一种检测抗IL-2中和抗体的方法与流程

本发明涉及一种检测抗il-2中和抗体的方法，属于分析。

背景技术：

1、il-2是主要由cd4阳性t细胞分泌的多功能细胞因子。它通过与il-2受体（il-2r）结合调节免疫反应。il-2r分为两种类型，高亲和力il-2r由三个亚基构成，α链（cd25），β链（cd122）和γ链（cd132）。高亲和力il-2r主要表达在treg细胞，新近激活的cd4阳性和cd8阳性效应t细胞，部分自然杀伤（nk）细胞和nkt细胞表面。中等亲和力的il-2r由两个亚基组成（cd122和cd132），主要表达在cd8阳性记忆t细胞和大多数nk细胞表面。il-2r信号传导不但影响效应t细胞、treg细胞，nk细胞等细胞的增殖，而且塑造它们的功能活性。

2、il-2在近30年前获得美国fda的批准，成为第1种抗癌免疫疗法。随后的研究发现它在通过调节性t细胞（treg）调节免疫耐受方面也具有重要的作用。目前临床实验中，低剂量il-2用于自身免疫病的治疗显示了较好的疗效。毒性反应及半衰期短是il-2临床应用的主要障碍。针对il-2半衰期短的问题，科学家们通过基因工程技术对其进行融合改造或是通过化学方法对其进行修饰，使其成为长效il-2，如il-2-fc, il-2-peg等，这些措施延缓了il-2在体内的代谢速度，从而延长了il-2的半衰期。

3、免疫原性检测是生物技术药物研发过程中必不可少的研究内容。根据fda发布的指导原则，药物免疫原性的评估是基于风险评估的整体性研究，通常贯穿生物技术药物研发的整个过程直至上市后。其中抗药中和抗体的产生能够导致药效的降低甚至丧失，也可以影响药物的药物代谢，直接关系到新药研发的成败。

4、目前，尚未见il-2中和抗体检测方法的专利发布。在pubmed中检索到的检测il-2中和抗体的方法大多基于il-2促进细胞增殖原理。其流程为：将待测血清按一定比例的稀释后，与固定浓度的il-2混合孵育，再加入到细胞中培养一段时间，最后通过检测细胞数量的变化来判断血清样本中是否存在中和抗体。这类方法的主要缺陷在于无法有效去除血清样品中内源性il-2及外源性残留的il-2对检测结果的干扰。人体中存在内源性il-2，肿瘤患者在接受il-2治疗过程中，血清中可能同时存在il-2及抗il-2中和抗体。生物样本中内源的或外源残留的il-2会与抗药中和抗体形成复合物，从而干扰中和抗体的准确检测。如果检测方法无法有效去除药物残留带来的干扰（及耐药性问题），可能导致假阴性结果，这不仅会误导药物研发方向，还可能对临床试验参与者及新药上市后的用药人群造成潜在风险。因此抗药中和抗体分析方法中的耐药性问题已成为当前药物免疫原性研究工作中函待解决的关键问题。

技术实现思路

1、针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种检测抗il-2中和抗体的方法，目的在于解决生物样品中存在的内源性il-2或外源性残留il-2干扰中和抗体检测的技术问题。

2、本发明提供的第一个技术方案为一种人血清中抗il-2中和抗体的检测体系，所述检测体系含有生物素标记il-2、链霉亲和素、甘氨酸、hek-blue il-2细胞、qb regent检测试剂。

3、在某些实施方式中，还包括阳性对照样品，所述阳性对照样品为抗人il-2抗体。

4、本发明提供的第二个技术方案为一种试剂盒，所述试剂盒包括第一个技术方案所述的检测体系。

5、本发明提供的第三个技术方案为一种人血清中抗il-2中和抗体的体外检测方法，所述方法为利用第一个技术方案所述的检测体系或第二个技术方案所述的试剂盒进行人血清中抗il-2中和抗体的体外检测。

6、在某些实施方式中，所述方法包括如下步骤：

7、（1）样品酸解离：将样品和乙酸溶液按一定体积比加入96孔板中，震荡孵育一定时间；所述样品包括阴性对照样品、阳性对照样品、待测样品；

8、（2）样品碱中和及与生物素标记的il-2孵育：向步骤（1）的震荡孵育样品中加入生物素标记的il-2和tris 溶液调成中性，震荡孵育一定时间；

9、（3）细胞种板：复苏1支hek blue il-2细胞，接种至96孔板中，将细胞置于37°c，5%co2培养箱中备用；

10、（4）固相捕获生物素标记的il-2-中和抗体复合物：将（2）中样品加入包被了链霉亲和素96孔板中，震荡孵育；

11、（5）洗脱中和抗体：（4）中96孔板经过漂洗后，加入甘氨酸溶液，震荡孵育一定时间，获得中和抗体洗脱液；

12、（6）洗脱的中和抗体与il-2工作液混合孵育：将（5）中溶液加入tris 溶液调成中性；然后加入使用细胞培养基稀释的il-2孵育一定时间；

13、（7）加入细胞孵育：将（6）中的液体加入步骤（3）中已接种hek-blue il-2细胞的96孔板中，将细胞置于37℃，5% co2培养箱中培养一定时间；

14、（8）检测吸光度：每孔取一定体积的细胞上清，加入新的96孔培养板中，再加入qbregent检测试剂，将板置于37℃，5% co2培养箱中孵育1小时，使用酶标仪检测640 nm吸光度。根据吸光度计算样品的抑制率，判断样品中是否存在抗il-2中和抗体。

15、在某些实施方式中，步骤（1）中，所述乙酸的终浓度为240 mm。

16、在某些实施方式中，步骤（2）中，生物素标记的il-2的浓度为2 mg/ml。

17、在某些实施方式中，步骤（5）中，甘氨酸的浓度为100 mm。

18、在某些实施方式中，步骤（6）中，样品加入100 μl含40 ng/ml il-2的细胞培养基。

19、在某些实施方式中，步骤（8）中，细胞上清与qb检测试剂的体积比为1:9。

20、本发明提供的第四个技术方案为第一个技术方案所述的检测体系或第二个技术方案所述的试剂盒在体外检测人血清中抗il-2中和抗体中的应用。

21、相比于现有技术，本发明的有益效果如下：

22、1. 本方法通过样品酸解离、固相捕获及洗涤等步骤可有效去除血清基质对检测的干扰。

23、2. 本发明方法耐药性好，1 μg/ml 阳性抗体可耐受125 ng/ml il-2。

24、3. 本发明方法灵敏度高。

25、4. 本发明方法用时少，实验整个流程少于30小时。

1. 一种人血清中抗il-2中和抗体的检测体系，其特征在于，所述检测体系含有生物素标记il-2、链霉亲和素、甘氨酸、hek-blue il-2细胞、qb regent检测试剂。

2.根据权利要求1所述的检测体系，其特征在于，还包括阳性对照样品，所述阳性对照样品为抗人il-2抗体。

3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1~2任一项所述的检测体系。

4.一种人血清中抗il-2中和抗体的体外检测方法，其特征在于，所述方法为利用权利要求1~2任一项所述的检测体系或权利要求2所述的试剂盒进行人血清中抗il-2中和抗体的体外检测。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述乙酸的浓度为240 mm。

7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，生物素标记的il-2的浓度为2mg/ml。

8. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，甘氨酸的浓度为100 mm。

9. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（8）中，细胞上清与qb regent检测试剂的体积比为1:9。

10.权利要求1~2任一项所述的检测体系或权利要求3所述的试剂盒在体外检测人血清中抗il-2中和抗体中的应用。