一种提取与分离纳米颗粒蛋白冠的方法与应用

本发明涉及分析检测，尤其是涉及一种提取与分离纳米颗粒蛋白冠的方法与应用。

背景技术：

1、纳米颗粒蛋白冠是纳米颗粒与生物体液接触后，由多层吸附蛋白形成的冠层结构。近年来的研究发现，蛋白冠会改变纳米颗粒的表面理化性质，进而影响纳米颗粒与生物系统的相互作用。已有的研究发现，蛋白冠的组成显著影响了纳米颗粒的体内分布和毒性效应，对纳米药物的功能产生重要的影响。因此，全面分析纳米颗粒蛋白冠的组成是纳米载药领域的基础。

2、根据蛋白在纳米颗粒表面的停留时间与亲和力的强弱，蛋白冠可以分为硬冠和软冠。其中，硬冠蛋白具有高亲和力和长停留时间，与纳米颗粒结合紧密。而软冠蛋白与纳米颗粒的亲和力较弱，易与周围蛋白发生交换，进而产生级联生物响应。由于蛋白冠隔离了纳米颗粒与生物体系，因而对纳米载药系统的治疗效果产生诸多干扰。已有研究发现，蛋白冠的组成显著影响了纳米颗粒的生物响应和毒性效应，因此精准分离纳米颗粒的蛋白冠是实现纳米载药系统应用的前提。

3、现有分离蛋白冠的方法主要依赖高速离心和磁分离。高速离心是借助离心力从生物体液中分离纳米颗粒，经多次洗涤后获得蛋白冠。离心分离法具有快速便捷等优势，但是需要经过反复高速离心和清洗，破坏了软冠蛋白的结构，因而只能分离硬冠蛋白。磁分离是借助外加磁场实现对四氧化三铁纳米颗粒蛋白冠的分离。该方法分离速度快，分离过程温和，因而能保留软冠蛋白，但是磁分离过程中四氧化三铁纳米颗粒的团聚会非特异性包埋未吸附的蛋白，导致蛋白冠的分离纯度不高。目前，尚没有普适、通用的纳米颗粒硬冠和软冠的分离方法。因此，亟需开发能够快速、原位分离纳米颗粒表面多层蛋白冠的新方法，以便于检测蛋白冠的组成，为进一步探究纳米颗粒与生物系统的相互作用以及纳米载药系统的合理设计提供基础。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种提取与分离纳米颗粒蛋白冠的方法与应用。本发明采用醛类固定剂原位固定纳米颗粒蛋白冠，通过高速离心实现蛋白冠分离的方法，并借助解交联方法实现对硬冠和软冠蛋白的组成分析。

2、本发明的技术方案如下：

3、本发明的第一个目的是提供一种提取与分离纳米颗粒蛋白冠的方法，包括如下步骤：

4、（1）将纳米颗粒与生物体液共同孵育，加入醛类固定剂固定硬冠和软冠，离心清洗，制得交联的纳米颗粒蛋白冠；

5、生物体液为直接来源于生物体的体液或处理液；醛类固定剂为乙二醛或甲醛；

6、（2）将交联的纳米颗粒蛋白冠溶解在解离缓冲液中，加热孵育后加入上样缓冲液，实现解交联；

7、（3）经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（sds-page）电泳分离后，进行蛋白质组成分析，获得蛋白冠的组成。

8、在本发明的一种实施方式中，步骤（1）中，纳米颗粒为金属有机骨架纳米颗粒mil-101，粒径为100 nm-200 nm。

9、优选地，纳米颗粒mil-101的粒径为110nm-140 nm。

10、在本发明的一种实施方式中，步骤（1）中，生物体液为血清、血浆、尿液、肺灌洗液、肠液、细胞裂解液中的一种或多种。

11、在本发明的一种实施方式中，步骤（1）中，醛类固定剂为乙二醛水溶液，反应体系中乙二醛的质量浓度为2%-8%。

12、在本发明的一种实施方式中，步骤（1）中，共同孵育的条件为：孵育温度为4-37°c，孵育时间为1min-24 h；固定硬冠和软冠的条件为：20-37 °c下孵育5-30 min。

13、优选地，共同孵育的条件为：37℃下，孵育1h。

14、优选地，固定硬冠和软冠的条件为：37 °c下孵育20 min。

15、在本发明的一种实施方式中，步骤（1）中，纳米颗粒以水溶液的形式加入反应体系，纳米颗粒的浓度不超过500 μg/ml，加入体积不超过生物体液体积的10%；乙二醛加入体积不超过生物体液体积的10%。

16、在本发明的一种实施方式中，步骤（2）中，解离缓冲液为20 mm的磷酸盐缓冲液，包含磷酸氢二钠和磷酸二氢钾，ph为7.4-9.0。

17、在本发明的一种实施方式中，步骤（2）中，加热孵育的条件为：40-95 °c下加热孵育5-30 min。

18、在本发明的一种实施方式中，步骤（2）中，上样缓冲液为20 mm 三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液（tris-hcl），ph 6.8。

19、在本发明的一种实施方式中，步骤（3）中，sds-page电泳分离的条件为100 v电压，分离90 min，所用的电泳缓冲液为0.1% sds，10 mm tris，20 mm甘氨酸；蛋白组分析采用label-free lcms/ms方法。

20、本发明的第二个目的是提供上述方法的应用，用于纳米医药、环境毒理领域中蛋白冠分离分析。

21、有益效果：

22、本发明方法基于醛类分子原位固定和解交联，实现纳米颗粒表面软冠和硬冠的高效分离和组成分析。本发明提供的原位固定和解交联方法能够对复杂生物体液中的蛋白冠进行快速分离和分析，具有效率高、分离快速等优点。

23、本发明方法填补了纳米颗粒表面蛋白硬冠和软冠高效、快速、原位分离的空缺，实现了高时空分辨下蛋白冠的可控分离和鉴定，特别是在软冠分析方面具有广阔的应用前景，为进一步探究纳米颗粒与生物体的相互作用以及纳米载药系统的合理设计提供了有效方法；

24、本发明方法无需实现对纳米颗粒或蛋白冠进行标记，对蛋白吸附不产生干扰。且本方法操作简便，成本低廉，抗干扰能力强，适用于多种纳米颗粒蛋白冠的分离分析。

25、本发明方法可适用于体内和体外纳米颗粒蛋白冠的分离分析。

1.一种提取与分离纳米颗粒蛋白冠的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，纳米颗粒为金属有机骨架纳米颗粒mil-101，粒径为100 nm-200 nm。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，生物体液为血清、血浆、尿液、肺灌洗液、肠液、细胞裂解液中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，醛类固定剂为乙二醛水溶液，反应体系中乙二醛的质量浓度为2-8%。

5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，共同孵育的条件为：孵育温度为4-37°c，孵育时间为1min-24 h；固定硬冠和软冠的条件为：20-37 °c下孵育5-30 min。

6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，解离缓冲液为20 mm的磷酸盐缓冲液，包含磷酸氢二钠和磷酸二氢钾，ph为7.4-9.0。

7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，加热孵育的条件为：40-95 °c下加热孵育5-30 min。

8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，上样缓冲液为20 mm tris-hcl缓冲液，ph 6.8。

9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，sds-page电泳分离的条件为100 v电压，分离90 min，所用的电泳缓冲液为0.1% sds，10 mm tris，20 mm甘氨酸；蛋白组分析采用label-free lcms/ms方法。

10.权利要求1-9任一项所述方法的应用，其特征在于，用于纳米医药、环境毒理领域中蛋白冠分离分析。