一种用于检测循环肿瘤细胞的生物传感器及其制备方法和应用

本发明涉及传感器，尤其涉及一种用于检测循环肿瘤细胞的生物传感器及其制备方法和应用。

背景技术：

1、近年来，癌症已成为全球面临的重大健康挑战，也是导致死亡的主要原因之一。癌症的早期检测对于提高患者生存率和降低死亡率至关重要，因此，亟需寻找高度特异性和敏感性肿瘤生物标志物。从原发性或转移性肿瘤释放到血流中的循环肿瘤细胞（ctcs）携带有关肿瘤的全面基因型和表型信息。随着癌症的进展，ctcs的数量和分子特征发生动态变化。因此，ctcs的检测可能具有重要的临床潜力，为癌症的早期诊断、治疗监测和预后评估提供关键信息。然而，ctcs的临床检测受到丰度极低、背景干扰严重等因素的制约。

2、ctcs分离的传统策略在分析性能和临床实用性方面仍存在诸多不足。免疫磁性分离虽然广泛使用，但主要用于分离和富集靶细胞，该过程涉及多个处理步骤，不可避免地造成部分细胞损失。此外，作为一种分离技术，它缺乏固有的信号放大能力，通常需要进一步的处理才能实现灵敏检测。同样，免疫亲和、微流控平台和基于尺寸的过滤方法依赖于复杂的仪器或缺乏对白细胞的足够区分。更关键的是，这些传统方法表现出对血液基质效应的敏感性，受到可溶性生物标志物和非特异性血浆蛋白吸附的竞争，从而影响检测准确性。

3、为了克服上述传统方法的局限性，生物传感器已成为一类极具前景的替代技术，其信号转导模式多样，包括比色法、荧光、电化学、电化学发光和局域表面等离子体共振等。其中，电化学分析因其快速响应、高选择性、低成本和仪器简单性等优势而极具竞争力。近年来，金属纳米材料的集成极大地提高了电化学生物传感器的灵敏度和催化效率，这主要是由于其高电导率、大比表面积和优异的催化活性，增强了电子传递，增加了生物识别元件负载，提高了信号放大。尤其是双金属核壳纳米结构，例如金核铂壳纳米颗粒（au@ptnps），比单金属或合金结构具有独特的优势。金核提供优异的导电性和明确的模板，而铂壳提供优异的催化活性，二者协同作用，展现出优异的电化学性能。尽管已经取得了上述进展，单个纳米催化剂仍常因聚集现象和催化活性不足而受限，难以实现超灵敏检测所需的显著信号变化。因此，本领域亟需一种高效抗干扰、可灵敏富集检测微量ctcs的新型技术手段。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于检测循环肿瘤细胞的生物传感器及其制备方法和应用，通过dna编码的自组装策略，将单一纳米催化剂有序构建为明确的三维架构，该单元内网络产生显著放大的电催化信号，使ctcs的定量检测成为可能。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种生物传感器，由以下部分组成：dna-au@ptnps和mch/tds/aue。

4、作为优选，所述dna-au@ptnps为信号探针bc1-au@ptnps与信号探针bc2-au@ptnps。

5、本发明还提供了所述生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

6、（1）将水和haucl4溶液混合，95~105℃条件下加入柠檬酸钠溶液，搅拌3~7min，继续反应8~12min，调节温度为85~92℃并搅拌25~35min，得到aunps溶液；

7、（2）将aunps溶液和na2ptcl6溶液混合后，加入抗坏血酸溶液，在85~95℃条件下反应25~35min，得到au@ptnps溶液；

8、（3）将au@ptnps溶液的ph调节至8.5~9.5，得到au@ptnps悬浮液；

9、（4）将au@ptnps悬浮液和sa溶液混合，孵育8~12h，加入牛血清白蛋白溶液，0.8~1.2h后离心获得sa-au@ptnps；

10、（5）将sa-au@ptnps分散于牛血清白蛋白溶液中，得到sa-au@ptnps悬浮液；

11、（6）将生物素标记的bc1和bc2分别与sa-au@ptnps悬浮液混合，孵育1~3h，封闭，分别得到信号探针bc1-au@ptnps与信号探针bc2-au@ptnps；

12、（7）将四面体a、四面体b、四面体c、四面体d和muc1适配体和tris-hcl缓冲液混合，得到混合溶液，将混合溶液加热至90~100℃维持3~7min，0.8~1.2min内快速冷却至2~6℃，得到tds；

13、（8）将电极和0.2~0.4μm的tds孵育，得到tds/aue；

14、（9）在tds/aue中加入0.8~1.2mm的mch反应0.8~1.2 h，得到mch/tds/aue。

15、作为优选，步骤（1）所述水和haucl4溶液的体积比为35~45ml：8~12μl，所述haucl4溶液的浓度为1~3m。

16、作为优选，步骤（2）所述aunps溶液的温度为85~95℃；所述aunps溶液和na2ptcl6溶液的体积比为14~18ml：650~750μl，所述na2ptcl6溶液的浓度为0.8~1.2mm；所述aunps溶液和抗坏血酸溶液的体积比为14~18ml：6~10ml，所述抗坏血酸溶液的浓度为3~5 mm。

17、作为优选，步骤（4）所述孵育的温度为2~6℃；所sa溶液和au@ptnps悬浮液的体积比为60~80μl：8~12 ml，所述sa溶液的浓度为0.8~1.2 mg/ml；所述牛血清白蛋白溶液和sa溶液的体积比为0.8~1.2ml：60~80μl，所述牛血清白蛋白溶液的牛血清白蛋白含量为8~12wt%。

18、作为优选，步骤（6）所述bc1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述bc2的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述孵育的温度为35~39℃，所述封闭的溶液为0.8~1.2wt%的bsa溶液；

19、步骤（7）所述混合溶液中四面体a、四面体b、四面体c、四面体d和muc1适配体的浓度分别为0.8~1.2μm；所述四面体a的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述四面体b的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述四面体c的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述四面体d的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述aptamer的核苷酸序列如seq id no.7所示；

20、步骤（8）所述孵育的温度为35~39℃，所述共孵育的时间为1~3 h。

21、本发明还提供了所述的生物传感器在检测循环肿瘤细胞中的应用。

22、本发明还提供了一种检测循环肿瘤细胞的方法，包括以下步骤：

23、a、将mch/tds/aue和含有靶标细胞的hepes缓冲液共孵育，得到反应金电极；

24、b、将信号探针bc1-au@ptnps和信号探针bc2-au@ptnps与反应金电极一起孵育30~50 min，得到网络状dna-au@ptnps/cells/mch/tds/aue；

25、c、将网络状dna-au@ptnps/cells/mch/tds/aue在tmb-h2o2溶液中于电化学工作站上面进行信号输出，采集i-t信号，判断循环肿瘤细胞有无。

26、作为优选，步骤a所述共孵育的温度为35~39℃，所述共孵育的时间为0.8~1.2 h；步骤c所述判断循环肿瘤细胞有无的标准为：若采集到的i-t信号大于空白信号输出，就说明有循环肿瘤细胞。

27、本发明的有益效果为：

28、本发明的的生物传感器具有多项优势：首先，tds修正的电极表面有效改善了捕获探针的取向，从而提高了ctc的捕获效率；其次，dna导向组装指导形成具有高密度催化位点的三维au@ptnps网络，从而增强电化学信号以实现高灵敏度的ctc检测；第三，胆固醇锚定将信号探针定位到细胞膜，有效消除分泌蛋白的干扰，增强检测特异性。因此，本研究引入的捕获与信号放大策略为ctcs高效分析提供了可靠且易用的平台，具备液体活检应用潜力。