石榴补血糖浆成分鉴定方法及改善认知障碍的网络药理学分析方法与流程

本发明涉及一种石榴补血糖浆成分鉴定方法及改善认知障碍的网络药理学分析方法。

背景技术：

1、认知障碍是由神经退行性疾病、脑血管病变、脑外伤、全身性代谢疾病或不良生活方式等多种因素引发的临床综合征，并非独立疾病，主要表现为记忆、注意力、语言、执行功能、视空间能力等一项或多项认知领域的损伤，且损伤程度足以影响个体日常活动、社交或工作能力；其按严重程度可分为轻度认知障碍、中度认知障碍和重度认知障碍（痴呆），按可逆性又可分为可逆性认知障碍（如维生素缺乏、药物副作用引发的，去除病因后可改善）与不可逆性认知障碍（如阿尔茨海默病、严重脑外伤后遗症引发的，神经元损伤难以修复）。该病症的发病率随年龄增长显著升高，尤其在65岁以上人群中更为突出，临床诊断需结合病史采集、神经心理评估、影像学检查和血液检查等手段，干预则以病因治疗、对症治疗、康复训练和支持性护理为主，其中轻度认知障碍是正常衰老与痴呆之间的关键过渡阶段，也是预防认知功能进一步恶化的重要窗口期。

2、认知障碍与健忘症的治疗差异点主要体现在治疗目标、干预手段和预后管理三个核心层面：前者治疗需先明确病因，针对神经退行性病变、脑血管损伤等原发病开展药物干预（如胆碱酯酶抑制剂改善认知）、认知康复训练及生活方式调整，同时辅以支持性护理，目标是延缓认知功能衰退、维持患者生活自理能力；而后者多由疲劳、压力过大、睡眠不足等可逆因素引发，治疗以调整生活习惯、缓解诱因为主，无需特殊药物干预，通过规律作息、适度脑力训练等方式即可改善症状，且预后较好，一般不会进展为严重认知损伤。

3、石榴补血糖浆（pomegranate blood-enriching syrup，pbes）是新疆维吾尔药业有限责任公司的独家品种，是新疆维吾尔自治区内特有维吾尔药。国家药品监督管理局国家标准（ws-10785（zd-0785）-2002-2011z）规定，pbes用于治疗健忘、贫血。国药准字号为z20026094，其主要由新疆石榴汁和酸石榴汁组成。

4、现有的石榴产品的相关技术，大部分只在说明石榴成分的抗炎等功效。最近的研究表明，pbes对小鼠的贫血有一定的治疗作用，并能改善血虚小鼠的造血功能。在临床试验中，人们发现pbes在治疗缺铁性贫血方面也是有效和安全的。

5、现有技术对于pbes改善认知障碍的相关技术相对匮乏，现有资料只在细胞层面证明了石榴补血糖浆改善认知障碍（赵丽蓉,黎晨,黄正元,等.石榴补血糖浆对东莨菪碱诱导pc12细胞凋亡的保护作用及机制研究[j].陕西中医,2024,45(05):588-592.）。现有专利申请cn202311039922.9“一种海马组织生物标志物组合以及其在预测健忘症是否改善中的应用”，提及石榴补血糖浆可治疗健忘，但是对于石榴补血糖浆的具体成分和体内作用，以及改善认知障碍的关键通路与靶点均不清楚。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中对于石榴补血糖浆的具体成分和体内作用，以及改善认知障碍的关键通路与靶点均不清楚的问题，本发明提供了一种石榴补血糖浆成分鉴定方法及改善认知障碍的网络药理学分析方法。采用本发明的成分鉴定方法可以准确鉴定出石榴补血糖浆中41种化合物；基于鉴定出的化合物通过网络药理学分析方法，可高效准确地筛选出石榴补血糖浆改善认知障碍的关键通路与关键靶点。

2、本发明提供了一种石榴补血糖浆成分鉴定方法，其包括：采用液质联用法对待测样品进行成分分析，得到石榴补血糖浆的化学成分；其中，所述待测样品为石榴补血糖浆的水提取物，所述水提取物的制备包括以下步骤：将石榴补血糖浆依次进行冻干，水复溶，均质，超声，液固分离，得到所述水提取物。

3、本发明中，所述冻干可采用本领域常规的方法进行。

4、本发明中，所述冻干的过程中冷冻温度可为-80℃至-20℃。

5、本发明中，所述冻干的时间可为12 h至48 h。所述冻干的时间以使所述石榴补血糖浆完全干燥为准。

6、本发明中，所述冻干前还可包括将石榴补血糖浆进行预冻的步骤，所述预冻的温度例如为-20℃；所述预冻的时间例如为24h。

7、本发明中，所述复溶可采用蒸馏水进行。其中，所述蒸馏水需符合gb/t 6682-2008一级水标准，其满足：电阻率≥ 18.2 mω·cm。其中，所述蒸馏水的用量可为每克冻干产物对应5 ml至20 ml蒸馏水。

8、本发明中，所述均质可为涡旋均质。

9、本发明中，所述均质的时间可为30 s至1 min。

10、本发明中，所述超声的温度可为25℃至39℃。

11、本发明中，所述超声的时间可为30 min至45 min。

12、在一具体实施方案中，所述超声满足：在39℃的温度下超声45 min。

13、本发明中，所述离心的温度可为2-8℃，例如为4℃。

14、本发明中，所述离心的转速可为4500 rpm至15,000 rpm，例如5000 rpm或10,000rpm。

15、本发明中，所述离心的时间可为5 min至10 min。

16、本发明中，所述过滤可采用滤膜进行。其中，所述滤膜的孔径可为0.1-0.3μm，例如为0.22 μm。

17、在一具体实施方案中，所述水提取物的制备包括以下步骤：将石榴补血糖浆在-20℃进行预冻24h，然后进行冻干48h，所述冻干的过程中冷冻温度为-20℃；将冻干产物用蒸馏水复溶涡旋均质1 min，在39℃的温度下超声45 min，最后在4℃下用5000 rpm的速度离心10 min，用0.22 μm的滤膜过滤。

18、本发明中，所述液质联用法可采用液质联用仪按照本领域常规的方法进行。

19、本发明中，所述液质联用法中液相色谱的流动相可包括a相和b相，其中，所述a相为甲酸水溶液，所述b相为乙腈。其中，所述甲酸水溶液的浓度可为0.05%-0.2%，例如为0.1%。

20、在一些优选实施方案中，所述液相色谱采用梯度洗脱程序，以所述b相在所述流动相中的体积占比计，所述梯度洗脱程序为：0-5 min: 5%-20%；5-10 min: 20%-30%；10-20min: 30%-75%；20-32 min: 75%-98%；32-34 min: 98%；34-42 min: 5%。

21、本发明中，所述液质联用法中液相色谱的进样量可为2-5 μl。

22、本发明中，所述液质联用法中液相色谱的流速可为0.2-0.4 ml/min。

23、本发明中，所述液质联用法中液相色谱的柱温可为35℃至45℃，例如为40℃。

24、在一具体实施方案中，所述液质联用法中液相色谱的参数设置为：使用梯度洗脱程序，进样量：2 μl，流速：0.2 ml/min，柱温：40℃，流动相为0.1%甲酸水（a相）以及乙腈（b相），b相的梯度洗脱时间为0-5 min: 5%-20%；5-10 min: 20%-30%；10-20 min: 30%-75%；20-32 min: 75%-98%；32-34 min: 98%；34-42 min: 5%。

25、本发明中，所述液质联用法中质谱可采用正离子模式和负离子模式同时扫描。

26、本发明中，所述液质联用法中质谱的离子源可为dual ajs esi。

27、本发明中，所述液质联用法中质谱的种类可为四级杆-飞行时间质谱（q-tof）。

28、本发明中，所述液质联用法中质谱可采用全扫描质谱仪进行。

29、本发明中，所述液质联用法中质谱的毛细管电压可为3500v至4000 v。

30、本发明中，所述液质联用法中质谱的喷嘴电压可为800-1200v，例如为1000 v。

31、本发明中，所述液质联用法中质谱的气体温度可为300-350℃，例如为320℃。

32、本发明中，所述液质联用法中质谱的干燥气体流量可为8-12 l/min，例如为11 l/min。

33、本发明中，所述液质联用法中质谱的鞘气体温度可为250℃至350℃，例如为280℃。

34、本发明中，所述液质联用法中质谱的鞘气体流量可为10 l/min至12 l/min，例如为11 l/min。

35、本发明中，所述液质联用法中质谱的扫描范围可为50~1500 m/z。

36、本发明中，所述液质联用法中质谱的采集速率可为1.0至2.0光谱/秒（spectra/s），例如为1.2 spectra/s。

37、本发明中，所述液质联用法中质谱的采集时间可为500 ms/spectrum至1000 ms/spectrum，例如为833.3 ms/spectrum。

38、在一具体实施方案中，所述液质联用法中质谱的条件为：正离子模式和负离子模式同时扫描，离子源：dual ajs esi，种类为q-tof，毛细管电压4000 v，喷嘴电压1000 v，气体温度320℃，干燥气体流量8 l/min，鞘气体温度280℃，鞘气体流量11 l/min，扫描范围为50~1500 m/z，采集速率为1.2 spectra/s，采集时间为833.3 ms/spectrum。

39、在一具体实施方案中，所述液质联用法满足：

40、所述液质联用法中液相色谱的条件为：进样量：2 μl，流速：0.2 ml/min，柱温：40℃；流动相：以0.1%甲酸水溶液为a相，以乙腈为b相；采用梯度洗脱程序，以所述b相在所述流动相中的体积占比计，所述梯度洗脱程序为：0-5 min: 5%-20%；5-10 min: 20%-30%；10-20 min: 30%-75%；20-32 min: 75%-98%；32-34 min: 98%；34-42 min: 5%；

41、所述液质联用法中质谱的条件为：正离子模式和负离子模式同时扫描，离子源：dual ajs esi；种类为四级杆-飞行时间质谱；毛细管电压4000 v，喷嘴电压1000 v，气体温度320℃，干燥气体流量8 l/min，鞘气体温度280℃，鞘气体流量11 l/min，扫描范围为50~1500 m/z，采集速率为1.2 spectra/s，采集时间为833.3 ms/spectrum。

42、本发明中，所述鉴定方法可至少鉴定出所述石榴补血糖浆的41个化学成分。

43、本发明还提供了一种改善认知障碍的网络药理学分析方法，其包括以下步骤：

44、s1、筛选活性成分：

45、对石榴补血糖浆的化学成分进行筛选，得到活性成分；

46、其中，所述石榴补血糖浆的化学成分为按照如前所述的石榴补血糖浆成分鉴定方法鉴定得到石榴补血糖浆的化学成分；

47、其中，所述筛选包括第一筛选和第二筛选，所述第一筛选为基于胃肠道吸收、血脑屏障渗透和药物相似性进行筛选；所述第二筛选为筛选已知对认知障碍有治疗作用的化学成分；

48、s2、构建活性成分-靶点网络：

49、对步骤s1筛选得到的活性成分的靶点进行预测，并可视化，构建活性成分-靶点网络，得到目标靶点；

50、s3、构建ppi网络：

51、基于步骤s2得到的目标靶点，进行疾病-成分相交靶点分析，构建ppi网络，得到相关靶点；

52、s4、确定关键通路和/或关键靶点：

53、基于步骤s3得到的相关靶点，根据degree值进行筛选，得到关键靶点；

54、或者，基于步骤s3得到的相关靶点，进行go及kegg富集分析，得到关键通路和/或关键靶点。

55、步骤s1中，所述第一筛选可包括将鉴定得到的所述石榴补血糖浆的化学成分的结构式导入swissadme网站进行筛选。

56、步骤s1中，所述第一筛选的标准可包括：胃肠道吸收（gastrointestinalabsorption，gia）≥80%；血脑屏障（blood-brain barrier，bbb）≥0.5；药物相似性满足lipinski、ghose、veber、egan和muegge中任意两种≥0.18。

57、步骤s1中，所述第二筛选中已知对认知障碍有治疗作用的化学成分可包括原儿茶酸、石榴苷、香豆酸、鞣花酸、绿原酸和没食子酸。

58、步骤s2中，所述预测可使用swiss target prediction网站进行；其中，可能性大小筛选的标准优选为：

p值＞0.7。

59、步骤s2中，所述可视化可通过cytoscape软件进行。其中，所述cytoscape软件可为本领域常规采用的cytoscape软件，例如为cytoscape 3.8.0。

60、步骤s2中，所述目标靶点可为46个。

61、在一些实施方案中，步骤s3中，在进行疾病-成分相交靶点分析时，在genecards网站通过检索认知障碍并根据评分获得与疾病相关的靶基因，通过将所述与疾病相关的靶基因与所述目标靶点进行匹配，识别得到相交靶点；其中，所述与疾病相关的靶基因优选为765个；所述相交靶点优选为11个。

62、在一些实施方案中，步骤s3中，使用string工具构建ppi网络，并使用cytoscape软件可视化。

63、步骤s3中，根据所述ppi网络可模拟出41个相关靶点。

64、步骤s4中，优选地，将degree值大于10的相关靶点确定为关键靶点。

65、步骤s4中，根据degree值进行筛选得到关键靶点后，还可包括通过分子对接进行验证的步骤；

66、步骤s4中，所述go及kegg富集分析可通过metascape软件进行。

67、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

68、本发明所用试剂和原料均市售可得。

69、本发明的积极进步效果在于：

70、本发明的石榴补血糖浆成分鉴定方法采用液质联用法对特别制备的水提取物进行检测，准确鉴定出41种化合物；进一步基于出的化合物，采用网络药理学分析方法准确高效地筛选出石榴补血糖浆改善认知障碍的关键通路与关键靶点。本发明不仅确定了石榴补血糖浆的化学成分，还确定了石榴补血糖浆对于改善认知障碍有关键作用的具体成分及关键通路与靶点。这不仅为石榴补血糖浆的临床适应症拓展（从补血到改善认知）提供了全新且详实的理论依据和实验支持，也为基于该方开发新型抗认知障碍药物、保健品或功能性食品指明了方向，极大地减少了针对研发流程的浪费。此外，通过动物实验，进一步验证了质量标志物发挥的关键作用，所建立的“网络药理学-动物实验”整合研究模式，也为其他中药复方的机制研究提供了可借鉴的方法。