糖肽试样的制造方法

本发明涉及糖肽试样的制造方法等。

背景技术：

1、在蛋白质的自下而上型蛋白质组学研究领域中，为了提高数据品质（蛋白质鉴定数、收率稳定性等）、使作业效率化、对应自动化，研究了各种各样的预处理法。作为其之一，可以列举sp3（single-pot, solid-phase-enhanced sample-preparation，单釜固相增强样品制备）法，在该方法中，能够使用数十纳米-数微米直径的磁性颗粒，在单管内进行蛋白质组学的试样制备（非专利文献1）。试样溶液中的蛋白质通过添加有机溶剂（乙醇、乙腈等）在磁性颗粒上凝集从而保持、清洗后，利用消化酶进行蛋白质消化工序。使用磁性颗粒的纯化的效率高，能够利用强力的变性剂且之后能够除去，消化效率提高。作为消化后的产物的肽也能够通过乙腈在磁性颗粒上保持、纯化。

2、另一方面，在专注于蛋白质的糖链修饰的作为蛋白质组学的分支领域的糖蛋白组学中，通过通常的蛋白质组学方法分析由生物体试样制备的总肽时，难以获得全面的数据。这是因为相比于非糖链加成肽，包含糖链修饰的肽（糖肽）质谱分析的检测灵敏度通常较低的缘故。

3、为了提高糖肽分析的数据品质，需要将由蛋白质消化产生的总肽混合物中的非糖链加成肽除去，分离糖肽。在糖肽的选择性纯化中，最常用的纯化方法主要是利用在糖肽上加成的糖链部分进行分离的亲水性相互作用液相色谱（hilic）的原理。在高有机溶剂（主要是乙腈）条件下在亲水性的固定相上将糖肽保持、清洗后，利用水比率高的溶剂洗脱糖肽。然而，蛋白质的预处理和糖肽的特异性纯化是独立进行的，并不适用于高效处理、特别是用于大规模分析的自动化方案。

4、现有技术文献

5、非专利文献

6、非专利文献1：mol syst biol. 2014 oct 30;10（10）:757. doi: 10.15252/msb.20145625. pmid: 25358341; pmcid: pmc4299378.

技术实现思路

1、发明所要解决的技术问题

2、本发明的技术问题在于提供一种糖肽相对于非糖肽的比例较高的糖肽试样的更有效的制造方法。

3、用于解决课题的技术方案

4、本发明的发明人鉴于上述技术问题进行了深入研究，结果发现，如果是如下的糖肽试样的制造方法，则能够解决上述技术问题，该制造方法包括：（3）使在表面保持蛋白质的颗粒与蛋白酶接触的工序、（4）在工序（3）之后添加有机溶剂的工序、和（5）清洗工序（4）中得到的颗粒的工序，上述颗粒为纤维素包覆颗粒，且/或在上述工序（4）中，与上述有机溶剂一起添加离子对试剂。本发明的发明人基于该发现进一步进行研究，结果完成了本发明。即，本发明包括下述方式。

5、项1.　一种糖肽试样的制造方法，其包括：

6、（3）使在表面保持蛋白质的颗粒与蛋白酶接触的工序、

7、（4）在工序（3）之后添加有机溶剂的工序、和

8、（5）清洗工序（4）中得到的颗粒的工序，

9、上述颗粒为亲水性聚合物包覆颗粒，且

10、在上述工序（4）中，与上述有机溶剂一起添加离子对试剂。

11、项2.　如项1所述的制造方法，其中，上述亲水性聚合物包覆颗粒为多糖类包覆颗粒。

12、项3.　如项2所述的制造方法，其中，上述多糖类包覆颗粒为纤维素包覆颗粒。

13、项4.　如项1所述的制造方法，其中，包括：（2）在工序（3）之前，在包含有机溶剂的溶液中使蛋白质与颗粒接触，使蛋白质保持于颗粒表面的工序。

14、项5.　如项4所述的制造方法，其中，在工序（2）中，包括分注含有上述颗粒和增粘剂的预先制备的颗粒悬液的工序。

15、项6.　如项5所述的制造方法，其中，上述增粘剂为甘油。

16、项7.　如项1所述的制造方法，其中，上述亲水性聚合物包覆颗粒为羧酸聚合物包覆颗粒。

17、项8.　如项1所述的制造方法，其中，上述亲水性聚合物包覆颗粒为磁性颗粒。

18、项9.　如项1所述的制造方法，其中，上述离子对试剂为有机酸。

19、项10.　如项9所述的制造方法，其中，上述离子对试剂包含卤代短链脂肪酸。

20、项11.　如项10所述的制造方法，其中，上述离子对试剂为包含卤代短链脂肪酸和非卤代短链脂肪酸的混合物。

21、项12.　如项1所述的制造方法，其中，上述有机溶剂为选自醇、乙腈和丙酮中的至少1种。

22、项13.　如项1～12中任一项所述的制造方法，其中，全部工序在同一容器内进行。

23、项14.　如项1～12中任一项所述的制造方法，其中，上述糖肽试样为质谱分析用试样。

24、项15.　一种通过项1～12中任一项所述的制造方法得到的糖肽试样。

25、项16.　一种蛋白质的糖链修饰的分析方法，其包括：对项15所述的糖肽试样进行质谱分析的工序。

26、发明效果

27、根据本发明，能够提供一种糖肽相对于非糖肽的比例较高的糖肽试样的更有效的制造方法。此外，还能够提供一种使用该糖肽试样的蛋白质的糖链修饰的分析方法。

1.一种糖肽试样的制造方法，其特征在于，包括：

2.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于：

3.如权利要求2所述的制造方法，其特征在于：

4.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于，包括：

5.如权利要求4所述的制造方法，其特征在于：

6.如权利要求5所述的制造方法，其特征在于：

7.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于：

8.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于：

9.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于：

10.如权利要求9所述的制造方法，其特征在于：

11.如权利要求10所述的制造方法，其特征在于：

12.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于：

13.如权利要求1～12中任一项所述的制造方法，其特征在于：

14.如权利要求1～12中任一项所述的制造方法，其特征在于：

15.一种糖肽试样，其特征在于：

16.一种蛋白质的糖链修饰的分析方法，其特征在于，包括：