参数对该除草剂响应的稳定性指标idsta。

22、                    （2）

23、式中，median(sd)为sd的中位数，该值越小，表示该光合荧光参数对该除草剂响应的稳定性越好，相应的稳定性指标idsta得分越高。

24、2）灵敏性指标（idsensi）的计算：

25、灵敏性指标用于量化光合荧光参数对低浓度除草剂的响应能力。对于暴露时间为t时每一除草剂胁迫藻样的每一光合荧光参数，获取每一浓度除草剂胁迫下平行样间光合荧光参数响应值it的中位数，并将低浓度范围内5个浓度点的it中位数与浓度的对数值（log10c）进行最小二乘线性拟合，根据公式（3）计算线性拟合曲线斜率的绝对值s，以其作为该光合荧光参数对该除草剂响应的灵敏性指标idsensi。

26、                  （3）

27、式中，xi表示除草剂第i个浓度（ci）的对数值（log10ci）；yi表示浓度为ci的除草剂胁迫下平行样间参数响应值it的中位数；表示xi的平均值；表示yi的平均值；n表示线性拟合中浓度点的数量（n=5）；s表示拟合曲线斜率的绝对值，s值越大，表示该参数对该除草剂低浓度变化的响应能力越强，则灵敏性指标idsensi的得分越高。

28、3）浓度依赖性指标（idcondep）的计算：

29、浓度依赖性指标用于表征除草剂浓度变化时，光合荧光参数呈单调递增或单调递减这一变化的规律程度。对于暴露时间为t时每一除草剂胁迫下受试藻样的每一光合荧光参数，采用公式（4）计算每一浓度除草剂暴露下平行样间参数响应值it的中位数yi与对数浓度（log10c）即xi间的spearman等级相关系数的绝对值ρ，以其代表该参数对该除草剂响应的浓度依赖性指标idcondep。

30、                （4）

31、式中，ρ越大表示该参数响应值随除草剂浓度变化的单调规律性越好，对应的浓度依赖性指标idcondep得分越高。

32、（2）指标权重与参数综合得分的确定：

33、对于每一种除草剂，将获得的26项jip-test光合荧光参数的灵敏性指标、稳定性指标、浓度依赖性指标分别进行min-max归一化处理，进而采用critic客观赋权法确定各指标的权重，基于每一指标归一化值inorm及其权重w，根据公式（5）通过加权求和计算每个光合荧光参数对每一种除草剂响应的性能得分（score），进而计算同一参数在q种除草剂上性能得分的平均值，以其作为每个光合荧光参数对除草剂响应性能的最终综合得分（finalscore），据此对26项jip-test光合荧光参数进行排序。

34、             （5）

35、（3）相关性聚类降维与代表性参数的确定：

36、为消除不同参数间因高度共线性而导致的信息冗余，采用基于pearson相关系数的层次聚类分析方法对26项jip-test光合荧光参数进行降维筛选。具体方法如下：

37、首先，基于q种除草剂在不同浓度下暴露时间为t时平行样间各参数响应值it的平均值，计算各参数间的pearson相关系数矩阵r26×26，并根据公式（6）将其转化为距离矩阵d26×26，以量化参数间的响应相似度。

38、                           （6）

39、式中，rij为参数i与参数j之间的pearson相关系数；dij为参数i与参数j之间的距离。该距离度量能够将高相关性的参数映射为较小的距离值，即rij越接近1，dij越小，表示参数i与参数j对除草剂的响应结果越相似。

40、其次，基于参数间的距离矩阵，设定pearson相关系数阈值为0.9（对应的距离阈值为0.1）对26个光合荧光参数进行类群划分，以将具有高度相似响应特征的参数归为一类。

41、最终，依据上述critic客观赋权法获得的每个参数对除草剂响应的最终综合得分，以综合得分（final score）≥0.5为合格判据，在每个类群中，筛选出final score≥0.5且具有不同光合生理意义的代表性光合荧光参数，以此作为最优参数组合，用于除草剂定性与定量分析。

42、步骤6：基于最优光合荧光参数构建雷达指纹图谱。

43、在确定最优光合荧光参数组后，对于步骤1所配制的所有除草剂在不同浓度下的胁迫藻样，明确暴露时间为t时每一最优光合荧光参数（j）响应值的全局最大值与全局最小值，据此利用公式（7）对每一除草剂胁迫藻样各最优光合荧光参数的响应值分别进行全局min-max归一化处理，进而将每一除草剂胁迫藻样归一化后的各参数响应值作为极径映射至极坐标空间，构建雷达指纹图谱。图谱中各参数对应的极坐标角度θj根据公式（8）均匀分配，且各参数顺时针排序及位置固定不变。

44、                        （7）

45、                           （8）

46、式中，p为优选出的最佳光合荧光参数的总数量；j为p个最优光合荧光参数中的第j个参数；ij表示第j个光合荧光参数的原始响应值；rj为第j个光合荧光参数经全局归一化后的响应值，取值范围为0～1，以其作为雷达指纹图谱极坐标系中该参数的径向半径，即极径。

47、将极坐标向笛卡尔直角坐标系转换，根据公式（9）计算获得第j个最优参数对应雷达指纹图谱特征顶点的笛卡尔坐标（xj, yj）。

48、                 （9）

49、按顺序连接所有顶点(x1, y1), ..., (xp, yp)，即可得到该胁迫藻样所对应的封闭几何多边形，该多边形即为每一胁迫藻样的雷达指纹图谱。

50、步骤7：提取雷达指纹图谱的特征信息。

51、将每一个雷达指纹图谱视为一个闭合平面区域，按照如下方法分别提取包括图谱总面积（a）、周长（l）、紧密度（cd）、曲率能量（ce）、几何重心横坐标（xc）、几何重心纵坐标（yc）、极径（r1, r2, …, rp）在内的k个图谱特征，用于表征雷达指纹图谱的形态分布及空间结构。

52、（1）面积（a）：

53、雷达指纹图谱的面积a根据公式（10）计算获得。

54、                  （10）

55、式中，(xj, yj)与(xj+1, yj+1)分别为第j个顶点及第j+1个顶点的笛卡尔坐标；且(xp+1, yp+1)=( x1, y1)。

56、（2）周长（l）：

57、雷达指纹图谱的周长l为多边形中p个边长长度的总和，采用公式（11）计算获得。

58、            （11）

59、（3）紧密度（cd）：

60、紧密度cd用于衡量雷达指纹图谱的聚合程度，采用公式（12）计算获得。

61、                        （12）

62、（4）曲率能量（ce）：

63、曲率能量（ce）表示雷达指纹图谱轮廓的弯曲程度，采用公式（13）计算获得。

64、               （13）

65、式中，当j = 1时，rj-1 = rp；当j = p时rj+1 = r1。

66、（5）重心横坐标（xc）与重心纵坐标（yc）：

67、重心是雷达指纹图谱各顶点分布的中心，代表图谱空间的偏移性。采用公式（14）和公式（15）分别计算重心的横坐标（xc）与纵坐标（yc）。

68、             （14）

69、             （15）

70、（6）极径（rj）：

71、极径为雷达指纹图谱中每个顶点到中心的距离，上述优选出的最佳光合荧光参数的个数为p，则雷达指纹图谱中顶点的个数为p，极径的数目也为p，每个极径（rj）根据上述步骤6中的公式（7）计算获得。

72、步骤8：构建雷达指纹图谱特征与支持向量机算法相结合的除草剂识别模型。

73、以步骤1所制得的不同除草剂系列浓度胁迫藻样对应的雷达指纹图谱为对象，将步骤7中提取出的总面积（a）、周长（l）、紧密度（cd）、曲率能量（ce）、几何重心横坐标（xc）、几何重心纵坐标（yc）、p个极径（rj）在内的k个雷达指纹图谱特征构建特征矩阵x，并将其与支持向量机（svm）机器学习算法相结合，通过数据集划分、核函数优选、参数寻优、模型训练，构建水体除草剂的识别模型。识别模型构建方法具体如下：

74、（1）数据集划分：

75、以步骤1中制得的不同除草剂系列浓度胁迫藻样的雷达指纹图谱为基础，采用分层抽样方法，以除草剂种类为分层依据，按8:2随机划分训练集和测试集。其中，训练集样本用于训练svm模型，学习图谱特征与除草剂种类间的非线性映射关系；测试集样本用于验证模型的识别效果。训练集样品雷达指纹图谱的图谱特征矩阵表示为xtrain，训练集样本对应的除草剂类别标签向量表示为ytrain；测试集样品雷达指纹图谱的图谱特征矩阵表示为xtest，测试集样本对应的除草剂类别标签向量表示为ytest。

76、（2）特征值归一化：

77、基于训练集雷达指纹图谱特征构成的特征矩阵xtrain，计算每个图谱特征（共k个）的均值和标准差σ，进而根据公式（16）采用z-score标准化方法对训练集和测试集中的每个图谱特征的特征值进行归一化处理，得到归一化后的训练集图谱特征矩阵xtrain-norm和测试集图谱特征矩阵xtest-norm。

78、                        （16）

79、式中，d为归一化前训练集和测试集中某一图谱特征的特征值；为训练集中该图谱特征的特征值均值；σ为训练集中该图谱特征的特征值标准差；dnorm为归一化后训练集和测试集中该图谱特征的特征值。

80、（3）svm模型类型及核函数的选择：

81、由于除草剂种类较多，为识别出具体的除草剂种类，选用多分类svm模型。核函数是svm模型的核心，其作用是将低维的图谱特征映射到高维特征空间，使原本非线性可分的样本（图谱特征与除草剂类别之间呈强非线性关系）变得可分，因此对模型的识别精度与泛化能力具有直接的决定作用。由于径向基核函数（rbf）能自适应捕捉特征与类别间的非线性关系，抗过拟合能力较强，且能有效放大不同除草剂图谱特征的微弱差异，因此确定选择rbf作为svm模型的核函数，以确保模型能有效实现低维图谱特征到高维空间的映射，并准确捕捉特征与除草剂类别的非线性关联，提升模型识别精度。rbf核函数的表达式如公式（17）所示。

82、          （17）

83、式中，di-norm、dj-norm分别为第i个样本和第j个样本经z-score标准化处理后的两个雷达指纹图谱特征向量；k是核函数的函数符号，k(di-norm, dj-norm)代表特征向量di-norm与dj-norm映射到高维特征空间之后的内积，表征样本i与样本j的雷达指纹图谱特征在高维空间中的相似程度；γ为核函数的核心参数，控制核函数的宽度，决定特征映射的维数。

84、（4）模型关键参数的优选：

85、采用网格搜索结合k折交叉验证的方法，对基于rbf核函数的svm模型中惩罚系数c与核函数参数γ两个关键参数进行优选。具体优选过程如下：

86、1）确定参数候选取值范围：惩罚系数c的候选范围为[0.03125, 0.125, 0.5, 1,2, 8, 32, 128, 512, 1024]，核函数参数γ的候选范围为[0.03125, 0.0625, 0.125,0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32]。

87、2）构建参数网格：将c和γ的候选值进行组合，形成所有可能的参数组合，共10×11=110组。

88、3）交叉验证训练：针对每一组参数组合，在训练集上进行10折交叉验证，计算10次验证的平均准确率，作为该参数组合的性能评价指标。

89、4）确定最优参数组合：筛选出交叉验证平均准确率最高的参数组合（cbest,γbest），作为基于rbf核函数的svm模型中最佳惩罚系数c与核函数参数γ两个关键参数。若存在多个参数组合的平均准确率相同的情况，则优先选择c较小、γ适中的组合，以避免过拟合。

90、（5）svm识别模型训练与确定：

91、将归一化后的训练集图谱特征矩阵xtrain-norm和除草剂类别标签向量ytrain输入svm模型，设置模型类型为多分类、核函数为rbf，并引入最优参数组合（cbest, γbest），开展模型迭代训练，直至模型收敛，从而构建出k个图谱特征与svm算法相结合的除草剂识别模型。

92、为评估所建除草剂svm识别模型的性能，采用测试集对训练好的svm模型进行独立验证，根据公式（18）计算识别准确率（accuracy），以其评估模型的识别准确性。

93、                 （18）

94、式中，tp为正确预测目标类别的样本数，tn为正确预测非目标类别的样本数，fp为错误预测目标类别的样本数，fn为错误预测非目标类别的样本数。

95、步骤9：针对每一种除草剂，建立雷达指纹图谱特征与偏最小二乘回归相结合的定量分析模型。

96、以步骤1中每种除草剂为独立研究对象，以同一种除草剂不同浓度胁迫藻样的雷达指纹图谱中包括图谱总面积（a）、周长（l）、紧密度（cd）、曲率能量（ce）、几何重心横坐标（xc）、几何重心纵坐标（yc）、极径（rj）在内的k个图谱特征作为自变量，以各图谱对应的样品中除草剂真实浓度作为因变量，采用偏最小二乘回归（plsr）方法对每种除草剂分别建立独立的定量分析模型，具体过程如下：

97、（1）每种除草剂数据集的构建：

98、针对每一种除草剂，以步骤1制得的该种除草剂不同浓度胁迫下f个受试藻样为研究对象，将f个除草剂胁迫藻样雷达指纹图谱中提取出的k个图谱特征构成自变量矩阵xf×k。以f个除草剂胁迫藻样中除草剂的浓度建立因变量向量y=[y1,y2,…,yf]t，yf为第f个（即最后一个）除草剂胁迫藻样的除草剂真实浓度。

99、（2）数据集划分：

100、将每种除草剂对应的f个胁迫藻样按照8:2随机划分训练集与测试集，训练集图谱特征矩阵表示为xcal，浓度向量表示为ycal；测试集图谱特征矩阵表示为xpre，浓度向量表示为ypre。

101、（3）自变量标准化预处理：

102、根据公式（19）采用z-score标准化方法对训练集及测试集中每个图谱特征的特征值进行归一化处理。

103、                        （19）

104、式中，d为训练集或测试集中每个图谱特征的特征值；为训练集中该图谱特征的均值；σ'为训练集中该图谱特征的标准差；dnew为训练集或测试集中该图谱特征经z-score归一化后的特征值。每种除草剂需单独进行训练集与测试集的标准化，不同除草剂分别具有各自一套独立的值与σ'值。

105、（4）最优主成分数的确定：

106、主成分数作为偏最小二乘回归（plsr）模型的核心参数，过少则无法捕捉图谱特征与浓度的关联规律导致欠拟合，过多则导致模型过拟合，因此采用留一交叉验证法确定模型构建的最优主成分数。具体方法如下：

107、1）预设主成分数的遍历范围：结合训练集样品总量与图谱特征的数量（k个），双重约束确定主成分数遍历区间的上限，下限设置为1。其中主成分数上限的双重约束方法为：

108、① 根据训练集样品总量约束上限：主成分数遍历范围的上限为训练集样品总数量的五分之一；

109、② 根据图谱特征数量约束上限：若k≤10，主成分数遍历范围的上限为10；若k＞10，主成分数遍历范围的上限为15。

110、依据上述两项约束条件，最终主成分数遍历范围的上限取两者中的最小值。

111、2）最优主成分数的筛选：逐一代入预设的主成分数，构建plsr模型，计算每一个主成分数对应的交叉验证均方根误差（rmsecv），以rmsecv最小为原则，确定该除草剂plsr模型的最优主成分数；若存在多个主成分数rmsecv相同的情况，优先选择最少的主成分数，以避免过拟合。

112、（5）同一种除草剂plsr定量模型的训练：

113、对于每一种除草剂，将归一化后的训练集图谱特征矩阵xcal-new和训练集浓度向量ycal输入plsr模型，设置模型参数为上述所确定的最优主成分数，执行偏最小二乘回归运算，建立线性回归模型，如公式（20）所示。

114、                    （20）

115、式中，b为plsr回归系数矩阵，e为残差矩阵。

116、基于公式（20）获得的plsr回归系数矩阵b，以经z-score归一化后的待测样品k个图谱特征的特征值为自变量，最终构建该种除草剂含量的定量解算方程，如公式（21）所示，该方程即为该种除草剂基于雷达指纹图谱特征与plsr相结合的定量分析模型。

117、             （21）

118、式中，dnew1～dnewk为样品雷达指纹图谱中k个图谱特征经z-score归一化后的特征值；b0为截距；b1～bk为各特征值对应的回归系数。

119、（6）模型预测与泛化性能验证：

120、基于训练集图谱特征值均值和标准差σ'，根据公式（19）对测试集样品图谱的各特征值进行z-score归一化处理，进而将归一化后的每个测试集样品图谱的k个特征值代入公式（21）中，基于该训练完成的plsr模型，计算每个测试集样品的除草剂浓度预测值k，进而将测试集中每个样品除草剂浓度的预测值k与真实值yk'进行对比，根据预测结果的决定系数r2（如公式（22）所示）和均方根误差（rmsep）（如公式（23）所示）评估模型预测的准确性，其中r2取值范围为0～1，r2越接近1、rmsep越接近0，代表模型对除草剂定量检测的准确性越好。

121、                   （22）

122、               （23）

123、式中，yk'为测试集中第k个样品除草剂的真实浓度；k为第k个样品除草剂的预测浓度；为所有测试集样品除草剂真实浓度的平均值，m为测试集中样品的数量。

124、对于每一种除草剂，重复上述过程，逐类完成相应除草剂plsr定量分析模型的构建，并最终构成一套多种除草剂plsr定量检测模型库。在该定量检测模型库中，每一种除草剂对应一个专属的定量分析模型。

125、步骤10：利用步骤8和步骤9所建模型，对实际待测水体中的除草剂进行定性识别及浓度定量检测。

126、对于实际待测水样，经过0.45 水系滤膜抽滤处理后，按照步骤1的方法，将等细胞密度且体积为v1的受试藻种悬浮液分别加入到体积为v2的待测水样中开展待测水体对受试藻种的暴露实验，同时按照步骤1的方法配制空白对照藻样，并在与步骤1相同的培养条件下对待测水体胁迫藻样及空白对照藻样同步进行培养。进而按照步骤2和步骤3的方法对待测水体胁迫藻样及空白对照藻样分别进行ojip曲线测量及26项jip-test光合荧光参数的提取；按照步骤4的方法计算待测水体胁迫下每一光合荧光参数的响应值；进而按照步骤5 的方法保留用于除草剂分析的最优光合荧光参数；并按照步骤6的方法基于最优光合荧光参数构建雷达指纹图谱。在此基础上，按照步骤7的方法对雷达指纹图谱中的k个图谱特征进行提取，并将所提取出的雷达指纹图谱特征值经过公式（16）的z-score归一化后，带入步骤8中所建立的除草剂识别模型中，以对除草剂的种类进行判断；进而根据模型对除草剂种类的判别结果，选定相应种类除草剂的定量分析模型，进而将该样品雷达指纹图谱k个特征的特征值经过步骤9中公式（19）归一化处理后，带入步骤9所建立的该除草剂plsr定量分析模型中（公式（21）），即可对待测水体中除草剂的浓度进行反演，从而实现待测水体中除草剂种类的识别及浓度的定量检测。

127、有益效果：

128、1、解决单一参数信息有限问题：突破现有技术仅依赖单一光合荧光参数（如fv/fm、pi_abs）的局限，充分利用26项jip-test光合荧光参数的多维信息，通过“聚类降维-综合评分”策略优选出最优参数组合，显著提升了除草剂识别的准确性和可靠性。

129、2、实现除草剂种类精准识别：基于雷达指纹图谱特征与支持向量机算法构建识别模型，对阿特拉津、敌草快、草甘膦三种除草剂的识别准确率达95.06%以上，有效解决了单一参数难以区分除草剂具体种类的问题。

130、3、实现除草剂浓度准确定量：针对每种除草剂建立偏最小二乘回归定量分析模型，决定系数r2达0.90以上，加标回收率91.27%～108.44%，相对误差1.67%～8.73%，满足现场快速定量检测需求。

131、4、操作快速简便：藻类暴露时间短（1 h即可），无需复杂样品前处理，检测流程简便快捷，适用于水体除草剂污染现场快速筛查与监测预警。

132、5、方法普适性强：适用于地表水、饮用水源、自来水等不同类型实际水体，对实际水体中除草剂定性与定量分析具有较好的应用潜力。