一种复杂基质中多目标物联合检测定量方法与流程

本发明涉及免疫检测定量，尤其涉及一种复杂基质中多目标物联合检测定量方法。

背景技术：

1、在谷物基质中氟苯尼考及氟苯尼考胺残留检测领域，常用的快速筛查技术是酶联免疫吸附测定技术。该技术基于抗原抗体的特异性结合反应，通过酶催化显色反应的强度对目标物进行定性或定量分析，具有操作简便、试剂成本低、通量高的特点，广泛应用于农产品质量安全监管中的大批量样本初筛。

2、在实际检测操作中，部分谷物样本的检测结果反复出现与真实含量不符的情况，难以可靠判读。例如，在对一批玉米样本进行氟苯尼考残留筛查时，检测人员按照试剂盒说明书完成加样、孵育、洗涤和显色步骤，在终止反应后读取终点吸光度值。观察显色情况时发现，某些已知不含有目标物的阴性对照样本孔内颜色明显偏深，与阳性参照孔接近；而个别人为添加低浓度标准品的质控样本孔内颜色却过浅，几乎与空白孔相当。复测时上述孔的显色深浅依然不稳定，不同操作人员重复加样操作获得的结果也存在差异。移液过程中还可观察到，粘度较大的样本提取液在吸头内流动缓慢，液面高度与预期体积明显不一致，不同孔加入的样本量不均。显色反应终止的时间点是统一的，但各孔颜色发展快慢不同，部分孔在固定时间点时显色尚未完全均匀。这些现象使得同批次检测结果的重复性差，肉眼判读和仪器读取均无法区分特异反应与非特异吸附，导致合格谷物被误判为阳性而作退货或销毁处理，造成粮食损失和经济赔偿纠纷，或者含有残留的阳性样本被错误放行，埋下食品安全隐患。因此，在谷物基质氟苯尼考残留检测过程中如何减少假阳性和假阴性的发生，是本领域亟需解决的问题。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种复杂基质中多目标物联合检测定量方法及系统，通过微孔板多波长时序吸光度数据的预处理与特征提取、基质干扰模式分离、交叉反应系数估计以及矩阵求解，实现复杂基质中第一目标物和第二目标物的准确联合定量，并校正体积偏差和筛查异常结果。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种复杂基质中多目标物联合检测定量方法，包括：

4、获取微孔板中各孔的原始多波长时序吸光度数据并进行基线校正与时间重采样处理，得到预处理光谱序列，基于所述预处理光谱序列构建按孔索引的时序光谱数据集；

5、基于所述时序光谱数据集对空白基质孔和样本孔进行时间域与光谱域特征提取和模式分离，得到每个孔的基质干扰特征向量，基于所述基质干扰特征向量构建按孔排列的基质干扰特征矩阵；

6、利用所述基质干扰特征矩阵对不同浓度标准系列孔的时序光谱数据进行干扰修正，得到各标准孔的净化免疫响应曲线，基于所述净化免疫响应曲线估计并构建第一目标物与第二目标物的交叉反应系数矩阵；

7、将所述交叉反应系数矩阵与未知样本的所述净化免疫响应曲线结合进行矩阵求解，得到所述第一目标物和所述第二目标物的定量结果，并基于所述定量结果执行体积偏差校正与结果筛查。

8、进一步地，所述获取微孔板中各孔的原始多波长时序吸光度数据并进行基线校正与时间重采样处理，得到预处理光谱序列，基于所述预处理光谱序列构建按孔索引的时序光谱数据集包括：

9、采集所述微孔板各孔的所述原始多波长时序吸光度数据并进行仪器漂移基线校正，得到漂移校正后吸光度矩阵；

10、基于所述漂移校正后吸光度矩阵，对每个孔的主检测波长信号与参比波长信号进行比值化处理，得到光谱归一化吸光度矩阵；

11、基于所述光谱归一化吸光度矩阵，对各孔的时间轴进行重采样与起始对齐处理，得到预处理光谱序列集合；

12、基于所述预处理光谱序列集合，结合孔位标签、样本编号和标称浓度信息，构建按孔索引的所述时序光谱数据集。

13、进一步地，所述采集所述微孔板各孔的所述原始多波长时序吸光度数据并进行仪器漂移基线校正，得到漂移校正后吸光度矩阵包括：

14、在酶促显色反应启动后，以固定时间间隔对所述微孔板中每个孔同步采集主检测波长通道和参比波长通道下的吸光度读数，构建原始吸光度采集矩阵；

15、基于所述原始吸光度采集矩阵中的空白缓冲孔数据，计算同一时间点、同一波长通道下所有空白缓冲孔吸光度值的算术平均值，得到对应的仪器漂移基线值；

16、将所述原始吸光度采集矩阵中每个孔在对应时间点、对应波长通道的吸光度值减去对应的所述仪器漂移基线值，得到扣除系统性偏移处理后的吸光度读数，重新组织为所述漂移校正后吸光度矩阵。

17、进一步地，所述基于所述光谱归一化吸光度矩阵，对各孔的时间轴进行重采样与起始对齐处理，得到预处理光谱序列集合包括：

18、计算所述光谱归一化吸光度矩阵中各孔的归一化吸光度时间序列相邻时间点的一阶差分值，当连续三个一阶差分值均超过起始判定阈值时，确定为反应起始时刻；

19、以所有孔中最早的所述反应起始时刻为统一时间原点，对每个孔的时间轴进行平移，使所有孔的所述反应起始时刻对齐至相同的相对时间零点并定义统一时间网格；

20、对每个孔平移后的归一化吸光度时间序列采用分段线性插值方法映射到所述统一时间网格上，得到所述各孔的预处理光谱序列，汇集形成所述预处理光谱序列集合。

21、进一步地，所述基于所述时序光谱数据集对空白基质孔和样本孔进行时间域与光谱域特征提取和模式分离，得到每个孔的基质干扰特征向量，基于所述基质干扰特征向量构建按孔排列的基质干扰特征矩阵包括：

22、从所述时序光谱数据集中提取空白缓冲孔、所述空白基质孔和所述样本孔的预处理光谱序列，构建多类型孔光谱序列集合；

23、基于所述多类型孔光谱序列集合，对每个孔的所述预处理光谱序列进行时间域描述符提取，得到时间域描述符集合；

24、基于所述多类型孔光谱序列集合，对每个孔的所述预处理光谱序列进行光谱域比值轨迹提取，得到光谱域描述符集合；

25、基于所述时间域描述符集合和所述光谱域描述符集合，对每个孔构建联合描述符向量，通过带正则化的非负矩阵分解进行模式分离，得到基质干扰成分模式矩阵、各孔的模式权重向量，并汇集形成所述基质干扰特征矩阵。

26、进一步地，所述基于所述多类型孔光谱序列集合，对每个孔的所述预处理光谱序列进行时间域描述符提取，得到时间域描述符集合包括：

27、提取所述预处理光谱序列在反应起始时刻之前最后若干个采样点归一化吸光度值的算术平均值，作为基线水平描述符；

28、对所述预处理光谱序列在反应稳态区的时间段进行一阶线性拟合计算斜率系数，作为慢速漂移斜率描述符；

29、计算吸光度值首次达到结合上升幅度阈值的所述基线水平描述符的时间点与所述反应起始时刻之间的时间差，作为早期显色延迟时间描述符；

30、对所述预处理光谱序列在反应初速区的时间段进行一阶线性拟合求解斜率系数，作为初速区斜率描述符，组合构成该孔时间域描述符元组汇集形成所述时间域描述符集合。

31、进一步地，所述基于所述时间域描述符集合和所述光谱域描述符集合，对每个孔构建联合描述符向量，通过带正则化的非负矩阵分解进行模式分离，得到基质干扰成分模式矩阵、各孔的模式权重向量，并汇集形成所述基质干扰特征矩阵包括：

32、将所有孔的所述联合描述符向量按孔位顺序堆叠为联合描述符矩阵并进行列归一化处理得到列归一化尺度向量；

33、采用非负双奇异值分解方法对列归一化后的所述联合描述符矩阵进行初始化，然后应用带l2正则化的乘法更新规则交替迭代更新，得到所述基质干扰成分模式矩阵与模式权重矩阵；

34、从所述模式权重矩阵中提取每个孔对应的行向量作为该孔的分布特征分配比，作为该孔的所述基质干扰特征向量并按孔位顺序堆叠形成所述基质干扰特征矩阵。

35、进一步地，所述利用所述基质干扰特征矩阵对不同浓度标准系列孔的时序光谱数据进行干扰修正，得到各标准孔的净化免疫响应曲线，基于所述净化免疫响应曲线估计并构建第一目标物与第二目标物的交叉反应系数矩阵包括：

36、从所述时序光谱数据集中提取缓冲体系标准曲线孔和复杂基质标准曲线孔的预处理光谱序列，构建双体系标准曲线光谱序列集合；

37、利用所述基质干扰特征矩阵对所述复杂基质标准曲线孔的所述预处理光谱序列进行基质成分预测与扣除，得到净化免疫响应曲线集合；

38、基于所述净化免疫响应曲线集合，对各标准孔的净化免疫响应曲线提取反应特征向量，构建标准曲线反应特征矩阵；

39、基于所述标准曲线反应特征矩阵和标称浓度矩阵，通过正则化非负多元回归估计所述交叉反应系数矩阵。

40、进一步地，所述利用所述基质干扰特征矩阵对所述复杂基质标准曲线孔的所述预处理光谱序列进行基质成分预测与扣除，得到净化免疫响应曲线集合包括：

41、从所述基质干扰特征矩阵中提取该孔位对应行的基质干扰特征向量；

42、利用基质干扰成分模式矩阵和所述基质干扰特征向量计算基质干扰描述符重构向量，并还原至原始物理量纲；

43、根据还原后的所述基质干扰描述符重构向量中含有的多个偏移量特征，构建包含色素恒定背景、内源酶渐进漂移和蛋白吸附缓升三类分量的时序基质干扰预测曲线；

44、将对应孔的所述预处理光谱序列逐时间点减去所述时序基质干扰预测曲线的预测吸光度对应值以取得该孔的所述净化免疫响应曲线形成所述净化免疫响应曲线集合。

45、进一步地，所述将所述交叉反应系数矩阵与未知样本的所述净化免疫响应曲线结合进行矩阵求解，得到所述第一目标物和所述第二目标物的定量结果，并基于所述定量结果执行体积偏差校正与结果筛查包括：

46、从所述时序光谱数据集中提取未知样本孔的预处理光谱序列，并利用所述基质干扰特征矩阵对其进行基质干扰修正，得到未知样本净化免疫响应曲线集合；

47、基于所述未知样本净化免疫响应曲线集合和缓冲体系标准曲线的特征统计量，计算体积偏差估计因子并进行时间尺度平移和幅值归一，得到校正后未知样本净化免疫响应曲线集合；

48、基于所述校正后未知样本净化免疫响应曲线集合提取反应特征向量，利用所述交叉反应系数矩阵进行矩阵求解以生成全局拟合参数，并划分子集进行独立求解计算子集间浓度一致性指标；

49、基于全局拟合残差范数和所述子集间浓度一致性指标，对初步定量结果进行异常筛查与结果分级并形成汇集结果表。

50、进一步地，所述基于全局拟合残差范数和所述子集间浓度一致性指标，对初步定量结果进行异常筛查与结果分级并形成汇集结果表包括：

51、从初步定量结果集合中计算残差范数阈值和一致性阈值；

52、当所述全局拟合残差范数小于或等于所述残差范数阈值且所述子集间浓度一致性指标小于或等于所述一致性阈值时，标记为正常结果并将当前估算参数输出为定量结果；

53、当所述全局拟合残差范数大于所述残差范数阈值或所述子集间浓度一致性指标大于所述一致性阈值时，标记为可疑结果；

54、当所述全局拟合残差范数大于所述残差范数阈值的二倍且所述子集间浓度一致性指标大于所述一致性阈值的二倍时，判断为无效结果。

55、第二方面，本发明提供一种复杂基质中多目标物联合检测定量系统，包括：

56、数据预处理与构建模块，用于获取微孔板中各孔的原始多波长时序吸光度数据并进行基线校正与时间重采样处理，得到预处理光谱序列，基于所述预处理光谱序列构建按孔索引的时序光谱数据集；

57、特征提取与模式分离模块，用于基于所述时序光谱数据集对空白基质孔和样本孔进行时间域与光谱域特征提取和模式分离，得到每个孔的基质干扰特征向量，基于所述基质干扰特征向量构建按孔排列的基质干扰特征矩阵；

58、干扰解耦与系数构建模块，用于利用所述基质干扰特征矩阵对不同浓度标准系列孔的时序光谱数据进行干扰修正，得到各标准孔的净化免疫响应曲线，基于所述净化免疫响应曲线估计并构建第一目标物与第二目标物的交叉反应系数矩阵；

59、定量求解与异常筛查模块，用于将所述交叉反应系数矩阵与未知样本的所述净化免疫响应曲线结合进行矩阵求解，得到所述第一目标物和所述第二目标物的定量结果，并基于所述定量结果执行体积偏差校正与结果筛查。

60、相比于现有技术，本发明的有益效果为：本发明构建了多波长时序吸光度采集与预处理体系，从时间域与光谱域两个维度为分离复杂基质干扰奠定结构化数据基础。通过引入参比波长通道作为光路状态探针并进行比值化处理，从光路层面切断了共性光学噪声进入后续动力学特征计算的路径，使归一化吸光度值仅对显色反应本身的吸光度变化敏感。通过对预处理光谱序列进行基线水平、慢速漂移斜率、早期显色延迟时间、初速区斜率等时间域描述符提取，以及轨迹均值、轨迹标准差、轨迹单调性指数等光谱域描述符提取，将连续模拟信号曲线转化为可参与模式分离的结构化数字指纹。采用带正则化的非负矩阵分解将联合描述符表示为脂溶性色素恒定背景模式、内源酶渐进漂移模式和蛋白吸附缓升模式的非负加权组合，在描述符层面把混合干扰解耦为可独立还原的权重系数，使干扰扣除能够按各孔实际含有的干扰模式比例进行针对性处理，而非对所有孔施加同一固定背景值。利用矩阵求解后的子集间浓度一致性指标，使数值合格但存在局部特征异常的不可信结果在子集间离散度上自然暴露，克服了现有方法仅以单次终点数值判定合格与否的固有局限。本发明提升了复杂基质中多目标物联合检测的准确性和可信度，适用于农产品质量安全领域的快速筛查分析。