用于糖果和乳制品产品用途的细胞培养乳的制作方法

本发明涉及

体外乳生产，并且更具体地涉及用于在生产基于乳的产品中使用的细胞培养乳，所述基于乳的产品包括诸如巧克力和冰淇淋的糖果物品；诸如奶酪、酸奶和奶油的乳制品产品；以及非食品产品。

背景技术：

1、对全球乳生产的需求不断增加，以应对一系列因素，包括全球人口增长和亚洲国家饮食的变化（即西方化）。在未来十年，全球乳制品的消费预计增加超过100b美元。这又给自然资源带来越来越大的压力，增加对动物福利的担忧，并导致增加的森林砍伐以及更多的温室气体产生。美国的乳制品消费占该国的温室气体排放量的约2%。为了满足全球需求，每天养殖约2.7亿头乳制品奶牛。乳中的每种组分与一系列积极的健康影响和消极的健康影响两者相关联。

2、乳是一种复杂的胶体基质，其含有乳脂、乳糖和许多不同的组分，包括天然存在的激素。乳的感官和功能特征源于其微量营养物概况，该微量营养物概况已经被证明成本高且难以复制。一般来说，美国奶牛的乳的总组成为87.7%水、4.9%乳糖（碳水化合物）、3.4%脂肪、3.3%蛋白质和0.7%矿物质。乳组成根据物种（奶牛、山羊、绵羊）、品种（荷斯坦牛、泽西岛牛）、动物的饲料和泌乳阶段而变化。

3、研究已经表明，乳的脂肪和蛋白质含量基于牛的品种。荷斯坦牛具有最低的脂肪和蛋白质含量，而泽西岛和根西岛品种具有最高的脂肪和蛋白质含量。即使在单个畜群中，乳蛋白可以在1.57%至4.66%的范围内，其中平均值为3.05%；而乳脂在1.77%至5.98%的范围内，其中平均值为3.76%。在乳生产中，食物来源、温度、湿度和季节都对乳质量的变化起着重要作用。为了解决乳组成的变化，常见的做法是将来自不同乳牛的乳在散装罐中共混，在美国全年生产相对一致的乳组成。

4、乳质量的另一个问题是在乳中发现的天然存在的激素的存在。这些激素包括催乳素(15.4 ± 1 ng/ml)、igf-1 (4 ± 1 ng/ml)、pge2 (2.4 ± 0.3 ng/ml)、pgf2α (2 ±0.5 ng/ml)、txb2 (1 ± 0.5 ng/ml)、皮质类固醇(14 ± 4 ng/ml)、睾酮(0.09 ± 0.03ng/ml)、5α-类甾醇(3 ± 1 ng/ml)、孕酮(12 ± 2 ng/ml)、甾酮(0.13 ng/ml)、17β-雌二醇(0.02 ng/ml)、酯二醇(0.027 ± 0.01 ng/ml)。此外，由于需要在其乳生产期间治疗整个畜群的感染（即慢性乳房感染），在工业规模的乳中通常存在激素和其他外来物质，诸如抗生素和药物。

5、虽然关于这些激素的生理浓度的存在几乎没有争议，但此类激素对动物和人类的潜在生物效应可能未被很好地理解，并且可能是深远的。此外，激素的存在可能会引起对乳制品食品的重大安全担忧，尤其是如雌激素的类固醇激素。一些证据表明与乳腺癌和前列腺癌的潜在联系。因此，需要特别关注，尤其是在主要发育期（例如围产期和青春期）期间。

6、为此，并且鉴于在分析方法和生物测定的发展方面的显著进展，重要的是澄清激素（尤其是如雌激素的类固醇激素）的存在的潜在影响，当它们是饮食的常见组分并且多年来被定期地食用时。

7、乳制品产品的膳食替代品在基于植物的乳和乳产品中发现。来自诸如杏仁、大豆、腰果和燕麦的植物的乳缺乏在基于动物的乳中发现的天然存在的激素，并且作为良好的蛋白质来源越来越受欢迎，而不会引起许多人经历的乳制品不耐受的问题。然而，来自这些替代性来源的基于植物的乳在提供转化为其他乳制品产品（诸如奶酪、黄油和酸奶）的生产的基于动物的乳的功能性方面往往不太有效。此外，基于植物的乳的日益普及也引发了其他可持续性问题，例如，为了扩大大豆生产已经采用的广泛砍伐森林，或者在经历长期干旱的地区生产杏仁所需的大量的水。

8、乳制品行业中另一个感兴趣的领域是被称为“a2乳”的替代性乳产品。奶牛的乳通常含有两种类型的β-酪蛋白蛋白：a1型和a2型，其不同之处在于在蛋白质结构的位置67处分别为氨基酸组氨酸或脯氨酸。假设是，含有a1 β-酪蛋白蛋白的传统牛乳可能会导致负面健康影响，包括消化不适、肠道炎症和乳过敏，而a2 β-酪蛋白似乎不会引起这些影响。

9、a1 β-酪蛋白和a2 β-酪蛋白蛋白两者均含有209个氨基酸(aa)。然而，在消化后，a1 β-酪蛋白释放β-酪啡肽-7 (bcm-7)，其触发一系列事件，这些事件增加炎症和胃肠道不适。因此，假设消费含有a1 β-酪蛋白的乳与胃肠道炎症增加、pd3症状恶化、转运延迟以及认知处理速度和准确性降低相关联。最近的研究证实，消费a1/a2 β-酪蛋白乳的受试者呈现与乳糖不耐受相关联的更严重的消化症状，而消费a2 β-酪蛋白乳未发现会加重这些症状。炎性标志物，诸如il-4、igg、ige和igg1，在a2 β-酪蛋白乳消费者中显著较低。目前，由于两种类型的β-酪蛋白a1和a2非常相似，并且由于生产富含a1-蛋白的乳的奶牛往往属于大量生产乳的品种（高产奶牛），例如荷斯坦奶牛，因此尚未开发出解决这种a1 β-酪蛋白问题的经济解决方案。

10、乳和乳制品产品，包括奶油、黄油、酸奶和奶酪，构成人类饮食的重要部分，提供了蛋白质、维生素和矿物质的重要来源。对于许多人来说，乳制品是获得补充营养物以保持心脏、肌肉和骨骼健康和正常运作的最简单方式。然而，上文讨论的乳质量相关问题已经困扰乳制品行业许多年，并且迫切需要解决方案。

11、对改进乳生产技术的需求是显然的，其由若干个因素驱动，包括目前通过牛养殖生产乳的不可持续的方法（土地和农业资源的低效使用、温室气体的产生等等）；可比的乳的替代品的缺乏；以及一致的质量和高质量的乳的有限的来源。

12、通过引用并入本文的美国专利第11,236,299号（转让给biomilk ltd.(rehovot,il)）公开了一种用于通过采用接种在三级分支、弹性导管支架上的一系列乳腺类器官进行

体外乳生产的方法。在示例性的实施方式中，乳生产系统包括容器的阵列，每个容器包括多个乳腺类器官(mo)；可操作以供给每个容器的营养物供应储器和乳收集模块。该系统的关键部件是mo，mo是形成嵌入基质中的多细胞三维结构（乳腺类器官）的乳腺上皮细胞。在用mo接种支架后，雌激素和黄体酮经由诱导乳腺基质与包含接种的mo的上皮之间的旁分泌信号传导，有助于诱导上皮的生长和形态发生。然后，mo开始在含有催乳素、营养物和生长因子的培养基中分泌乳，持续在10-21天之间的时间段。虽然wilk专利公开了一种用于

体外生产乳的方法，但它没有提供一系列在细胞结构方面用于修改乳产品，以便提高营养含量、减少对激素的依赖、选择优选的a2 β-酪蛋白和其他“特制乳”产品（例如低变应原性乳）的选项，其将有助于提供更可持续和营养的食物来源，以满足全球不断增长的需求。

13、鉴于对乳制品产品的不断增长的需求，需要一种更可持续和通用的乳生产方法，以克服当前乳制品行业面临的环境和动物福利挑战。传统乳在糖果和乳制品产品中的使用已十分广泛。然而，诸如环境影响、动物福利担忧以及供应链问题等限制使得创新的替代方案成为必要。细胞培养乳提供了一种可持续且在伦理上可行的解决方案，彻底改变了各种食品的生产。

技术实现思路

1、根据本发明的实施例，提供了使用乳腺细胞来进行

体外乳生产的系统和方法，该乳腺细胞被培养以用于增强的细胞增殖以及乳和乳组分分泌。细胞增殖的增强至少部分地通过经由向培养基施加流动和通过各种不同方法改变流动的机械刺激来实现，该各种不同方法包括但不限于单向层流、湍流、脉动流和振荡流。由本发明系统提供的持续机械刺激能够产生健康的上皮细胞(ec)并生产基本上不含激素（除了催乳素以外）的乳。本文公开的系统和方法通常适用于生产用于食品培养和用于生物工业用途的细胞蛋白和乳制品。

2、在本发明的一个方面中，一种用于

体外乳生产的设备包括：反应器组件，该反应器组件包括：细长壳体，该细长壳体被配置用于保留细胞外培养基；一根或多根细长中空管，该一根或多根细长中空管在壳体内纵向对齐地设置在细胞外培养基内，该一根或多根管具有入口端、出口端和内表面，该内表面被配置用于附着泌乳细胞的单层，其中该一根或多根管的至少一部分由半渗透性材料形成，该半渗透性材料被配置为允许细胞外培养基扩散到该一根或多根管中，其中细胞外培养基包括用于维持泌乳细胞的营养溶液；泵，该泵与该一根或多根管流体连接，该泵被配置为通过中空管产生泌乳培养基的脉动或振荡流，以在泌乳细胞上诱导剪切应力，其中该泵被控制以在预定范围内的不同剪切应力水平之间交替，其中剪切应力的变化刺激泌乳细胞以产生乳产品；供应环路，所述供应环路用于通过所述壳体供应所述细胞外培养基并使所述细胞外培养基循环；以及储器，该储器与该一根或多根管的出口端流体连接，该储器被配置用于收集乳产品。该设备进一步包括设置在该一根或多根管的出口端附近的反馈环路，该反馈环路用于将乳产品再循环到入口端中以用于进一步富集。在一些实施例中，剪切应力水平的预定范围为2至75 dyn/cm2。供应环路可以包括储器，该储器被配置用于移除用过的细胞外培养基并添加新鲜的细胞外培养基。

3、在一些实施例中，泌乳细胞与饲养细胞共培养。饲养细胞可以是外周血单核细胞。在一些实施例中，泌乳细胞可以从健康奶牛的乳中分离。在其他实施例中，泌乳细胞可以从健康乳腺组织中提取，该健康乳腺组织使用选自cd9、cd47、cd54、cd59、cd95、cd164、cd49b、cd66、cd24、ck8/18、ck19、muc1、gata3、epcam、cd13、cd15s/cd73/cla、+cd166/cd227/cd340、cd10、cd90、cd200、cd29/cd142/cd271、ck5、ck14、ck17、sma、v1m、cd34/cd39/cd140b和cd49e的一组生物标志物鉴定。在一些实施例中，泌乳细胞可以从健康乳腺组织中提取，该健康乳腺组织选自所有乳腺细胞、所有乳腺上皮细胞、乳腺管腔细胞、乳腺管腔祖细胞、成熟乳腺管腔细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺基质细胞。泌乳细胞可以被基因修饰以诱导过度泌乳，或者生产为低变应原性、减少的乳糖中的一者或多者并且具有增加的a2 β-酪蛋白蛋白的乳。在一些实施例中，每个中空管可以涂覆有胶原。该一根或多根管由其至少一部分是半渗透性毛细管膜的材料形成。在一些实施例中，该一根或多根管的内表面首先与支持基质的层结合，其中泌乳细胞附着至支持基质的非结合表面，并且其中泌乳细胞在支持基质的顶部形成泌乳细胞的单层。

4、在一些实施例中，该设备进一步包括系统控制器，该系统控制器被配置为向泵和供应环路生成控制信号。

5、可以包括任选的机械刺激组件，以在从入口端朝向出口端的方向上向该一根或多根管的外部施加挤压力。任选的一个或多个光源可以被设置在反应器组件内以使泌乳细胞暴露于光刺激。在一些实施例中，一个或多个光源是发射450nm的光的发光二极管(led)。

6、泌乳培养基可以包括epicult™ plus培养基、实验室生长的fcs替代性培养基和无fcs培养基中的一者或多者，并且可以进一步包括催乳素。

7、在本发明的另一方面中，可以通过将多个上述设备互连来构建乳生产设施。

8、在本发明的又另一个方面中，在上述设备中进行

体外乳生产的方法包括：向该一根或多根管供应泌乳培养基，其中泌乳培养基包含催乳素；形成附着在所述一根或多根管的所述内表面上的泌乳细胞的单层；以及控制泵以在预定范围内的不同剪切应力水平之间交替，其中加工时间段期间剪切应力水平的变化刺激泌乳细胞以生产乳产品。该方法可以进一步包括经由反馈环路将乳产品再循环到该一根或多根管中以富集乳产品，直到达到预定的乳质量。在一些实施例中，泌乳细胞与饲养细胞共培养。饲养细胞可以是外周血单核细胞。泌乳培养基可以是epicult™ plus培养基、实验室生长的fcs替代性培养基和无fcs培养基中的一者或多者。

9、在一些实施例中，泌乳细胞可以从健康奶牛的乳中分离。在其他实施例中，泌乳细胞可以从健康乳腺组织中提取，该健康乳腺组织使用选自cd9、cd47、cd54、cd59、cd95、cd164、cd49b、cd66、cd24、ck8/18、ck19、muc1、gata3、epcam、cd13、cd15s/cd73/cla、+cd166/cd227/cd340、cd10、cd90、cd200、cd29/cd142/cd271、ck5、ck14、ck17、sma、v1m、cd34/cd39/cd140b和cd49e的一组生物标志物鉴定。在其他实施例中，泌乳细胞可以从健康乳腺组织中提取，该健康乳腺组织选自所有乳腺细胞、所有乳腺上皮细胞、乳腺管腔细胞、乳腺管腔祖细胞、成熟乳腺管腔细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺基质细胞。

10、泌乳细胞可以被基因修饰以诱导过度泌乳和/或以生产为低变应原性、减少的乳糖中的一者或多者并且具有增加的a2 β-酪蛋白蛋白的乳。

11、在进一步的实施例中，本文公开的细胞培养乳可被加工用于生产常规的基于乳的产品，所述细胞培养乳的加工要么与初级乳加工序列整合，要么通过对基础乳进行后加工来进行。此类实施例利用源自培养的细胞而非牲畜的细胞培养乳，来制造一系列糖果和乳制品产品，包括但不限于巧克力、糖果、烘焙食品、冰淇淋、黄油、奶酪、酸奶和奶油。该方法可降低环境影响，解决动物福利担忧，并确保用于广泛的基于乳的食品产品和非食品产品的生产的一致且可扩展的乳供应。