循环肿瘤细胞检测分析仪的模型细胞梯度功能验证方法

本发明属于生物特征识别的智能传感系统，涉及体外诊断分析仪性能验证与单细胞微流控分析，具体涉及一种循环肿瘤细胞检测分析仪的模型细胞梯度功能验证方法。

背景技术：

1、循环肿瘤细胞检测分析仪通常包括样本输送或富集、细胞识别、微流控检测、显微成像、轨迹提取和结果分析环节。仪器投入使用前或更换芯片、试剂、光学器件和软件版本后，需要确认各环节在声明的检测范围内保持正常。采用单一加入数量的模型细胞只能确认仪器能够产生检测结果，不能评价低水平计数波动、量程线性和高水平样本后的携带污染；采用单一细胞状态也不能确认分析算法能否分辨相邻机械响应。低计数样本若仅由细胞悬液按浓度稀释制备，实际进入样本管的细胞数量会出现明显抽样波动，名义加入数量不能直接作为回收率真值。不同模型细胞群的尺寸分布、存活率和聚集比例还会改变微流道内的受力和图像分割结果，使细胞组成差异与分析响应相互混合。此外，微通道加工偏差、入口位置、流量漂移、固定横向成像偏差和连续机械激励后的恢复不足均可形成表观梯度。现有单点或端点核查难以同时区分检测异常、轨迹异常和机械响应分析异常，仍需采用可追溯加入数量和独立表型赋值的模型细胞梯度，对分析仪的检测与分析功能进行分项验证。

技术实现思路

1、本发明提供一种循环肿瘤细胞检测分析仪的模型细胞梯度功能验证方法。该方法分别设置计数梯度和等总细胞数功能表型比例梯度：计数梯度用于核查模型细胞检出、回收、计数线性和携带污染，功能表型比例梯度用于核查机械响应分析对已知细胞组成变化的跟随能力。刚性标定微粒在模型细胞梯度检测前后复核流路、成像和被动轨迹基线；同一模型细胞在楔形结构依次位于左侧、右侧、右侧和左侧的4个单元中形成4个定向残差，用于正交分离模型细胞机械响应、固定方向偏差、先后次序偏差和单元对间漂移。验证过程不使用本批模型细胞重新训练或调整待验证分析仪，输出内容限定为分析仪功能状态及异常项目。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、包括：锁定待验证分析仪的检测参数、图像处理参数、分析模型和验收条件；制备多个加入数量水平的计数梯度样本，并将经独立参考方法赋值的低响应端点模型细胞和高响应端点模型细胞按多个比例混合，制备模型细胞总数相同且总数位于所述计数梯度确认的线性范围内的功能表型比例梯度样本；在梯度样本检测前输入刚性标定微粒，建立以微粒直径和各镜像分叉—汇合单元的入口横向坐标为条件的刚性被动参照轨迹及轨迹级同时预测包络，在梯度样本检测后再次输入刚性标定微粒进行复核；按照预设次序检测2组梯度样本，获得模型细胞检测数量，并根据同一模型细胞依次经过楔形结构位于左侧、右侧、右侧和左侧的4个镜像分叉—汇合单元时相对于对应刚性被动参照轨迹的定向残差，得到模型细胞机械响应、固定方向偏差、先后次序偏差和单元对间漂移；根据计数梯度的参考加入数量和检测数量确定检测回收率、计数线性、完整轨迹分析产率及携带污染率；按照检测前由独立尺寸测量结果锁定的共同直径层和层间权重，对功能表型比例梯度的平行样本逐管计算机械响应，根据各共同直径层内2个端点的机械响应及同一细胞集合中高响应端点模型细胞的实测组成比例确定期望机械响应，进而确定功能梯度闭合偏差和组成保持偏差；将各指标与所述验收条件比较，输出待验证分析仪的功能验证结果及异常项目。

4、所述低响应端点模型细胞和高响应端点模型细胞由同一来源、同一培养批次的模型肿瘤细胞分组处理得到；每组模型细胞均分成参考份、检测份和留样复核份，参考份采用微吸管吸引、原子力显微测量或独立细胞变形检测装置测量参考机械响应，检测份不参与参考机械响应的确定，也不参与待验证分析仪的模型训练或参数调整；高响应端点模型细胞的参考机械响应中位数高于低响应端点模型细胞，且2个中位数之差不小于2组单细胞参考机械响应相对于各自组内中位数的绝对偏差中位数之和；2个端点的存活率均不低于90%，单细胞比例均不低于95%。

5、所述计数梯度样本包括空白水平和至少4个非零加入数量水平；对加入数量不大于20个模型细胞的样本，采用具有成像确认功能的单细胞分配器逐个分配并记录整数加入数量；对加入数量大于20个模型细胞的样本，采用数字成像计数和质量法分配确定参考加入数量及其不确定度；各计数梯度样本使用同一批阴性基质，最高加入数量水平检测后输入所述阴性基质形成携带污染空白样本，以携带污染空白样本的识别数量相对于基础空白识别数量的增量除以最高加入数量水平的实测识别数量与基础空白识别数量之差，得到携带污染率。

6、所述功能表型比例梯度包括高响应端点模型细胞所占比例为0和1的2个端点水平以及至少3个中间水平；采用成像确认的细胞分配器将低响应端点模型细胞和高响应端点模型细胞分别分配成预枚举细胞份，再按参考加入数量组合，使各水平的模型细胞总数相同；2个端点分别具有可区分的身份参考信号，所述身份参考信号仅用于确定检测后组成，不参与单个模型细胞机械响应的计算；在样本检测前对2个端点进行独立尺寸测量，使用相同的等效直径分层边界，将2个端点均达到预设参考数量的直径层确定为共同直径层，并在梯度水平解码前锁定共同直径层及其层间权重。

7、将2个端点分别采用2种身份标记方式进行交叉标记，形成标记正置样本和标记互换样本；所述端点动态范围为2种标记方式下高响应端点与低响应端点机械响应差值的绝对值中的较小值；同一端点在2种标记方式下的机械响应差不大于端点动态范围的10%时，使用相应身份参考信号；各梯度样本采用包含全部梯度水平的平衡随机区组次序检测，功能表型比例总体递增的区组与总体递减的区组数量相同，区组内中间水平按照预先生成的随机序列排列。

8、所述待验证分析仪的微流控观察芯片包括尺寸检测区、微阀分配器和多个尺寸适配通道；每个尺寸适配通道依次设置4个镜像分叉—汇合单元，每个镜像分叉—汇合单元包括入口基线段、单侧楔形激励段、响应观察段、对称分叉段、2条等流阻支路、汇合段和恢复段，响应确认位置位于所述响应观察段；采用至少3种直径的刚性标定微粒，在各微粒直径和入口位置区间内建立刚性被动参照轨迹，以完整轨迹的最大标准化横向残差的预设高分位数形成轨迹级同时预测包络；按微粒直径汇集覆盖2条支路分界两侧的轨迹建立条件化被动支路边界；使用未用于建立所述轨迹级同时预测包络的复核轨迹，按照与模型细胞相同的跨界判据确定刚性标定微粒假跨界率。

9、将模型细胞分配至楔形结构最小间隙为模型细胞等效直径110%～135%的尺寸适配通道；第k个镜像分叉—汇合单元的定向残差为模型细胞在该单元响应确认位置的横向坐标与以模型细胞等效直径及该单元入口横向坐标为条件的刚性被动参照轨迹横向坐标之差，经该单元的镜像方向系数变换后除以该单元入口基线段宽度所得数值；模型细胞机械响应为4个定向残差之和除以4所得数值，固定方向偏差为第1个和第4个定向残差之和减去第2个和第3个定向残差之和后除以4所得数值，先后次序偏差为第1个和第3个定向残差之和减去第2个和第4个定向残差之和后除以4所得数值，单元对间漂移为第1个和第2个定向残差之和减去第3个和第4个定向残差之和后除以4所得数值。

10、从运动图像中确定峰值轮廓变形指数和轮廓恢复长度；轮廓恢复条件为模型细胞离开楔形结构后连续10帧的轮廓变形指数与入口基线值之差的绝对值，均不大于入口基线重复测量标准差的2倍和0.005中的较大值；完整轨迹分析数量由4个镜像分叉—汇合单元的轨迹均完整、图像质量合格且后续各单元入口平均速度相对于第1个单元入口平均速度的偏差不超过10%的模型细胞构成；固定方向偏差、先后次序偏差和单元对间漂移在全部具有完整轨迹的模型细胞上独立统计，不作为完整轨迹的预先排除条件。

11、对每个功能表型比例水平的各平行样本，在每个共同直径层内计算身份可判定且具有完整轨迹的模型细胞机械响应算术平均值及高响应端点模型细胞实测组成比例；先以平行样本为统计单位计算各共同直径层的机械响应平均值，再按照检测前锁定且不随检测数量改变的相同层间权重，分别汇总各比例水平的实测机械响应；根据各共同直径层内2个端点的机械响应平均值和中间水平的层内实测组成比例确定层内期望机械响应，并按照所述层间权重汇总；以实测机械响应与期望机械响应之差的绝对值除以高响应端点与低响应端点的汇总机械响应之差，得到功能梯度闭合偏差；以具有完整轨迹且身份可判定的高响应端点模型细胞实测组成比例与参考加入比例之差的绝对值，得到组成保持偏差。

12、刚性标定微粒复核不满足轨迹漂移条件或假跨界率条件时，输出运行条件无效及流路或成像基线异常；计数线性、检测回收率、携带污染率或完整轨迹分析产率不满足相应验收条件时，分别输出模型细胞检测异常或图像分割与轨迹续接异常；固定方向偏差、先后次序偏差或单元对间漂移不满足相应限值时，输出镜像方向异常、恢复段记忆异常或运行内漂移异常；留样复核份仍满足独立端点赋值条件，而待验证分析仪测得的高响应端点机械响应未高于低响应端点机械响应与噪声限值之和，或者功能梯度闭合偏差或组成保持偏差不满足验收条件时，输出机械响应分析异常；留样复核份不再满足独立端点赋值条件时，输出梯度材料无效；全部项目满足相应验收条件时，输出模型细胞梯度功能验证通过。

13、与仅使用单一模型细胞水平进行核查相比，本方法分别设置加入数量梯度和功能表型组成梯度，模型细胞总负荷变化与功能表型比例变化由2组样本分别评价。低计数水平采用成像确认的逐细胞分配结果作为整数参考值，高计数水平采用数字成像计数和质量法分配并记录赋值不确定度。2个端点由待验证分析仪之外的参考方法赋值，身份参考信号仅用于确定检测后组成，不参与单个模型细胞机械响应计算。刚性标定微粒形成按直径、实体单元和入口位置条件化的被动参照轨迹，轨迹级同时预测包络约束完整路径上的被动波动。楔形结构依次位于左侧、右侧、右侧和左侧时，4次定向残差经完整正交分解得到模型细胞机械响应、固定方向偏差、先后次序偏差和单元对间漂移，流路固定偏移、单元内次序影响和运行内漂移分别保留。共同直径层和检测前锁定的层间权重限制端点尺寸分布差异造成的响应偏移；层内实测组成比例、端点算术平均响应和中间水平响应构成功能梯度闭合关系，能够识别端点可分而中间组成跟随异常的分析状态。分项判定结果分别对应流路与成像基线、模型细胞检出、图像分割与轨迹续接、镜像方向、恢复段记忆、运行内漂移和机械响应分析功能。