一种简易的纳流液相色谱柱填充装置及方法与流程

本发明涉及液相色谱柱制备，特别是涉及一种简易的纳流液相色谱柱填充装置及方法。

背景技术：

1、纳流液相色谱作为高效液相色谱微型化的重要分支，采用内径小于100μm的毛细管色谱柱，流动相流量仅为每分钟几十至几百纳升，相较于常规液相色谱具有溶剂消耗少、样品需求量小、检测灵敏度高以及与质谱联用兼容性好等显著优势，在蛋白质组学、代谢组学、单细胞分析及微量药物代谢等前沿领域发挥着不可替代的作用。色谱柱作为核心分离部件，其填充质量直接决定分离度、峰容量及重现性。然而，商品化纳流色谱柱价格昂贵，单根售价数千至近万元，且因内径极细、易堵塞损坏，属于高频耗材，显著增加了运行成本和技术普及门槛。为此，许多实验室尝试自行填装，填充方法也从早期手动加压或注射器推注（压力低、重现性差）逐步演进，目前高压匀浆法成为主流，此外离心填充法虽能提高通量但依赖昂贵离心机及专用转子，普及性有限。

2、现有技术中，高压匀浆填充方案通常采用内径50–75μm石英毛细管，填充亚2μm反相键合硅胶填料，以高压色谱泵在300bar以上压力驱动匀浆，出口端通过激光拉针仪或程控高温烧结炉制备柱塞。然而存在四方面突出问题：其一，设备依赖度高且压力要求苛刻，填充阻力随内径平方反比剧增，常规高压钢瓶（约130–150bar）无法驱动，必须依赖昂贵的高压色谱泵，购置成本数万至数十万元，普通实验室难以具备条件；其二，填充装置多为各实验室非标准化搭建，涉及复杂气液路连接和压力控制模块，缺乏统一简便的可复制设计，无经验人员难以从零搭建，即便参照文献也常因密封、压力稳定性等问题导致失败或重现性差；其三，匀浆中填料颗粒在长时间填充过程易团聚沉降，导致柱床内空隙、裂缝或密度不均，显著降低柱效并增加峰展宽，且稳定填充长度受限，难以达到20cm以上的高效长柱；其四，出口端筛板制作依赖高温烧结设备（激光拉针仪或烧结炉），化学聚合法虽可替代但耗时长、死体积难控、失败率高，进一步抬高了设备门槛。

3、综上所述，现有纳流色谱柱填充技术普遍面临设备成本高昂、操作复杂、柱床均匀性差以及长柱制备困难等不足，尤其是对高压恒流泵和高温烧结设备的刚性依赖，严重制约了该技术在普通实验室的推广。

4、为此，提出一种简易的纳流液相色谱柱填充装置及方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种简易的纳流液相色谱柱填充装置及方法，旨在解决或改善上述技术问题中的至少之一。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：本发明提供一种简易的纳流液相色谱柱填充装置，包括：

3、供压设备，所述供压设备用于提供高压氮气；

4、管道组件，所述管道组件通过减压阀安装在所述供压设备的出气端；

5、变径连接组件，所述变径连接组件安装在所述管道组件远离所述供压设备的一端；

6、三通阀，所述三通阀可拆卸连接在所述管道组件上；

7、色谱柱管，所述色谱柱管可拆卸连接在所述变径连接组件上，所述色谱柱管的内径大于100μm；

8、其中，所述色谱柱管远离所述变径连接组件的一端填充筛板。

9、根据本发明提供的一种简易的纳流液相色谱柱填充装置，所述管道组件包括第一管道和第二管道，所述第一管道的一端通过所述减压阀安装在所述供压设备的出气端，另一端通过卡套螺母与所述三通阀的进口端可拆卸连接；所述第一管道的一端与所述变径连接组件可拆卸连接，另一端通过卡套螺母与所述三通阀的出口端可拆卸连接；

10、所述第一管道与所述减压阀之间通过螺帽固定连接。

11、根据本发明提供的一种简易的纳流液相色谱柱填充装置，所述变径连接组件包括双卡套气管变径接头和特氟龙管，所述双卡套气管变径接头的大口径端与所述第二管道可拆卸连接，另一端与所述特氟龙管可拆卸连接，所述特氟龙管远离所述双卡套气管变径接头的一端与所述色谱柱管可拆卸连接。

12、根据本发明提供的一种简易的纳流液相色谱柱填充装置，所述第一管道和所述第二管道均采用不锈钢材质制成；所述第一管道和所述第二管道的外径均为1/4英寸；

13、所述第一管道和所述第二管道的壁厚均为1.0mm～1.5mm；

14、所述第一管道和所述第二管道的长度均为80mm～120mm。

15、根据本发明提供的一种简易的纳流液相色谱柱填充装置，所述供压设备采用高压氮气瓶，所述色谱柱管采用石英毛细管。

16、根据本发明提供的一种简易的纳流液相色谱柱填充装置，所述色谱柱管的内径为120μm～10μm，所述色谱柱管的外径为300μm～400μm。

17、根据本发明提供的一种简易的纳流液相色谱柱填充装置，所述双卡套气管变径接头的两端内径分别为1/4英寸和1/16英寸。

18、本发明还提供一种简易的纳流液相色谱柱填充方法，包括以下步骤：

19、步骤一、搭建填充装置：将减压阀安装在供压设备的出气端，将管道组件通过减压阀与供压设备连接，将三通阀连接在管道组件上，将变径连接组件安装在管道组件远离供压设备的一端；

20、步骤二、制作筛板：截取色谱柱管，取颗粒物置于平整表面，将色谱柱管一端的端面垂直对准颗粒物，将颗粒物压入色谱柱管端部管腔形成筛板；

21、步骤三、配制匀浆填料：以乙醇作为匀浆溶剂，将色谱填料与无水乙醇混合，经涡旋振荡和超声处理使填料分散均匀，制得匀浆填料；

22、步骤四、转移匀浆填料：将管道组件与三通阀分离，将匀浆填料注入管道组件内腔，然后将管道组件重新连接至三通阀，将带有筛板的色谱柱管与变径连接组件密封连接；

23、步骤五、加压填充：关闭三通阀的卸压口，开启供压设备，调节减压阀出口压力至预定压力，使填料在高压氮气的压力作用下向色谱柱管出口端推进，形成色谱柱床；

24、步骤六、释压与后处理：待填料堆积至目标长度后，关闭供压设备，打开三通阀的卸压口释放残压，取出填充完成的色谱柱。

25、根据本发明提供的一种简易的纳流液相色谱柱填充方法，步骤二中，所述颗粒物采用二氧化硅球形颗粒，颗粒物的粒径与色谱柱管内径相适配；将颗粒物压入色谱柱管端部管腔后，嵌入深度为0.5mm～1mm。

26、根据本发明提供的一种简易的纳流液相色谱柱填充方法，步骤三中，称取10mg色谱填料加入1ml无水乙醇，涡旋振荡1分钟，再超声处理5分钟；

27、步骤五中，所述预定压力为6mpa。

28、本发明公开了以下技术效果：

29、本发明中色谱柱管的内径大于100μm，提高色谱柱对样品杂质的耐受能力，不易堵塞，延长使用寿命，降低更换频率，较大的内径使柱床结构对压力波动的机械耐受性增强；同时由于增加了色谱柱管的内径，在相同填充工况下色谱柱管内的流动背压与内径的平方成反比，使得可以提供常规高压氮气的供压设备经减压阀可在稳定输出的压力即可完成的填充操作，从而在工程上实现了压力源与填充需求的匹配，避开了昂贵高压色谱泵的使用，填充装置搭建简单，成本较低。

30、本发明以乙醇作为匀浆溶剂，能够使匀浆填料在数小时的填充时间窗口内维持良好的悬浮均匀性，确保进入毛细管的填料浓度始终稳定，进而形成密度一致的柱床，显著减少了空隙和裂缝，提高色谱柱制备成功率和柱床均匀性。

31、本发明采用颗粒物压入色谱柱管端部管腔形成筛板，通过机械嵌合方式固定于色谱柱管端部，颗粒与管壁间通过弹性接触应力和摩擦形成稳定的机械锚定，全过程无需任何专用设备，制作时间短、成功率高，柱后死体积可控，筛板制作简便快捷，无需昂贵高温烧结设备。

32、本发明可根据实验需求灵活调整填料类型、色谱柱管的柱长与固定相，尤其适用于日常维护、方法开发以及资源有限的科研教学单位，有力推动了纳流液相色谱技术的普及应用。