一种高灵敏度蛋白质免疫检测探针试纸及装置

本发明涉及蛋白检测，尤其是涉及一种高灵敏度蛋白质免疫检测探针试纸及装置。

背景技术：

1、针对待测浓度比较低(例如心肌肌钙蛋白i(ctni)的检测浓度通常为100-10pg/ml)的生物标记物，传统的临床检测主要是在医院使用大型、复杂的机器设备进行的，整个过程至少需要一个小时才能完成。这些耗时的检测方法会导致治疗延误，并可能引起不必要的死亡。此外，偏远地区和低收入地区的患者往往无法获得有效的诊断工具，从而加剧了因治疗延误或缺失而导致的死亡率。因此，迫切需要一种快速、易用、高灵敏度、高准确性和高成本效益的诊断解决方案，以促进疾病的早期检测，进而实现在急性心肌梗死的早期阶段进行及时干预，大幅改善患者预后，挽救生命，提高患者生存质量的目的。

2、侧流分析法(lfa)是最有希望满足快速、可靠检测低浓度生物标记物要求的工具之一。由于其操作简单、成本低、准确性高，lfa已被广泛应用于各个领域，包括食品毒素检测、环境检测、疾病诊断和sars-cov-2筛查。然而，lfa的灵敏度较差，只能检测浓度超过纳克/毫升的生物标记物。这一局限性限制了其在低浓度生物标记物检测中的应用，例如ctni浓度通常为100-10pg/ml，还有一些高致命性毒素的待测浓度，远低于lfa的检出限。金纳米粒子(aunps)作为传统的、广泛使用的信号报告物，已被广泛应用于包括药物检测和妊娠检测在内的lfa中。目前，大多数家用lfa设备都采用了比色法，如基于aunps的lfa。然而，基于aunps的lfa的比色信号相对较弱，因此，也不适合低浓度生物标记物的检测。

3、在不使用先进的发光纳米材料或昂贵的检测设备的前提下，增强lfa的比色信号仍然是一项重大挑战。人们已经探索了许多提高lfa性能的方法，包括表面增强拉曼散射(sers)、量子点修饰微球和电化学方法。然而，这些方法大多需要额外的昂贵设备，如基于荧光或sers的激发激光器和滤光片，这严重限制了它们在家庭或更广泛的疾病筛查中应用的可行性。

4、目前，化学发光侧流免疫分析法(cl-lfas)已成为一种被广泛研究的、提高lfa检测性能的方法。cl-lfas是通过将抗体或hrp等酶结合到纳米颗粒上，并在lfa中使用这些共轭物，从而使cl-lfas产生强烈的化学发光信号，进而显著提高检测灵敏度。然而，传统的cl-lfas方法通常采用物理吸附或化学共价键来吸附蛋白质，往往导致吸附效率较低。此外，硝酸纤维素膜上hrp的非特异性吸附会增加背景信号，从而降低低浓度信号的清晰度。

5、有研究表明，使用peg化金纳米粒子(aunps)可以解决cl-lfas中的假阳性问题，但由于持续的高背景信号和环境光的严重干扰，会影响信号的清晰度，致使其临床检测性能并不理想，尤其是在分析物浓度较低的情况下。此外，其检测范围仍在1纳克/毫升以上，因此，不适合急性心肌梗死(ami)的早期诊断。因此，提高信号分子的结合效率，同时尽量减少背景噪声，仍然是提高cl-lfa s性能的关键挑战。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种高灵敏度蛋白质免疫检测探针试纸及装置，以解决目前对于浓度特别低的待测蛋白质的准确检测需要大型复杂的仪器设备、检测耗时长、地域限制显著，严重影响低浓度待测蛋白质的早期检测效率和覆盖率的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供一种共轭物，包括金纳米粒子和添加在金纳米粒子表面的待测蛋白的特异抗体、链霉亲和素-生物素。

3、一种如上所述的共轭物的制备方法，包括如下步骤：

4、s1、向碳酸钠溶液中依次加入金纳米粒子溶液和辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，混匀后振荡孵育，孵育结束后离心，将沉淀重新分散于平衡盐溶液中，得到共轭物i溶液；

5、s2、向制备的共轭物i溶液中加入链霉亲和素-生物素，充分混匀后振荡孵育，加入阻断剂后继续孵育，孵育结束后离心，将沉淀重新分散到回收液中，即获得目标共轭物的溶液。

6、优选的，s1中金纳米粒子溶液的浓度为0.1μg/ml～10mg/ml；碳酸钠溶液的浓度为0.01～0.1m；辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素的浓度为1mg/ml；金纳米粒子溶液：碳酸钠溶液：辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素的体积比为100～300:6～10:12～18；室温孵育40～80分钟；离心条件为可使固液分离的任意条件；平衡盐溶液的ph为8.0。

7、优选的，s2中链霉亲和素-生物素的反应浓度为50μg/ml；室温孵育10～60分钟，加入阻断剂后继续孵育10～60分钟；离心条件为可使固液分离的任意条件；阻断剂为bsa；回收液为含有1％bsa、5％蔗糖和0.1％吐温20的硼酸盐缓冲溶液。

8、一种高灵敏度共轭探针试纸，所述高灵敏度共轭探针试纸由pvc底板和置于pvc底板上的硝酸纤维素膜、样品垫和吸收垫组成；样品垫和吸收垫分别置于硝酸纤维素膜的两端，样品垫与硝酸纤维素膜、吸收垫与硝酸纤维素膜均无缝连接；样品垫与硝酸纤维素膜连接处上覆共轭垫；共轭垫上滴加上述共轭物；硝酸纤维素膜上固定测试线与对照线；测试线靠近共轭垫端。

9、优选的，共轭垫与样品垫、硝酸纤维素膜等宽；共轭垫覆盖范围约样品垫的1/3、硝酸纤维素膜的1/6；样品垫和共轭垫均为fusion3膜，硝酸纤维素膜的孔径为15μm，吸附垫的吸水能力为800～1300g/cm3；测试线为待测蛋白捕获抗体；对照线为山羊抗小鼠igg抗体。

10、一种如上所述的共轭物在免疫检测中的应用。

11、一种如上所述的高灵敏度共轭探针试纸在免疫检测中的应用。

12、一种双增强lfa检测装置，所述检测装置中含有上述高灵敏度共轭探针试纸，所述检测装置由外壳、支架和蓝牙遥控构成，外壳由底座和置于底座上的镜筒组成，镜筒上端安装高分辨率镜头，镜头与其上放置的手机的摄像头重合，手机另一端与支架相连，保持手机的稳定状态；底座设有可抽插高灵敏度共轭探针试纸的空隙；蓝牙遥控控制手机拍照；外壳为深色、不透光材质制成。

13、一种如上所述的双增强lfa检测装置在免疫检测中的应用。

14、本发明采用物理吸附法将hrp-sa吸附到金纳米粒子(aunps)表面，然后通过sa-bio相互作用和物理吸附，将bio-ab两次共轭到aunps上，获得共轭物au/hrp-sa/bio-ab，获得的共轭物au/hrp-sa/bio-ab可以为aunps上的生物抗体提供更多的结合位点，从而提高抗体和待测蛋白在共轭物表面的结合活性，进而增加免疫复合物被捕获抗体捕获的几率，从而提高检测灵敏度。

15、将制备的共轭物au/hrp-sa/bio-ab应用到侧流免疫层析试纸制备上，制得一种高灵敏度共轭探针试纸，当含ctni的待测样品加入样品垫后，会流向共轭垫，并与共轭垫中的共轭物au/hrp-sa/bio-ab相结合，随后移动到硝酸纤维素(nc)膜上的检测线上，被固定在检测线上的一抗捕获，aunps显示比色信号，而aunps上的hrp催化反应，显示化学发光信号。由于共轭物au/hrp-sa/bio-ab与目标分析物的结合几率比现有技术高得多，当免疫复合物流经检测线时，被捕获抗体捕获的几率也大幅增加，从而在检测线上产生更明显的信号，在比色和发光检测模式下，信号均会明显增强。

16、因此，本发明提供的一种高灵敏度蛋白质免疫检测探针试纸及装置，其具体技术效果如下：

17、(1)本发明提供了一种共轭物au/hrp-sa/bio-ab，稳定性好，通过物理吸附和相互作用力，将hrp-sa和sa-bio分次共轭到aunps表面，可以为待测蛋白提供更多的结合位点，提高待测蛋白与共轭物的结合活性，进而增加免疫复合物被捕获抗体捕获的几率，从而在检测线上产生更明显的信号，在比色和发光检测模式下，信号均会明显增强；

18、(2)本发明提供的一种共轭物au/hrp-sa/bio-ab，改变了共轭物的表面电荷状态，进而减少共轭物对nc膜的非特异性吸附，从而达到显著降低背景噪声的效果；

19、(3)本发明提供的一种共轭物au/hrp-sa/bio-ab，通过多层bio-ab涂层的使用以及sa和bio之间的强相互作用，显著增加了aunps上的抗体负载，进一步提高检测的灵敏度；

20、(4)本发明通过将nc膜、样品垫、吸收垫、共轭垫依次重叠在pvc底板上，在共轭垫上加入一定体积的共轭物au/hrp-sa/bio-ab，成功制得了一种用于侧流免疫分析法的高灵敏度共轭探针试纸；

21、(5)本发明提供了一种紧凑型双增强lfa检测装置，结构简单、成本低，检测速度快、灵敏度高、特异性强、准确性好，便于携带和转运，可以在不受环境光干扰的情况下有效捕捉检测过程中的比色和化学发光信号，适用范围广，在心脏疾病早期检测中具有广阔的应用前景。

22、下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。