一种基于限域萃取的血浆中蛋白质和脂质即时分离方法

本发明涉及生物样品前处理，特别是涉及一种基于限域萃取的血浆中蛋白质和脂质即时分离方法。

背景技术：

1、血浆作为临床检验中最常用的体液样本，具有采集微创、可及性高的优势，是寻找循环生物标志物和开展队列研究的重要材料。血浆脂质（如磷脂、鞘脂、胆固醇、甘油三酯等）在细胞膜结构维持、能量代谢及信号传导中发挥关键作用，血浆脂质代谢异常与多种疾病密切相关。因此，准确分析血浆脂质具有重要价值。

2、然而，血浆是一种成分极为复杂的生物基质，含有高丰度蛋白质（如白蛋白、免疫球蛋白等）以及多种活性酶类（如磷脂酶、脂蛋白脂肪酶等）。离体采样后，血浆中残存的磷脂酶等酶类仍具有催化活性，会持续催化脂质的水解与降解反应，导致脂质谱在样本前处理过程中发生离体变化。同时，高丰度蛋白质不仅会通过非特异性吸附干扰脂质的提取回收率，其形成的蛋白-脂质复合物还会影响脂质从基质中的释放效率。因此，在血浆脂质分析的前处理环节中，实现蛋白质与脂质的高效分离并有效控制酶活性对保证分析结果的准确性尤为重要。

3、针对上述需求，现有血浆前处理方法主要包括蛋白沉淀法、液液萃取法和固相萃取法：（1）蛋白沉淀法通过加入有机溶剂或酸碱试剂使蛋白质变性沉淀，再经离心或过滤去除。该方法操作相对简单，但存在固有缺陷：蛋白质的变性沉降过程需要一定时间才能完成，此间血浆中残存的磷脂酶等活性酶类仍持续催化脂质水解；沉淀的蛋白质会物理包裹部分脂质造成共沉淀损失；且净化程度有限，残留的磷脂类内源性干扰物会对后续液相色谱-串联质谱法（lc-ms/ms）分析产生显著离子抑制效应。（2）液液萃取法利用目标物在水相与有机相之间的分配差异实现萃取分离。该法存在以下不足：操作步骤繁琐、耗时长，萃取过程中酶类对脂质的降解作用难以被及时终止；需要使用大量有机溶剂，且难以同步去除蛋白质，需额外增加处理步骤，进一步延长了样品暴露于活性酶环境的时间，增大了脂质离体降解和分析误差的风险。（3）固相萃取法利用固相吸附剂对目标物的选择性吸附实现分离富集。该方法虽可实现一定程度的蛋白质去除，但现有技术通常要求预先进行蛋白沉淀或离心等前置处理，整体流程仍然冗长；固相传质过程依赖扩散控制，动力学速率较慢，萃取时间较长，样品在流程中持续面临酶解威胁。

4、综上所述，现有血浆前处理方法普遍存在操作流程耗时较长的问题，处理期间难以有效抑制活性酶类对脂质的持续代谢，导致所测脂质水平存在偏离原始生理浓度的风险。同时，现有方法在蛋白质的去除彻底性、去除效率等方面也有待提高。开发一种能够有效克服上述不足的血浆前处理技术，对于提高血浆脂质定量分析的准确性和可靠性具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种基于限域萃取的血浆中蛋白质和脂质即时分离方法。通过将碳纳米纤维膜与混合溶剂结合形成限域萃取体系，利用纳米孔道的尺寸排阻效应和孔道内的极性梯度分布，实现蛋白质与脂质的即时分离与酶活性的即时淬灭，并通过洗脱收集脂质，完成血浆样本前处理。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种基于限域萃取的血浆中蛋白质和脂质即时分离方法，包括以下步骤：

3、s1.将碳纳米纤维膜置于腔体中，向碳纳米纤维膜上加入混合溶剂，所述混合溶剂在毛细作用和纳米限域效应的共同作用下被限制于所述碳纳米纤维膜的纳米孔道内，因不同溶剂组分的扩散速率差异而在所述纳米孔道内形成连续极性梯度分布；

4、s2.将血浆样品以恒定流速通过s1所述负载有混合溶剂的碳纳米纤维膜，血浆中的蛋白质及酶类被截留后随溶剂流排出，脂质分子进入所述纳米孔道内部并被吸附保留；

5、s3.将洗脱溶剂通过s2所述碳纳米纤维膜，将吸附的脂质洗脱并收集。

6、在一些可选的实施方式中，s1中，所述碳纳米纤维膜的纳米孔道孔径为1-100nm。

7、在一些可选的实施方式中，s1中，所述碳纳米纤维膜为碳纳米纤维和碳纤维的复合膜，其制备方法包括：

8、（1）碳纤维基底预处理

9、高温除浆：取长度55-65cm的碳纤维，固定于金属丝上，置于马弗炉中。以3-7℃/min的升温速率由室温升至430-470℃，恒温热处理25-35min，随后以相同速率降至室温，以去除纤维表面有机浆料。

10、索氏提取除浆：将经热处理后的碳纤维装入索氏提取器中，以丙酮为溶剂，控制沙浴温度为270-290℃，连续回流提取10-14h，以彻底清除纤维表面残余杂质。

11、酸化处理：将提取后的碳纤维浸入混酸溶液（由浓硝酸与浓硫酸按体积比1：（2-4）配制）中处理10-14h，进行表面酸化改性。处理完毕后，用超纯水反复洗涤纤维至中性，烘干备用。

12、（2）催化剂配制与负载

13、催化剂配制：将p123和无水乙醇加入玻璃瓶中，充分溶解；随后加入盐酸溶液和超纯水，于350-450r/min转速下磁力搅拌。缓慢滴加正硅酸四乙酯，搅拌25-35min后，加入硝酸镍，继续搅拌11-13h，获得催化剂前驱体。其中，p123、无水乙醇、盐酸溶液、超纯水、正硅酸四乙酯和硝酸镍的质量体积比为（1-1.5）g：（20-30）ml：（60-70）μl：（1-5）ml：（1-8）ml：（2-3）g。

14、催化剂沉积：将预处理后的碳纤维基底浸没于催化剂前驱体中，浸泡11-13h。取出后剪切成2-4cm的小段，置于布氏漏斗中，以催化剂前驱体淋洗至纤维充分散开，抽滤至干。

15、模板去除：将负载催化剂的碳纤维转移至马弗炉中，以3-7℃/min的升温速率升至430-470℃，恒温焙烧25-35min，以除去模板剂p123，随后随炉冷却至室温。

16、（3）碳纳米纤维原位生长：

17、将步骤（2）得到的负载有镍催化剂的碳纤维基底置于管式炉中，首先通入130-170cc/min的氮气建立惰性气氛。待气流稳定后，以3-7℃/min的升温速率升至600-660℃。在600-660℃下引入20-30cc/min氢气，还原活化催化剂25-35min；随后同时通入30-40cc/min乙炔气体，进行化学气相沉积反应25-35min，在碳纤维表面原位生长碳纳米纤维。反应结束后，停止供入氢气和乙炔，保持氮气保护气氛，自然冷却至室温，得到碳纳米纤维和碳纤维复合材料。

18、（4）萃取膜装置组装：

19、将制得的碳纳米纤维和碳纤维复合材料置于装有甲醇的离心管中，以最低功率超声清洗55-65s，去除表面附着的无定形碳。清洗后将材料转移至洁净锡箔纸上，于65-75℃烘箱中干燥1-3h。干燥后，将材料剪切成2-3cm的短节，沿纤维纵向拆分，精确称取3.0±0.1mg的碳纳米纤维和碳纤维复合材料，均匀平铺于孔径为0.2-0.25µm的nylon 66有机相滤膜上，压实封装，得到s1中的碳纳米纤维膜。

20、在一些可选的实施方式中，s1中，所述混合溶剂包括氯仿和甲醇。

21、在一些可选的实施方式中，所述氯仿和甲醇的体积比为（1-3）：1。

22、在一些可选的实施方式中，s1中，所述混合溶剂的加入流速为50-200μl/min。

23、在一些可选的实施方式中，s1中，将碳纳米纤维膜裁剪成直径为1-2cm的圆形片，置于微孔滤膜腔体中。取混合溶剂，以50-200μl/min的流速缓慢滴加至碳纳米纤维膜上。在毛细作用和纳米限域效应的共同作用下，混合溶剂被限制在碳纳米纤维膜的纳米孔道内。由于氯仿和甲醇在纳米孔道中的扩散速率存在差异，在纳米孔道内形成从富甲醇区到富氯仿区的连续极性梯度分布。

24、在一些可选的实施方式中，s2中，所述血浆样品的进样量为10-100μl；所述恒定流速为50-200μl/min。

25、在一些可选的实施方式中，s2中，将10-100μl血浆样品通过推拉式注射泵以50-200μl/min的恒定流速，推过上述负载有混合溶剂的碳纳米纤维膜。其中，蛋白质及酶类因尺寸大于纳米孔道孔径而被截留，随溶剂流排出；脂质分子因尺寸小于纳米孔道孔径而进入纳米孔道内部，基于相似相溶原理分配到极性梯度分布的不同区域，并通过π-π相互作用和疏水作用被吸附保留。

26、在一些可选的实施方式中，s2中，血浆中的蛋白质及酶类随溶剂流排出的时间≤60s。

27、在一些可选的实施方式中，s3中，所述洗脱溶剂包括异丙醇和乙腈。

28、在一些可选的实施方式中，所述异丙醇和乙腈的体积比为（1-3）：1。

29、在一些可选的实施方式中，s3中，所述洗脱溶剂的用量为100-500μl；所述洗脱溶剂的流速为50-100μl/min。

30、在一些可选的实施方式中，s3中，取100-500μl洗脱溶剂以50-100μl/min的流速推过碳纳米纤维膜，将吸附的脂质洗脱，收集洗脱液。

31、本发明中基于限域萃取的血浆中蛋白质和脂质即时分离流程示意图，如图1所示。

32、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

33、（1）本发明利用碳纳米纤维膜纳米孔道的尺寸排阻效应，实现了蛋白质与脂质在60s内的高效即时分离。蛋白质分子因尺寸大于纳米孔道孔径而被截留于限域空间之外，随溶剂流快速排出；脂质分子因尺寸小于纳米孔道孔径而自由进入纳米孔道内部被吸附保留。经蛋白定量检测，本方法对血浆中总蛋白质的去除率≥90.2%。同时，磷脂酶等酶类同样因尺寸排阻而被截留，无法与进入限域空间的脂质底物接触，酶活性被即时淬灭，有效抑制了脂质的离体酶解，确保所测脂质水平能够真实反映血浆中的原始生理浓度。

34、（2）本发明利用碳纳米纤维膜在纳米限域空间内的极性梯度分布效应，克服了传统液液萃取法仅能提取特定极性脂质的不足。氯仿与甲醇在纳米孔道内因扩散速率差异形成从富甲醇区（高极性）到富氯仿区（低极性）的连续极性梯度，使得不同极性的脂质分子可在单一萃取体系中同步分配与富集，提高了血浆脂质组学分析的覆盖度。

35、（3）传统血浆前处理方法操作步骤繁琐，通常需要15-60min完成，期间脂质持续暴露于活性酶环境和氧化条件下，易发生酶解和氧化降解。本发明将完整的前处理流程压缩至5min以内，其中核心的蛋白质排阻与脂质捕获步骤在60s内完成，缩短了样品暴露于活性酶环境的时间，有效降低了脂质离体降解的风险，保证了血浆脂质分析数据的真实性与可靠性。

36、（4）本发明将蛋白质去除、脂质萃取与富集集成于单一膜萃取装置内完成，无需额外的离心、蛋白沉淀或固相萃取前置处理步骤，操作流程简化。同时，本发明所用有机溶剂用量低于传统液液萃取法，降低了操作成本和环境负担。本方法无需昂贵的自动化液体处理设备，操作不依赖专业技术经验，适用于大规模临床脂质组学队列研究及常规临床检验中的血浆样本前处理。