一种甲型/乙型流感病毒抗原检测试纸条及其制备方法与流程

本发明属于生物医学检测，具体涉及一种甲型/乙型流感病毒抗原检测试纸条及其制备方法，更具体地，涉及一种基于胶体金免疫层析技术的甲型/乙型流感病毒抗原联合检测试纸条及其制备方法。

背景技术：

1、流感是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，严重危害人类健康。流感病毒可以分为甲（a）、乙（b）、丙（c）、丁（d）四个型别，其中的甲型（h1n1亚型和h3n2亚型）和乙型流感病毒会导致每年的季节性流行。在学校、托幼机构和养老院等人群密集的场所可发生聚集性疫情。

2、流感患者和无症状感染者是季节性流感的主要传染源。流感病毒主要通过感染者打喷嚏和咳嗽等产生的飞沫传播，也可经口腔、鼻腔、眼睛等黏膜直接或间接接触感染，比如手接触被病毒污染的物品，又触摸自己口鼻是常见的传播方式。在特定场所，如人群密集且环境密闭或通风不良的房间内，流感病毒也可能通过气溶胶的形式传播。通常，流感的潜伏期为1-4天（平均2天），从潜伏期末到出现症状后的急性期都有传染性。

3、目前，临床检验中应用的针对甲型/乙型流感病毒的检测方法主要有pcr法和胶体金法。其中，荧光pcr法虽然灵敏度高，但样本处理繁琐、耗时长，必须借助相关仪器设备，且操作人员须经专业培训，限制了普通用户的使用。胶体金免疫层析法因其操作简便、检测快速、无需仪器等优势，在poct（即时检测）领域得到广泛应用。

4、然而，目前市售的甲型/乙型流感病毒抗原胶体金法检测试剂盒普遍存在灵敏度偏低或工艺复杂等问题，容易出现假阴性结果。因此，开发一种灵敏度高、特异性好、制备工艺简便的甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒具有重要的意义和价值。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种甲型/乙型流感病毒抗原检测试纸条及其制备方法和应用。本发明通过采用双巯基聚乙二醇封闭、bsa/bsa-ab特异性吸附形成大颗粒偶联物、以及在样品垫处理液中添加木质素磺酸钠等技术手段，显著提高了检测灵敏度和特异性，且操作简便、无需仪器，适于大规模推广应用。

2、为了解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案得以实现的。

3、本发明第一方面提供了一种甲型/乙型流感病毒抗原检测试纸条，包括底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫按层析方向顺次搭接粘贴在底板上；

4、所述样品垫经样品垫处理液浸泡处理；所述样品垫处理液包括tris（三羟甲基氨基甲烷）、casein（酪蛋白）、吐温20、s9（tetronic 1307）、木质素磺酸钠；

5、所述金标垫上承载有胶体金标记的金标偶联物1和金标偶联物2，所述金标偶联物1包括甲型流感单克隆抗体1和bsa（牛血清白蛋白），采用双巯基聚乙二醇进行封闭；所述金标偶联物2包括乙型流感单克隆抗体1和bsa-ab（抗牛血清白蛋白抗体），采用双巯基聚乙二醇进行封闭；

6、所述硝酸纤维素膜上包被有质控线c线和检测线t线，所述质控线包被有抗igg抗体，所述检测线包括甲型流感病毒检测线和乙型流感病毒检测线，分别包被有甲型流感单克隆抗体2和乙型流感单克隆抗体2。

7、作为优选地，所述双巯基聚乙二醇分子量为5000-30000；更优选地，所述双巯基聚乙二醇分子量为15000-25000；最优选地，所述双巯基聚乙二醇分子量为20000。

8、作为优选地，所述底板选自pvc底板。

9、作为优选地，所述抗igg抗体为羊抗鼠igg抗体。

10、本发明第二方面提供了上述甲型/乙型流感病毒抗原检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：

11、（1）将甲型流感单克隆抗体2、乙型流感单克隆抗体2采用包被液稀释后包被于硝酸纤维素膜的检测线位置，将抗igg抗体采用包被液稀释后包被于硝酸纤维素膜的质控线位置，烘干；

12、（2）将tris缓冲液加入至胶体金溶液中混匀，随后加入甲型流感单克隆抗体1和bsa搅拌反应；再加入双巯基聚乙二醇溶液搅拌反应；随后离心弃上清，沉淀物采用保存液进行复溶，得到金标偶联物1；

13、将tris缓冲液加入至胶体金溶液中混匀，随后加入乙型流感单克隆抗体1和bsa-ab，搅拌反应；再加入双巯基聚乙二醇溶液搅拌反应；随后离心弃上清，沉淀物采用保存液进行复溶，得到金标偶联物2；

14、所述保存液包括tris、casein和蔗糖；

15、步骤（2）中使用tris调节胶体金的ph值，tris缓冲液维持胶体金体系呈弱碱性，缓冲能力较温和，不同目标蛋白可以同时与胶体金进行偶联，无需调节至最适ph值。同时，该步骤中使用双巯基聚乙二醇进行封闭，双巯基聚乙二醇的巯基部位与胶体金之间通过金硫键结合，封闭多余位点的同时，两端的巯基可以连接不同的胶体金颗粒，聚合成大颗粒，被捕获时增强显色强度，提高产品灵敏度；peg部位良好的亲水性，使得聚合后的大颗粒可以继续较好的分散溶液中，不会聚集出现死金现象。金标偶联物1与金标偶联物2通过bsa、bsa-ab的特异性吸附，形成胶体金-甲型流感单克隆抗体1-bsa-bsa-ab-乙型流感单克隆抗体1-胶体金的大颗粒聚合物，被捕获时，显著增强显色强度，提高产品灵敏度。

16、（3）将步骤（2）得到的金标偶联物1和金标偶联物2混匀后加入稀释液进行稀释，随后将空白垫片浸泡于其中，取出烘干，得到金标垫；

17、所述稀释液包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、np-40；

18、（4）将tris、casein、吐温20、s9、木质素磺酸钠置于溶剂中混匀制得样品垫处理液，随后将空白垫片浸泡于样品垫处理液中，取出烘干，得到样品垫；

19、步骤（4）中的木质素磺酸钠可以吸附样本中的脂质、胆红素等疏水性干扰物，减少背景干扰，提高特异性。

20、（5）将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫按照层析方向顺次搭接粘贴于底板上，裁切后即得。

21、作为优选地，步骤（1）中所述包被液包括tris和海藻糖；更优选地，所述包被液包括浓度为1.2-2.4g/l的tris和浓度为20-30g/l的海藻糖。

22、作为优选地，步骤（1）中甲型流感单克隆抗体2（购自江苏申基生物科技有限公司）、乙型流感单克隆抗体2（购自江苏申基生物科技有限公司）、羊抗鼠igg抗体（购自江苏申基生物科技有限公司）稀释后的浓度分别为0.8-1.0mg/ml。

23、作为优选地，步骤（1）中所述抗igg抗体为羊抗鼠igg抗体。

24、作为优选地，步骤（1）中所述烘干的温度为40-50℃，时间为1-3h。

25、作为优选地，步骤（2）中所述胶体金溶液的体积为8-12ml；tris缓冲液加入至胶体金溶液后的tris的终浓度为5-10mm。

26、作为优选地，步骤（2）中所述胶体金溶液可通过市售获得，亦可采用如下方法制备得到：将4ml 10g/l的氯金酸溶液加入100ml超纯水中，加热搅拌回流至沸腾，加入6.4ml10g/l的柠檬酸钠溶液，待溶液变成酒红色后，继续加热回流15min，随后停止加热，待溶液自然冷却至室温，得到胶体金溶液。

27、作为优选地，步骤（2）中所述甲型流感单克隆抗体1（购自江苏申基生物科技有限公司）与胶体金溶液的质量体积比（mg：ml）为1：50-120；所述甲型流感单克隆抗体1与bsa的质量比为1：0.6-1.5；所述甲型流感单克隆抗体2（购自江苏申基生物科技有限公司）与胶体金溶液的质量体积比（mg：ml）为1：50-120；所述甲型流感单克隆抗体2与bsa-ab的质量比为1：0.6-1.5。

28、作为优选地，步骤（2）中在进行金标偶联物1制备时加入甲型流感单克隆抗体1和bsa搅拌反应的温度为20-25℃，时间为10-15min，加入双巯基聚乙二醇溶液搅拌反应的温度为20-25℃，时间为10-15min，双巯基聚乙二醇溶液与胶体金溶液的体积比为0.1-0.15：10；在进行金标偶联物2制备时加入乙型流感单克隆抗体1和bsa-ab搅拌反应的温度为20-25℃，时间为10-15min，加入双巯基聚乙二醇溶液搅拌反应的温度为20-25℃，时间为10-15min，双巯基聚乙二醇溶液与胶体金溶液的体积比为0.1-0.15：10。

29、作为优选地，步骤（2）中在进行金标偶联物1制备时离心的温度为4℃，转速为8000-10000rpm，时间为10-15min；在进行金标偶联物2制备时离心的温度为4℃，转速为8000-10000rpm，时间为10-15min。

30、作为优选地，步骤（2）所述保存液中tris、casein和蔗糖的浓度分别为2-3g/l、3-8g/l、80-120g/l。

31、作为优选地，步骤（2）中所述双巯基聚乙二醇分子量为5000-30000；更优选地，所述双巯基聚乙二醇分子量为15000-25000；最优选地，所述双巯基聚乙二醇分子量为20000。

32、作为优选地，步骤（2）中所述双巯基聚乙二醇溶液的浓度为30-80g/l。

33、作为优选地，步骤（3）中所述金标偶联物1与金标偶联物2的体积比为1：1-2。

34、作为优选地，步骤（3）所述稀释液中磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、np-40的浓度分别为5-6g/l、1-1.5g/l、8-12g/l、8-12g/l；稀释的倍数为15-25倍。

35、作为优选地，步骤（3）中所述烘干的温度为35-40℃。

36、作为优选地，步骤（4）中所述样品垫处理液中tris、casein、吐温20、s9、木质素磺酸钠的浓度分别为6-12g/l、3-7g/l、3-7g/l、3-7g/l、0.1-0.2g/l。

37、作为优选地，步骤（4）中所述烘干的温度为35-40℃。

38、作为优选地，步骤（5）中所述底板选自pvc底板。

39、本发明第三方面提供了一种甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒，包括上述甲型/乙型流感病毒抗原检测试纸条或根据上述制备方法制备得到的甲型/乙型流感病毒抗原检测试纸条，以及样本提取液、咽拭子、样本提取管、吸管中的一种或多种。

40、本发明第四方面提供了一种甲型/乙型流感病毒抗原检测方法，采用上述甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒进行检测，包括如下步骤：

41、将待测样本加入样本提取液中处理，将处理后的样本滴加至上述甲型/乙型流感病毒抗原检测试纸条的样品垫上，层析后观察结果；若检测线t线和质控线c线均显红色，则判定为阳性；若仅质控线c线显红色而检测线t线不显色，则判定为阴性；若质控线c线不显色，则判定为无效。

42、作为优选地，所述层析的时间为10-15min。

43、本发明采用双抗体夹心法原理定性检测人鼻拭子、口咽拭子中甲型/乙型流感病毒抗原。检测时当样本中存在甲型/乙型流感病毒抗原时，样本中的甲型/乙型流感病毒抗原与金标垫上的胶体金标记抗体（金标甲型流感单克隆抗体1偶联标记物和金标乙型流感单克隆抗体1偶联标记物）相互反应，形成标记抗体-抗原复合物，复合物通过毛细作用向上层析，被包被在硝酸纤维素膜上的检测线（t线）抗体（甲型流感单克隆抗体2和乙型流感单克隆抗体2）捕获，出现红色条带。复合物继续向上层析，被包被在硝酸纤维素膜上的质控线（c线）抗体（羊抗鼠igg抗体）捕获，出现红色条带。当样本中待测物含量低于最低检测限时，检测线（t线）不显色。

44、本发明相对于现有技术，具有如下有益效果：

45、（1）本发明采用双巯基聚乙二醇（di-sh-peg）作为胶体金封闭剂，其两端的巯基通过金硫键与不同胶体金颗粒结合，使胶体金偶联物聚集成大颗粒，被捕获时显色强度显著增强。同时，bsa与bsa-ab之间的特异性吸附进一步促进大颗粒聚合物的形成。实验表明，本发明对甲型h1n1（2009）的检测限可达0.675×105u/ml，优于对比例产品，灵敏度显著提高。

46、（2）本发明在样品垫处理液中添加木质素磺酸钠，可有效吸附样本中的脂质、胆红素等疏水性干扰物，减少背景干扰。经大量阴性临床样本验证，特异性高达100%。

47、（3）本发明采用胶体金免疫层析技术，以胶体金作为载体，检测鼻拭子、口咽拭子样本无需借助仪器设备，10分钟即可报告检测结果。

48、（4）本发明使用tris调节胶体金ph值，tris缓冲液可维持胶体金体系呈弱碱性环境，缓冲能力温和，不同等电点的目标蛋白可同时与胶体金进行偶联，无需分别调节至各自最适ph值，简化了制备工艺。

49、（5）双巯基聚乙二醇的peg链段具有良好的亲水性，使聚合后的大颗粒能够较好地分散在溶液中，不会出现聚集沉淀（死金）现象，保证了试纸条的批间稳定性和储存稳定性。