一种小儿七星茶中甘草指标成分含量的测定方法及其应用与流程

本发明涉及检测与分析，具体涉及一种小儿七星茶中甘草指标成分含量的测定方法及其应用。

背景技术：

1、小儿七星茶颗粒为一儿科经典成方制剂，标准处方由薏苡仁893g、稻芽893g、山楂446g、淡竹叶670g、钩藤335g、蝉蜕112g、甘草112g七味药材经提取、浓缩、制粒、包装制成，核心功效为开胃消滞、清热定惊，临床广泛用于小儿积滞化热引发的消化不良、不思饮食、烦躁易惊、夜寐不安、大便不畅、小便短赤等儿科常见病症。七味原料药材各自含有特征活性物质，共同构成制剂药效物质基础：甘草中含甘草酸、甘草苷、新甘草苷、芹糖甘草苷、异甘草苷等黄酮及三萜皂苷类成分，是健脾调和、清热解毒的核心药效物质；淡竹叶富含异荭草苷等碳苷黄酮，发挥清心除烦作用；钩藤含钩藤碱、异钩藤碱，为平肝定惊的标志性成分；山楂、稻芽、薏苡仁分别含有机酸、多酚、多糖类物质，专司消食化积；蝉蜕含氨基酸与甾醇类活性组分，辅助疏风安神。上述多类有效成分协同作用，共同实现制剂完整药理疗效。然而现行药典质量标准仅采用高效液相色谱法对制剂中甘草酸单一成分进行含量限定，仅依靠单一指标既无法表征淡竹叶、钩藤、山楂等其余六味药材的投料真实性，也不能全面反映处方内黄酮、三萜、生物碱、有机酸等多类别有效成分的整体含量水平，质控覆盖面严重不足，难以精准、全面管控小儿七星茶颗粒的整体内在质量，存在较大质控漏洞。

2、小儿七星茶颗粒由七味药性、物质类别差异显著的中药材配伍而成，每一味药材均含有多种结构、极性、紫外吸收特征各不相同的有效成分。现有技术中已报道的小儿七星茶颗粒检测方法，多数聚焦于钩藤等药味的生物碱类标志物，针对处方中关键药味甘草的可同步检测的含测指标较少，难以充分评价处方中甘草原料投料的稳定性，也无法精准反映制剂中甘草相关有效成分的实际水平。

3、甘草为小儿七星茶颗粒处方的重要组成药味，其所含三萜皂苷、黄酮苷类等多种活性成分直接关联制剂临床药效。甘草内部同时含有甘草酸、甘草苷、异甘草苷等多类药效物质，不同成分理化性质、紫外响应存在差异；现有常规hplc-uv检测方案仅能测定甘草中少数指标成分，难以实现甘草多特征成分同步定量，无法完整表征甘草在制剂中的物质基础。

4、现有部分文献虽可实现小儿七星茶二十种以上多类成分同时检测，但普遍依赖质谱检测器，仪器购置与维护成本高，不利于常规实验室普及应用。因此行业迫切需要开发一种针对小儿七星茶颗粒中甘草多指标成分的检测方法，要求前处理简便、分析耗时短、色谱分离效果优异、定量准确度高，且适配通用hplc-uv设备，满足该复方制剂中甘草药味的质量控制需求。

5、检索到的相关专利文献：

6、公开国别中国，公告号cn108627581b，公告日2021.08.31，该文献公开了一种小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱含量测定方法，其包括如下步骤：(1)混合对照品溶液的制备:称取钩藤碱和异钩藤碱适量，精密称定，加甲醇配制成钩藤碱和异钩藤碱的混合对照溶液；(2)供试品溶液的制备：准确称取小儿七星茶颗粒，加入热水溶解，超声处理，放冷，用氨水调节ph值，再用乙酸乙酯振摇提取，回收乙酸乙酯液，残渣加甲醇溶解，即可；(3)高效液相色谱法测定：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相：乙腈(a)：0.02-0.07%二乙胺-(7-10)mm醋酸铵(b)=40-60:60-40v/v；流速:0.8-1.2ml/min；洗脱时间:35-60分钟；柱温:25-35℃；检测波长:240-250nm；该含量测定方法操作简单、准确反映产品的真实含量，适合产业化日常生产检验。

7、公开国别中国，公告号cn115290769b，公告日2024.05.14，该文献公开了一种小儿七星茶颗粒有效成分的检测方法，该方法由以下步骤组：成首先配制混合内标溶液、混合标准品溶液和待检测进样液，再按下述方法进行检测:按进样量为1-10ul，柱温为20-40℃的poroshel1 120ec-c18色谱柱进样，接着用由a相和b相组成的流动相以0.15-0.45ml/min的流速并按照规定的程序进行梯度洗脱，同时采用多反应监测分析，获得被检测物以及标准品的谱图;最后将被检测物以及标准品的谱图比对，确定小儿七星茶颗粒中26种有效成分及含量。本方法能同时对小儿七星茶颗粒中26种有效成分进行定性和定量检测，而且具有精密度高和重复性好的优点。

8、检索到的相关非专利文献：

9、期刊名称《中国实验方剂学杂志》，文献名称《小儿七星茶颗粒指纹图谱》，卷号第13卷，公开日期2014.07.29，该文献公开了用高效液相色谱法，设置9段梯度洗脱程序同步测定甘草苷、绿原酸、芹菜素3种成分，整套梯度洗脱流程结合色谱柱平衡至初始流动相，单次检测总时长高达118 min，检测周期冗长，大批量样品检测效率极低。

10、前述文献代表的现有技术至少存在以下未解决的技术问题或缺陷：

11、检测周期冗长，大批量样品检测效率极低，相关证据为：文献《小儿七星茶颗粒指纹图谱》中公开的高效液相色谱法单次检测总时长高达118 min，检测效率低。

12、本发明在解决上述问题或克服上述缺陷时，曾遇到以下困难和障碍：

13、中药成分复杂，方法开发过程中为了改善峰形，提高色谱峰分离度，增强检测器的信号响应强度，实验考察了不同流动相添加剂种类以及浓度，以及各组分吸收波长等参数。最后，通过优化梯度洗脱程序，样品中7个目标成分可在37 min内完成基线分离并完成定量分析。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供：

2、一种小儿七星茶中甘草指标成分含量的测定方法，及其相关技术，以解决提升目标峰的分离度、增强信号响应度、改善峰型等技术问题或其组合。

3、术语说明：

4、除非另有定义，否则本文所有科技术语具有的涵义与本发明主题所属领域技术人员通常理解的涵义相同。除非另有说明，本文全文引用的所有专利、专利发明、公开材料通过引用方式整体并入本文。如果本文对术语有多个定义，以本章的定义为准。

5、应理解，上述简述和下文的详述为示例性且仅用于解释，而不对本发明的主题作任何限制。在本发明中，除非另有具体说明，否则使用单数时也包括复数。还应注意，除非另有说明，否则所用“或”、“或者”表示“和/或”。此外，所用术语“包括”以及其它形式，例如“包含”、“含”和“含有”并非限制性。

6、可在参考文献《中华人民共和国药典》2025年版、《中药制剂分析》（第2版，蔡宝昌主编，高等教育出版社）等中找到对标准术语的定义。

7、除非另有说明，否则采用本领域技术范围内的常规方法，如单波长恒定检测、程序切换波长法、外标一点法、外标标准曲线法、专属性、精密度、稳定性、回收率、线性考察等方法。

8、除非提出具体定义，本文中使用的各类市售产品的使用，均采用标准技术。例如，可利用厂商对试剂盒的使用说明，或者按照本领域公知的方式或本发明的说明来进行实施。通常可根据本说明书中引用和讨论的多个概要性和较具体的文献中的描述，按照本领域熟知的常规方法实施上述技术和方法。

9、本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了60-120和80-110的范围，理解为60-110和80-120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1-2、1-4、1-5、2-3、2-4和2-5。

10、本发明中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了“0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。

11、本文所用的术语“小儿七星茶”，指：由薏苡仁、稻芽、山楂、淡竹叶、钩藤、蝉蜕、甘草七味药材配伍制成的儿科中成药制剂，具有开胃消滞、清热定惊功效。

12、本文所用的术语“hplc-uv”，指：高效液相色谱-紫外检测器联用技术（highperformance liquid chromatography-ultraviolet detector），是以高效液相色谱实现样品组分分离、紫外检测器对目标物质进行定量定性分析的色谱检测方法。

13、本文所用的术语“切换波长法”，指：高效液相色谱检测过程中，根据不同目标对照品最大紫外吸收波长差异，在色谱程序不同保留时间段自动切换紫外检测波长，同步实现多种极性、紫外吸收特征差异较大成分同步测定的色谱检测方法。

14、本文所用的术语“甘草酸”，指：glycyrrhizic acid，cas: 1405-86-3，甘草中标志性三萜皂苷类活性成分，分子式c42h62o16，作为药物，具有抗炎、抗变态反应；作为甜味剂，广泛用于各类食品。

15、本文所用的术语“甘草苷”，指：liquiritin，cas: 551-15-5，草中黄酮葡萄糖苷类活性成分，为甘草质量控制及本品含量测定特征指标，具有抗氧化、抗hiv等多种药理作用。

16、本文所用的术语“新甘草苷”，指：neoliquiritin apioside，cas: 5088-75-5，甘草特征黄酮双糖苷，糖基取代位点与芹糖甘草苷存在结构差异，为本品含量测定待测指标。

17、本文所用的术语“芹糖甘草苷”，指：liquiritin apioside，cas: 74639-14-8，cas: 74639-14-8，甘草中芹糖-葡萄糖双糖取代黄酮苷。

18、本文所用的术语“异甘草苷”，指：isoliquiritoside，又称异甘草甙，是一种黄酮类化合物，化学式为c21h22o9，分子量418.39，cas: 5041-81-6；其外观呈白色至黄色结晶粉末，熔点为185-186℃，沸点743.5±60.0℃，是甘草中异黄酮糖苷类活性成分。

19、本文所用的术语“异荭草苷”，指：luteolin-6-c-glucoside，cas: 4261-42-1，木犀草素6位碳葡萄糖苷，是一种草素化学物质，分子式是c21h20o11，密度是1.759g/cm3，甘草中特征碳苷类指标成分，用于小儿七星茶中淡竹叶药材的质量评价。

20、第一方面，本发明提供了：一种小儿七星茶中甘草指标成分含量的测定方法，包括步骤：

21、（1）对照品溶液的制备：将对照品溶于溶剂后制成对照品溶液；

22、（2）供试品溶液的制备：将供试品溶于溶剂后经超声处理后离心，得到供试品溶液；

23、（3）hplc-uv检测：将步骤（1）所得对照品溶液和步骤（2）所得供试品溶液进行hplc-uv检测。

24、其中，步骤（1）和步骤（2）所用的溶剂选自水、甲醇、乙醇、乙腈中的至少一种；

25、优选地，步骤（1）和步骤（2）所用的溶剂为水。

26、其中，步骤（1）所述对照品溶液的浓度为0.5-2mg/ml，例如0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml、1.1mg/ml、1.2mg/ml、1.3mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、1.6mg/ml、1.7mg/ml、1.8mg/ml、1.9mg/ml、2mg/ml，或其任意衍生的范围；

27、优选地，步骤（1）所述对照品溶液的浓度为1mg/ml。

28、其中，步骤（2）所述供试品溶于溶剂的浓度为0.1-0.5g/ml，例如0.1g/ml、0.15g/ml、0.2g/ml、0.25g/ml、0.3g/ml、0.35g/ml、0.4g/ml、0.45g/ml、0.5g/ml，或其任意衍生的范围；

29、优选地，步骤（2）所述供试品溶于溶剂的浓度为0.2g/ml。

30、其中，步骤（2）所述超声的频率为20-60khz，例如20khz、25khz、30khz、35khz、40khz、45khz、50khz、55khz、60khz，或其任意衍生的范围；

31、优选地，步骤（2）所述超声的频率为40khz。

32、其中，步骤（2）所述超声的功率200-600w，例如200w、250w、300w、350w、400w、450w、500w、550w、600w，或其任意衍生的范围；

33、优选地，步骤（2）所述超声的功率400w。

34、其中，步骤（2）所述超声的时长为5-20min，例如5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min，或其任意衍生的范围；

35、优选地，步骤（2）所述超声的时长为10min。

36、其中，步骤（2）所述离心的转速为10000-15000rpm，例如10000rpm、10500rpm、11000rpm、11500rpm、12000rpm、12500rpm、13000rpm、13500rpm、14000rpm、14500rpm、15000rpm，或其任意衍生的范围；

37、优选地，步骤（2）所述离心的转速为14000rpm。

38、其中，步骤（2）所述离心的时长为5-20min，例如5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min，或其任意衍生的范围；

39、优选地，步骤（2）所述离心的时长为10min。

40、在一些具体的实施方式中，步骤（3）所用色谱柱采用acclaim 120 c18（250 mm×4.6 mm, 5μm）。

41、其中，步骤（3）所述检测的流动相a选自甲醇、乙腈中的至少一种；

42、优选地，步骤（3）所述检测的流动相a为乙腈。

43、其中，步骤（3）所述检测的流动相b选自水、乙酸铵水溶液、磷酸水溶液、甲酸水溶液和乙酸水溶液中的至少一种；

44、优选地，步骤（3）所述检测的流动相b为乙酸水溶液；

45、进一步优选地，所述乙酸水溶液中乙酸的重量百分数为0.1%-1.0%，例如0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%，或其任意衍生的范围；

46、更进一步优选地，所述乙酸水溶液中乙酸的重量百分数为0.5%。

47、其中，步骤（3）所述检测的梯度洗脱条件如下所示：

48、表1梯度洗脱条件

49、

50、其中，步骤（3）所述检测的柱温选自30-45℃，例如30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃，或其任意衍生的范围；

51、优选地，步骤（3）所述检测的柱温为35℃。

52、其中，步骤（3）所述检测的进样体积选自2-40μl，例如2μl、4μl、6μl、8μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl、35μl、40μl，或其任意衍生的范围；

53、优选地，步骤（3）所述检测的进样体积为15μl。

54、其中，步骤（3）所述检测的流速选自0.5-2ml/min，例如0.5ml/min、0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min、1.2ml/min、1.3ml/min、1.4ml/min、1.5ml/min、1.6ml/min、1.7ml/min、1.8ml/min、1.9ml/min、2ml/min，或其任意衍生的范围；

55、优选地，步骤（3）所述检测的流速为1.0 ml/min。

56、其中，步骤（3）所述检测的波长选自250-380nm；

57、进一步地，步骤（3）所述检测的波长采用切换波长的方式检测；

58、优选地，步骤（3）所述检测的波长为288 nm、252 nm、380 nm；

59、具体地，步骤（3）所述检测的波长与目标化合物以及检测时间的对应关系如下所示：

60、表2不同时间下的波长选择

61、

62、基于对本发明的技术问题的进一步解决或同时解决多个技术问题，在本发明第一方面所提供的技术方案中，优选方案包括：

63、第一项优选方案：步骤（3）所述检测的流动相b选自水、乙酸铵水溶液、磷酸水溶液、甲酸水溶液和乙酸水溶液中的至少一种；优选地，步骤（3）所述检测的流动相b为乙酸水溶液；进一步优选地，所述乙酸水溶液中乙酸的重量百分数为0.1%-1.0%；更进一步优选地，所述乙酸水溶液中乙酸的重量百分数为0.5%。该技术方案在解决了技术问题“所得谱图中色谱峰更多，峰型更好”的基础上，进一步解决了技术问题“提高目标峰的分离度，增强信号响应较强”。

64、第二项优选方案：步骤（3）所述检测的柱温选自30-45℃；优选地，步骤（3）所述检测的柱温为35℃。该技术方案在解决了技术问题“提高目标峰的分离度，增强信号响应较强”的基础上，进一步解决了技术问题“提升色谱峰分离度、分离效率以及色谱柱寿命，”。

65、第三项优选方案：步骤（3）所述检测的进样体积选自2-40μl；优选地，步骤（3）所述检测的进样体积为15μl。该技术方案在解决了技术问题“提高目标峰的分离度，增强信号响应较强”的基础上，进一步解决了技术问题“更进一步提高目标峰的分离度，增强信号响应较强”。

66、第二方面，本发明提供了：所述测定方法在小儿七星茶颗粒的综合质量控制方面的应用。

67、“步骤（1）和步骤（2）所用的溶剂选自水、甲醇、乙醇、乙腈中的至少一种”，由本文前述解释和/或实施例2中相应的技术特征“选择比较了水，30%、50%、70%和100%甲醇共5种溶剂体系”等经概括得到。因此，本领域技术人员经合理的推定，可认定“步骤（1）和步骤（2）所用的溶剂选自水、甲醇、乙醇、乙腈中的至少一种”、其下位概念、其基本等同的技术手段、基于现有技术水平在常规技术手段和公知常识内可替换其的技术手段，都应当属于本发明的保护范围。

68、“步骤（2）所述超声的时长为5-20min”，由本文前述解释和/或实施例2中相应的技术特征“对样品进行超声提取时间的考察，包括5 min、10 min、20 min”等经概括得到。因此，本领域技术人员经合理的推定，可认定“步骤（2）所述超声的时长为5-20min”、其下位概念、其基本等同的技术手段、基于现有技术水平在常规技术手段和公知常识内可替换其的技术手段，都应当属于本发明的保护范围。

69、“所述乙酸水溶液中乙酸的重量百分数为0.1%-1.0%”，由本文前述解释和/或实施例2中相应的技术特征“乙腈-0.1 %乙酸水、乙腈-0.2 %乙酸水、乙腈-0.5 %乙酸水和乙腈-1.0 %乙酸水”等经概括得到。因此，本领域技术人员经合理的推定，可认定“所述乙酸水溶液中乙酸的重量百分数为0.1%-1.0%”、其下位概念、其基本等同的技术手段、基于现有技术水平在常规技术手段和公知常识内可替换其的技术手段，都应当属于本发明的保护范围。

70、“柱温选自30-45℃”，由本文前述解释和/或实施例2中相应的技术特征“不同色谱柱柱温（30℃、35℃、40℃、45℃）”等经概括得到。因此，本领域技术人员经合理的推定，可认定“柱温选自30-45℃”、其下位概念、其基本等同的技术手段、基于现有技术水平在常规技术手段和公知常识内可替换其的技术手段，都应当属于本发明的保护范围。

71、“进样体积选自2-40μl”，由本文前述解释和/或实施例2中相应的技术特征“不同进样体积（2μl、5μl、10μl、15μl、20μl、30μl、40μl）”等经概括得到。因此，本领域技术人员经合理的推定，可认定“进样体积选自2-40μl”、其下位概念、其基本等同的技术手段、基于现有技术水平在常规技术手段和公知常识内可替换其的技术手段，都应当属于本发明的保护范围。

72、本发明的有益效果为：

73、本发明至少具有如下有益效果：

74、（1）本发明的测定方法所得谱图的目标峰的分离度最好，信号响应强；

75、（2）本发明的测定方法针对不同目标成分，本实验利用波长切换功能优选各自最大吸收波长进行定量检测，以提升方法的检测灵敏度；

76、（3）本发明的测定方法精密度高、重复性好、稳定性好、简便高效，为小儿七星茶颗粒的综合质量控制提供可信的借鉴和参考。