一种无血清细胞冻存液及制备方法与流程

本发明属于生物样本保存，涉及一种无血清细胞冻存液及制备方法，具体涉及一种无血清、无动物源成分的细胞冻存液及其制备方法，适用于各类体外培养细胞的程序化低温冻存与液氮长期保藏。

背景技术：

1、细胞低温冻存是细胞资源保藏、新药筛选、干细胞临床转化不可或缺的关键技术，依靠低温抑制胞内酶活性、阻滞细胞代谢，实现细胞长时间保存。目前实验室通用经典冻存液配方为：基础培养基+10%胎牛血清fbs+10% dmso。胎牛血清内含白蛋白、生长因子、多肽等天然组分，可在冻存阶段缓冲渗透压变化、修护细胞膜损伤，提升复苏存活率。

2、但现有含血清冻存液存在多项不可规避缺陷：

3、1. 外源生物安全隐患：胎牛血清为牛源产物，生产过程难以完全剔除牛病毒、支原体、真菌、朊蛋白等外源污染物，应用于临床级干细胞制剂时存在重大生物安全风险；

4、2. 产品批次波动性大：血清天然组分受产区、牛龄、生产批次影响成分差异极大，同细胞不同批次冻存复苏率浮动明显，实验重复性差；

5、3. 成本与伦理限制：优质特级胎牛血清采购价格高昂，大批量细胞冻存大幅增加实验成本；采血制备胎牛血清存在动物伦理争议，各国管控日趋严格；

6、4. 敏感样本兼容性差：干细胞、原代细胞对血清中不明异体蛋白敏感，冻存后极易出现细胞分化偏移、细胞凋亡、坏死等问题。

7、目前市面商业化无血清冻存液普遍存在缺陷：部分产品高dmso配比，细胞毒性大；部分配方添加多种人工合成大分子，低温下易析出沉淀；多数产品仅适配单一肿瘤细胞，无法兼容干细胞，原代细胞等难养的细胞类型。因此，开发一款组分明确、无动物源、广谱适配、低温保护效果优异的无血清冻存液具备重要应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种无血清细胞冻存液及制备方法，所述细胞冻存液配方精简、无血清无动物源、低温防护性能优异、广谱适配单细胞的无血清细胞冻存液，依靠多组分协同增效，降低冰晶损伤与氧化损伤，提升各类样本复苏存活率，同时兼顾试剂长期储存稳定性与使用安全性。

2、为达到上述目的，本发明是采用下述技术方案实现的：

3、第一方面，本发明提供一种无血清细胞冻存液，包括基础培养基、渗透保护剂、能量补充剂、抗氧化剂、组织稳定剂以及ph调节剂，所述无血清细胞冻存液的体系ph稳定在7.2～7.4。

4、上述技术方案中的无血清细胞冻存液，整体配方体系完全剔除胎牛血清、小牛血清、血浆、动物组织水解物等全部动物源性提取物，所有原料均采用化学合成或植物来源原料配制；所述无血清冻存液可同时满足悬浮细胞、贴壁细胞低温冷冻保存需求，冻存后经液氮长期储存，细胞复苏完整率高于88%。

5、进一步地，以每100 ml无血清细胞冻存液为基准，各组分按照质量体积配比配置如下：基础培养基60～90 ml，渗透抗冻保护剂2～15v/v%，非渗透性抗冻保护剂5～20w/v%，抗氧化剂0.01～0.5w/v%，细胞稳定剂0.1～2 g，ph调节剂0.05～0.3 g，ph体系稳定在7.2～7.4。

6、上述技术方案中，各组分配比在限定区间内任意组合复配，组分之间相互协同发挥低温防护作用，无配伍析出、分层现象，配制完成后的成品细胞冻存液4℃避光静置12个月理化性质保持稳定。

7、优选地，以每100 ml无血清细胞冻存液为基准，各组分按照质量体积配比配置：基础培养基85～92 ml、渗透抗冻保护剂3～6 g、非渗透性抗冻保护剂2～4 ml、抗氧化剂0.05～0.3 g、细胞稳定剂0.5～1.5 g、ph调节剂0.1～0.2 g。

8、上述技术方案中，该优选配比区间下，对干细胞和原代细胞低温保护效果最优，冻存样本复苏存活率可达90%以上。

9、进一步地，所述基础培养基包括dmem（dulbecco's modified eagle medium，杜尔贝科改良伊格尔培养基）、rpmi-1640（roswell park memorial institute 1640 medium，洛斯维·帕克纪念研究所-1640培养基）、mem（minimum essential medium，最低必需培养基）和dmem/f12（dmem and ham's f-12 mixture，杜尔贝科改良伊格尔培养基/哈姆f12营养混合物）中的任意单一培养基，或是两种及以上培养基按照任意体积比例的组合。

10、上述技术方案中，所述基础培养基为无血清型干粉配制原液，不含外源蛋白、生长因子添加物，主要用于维持细胞冻存体系离子平衡与基础小分子营养环境，缓冲冻存升降温过程中渗透压急剧波动。

11、优选地，所述基础培养基为dmem/f12或rpmi-1640。

12、上述技术方案中，dmem/f12或rpmi-1640提供细胞基础离子环境与小分子营养，维持冻存过程基础渗透压稳态。

13、进一步地，所述渗透抗冻保护剂包括二甲基亚砜dmso、乙二醇、丙二醇和甘油中的一种或任意两种及以上组合。

14、优选地，所述渗透抗冻保护剂为二甲基亚砜，添加体积为无血清细胞冻存液总体积的2%～15%。

15、上述技术方案中，低添加量既可以穿透细胞膜结合胞内游离水分子、降低体系冰点、抑制粗大尖锐冰晶生成，同时能够最大程度降低有机溶剂对细胞的化学毒性，规避高浓度dmso引发的细胞凋亡、分化异常问题。

16、进一步地，所述非渗透性抗冻保护剂包括 海藻糖、蔗糖、山梨醇和甘露醇中的一种或任意两种及以上组合。

17、优选地，所述非渗透性抗冻保护剂为海藻糖与甘露醇组合，海藻糖与甘露醇质量配比为1:（0.5～2）。

18、上述技术方案中，海藻糖通过嵌入细胞膜磷脂双分子层，低温稳固细胞膜结构，甘露醇平衡细胞内外渗透压，协同避免降温时细胞脱水皱缩或吸水胀破或冰晶穿刺造成细胞胀破，维持细胞形态完整。

19、进一步地，所述抗氧化剂包括l-抗坏血酸、维生素e、还原型谷胱甘肽和天然茶多酚中的一种或任意两种及以上组合。

20、优选地，所述抗氧化剂为l-抗坏血酸（维生素c）与还原型谷胱甘肽组合。

21、上述技术方案中，二者协同清除冻存降温、复苏升温过程中细胞应激产生的大量活性氧自由基，抑制氧化应激通路激活，显著减少氧化损伤诱发的细胞坏死与凋亡。

22、进一步地，所述细胞稳定剂包括 peg2000（聚乙二醇2000）、peg4000（聚乙二醇4000）、peg6000（聚乙二醇6000）、羟乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮（pvp）和透明质酸钠中的一种或多种组合。

23、优选地，所述细胞稳定剂为透明质酸钠和peg4000的组合。

24、上述技术方案中，高分子聚合物可在细胞外壁形成一层柔性水化保护膜，避免低温机械挤压造成细胞团聚，同时减少冻存过程中样本与管壁粘连损耗，缓冲温度骤变带来的机械损伤。

25、进一步地，所述ph调节剂包括hepes（4-羟乙基哌嗪乙磺酸）缓冲盐、碳酸氢钠粉末和无菌pbs缓冲液中的一种或多种组合。

26、上述技术方案中，经ph调节剂校准后，成品细胞保存液ph稳定维持在7.2～7.4生理区间，受环境温度变化、长期冷藏储存影响ph波动幅度≤±0.1，避免酸碱失衡破坏细胞膜稳定性。

27、优选地，所述ph调节剂为hepes缓冲体系。

28、上述技术方案中，hepes缓冲体系不受温度变化影响，全程锁定ph7.2～7.4生理区间，避免酸碱失衡损伤细胞膜。

29、进一步地，所述无血清细胞冻存液适用保存样本包括：人源/啮齿类肿瘤贴壁与悬浮细胞、哺乳动物组织来源原代细胞、骨髓/脂肪来源间充质干细胞和免疫细胞。

30、上述技术方案中，免疫细胞包括t细胞和nk细胞。

31、第二方面，本发明提供一种第一方面任一项所述的无血清细胞冻存液的制备方法，包括以下步骤：

32、将基础培养基加入灭菌容器中搅至溶液体系均匀；

33、依次向基础培养基溶液中添加渗透保护剂和抗冻保护剂，持续搅拌直至固体原料完全溶解，混合溶液澄清无肉眼可见固体沉淀和絮状物；

34、向上述混合溶液中投入抗氧化剂和细胞稳定剂组分，持续搅拌至组织稳定剂和抗氧化剂充分溶胀分散，体系均一稳定；

35、分次添加ph调节剂，监测体系ph数值，边添加边搅拌，调节体系整体ph至7.2～7.4标准生理范围；

36、调配完成后的混合溶液过滤、分装后保存，得到目标无血清细胞冻存液。

37、可选地，所述的无血清细胞冻存液的制备方法在紫外灭菌后的无菌超净工作台内开展，配制所用烧杯、搅拌转子、过滤装置全部经121℃高温高压灭菌烘干冷却备用；

38、将基础培养基加入灭菌容器中搅拌的搅拌温度均为10~35℃，搅拌速度为 30~90rpm，搅拌时间为8～15 min；

39、向基础培养基溶液中添加渗透保护剂和抗冻保护剂，持续搅拌的搅拌时间为20～30 min；

40、向上述混合溶液中投入抗氧化剂和细胞稳定剂组分，持续搅拌的搅拌时间为30～60 min；

41、调配完成后的混合溶液过滤、分装后保存，得到目标无血清细胞冻存液，包括：调配完成后的混合液采用0.22μm无菌水系滤膜负压过滤两级除菌，去除微量不溶杂质与微生物，无菌环境下分装至无菌密封离心管，4℃避光密封冷藏保存，得到目标无血清细胞冻存液。

42、上述技术方案中，得到的目标无血清细胞冻存液产品整体保质期12个月，开封使用后建议1个月内用完，产品原液禁止反复冻融。

43、第三方面，本发明提供一种第一方面任一项所述的无血清细胞冻存液的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

44、选取对数生长期健康细胞，pbs清洗去除残余废液，离心弃上清后，采用预冷至2～8℃的无血清冻存液重悬沉淀，单细胞悬液终浓度控制在1×106～5×106个/ml，分装冻存管后采用梯度程序降温：4℃静置30 min，-20℃放置2 h，-80℃冰箱过夜，转入液氮罐长期保存。

45、可选地，细胞冻存后应用步骤包括：液氮取出冻存管置于37℃水浴1～2min全融，稀释去除dmso后离心换液，新鲜培养基接种。

46、有益效果

47、无血清无动物源性：全程不含胎牛血清、动物组织提取物，从源头杜绝外源病毒、支原体污染风险，符合临床细胞制剂无动物源质控标准，规避动物伦理问题；

48、冻存复苏效率优异：多组分协同抗冻，单细胞复苏存活率≥90%，干细胞复苏存活率≥88%，优于市面普通无血清冻存液，媲美优质进口胎牛血清冻存液；

49、储存稳定性优异：全化学合成配方，组分精准可控，无天然原料批次差，原液2～8℃避光存放12个月无析出、无分层、冻存性能无衰减，实验重复性强；

50、广谱适用：兼容贴壁/悬浮肿瘤细胞、原代细胞、间充质干细胞、免疫细胞；

51、低毒易操作：dmso低剂量配比，降低化学毒性，复苏后细胞凋亡少、增殖恢复速度快；无需程控降温仪，常规梯度降温即可实现长效保存，操作门槛低；

52、经济性突出：省去高价胎牛血清用料，工业化批量生产成本低，显著降低实验室长期细胞保藏开销。