一种基于仿生活性口袋的自供级联纳米酶耦合限域CRISPR/Cas13a的电化学生物传感器及其应用

本发明涉及电化学生物传感与纳米医学检测，尤其涉及一种基于仿生活性口袋的自供级联纳米酶耦合限域crispr/cas13a的电化学生物传感器及其应用。

背景技术：

1、乳腺癌是威胁女性健康的恶性肿瘤，其发病率逐年上升且呈年轻化趋势，早期精准诊断对改善患者预后至关重要。环状rna（circrna）作为一类具有共价闭合环状结构的内源性非编码rna，因其对核酸外切酶降解具有天然抗性，在体液中稳定性远高于线性rna，已成为极具潜力的液体活检标志物。其中，circrobo1在乳腺癌组织中异常高表达，与肿瘤增殖、侵袭及转移密切相关，被视为理想的早期诊断靶标。然而，临床样本中circrna的丰度极低（常处于飞摩尔至皮摩尔水平），且背景基质含有大量干扰性核酸及蛋白质，使得高灵敏度、高特异性定量检测面临严峻挑战。

2、目前，针对低丰度核酸靶标的检测主要依赖两类信号放大策略。其一是核酸程序性扩增技术，如聚合酶链式反应（pcr）、滚环扩增（rca）及熵驱动链置换反应等，通过酶促或动态dna组装实现靶标序列的指数或线性放大；其二是基于纳米酶标记的催化信号转导，利用具有类酶活性的纳米材料（如金属氧化物、贵金属簇等）将识别事件转化为可读出的电化学、比色或荧光信号。近年来，crispr/cas系统（特别是cas13a、cas12a等具备反式切割活性的效应蛋白）因其高序列特异性而被引入核酸检测领域，但上述策略在单独使用时均存在显著性能瓶颈：单一核酸扩增往往受限于反应动力学和背景噪声，难以在电极界面产生足够强的最终响应；而单一纳米酶标记则因催化效率有限，无法满足超痕量靶标的检测需求。

3、更为关键的是，当尝试将多级信号放大（如核酸扩增偶联纳米酶催化）进行整合时，现有技术暴露出两个深层缺陷。其一，在级联纳米酶体系中，不同催化功能的活性组分通常采用物理混合或随机共固定方式，导致类葡萄糖氧化酶（gox）与类过氧化物酶（pod）的活性位点空间分布不匹配。gox催化底物产生的中间产物h2o2需通过溶液扩散才能到达pod活性中心，此过程中h2o2易被复杂基质中的还原性物质消耗或发生自身分解，造成传质损耗和信号失真。其二，crispr/cas13a在电极固液界面上的反式切割活性严重受限于空间位阻效应—当cas13a/crrna复合物识别靶标后被激活，其非特异性切割能力虽强，但在电极修饰层附近因dna探针密集排列形成的物理屏障，往往导致切割底物的可及性降低；同时，游离的激活态cas13a在液相中极易发生构象失活，催化持久性差，难以兼顾高切割效率与长时间稳定输出。

4、综上所述，现有技术在痕量circrna检测中面临“前端核酸识别-中继信号转换-末端催化输出”各环节之间协同性差、中间体传质效率低、界面反应活性衰减快等瓶颈问题。因此，亟需构建一种能够实现高效靶标转化、空间有序传递以及级联催化无缝衔接的新型传感策略。本发明针对上述技术难题，通过设计仿生活性口袋结构以优化纳米酶级联微环境，并结合dna四面体介导的限域crispr/cas13a切割体系，旨在从分子识别、信号转导到电化学输出的全链条提升检测灵敏度与稳定性，为乳腺癌早期诊断提供新的技术手段。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于仿生活性口袋的自供级联纳米酶耦合限域crispr/cas13a的电化学生物传感器及其应用。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种基于仿生活性口袋的自供级联纳米酶耦合限域crispr/cas13a的电化学生物传感器，包括：

4、电极基底，其表面修饰有dna三角棱柱，所述dna三角棱柱包含供crispr/cas13a反式切割的底物序列；

5、仿生级联复合纳米酶探针，所述探针为aucu/pda@hisarg/fe-mof-h1复合物，其包含：fe-mof多孔骨架、共价连接于所述骨架表面的组氨酸和精氨酸修饰层、包覆于所述hisarg/fe-mof表面的聚多巴胺层、负载于所述聚多巴胺层表面的aucu双金属纳米颗粒，以及连接于复合物表面的h1发夹探针；

6、靶标识别与信号放大体系，包含熵驱动链置换反应元件、cu²+辅助dnazyme剪切元件，以及由dna四面体介导的crispr/cas13a激活系统。

7、优选的，所述aucu双金属纳米颗粒中cu与au的摩尔比为0~1.5:1。

8、优选的，所述组氨酸和精氨酸通过edc/nhs活化偶联于fe-mof表面，组氨酸与精氨酸的质量比为0.5~1.5:1。

9、本发明提供了一种如所述电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

10、（1）合成fe-mof：将zrocl2·8h2o、fe-tcpp和苯甲酸溶于dmf，经溶剂热反应制得fe-mof；

11、（2）制备hisarg/fe-mof：将fe-mof经edc/nhs活化后，加入组氨酸和精氨酸进行共价修饰；

12、（3）制备aucu/pda@hisarg/fe-mof：将hisarg/fe-mof分散于tris-hcl缓冲液，依次加入多巴胺进行包覆，再加入au核溶液、haucl4和cucl2溶液进行双金属生长；

13、（4）连接h1发夹探针：将步骤（3）所得复合材料活化后，与h1发夹探针孵育，得到功能化信号探针；

14、（5）电极修饰：将玻碳电极电沉积金后，滴加dna三角棱柱孵育，再用mch封闭；

15、（6）传感器组装：将靶标识别与信号放大体系产生的激活态cas13a复合物滴加至电极表面进行限域切割，清洗后孵育步骤（4）所得功能化信号探针。

16、优选的，步骤（3）中所述cucl2溶液的加入量以调节cu/au摩尔比为0~1.5:1，且包覆反应时间为0.5~2h，加入金属源后的反应时间为1~3h。

17、优选的，步骤（4）中所述h1发夹探针的浓度为0.5~5 μm，孵育条件为2~8℃过夜；步骤（5）中所述dna三角棱柱的浓度为0.2~2 μm，mch的浓度为0.5~2 mm。

18、本发明提供了一种利用所述电化学生物传感器检测circrna的方法，包括：

19、（1）靶标识别与放大：靶标circrna触发熵驱动链置换反应释放lock链，暴露s1链，在cu²+辅助下经dnazyme切割s1产生trigger；

20、（2）cas13a激活：将trigger与dna四面体孵育形成tdn-trigger复合物，再与lwacas13a和crrna孵育，激活cas13a的反式切割活性；

21、（3）限域切割：将激活态cas13a复合物滴加至dna三角棱柱修饰的电极表面，切割dna三角棱柱底物序列；

22、（4）信号输出：清洗后孵育aucu/pda@hisarg/fe-mof-h1探针，使探针特异性锚定于切割后的电极界面；

23、（5）电化学检测：在含葡萄糖的pbs溶液中，采用差分脉冲伏安法（dpv）记录峰电流变化值，定量检测靶标circrna浓度。

24、优选的，步骤（2）中所述lwacas13a的浓度为10~100 nm，crrna的浓度为5~50 nm，孵育条件为35~40℃孵育30~60分钟；步骤（3）中所述切割的孵育时间为30~60分钟；步骤（4）中所述探针孵育时间为30~60分钟。

25、优选的，所述靶标circrna为circrobo1，所述电化学检测的线性范围为100 fm至50 nm，检测限不高于50 fm。

26、本发明提供了所述的电化学生物传感器或所述的检测方法在制备乳腺癌诊断试剂或试剂盒中的应用，所述诊断的标志物为circrobo1。

27、进一步的，本发明构建了一种具有仿生催化微环境的复合纳米酶aucu/pda@hisarg/fe-mof（图1d），并将其与核酸空间拓扑调控和限域crispr/cas13a切割相结合，建立了用于circrobo1检测的电化学生物传感平台。

28、其中，fe-mof作为多孔限域骨架，his/arg共修饰用于调节局部氢键网络和质子转移环境；外层aucu/pda兼具类葡萄糖氧化酶活性和良好导电性。该结构可实现外层原位生成h2o2与内层邻近利用h2o2的级联耦合，从而降低中间体扩散损耗并增强电化学信号输出。在检测过程中，circrobo1首先触发熵驱动链置换和cu2+辅助dnazyme切割，生成大量模拟靶标链（图1a）；

29、随后，该模拟靶标链在dna四面体介导下激活cas13a（图1b），并在电极界面诱导udt探针的限域反式切割，进而诱导复合纳米酶探针固载在电极表面，产生增强的dpv响应（图1c）。该策略将仿生催化微环境构建与核酸空间组织调控相结合，为低丰度circrna的灵敏电化学检测提供了一种可行方案。

30、与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

31、本发明成功构建了一种基于仿生活性口袋与限域crispr/cas13a协同放大的电化学生物传感平台，实现了对乳腺癌标志物circrobo1的超灵敏、高特异性检测。经实验验证，该传感器在100 fm至50 nm的宽浓度范围内，峰电流变化值与靶标浓度对数呈良好的线性关系（r² = 0.998），检测限低至12.9 fm。同时，该平台具备优异的序列识别能力，能够精准区分单碱基错配、双碱基错配序列及多种干扰mirna，显著克服了临床复杂样本中低丰度靶标难以准确定量的技术瓶颈，为痕量核酸标志物的早期筛查提供了可靠的工具。

32、在核酸空间拓扑调控方面，本发明通过dna四面体（tdn）介导激活cas13a，规避了传统游离trigger易在液相中快速失活的缺陷，显著提升了固液界面上的催化持久性。研究表明，相较于游离trigger直接激活模式，tdn-trigger体系构建的三维空间限域环境使crispr/cas13a在电极表面的反式切割效率提升了2.54倍。该设计有效解决了常规crispr/cas体系在界面催化中受空间位阻影响大、催化活性衰减快的难题，从底层架构上增强了传感器的信号转换能力。

33、在信号放大的纳米酶设计方面，本发明设计了aucu/pda@hisarg/fe-mof仿生复合纳米酶探针。该材料利用fe-mof的限域孔道与his/arg双氨基酸协同修饰，构建了可显著缩短h2o2扩散路径的仿生活性口袋，实现了外层aucu纳米颗粒（类葡萄糖氧化酶）与内层fe-mof（类过氧化物酶）的高效级联耦合。测试结果证实，该体系的一步催化效率较传统分步级联体系提升了2.09倍，且即便在中性生理条件下依然保持极高的催化活性。该设计从根本上解决了现有级联纳米酶活性位点空间不匹配、中间体传质损耗大的技术问题，显著增强了电化学信号的输出强度与稳定性。