一种狐精液冷冻保存稀释液、保存方法及应用

本发明属于精子冷冻保存，具体涉及一种狐精液冷冻保存稀释液、保存方法及应用。

背景技术：

1、狐是极具经济价值的珍贵毛皮动物。良种繁育对提升狐毛皮品质、改良生产性能及保护种质资源具有重要意义。人工授精技术作为良种繁育的核心手段，应用效率高度依赖于精液冷冻保存效果。冷冻精液可实现优质种公狐资源的跨时空高效利用，减少优良种狐的饲养保有量，降低引种与养殖成本，规避活体引种带来的疫病传播风险，对推动狐良种选育与毛皮养殖产业化发展至关重要。

2、尽管精液冷冻保存技术已在畜禽养殖中趋于成熟，但狐精液具有独特的生物学特性，其冷冻保存仍面临诸多技术难点：狐精子对低温应激高度敏感，细胞膜结构稳定性差，在冷冻降温与解冻复苏过程中易发生严重冷冻损伤，进而引发精子活力降低、细胞膜完整性损伤、顶体结构受损等问题，极大限制了狐冷冻精液的应用效果与推广范围。

3、因此，亟须一种适配狐生理特性的专用精液冻存液及标准化冷冻保存技术，解决狐精子冷冻损伤难题。

技术实现思路

1、针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种狐精液冷冻保存液、保存方法及应用。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明的第一个方面，提供一种狐精液冷冻保存稀释液，所述狐精液冷冻保存稀释液含有engeletin。

4、进一步地，所述engeletin在狐精液冷冻保存稀释液中的浓度为5～30 μm。

5、作为示例，所述engeletin在狐精液冷冻保存稀释液中的浓度可以为5 μm、8 μm、10 μm、15 μm、18 μm、20 μm、22 μm、25 μm或30 μm等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。

6、进一步地，所述狐冷冻保存稀释液包括a液和b液；

7、所述a液包含：27.1 g/l tris、14 g/l 柠檬酸、11.2 g/l 葡萄糖、3 g/l 牛血清白蛋白、0.5 g/l的庆大霉素、10～30 μm engeletin、25% v/v 卵黄、1% v/v dmso；

8、所述b液包含：27.1 g/l tris、14 g/l 柠檬酸、11.2 g/l 葡萄糖、3 g/l 牛血清白蛋白、0.5 g/l的庆大霉素、10～30 μm engeletin、25% v/v 卵黄、1% v/v dmso、5% v/v甘油和6.8 g/l十二烷基硫酸钠。

9、作为示例，所述engeletin在a液和b液中的浓度可以为10 μm、15 μm、18 μm、20 μm、22 μm、25 μm或30 μm等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。

10、进一步地，所述a液包含：27.1 g/l tris、14 g/l 柠檬酸、11.2 g/l 葡萄糖、3 g/l 牛血清白蛋白、0.5 g/l 庆大霉素、20 μm engeletin、25% v/v 卵黄、1% v/v dmso；

11、所述b液包含：27.1 g/l tris、14 g/l 柠檬酸、11.2 g/l 葡萄糖、3 g/l 牛血清白蛋白、0.5 g/l的庆大霉素、20 μm engeletin、25% v/v 卵黄、1% v/v dmso、5% v/v 甘油和6.8 g/l十二烷基硫酸钠。

12、engeletin(别名dihydrokaempferol 3-rhamnoside)是一种黄酮苷类物质，是从土茯苓、菝葜中获得，主要具有抗炎、缓解疼痛、消肿、利尿、抗菌等药理作用。

13、本发明首次发现engeletin可用于狐精液冷冻保存，能够显著提高冷冻解冻后狐精子活力、质膜完整性、顶体完整性、dna完整性、cat、gsh-px、t-aoc、mmp和atp基因表达水平，降低冷冻精液的mda和ros水平。

14、本发明中，engeletin的分子量为434.39，分子式为c21h22o10，cas号为572-31-6，结构式为

15、。

16、本发明的第二个方面，提供第一方面所述的狐精液冷冻保存稀释液在狐精液保存中的应用。

17、本发明的第三方面，提供一种狐精液冷冻保存的方法，包括以下步骤：

18、s1、采集狐新鲜精液，将精液与a液混合得到混合精液，放置于4℃保存2 h；

19、s2、将混合精液加入至4℃预冷的b液，缓慢混匀，分装至4℃预冷的冷冻细管中，封口，置于4℃平衡30 min；

20、s3、将冷冻细管置于液氮上方5 cm处熏蒸20 min，放入液氮中保存；

21、所述a液包含：27.1 g/l tris、14 g/l 柠檬酸、11.2 g/l葡萄糖、3 g/l牛血清白蛋白、0.5 g/l的庆大霉素、10～30 μm engeletin、25% v/v 卵黄、1% v/v dmso；

22、所述b液包含：27.1 g/l tris、14 g/l 柠檬酸、11.2 g/l葡萄糖、3 g/l牛血清白蛋白、0.5 g/l的庆大霉素、10～30 μm engeletin、25% v/v 卵黄、1% v/v dmso、5% v/v 甘油和6.8 g/l十二烷基硫酸钠。

23、进一步地，步骤s1中，所述精液的精子活力大于0.8。

24、进一步地，步骤s2中，混合精液与4℃预冷的b液的体积比为1:1。

25、进一步地，步骤s2中，混合精液加入至4℃预冷的b液的时间为1～3 min。

26、作为示例，混合精液加入至4℃预冷的b液的时间可以为1 min、2 min或3 min。

27、进一步地，所述冷冻细管为0.25 ml的冷冻细管。

28、与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：

29、本发明提供的狐精液冷冻稀释液通过将engeletin与ph缓冲剂tris、柠檬酸，供能成分葡萄糖，抑菌成分庆大霉素等复合配制而成，能够显著提高冷冻解冻后狐精液的精子活力、质膜完整性、顶体完整性、dna完整性、cat、gsh-px、t-aoc、mmp和atp水平，降低冷冻解冻后狐精液的mda和ros水平。提高了狐精液冷冻保存效果，达到长期冷冻保存的目的，为后续人工授精等技术手段提供有力保障。

1.一种狐精液冷冻保存稀释液，其特征在于，所述狐精液冷冻保存稀释液中含有engeletin。

2. 如权利要求1所述的狐精液冷冻保存稀释液，其特征在于，所述engeletin在狐精液冷冻保存稀释液中的浓度为5～30 μm。

3.如权利要求1所述的狐精液冷冻保存稀释液，其特征在于，所述狐冷冻保存稀释液包括a液和b液；

4. 如权利要求3所述的狐精液冷冻保存稀释液，其特征在于，所述a液包含：27.1 g/ltris、14 g/l 柠檬酸、11.2 g/l葡萄糖、3 g/l牛血清白蛋白、0.5 g/l的庆大霉素、20 μmengeletin、25% v/v 卵黄、1% v/v dmso。

5.权利要求1-4任一项所述的狐精液冷冻保存稀释液在狐精液冷冻保存中的应用。

6.一种狐精液冷冻保存的方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤s1中，混合精液中精子浓度为2×108个精子/ml。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤s2中，混合精液与4℃预冷的b液的体积比为1:1。

9. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤s2中，混合精液加入至4℃预冷的b液的时间为1～3 min。

10. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤s2中，所述冷冻细管为0.25 ml的冷冻细管。