一种褐鳟全雌三倍体规模化生产方法与流程

本发明属于水产鱼类遗传育种，尤其涉及一种褐鳟全雌三倍体规模化生产方法。

背景技术：

1、国际上有关多倍体诱导的研究工作进展很快。日本应用静水压技术大规模诱导生产苏大马哈鱼全雌三倍体和牙鲆四倍体，俄罗斯已进行了工业化大规模培育鲤鱼三倍体；全雌三倍体虹鳟由于其不受性成熟影响，在加拿大己商品化生产；三倍体草鱼在美国天然水域中放养，既可以除草，又能阻止草鱼群体大量繁殖破坏生态平衡。三倍体化是一种在减数分裂过程中将鱼类的染色体组从2n修改为3n的人工技术，是通过在减数分裂过程中阻止第二个极体的排出而实现的。三倍体鱼通常不育，由于无生殖耗能而具有持续生长的特点，并可避免性别导致的攻击性和死亡率，为水产养殖中的食品鱼生产提供了显著优势。它们全年都能保持稳定的生长和鱼肉质量，而二倍体鱼在生殖季节这些特性会下降。此外，由于它们的不育性，从鱼场逃逸的三倍体鱼无法与野生鱼繁殖，从而保持本地种群的结构。因此，三倍体被认为是渔业养殖的推荐选择，可以降低野生鱼类种群遗传退化的风险。

2、目前，国外种质销售公司为了控制优良种质的流失，达到长期占领种苗市场从中获利的目的，所出售苗种主要以全雌二、三倍体为主。由于种质基础、设备落后和国外的技术壁垒等因素的制约，我国尚未实现所有冷水鱼品种全雌三倍体的规模化生产。在鲑科中，关于三倍体的研究工作主要集中在虹鳟鱼和大西洋鲑鱼上。对于其他物种如褐鳟，只有很少的研究工作，而褐鳟具有很高的商业价值，可为冷水鱼养殖产业提供一种不同的特色养殖产品。关于褐鳟热休克三倍体化的研究已经发表，然而，热休克制备褐鳟三倍体率并不稳定，难以形成规模化生产，并且关于褐鳟通过压力冲击进行三倍体化的研究更为有限。因此需要创新出具有自主产权的制种技术和工艺，通过改进三倍体化方法，实现褐鳟规模化全雌三倍体生产，为产业发展培育出生长速度快、不育、肉质鲜美的品种。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种褐鳟全雌三倍体规模化生产方法，显著提高三倍体率，并能够保持较高的发眼率和孵化率。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明提供了一种褐鳟全雌三倍体规模化生产方法，包括：

4、s1、亲本挑选：将褐鳟雌鱼和伪雄鱼移入暂养池暂养；

5、s2、人工产卵授精：取出雌鱼卵子和伪雄鱼精液，人工授精，获取受精卵；

6、s3、加倍化处理：8.5~10℃水温条件下于积温达到315~405度分时用压力值为50×103~56×103kpa的静水压对受精卵进行加倍化处理6~14min；

7、s4、孵化：将处理后的受精卵孵化，获得褐鳟全雌三倍体。

8、优选的，步骤s1中，所述雌鱼为3龄及以上，体重在1kg以上的体质健壮、无病、无伤、无畸形的雌性褐鳟；所述伪雄鱼为性腺发育状态良好的褐鳟伪雄鱼；所述雌鱼和伪雄鱼按照10:（0.5~1.5）的比例移入暂养池暂养。

9、优选的，步骤s1中，所述暂养池尾排水的溶氧量≥6mg/l，环境温度为9~12℃，水温为8.5~10℃。

10、优选的，步骤s2中，所述伪雄鱼精液的获取方法包括：取伪雄鱼精巢，用0.9%的生理盐水冲洗，擦干；将精巢剪成小块后，放入精液保存液中，获得的伪雄鱼精液。

11、优选的，以500ml体积计，所述精液保存液的配置方法包括：将nacl 3.7145g、kcl1.3905g、cacl2·2h2o 0.1911g、mgcl2·6h2o 0.1524g和nahco30.2100g溶入500ml蒸馏水中，用1n-naoh溶液将ph值调整到8.5~9.5；所述精液保存液的温度为8.5~10℃。

12、优选的，步骤s2中，所述雌鱼卵子的获取方法包括：容器中加入洗卵液；将雌鱼麻醉，采卵，获得卵子。

13、优选的，以1000ml体积计，所述洗卵液的配置方法包括：将7.5g的nacl、0.2g的kcl、0.2g的cacl2·2h2o和0.02g的nahco3加入到1000ml蒸馏水中，制成洗卵液；所述洗卵液的温度为8.5~10℃。

14、优选的，步骤s2中，所述人工授精的方法包括：每个容器收集6~8尾雌鱼卵子，加入50~100ml伪雄鱼精液，羽毛轻柔搅拌1~2min后静置2~4min；清水冲洗2~3次，获得受精卵。

15、优选的，步骤s3中，受精卵加倍化处理前，使用3~5l/min的微流水冲洗20~30min，再进行静水压处理。

16、优选的，所述规模化生产方法还包括孵化管理与检测，孵化期间严格控制避光，避免断水及受精卵震动；当孵化的受精卵达到230度日时检测发眼率，240度日时检测三倍体率。

17、优选的，步骤s2~s4中的环境温度为9~12℃，水温为8.5~10℃。

18、本发明的有益效果：

19、本发明采用性别逆转技术规模化诱导伪雄鱼（xx型生理雄性），建立“伪雄鱼（xx）×正常雌鱼（xx）”的全雌杂交体系，从遗传源头上确保子代100%雌性基因型；开发出专属静水压力处理参数（压力值/起始时间/持续时间）。技术上：倍化率达到95%以上，超过商业化生产阈值（行业标准通常要求≥90%）；99%雌性率显著高于天然种群（约50%）；较高的孵化率解决三倍体发育障碍难题。产业上：雌性三倍体褐鳟性腺不发育，雄性三倍体性腺仍可发育，由于雌性三倍体无生殖能量损耗，营养全部用于躯体生长，生长速度较雄性平均提升20%~30%，因此全雌群体是三倍化培育的优质种质基础；三倍体不育特性避免性成熟导致的肉质下降和死亡率升高；建立不依赖野生亲本的闭环制种体系；年产百万级苗种能力满足商业化需求。综上，本发明通过多技术模块的系统集成，解决了种源控制、染色体组操作、规模化育苗等技术瓶颈，使冷水性鱼类性别控制技术获得显著提升。其商业化应用将重构褐鳟养殖产业链，预计可降低苗种成本40%以上，推动冷水鱼产业向高效化、生态化方向发展。

1.一种褐鳟全雌三倍体规模化生产方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的规模化生产方法，其特征在于，步骤s1中，所述雌鱼为3龄及以上，体重在1kg以上的体质健壮、无病、无伤、无畸形的雌性褐鳟；所述伪雄鱼为性腺发育状态良好的褐鳟伪雄鱼；所述雌鱼和伪雄鱼按照10:（0.5~1.5）的比例移入暂养池暂养；

3.根据权利要求1所述的规模化生产方法，其特征在于，步骤s2中，所述伪雄鱼精液的获取方法包括：取伪雄鱼精巢，用0.9%的生理盐水冲洗，擦干；将精巢剪成小块后，放入精液保存液中，获得的伪雄鱼精液。

4.根据权利要求3所述的规模化生产方法，其特征在于，以500ml体积计，所述精液保存液的配置方法包括：将nacl 3.7145g、kcl 1.3905g、cacl2·2h2o 0.1911g、mgcl2·6h2o0.1524g和nahco3 0.2100g溶入500ml蒸馏水中，用1n-naoh溶液将ph值调整到8.5~9.5；所述精液保存液的温度为8.5~10℃。

5.根据权利要求1所述的规模化生产方法，其特征在于，步骤s2中，所述雌鱼卵子的获取方法包括：容器中加入洗卵液；将雌鱼麻醉，采卵，获得卵子。

6.根据权利要求5所述的规模化生产方法，其特征在于，以1000ml体积计，所述洗卵液的配置方法包括：将7.5g的nacl、0.2g的kcl、0.2g的cacl2·2h2o和0.02g的nahco3加入到1000ml蒸馏水中，制成洗卵液；所述洗卵液的温度为8.5~10℃。

7.根据权利要求1所述的规模化生产方法，其特征在于，步骤s2中，所述人工授精的方法包括：每个容器收集6~8尾雌鱼卵子，加入50~100ml伪雄鱼精液，羽毛轻柔搅拌1~2min后静置2~4min；清水冲洗2~3次，获得受精卵。

8.根据权利要求1所述的规模化生产方法，其特征在于，步骤s3中，受精卵加倍化处理前，使用3~5l/min的微流水冲洗20~30min，再进行静水压处理。

9.根据权利要求1所述的规模化生产方法，其特征在于，所述规模化生产方法还包括孵化管理与检测，孵化期间严格避光，避免断水及受精卵震动；当孵化的受精卵达到230度日时检测发眼率，240度日时检测三倍体率。

10.根据权利要求1所述的规模化生产方法，其特征在于，步骤s2~s4中的环境温度为9~12℃，水温为8.5~10℃。