一种检测生长激素释放肽的比率型针灸针传感器及其制备方法

本发明涉及一种传感器及其制备方法，更具体一点说，涉及一种检测生长激素释放肽的比率型针灸针传感器及其制备方法，属于电化学分析检测。

背景技术：

1、生长激素释放肽，（ghrl）是由胃黏膜细胞分泌的一种含28个氨基酸的生物活性多肽，在人体能量稳态调节及食欲调控中发挥关键作用，同时参与介导胃肠分泌、肠道运动及胰腺内分泌功能的生理调节过程。新兴的临床和生物学证据表明，循环ghrl水平异常与多种疾病进展密切相关，包括帕金森病、阿尔茨海默病、终末期肾病及胃肠道恶性肿瘤。因此，ghrl已被证实为相关疾病早期病理评估和预后评价中具有前景的外周生物标志物。

2、目前，ghrl的常规定量检测手段主要包括放射免疫分析法、液相色谱-串联质谱法及酶联免疫吸附测定法。然而这些方法高度依赖于精密分析仪器、昂贵的实验耗材和专业的操作技能，同时存在潜在的职业危害，且难以适应资源有限的临床场景，因此，研发一种便携低成本、具备双信号自校正、识别响应速度快、特异性强的ghrl微型电化学传感器是必然的趋势。

技术实现思路

1、为了解决现有生长激素释放肽检测手段仪器昂贵、操作复杂、单信号电化学检测易受环境干扰、传统分子印迹聚合物模板洗脱困难、靶标响应缓慢的技术问题，本发明提供一种检测生长激素释放肽的比率型针灸针传感器及其制备方法。

2、为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

3、本发明一种检测生长激素释放肽的比率型针灸针传感器的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

4、步骤1）针灸针预处理：打磨抛光针灸针，分别在乙醇和去离子水中超声清洗5分钟，氮气吹干备用；

5、步骤2）金纳米粒子的修饰：将经过步骤1）预处理后的针灸针作为工作电极，针灸针针尖部分浸泡在含kcl的haucl4溶液中，进行循环伏安扫描，所得电极记作anme/aunps；

6、步骤3）单壁碳纳米管的修饰：将步骤2）所得的anme/aunps电极作为工作电极，在含有3，4-乙烯二氧噻吩和单壁碳纳米管的水溶液中电聚合，聚合完成后获得修饰后的电极，用水清洗并晾干，获得电极anme/aunps/swcnts；

7、步骤4）内置信号的修饰：将步骤3）获得的anme/aunps/swcnts电极浸泡在甲萘醌溶液中进行循环伏安扫描，获得电极anme/aunps/swcnts/pmnq；

8、步骤5）β-环糊精的修饰：将步骤4）获得的anme/aunps/swcnts/pmnq电极浸泡在β-环糊精溶液中进行循环伏安扫描，获得电极anme/aunps/swcnts/pmnq/pβ-cd；

9、步骤6）模板分子的结合：将步骤5）获得的anme/aunps/swcnts/pmnq/pβ-cd电极浸入ghrl（生长激素释放肽溶液）溶液中，在0℃至4℃条件下孵育10h，获得电极anme/aunps/swcnts/pmnq/pβ-cd~ghrl；

10、步骤7）印迹聚合膜的修饰：将步骤6）获得的电极作为工作电极，通过循环伏安扫描对酸性铬蓝k进行电聚合，获得电极anme/aunps/swcnts/pmnq/pβ-cd~ghrl/pacbk；

11、步骤8）参比信号的修饰：将步骤7）所得电极距针尖5 mm部分浸泡在阿魏酸溶液中进行循环伏安扫描，获得电极anme/aunps/swcnts/pmnq/pβ-cd~ghrl/pacbk/pfa；

12、步骤9）模板分子的洗脱：洗脱步骤8）获得电极上包裹的ghrl（生长激素释放肽）模板，得到表面分子印迹微传感器anme/aunps/swcnts/pmnq/pβ-cd~ghrl@smip~pfa。

13、优选的，步骤2）循环伏安扫描速率25 mv/s，电势区间-1.5 v至0.5 v，扫描5个周期；haucl4溶液浓度2.5 m mol/l，针灸针10 mm针尖部分浸泡在含kcl的haucl4溶液中。

14、优选的，步骤3）电聚合电位1.2 v，聚合时长110 s；3，4-乙烯二氧噻吩溶液浓度为0.02 mol/l，单壁碳纳米管溶液浓度为2 mg/ml。

15、优选的，步骤4）中所述甲萘醌溶液为0.1 m pbs（甲萘醌溶解在0.1 m的磷酸盐缓冲液中形成的溶液），其ph值为7.0，浓度为1 mm；电聚合电位区间-0.6 v至0 v，扫描速率50mv/s，循环扫描10次。

16、优选的，步骤5）β-环糊精溶液为0.1 m pbs（β-环糊精溶解在0.1 m的磷酸盐缓冲液中获得溶液），其ph值为7.5，浓度为10 mm；电聚合电位区间-1 v至1.0 v，扫描速率70mv/s，循环扫描4次。

17、优选的，步骤6）ghrl溶液为0.01 m pbs（生长激素释放肽溶解在0.1 m的磷酸盐缓冲液中获得溶液），且ph值为7.4，浓度为5 μg/ml，孵育时长10 h。

18、优选的，步骤7）酸性铬蓝k的溶液为0.05 m pbs（酸性铬蓝k溶解在0.05 m的磷酸盐缓冲液中获得溶液），其ph值为7.0，浓度为0.5 mm；电聚合电位区间-0.4 v至1.5 v，扫描速率70 mv/s，循环扫描45次。

19、优选的，步骤8）阿魏酸溶液为0.1 m pbs（阿魏酸溶解在0.1 m的磷酸盐缓冲液中获得溶液），且ph值为4.5，浓度为0.4 mm；电聚合电位区间-0.25 v至0.75 v，扫描速率50mv/s，循环扫描10次；电极使用前通入氮气10 min。

20、优选的，步骤9）洗脱采用的洗脱剂为含5%甲醇的0.1 m pbs（5%甲醇溶解在0.1 m的磷酸盐缓冲液中获得溶液），其ph值为5.0溶液，洗脱时长60 min。

21、本发明一种采用所述方法制备得到的检测生长激素释放肽的比率型针灸针传感器。

22、相对于现有技术本技术具有如下有益效果：

23、1）本发明通过构建内置信号（mnq）与参比信号（fa）双输出模式，利用两者峰电流的比值进行定量校准，能够有效抵消环境温度、溶液ph、电极表面状态波动及非特异性吸附等因素引起的背景干扰，大幅降低了单信号输出模式易产生的假阳性或假阴性风险，显著提高了ghrl在复杂生物样本中的检测准确性和可靠性。

24、2）本发明以针灸针微电极（anme）为基底，通过电沉积金纳米粒子（aunps）和单壁碳纳米管（swcnts）进行双重功能化修饰，利用aunps的高导电性和生物相容性以及swcnts的大比表面积和优异电子传递能力，协同增大了电极有效比表面积并加速了界面电子转移速率，从而显著放大了电化学响应信号，实现了对ghrl的痕量级高灵敏检测。

25、3）本发明通过电聚合技术依次可控地构建mnq内置信号层、β-环糊精锚定层、acbk印迹识别层及fa参比信号层，各功能层厚度和修饰量可通过电聚合参数（电位、时间、扫描圈数）精确调控，具有良好的批次间重复性。经系统优化验证，所得比率型电化学传感器展现出宽线性检测范围、超低检测限、优异的重复性、长期稳定性和突出的抗干扰能力。

26、4）本发明采用表面分子印迹聚合物（smips）构建识别层，将ghrl的特异性识别空腔直接形成于电极材料表层，有效缩短了目标分子的扩散路径，降低了界面传质阻力，在保持优异特异性结合能力的同时实现了快速响应平衡，克服了传统本体印迹聚合物模板包埋过深、洗脱困难和结合动力学缓慢的技术缺陷。

27、5）本发明所构建的比率型电化学传感器制备成本低廉，检测过程无需复杂样品前处理及昂贵标记物，配合便携式电化学工作站即可实现快速检测，操作简便、对操作人员专业技能要求低，且针灸针微电极尺寸微小、适于微量样本检测，特别适用于资源有限的基层医疗机构、现场即时检测（poct）及临床大规模筛查场景，具有良好的产业化应用前景。