一种在远海快速获得纯化珊瑚受精卵的方法

本发明涉及珊瑚有性繁殖与杂交育种，具体涉及一种在远海快速获得纯化珊瑚受精卵的方法。

背景技术：

1、珊瑚礁被誉为“海洋中的热带雨林”，是海洋生态系统中最重要、最复杂、生产力最高的生态系统之一。珊瑚礁不仅为大量鱼类、贝类、甲壳类等海洋生物提供栖息地，还在保护海岸线、防止海浪侵蚀、维持渔业资源、促进海洋旅游以及保障海岛和海岸带生态安全方面发挥着重要作用。因此，珊瑚礁具有重要的生态价值、经济价值和国土战略安全价值。

2、然而，近年来，全球珊瑚礁生态系统正在快速退化。面对珊瑚礁持续退化的趋势，仅依靠自然恢复已经难以满足生态修复需求，因此需要发展更加主动和高效的人工修复技术。

3、目前，珊瑚修复主要有两种方式：一种是无性繁殖，也就是通过珊瑚断枝、碎片等方式培育新个体；另一种是有性繁殖，也就是通过收集珊瑚释放的精子和卵子，使其受精并培育成新的珊瑚个体。无性繁殖操作相对简单、见效快，是目前应用较多的方法，但它产生的新个体遗传背景较为单一，长期使用可能导致种群遗传多样性不足，降低珊瑚面对高温、疾病和环境变化的适应能力。相比之下，有性繁殖能够通过精子和卵子的结合重新组合遗传信息，产生遗传背景更加丰富的新个体。特别是在珊瑚杂交育种中，可以选择具有耐热、生长快、抗逆性强等优良性状的亲本进行定向杂交，培育出更适应未来海洋环境的珊瑚后代。这种方法类似于农业中的良种选育，是提升珊瑚环境适应力和生态恢复能力的重要技术方向。

4、但是，珊瑚杂交育种在实际操作中存在一个非常关键的技术瓶颈：如何快速、准确、单独地获得某一个珊瑚亲本的精子和卵子，并保证其不与其他珊瑚个体或其他珊瑚种类的配子混杂。

5、多数造礁珊瑚在产卵时释放的不是单独的精子和卵子，而是“精卵束”。精卵束可以理解为一个个小胶囊，里面包裹着多个卵子和大量精子。精卵束从珊瑚虫口部释放后，会因为自身具有正浮力而迅速向水面上浮，并在水体中扩散。自然状态下，同一海域内很多珊瑚个体会在相近时间同步产卵，这虽然有利于自然受精，但对于人工杂交育种来说，却容易造成不同亲本、不同种类之间的精卵束混杂。另外产生精卵束的珊瑚一般自体不受精，也就是说想要成功获得受精卵，至少需要分离两个来自不同亲本的精卵束。

6、如果精卵束来源不清楚，就无法确定后续受精得到的幼体来自哪一个父本和母本，也无法开展真正意义上的定向杂交选育。此外，珊瑚精子和卵子的受精窗口期较短，通常需要在产卵后的较短时间内完成收集、分离、纯化和杂交受精。如果操作时间过长，精子容易被海水稀释，卵子也可能因转移、搅拌或碰撞而受损，从而降低受精率和后续胚胎发育质量。

7、现有技术中，无论是在野外海域还是岸基培育场，珊瑚精卵束收集通常依赖人工用烧杯、长柄勺等工具从水面舀取漂浮的精卵束。该方法存在明显不足：一是收集到的精卵束往往来自多个珊瑚个体甚至多个珊瑚种类，难以追溯来源，难以获得纯化受精卵；二是收集效率低，所用工具繁杂缺乏便利，容易错过最佳受精时间；三是转移过程中容易导致精子稀释、卵子损伤和样品混杂；四是难以同时处理多个目标亲本，不利于规模化杂交育种。

8、因此，亟需建立一种方法，能够利用珊瑚精卵束自身上浮的特点，对特定亲本释放的精卵束进行定向收集，并快速分离纯化出来源清楚的精子和卵子，在较短的受精窗口期内完成受精，产生批量受精卵，为珊瑚杂交育种、种质保存和生态修复提供基础技术支撑。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种在远海快速获得纯化珊瑚受精卵的方法。

2、本发明是通过以下技术方案予以实现的：

3、一种在远海快速获得纯化珊瑚受精卵的方法，该方法包括如下步骤：

4、（1）目标亲本选择：选择具有耐热性、生长速度快、抗逆能力强、繁殖能力高的目标珊瑚亲本，包括作为父本的珊瑚个体和作为母本的珊瑚个体；

5、（2）精卵束定向收集：在目标珊瑚亲本产卵前或产卵过程中，将锥形收集结构布设于目标珊瑚个体上方，实现目标亲本精卵束的原位定向收集；所述收集结构包括锥形收集网和收集瓶，所述锥形收集网为倒置漏斗形结构，其顶部与下端开口的收集瓶连通，底部覆盖于目标珊瑚亲本上方，使精卵束沿锥形收集网向上聚集并进入收集瓶中；

6、（3）精卵束破裂处理：将收集获得的精卵束置于收集瓶内，通过滴管吹打、玻璃棒轻柔搅拌等温和方式使精卵束破裂，释放精子和卵子分散于海水中；

7、（4）精子与卵子快速分离纯化：在收集瓶瓶口安装过滤结构，精子透过过滤结构，卵子被过滤结构截留，从而分别获得来源明确的精子和卵子；

8、（5）将来自不同目标珊瑚亲本的纯化精子和纯化卵子混合进行人工受精；

9、（6）受精完成后，利用过滤结构截留受精卵，并连续加入海水进行冲洗，使残余精子及其释放的顶体酶随海水排出，终止受精过程，从而获得来源明确、受精同步、纯度高且活性良好的珊瑚受精卵。

10、获得的受精卵可直接用于远海底播修复、人工育苗、幼体附着培养、珊瑚种质资源保存、杂交育种、耐逆性筛选以及珊瑚发育生物学等相关研究。

11、步骤（1）所述目标亲本来源于野外自然礁区、远海船载暂养系统或岸基培育设施。

12、优选地，步骤（2）每套收集结构对应一个目标珊瑚亲本。

13、优选地，所述收集结构包括锥形收集网、收集瓶及内过滤网圈，其中锥形收集网顶部与收集瓶可拆卸连接，内过滤网圈可拆卸安装于收集瓶瓶口。

14、优选地，锥形收集网顶部与收集瓶通过螺纹连接环连接。

15、优选地，所述圆锥形收集网采用柔性耐海水腐蚀网状材料制成，所述材料为尼龙，网孔规格为100–200目，更优选为150目，对应孔径约为106 μm，以在保证水体交换的同时防止精卵束逸散。

16、优选地，收集瓶为透明或半透明塑料瓶，以便观察精卵束收集情况并方便人工操作。

17、优选地，在所述锥形收集网与收集瓶的连接部位外侧设置浮力调节部件，所述浮力调节部件为泡沫浮力圈等浮力材料，用于调节收集结构整体浮力，使锥形收集网在水体中保持基本竖直状态。通过上述设置，有助于减少锥形收集网贴附于珊瑚表面形成褶皱，从而减少精卵束滞留或损失，提高收集效率。

18、优选地，在锥形收集网底部设置配重部件或调节结构，以与浮力调节部件配合，实现收集结构在不同水流环境中的姿态稳定。

19、优选地，所述锥形收集网底部边缘设置支撑钢圈，并设有多个气眼，并通过金属挂钩、尼龙绳、夹持件或绑带固定于礁体、支撑结构或培育设施上方；所述收集结构悬浮于目标珊瑚亲本上方3～10 cm处，并整体浸没于海水中或使收集瓶顶部高于水面。

20、优选地，步骤（4）和步骤（6）中所述过滤结构为过滤网圈，所述过滤网圈包括外圈支撑环及设置于外圈支撑环底部或内侧的过滤网层，所述过滤网圈可拆卸地卡合或旋合于收集瓶瓶口，所述过滤网层网孔规格为100～200目，优选为150目，对应孔径约106 μm。

21、优选地，步骤（4）在收集瓶瓶口安装过滤网，将另一收集瓶与其对接并整体翻转，使精子透过过滤网进入另一收集瓶，而卵子被过滤网截留；所述卵子在人工受精前经海水冲洗1～3次，以去除附着于卵子表面的残余精子。

22、优选地，步骤（5）所述人工受精是通过将分别装有精子和卵子的收集瓶瓶口相对连接后整体翻转混匀完成，精子和卵子的体积比为1:1；所述混匀方式为将连接后的收集瓶整体正置和倒置交替翻转5～20次，并静置20～30 min完成受精。

23、优选地，收集瓶和内过滤网圈既可用于配子分离，也可作为人工受精及洗卵容器重复使用，实现配子收集、受精及受精卵纯化的一体化操作，减少样品转移次数，降低受精卵损失，提高整体操作效率。

24、优选地，所述方法适用于释放精卵束的造礁珊瑚，包括但不限于鹿角珊瑚属、蔷薇珊瑚属、裸肋珊瑚属、扁脑珊瑚属、叶状珊瑚属、刺叶珊瑚属及角蜂巢珊瑚属中的全部或部分种类。

25、本发明先利用珊瑚精卵束具有正浮力的生物学特性，在目标珊瑚亲本上方构建定向导流收集空间，使释放后的精卵束沿收集网集中进入收集瓶，实现单一亲本精卵束的快速富集与收集。珊瑚精卵束破裂后进一步利用珊瑚精子与卵子在粒径上的显著差异，通过设置特定孔径的过滤结构，使尺寸较小的精子能够透过滤网，而尺寸较大的卵子被过滤网截留，实现精子与卵子的快速物理分离。通过单亲本独立收集及配对标记管理，可保证获得的精子和卵子具有明确来源，实现杂交育种过程中父本和母本来源可追溯，提高人工杂交育种的准确性和可靠性。本发明将精卵束收集、破裂、过滤分离及纯化过程形成连续操作流程，缩短配子处理时间，有利于在珊瑚受精窗口期内完成杂交操作，提高受精效率及后续胚胎发育质量。

26、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

27、（1）本发明利用珊瑚精卵束具有正浮力的特性，在目标珊瑚亲本产卵前或产卵过程中，将锥形收集结构布设于目标珊瑚个体上方，快速定向收集目标亲本释放的精卵束，能够获得来源明确的单亲本纯化精子与卵子，实现配子来源可追溯，满足定向杂交育种需求。

28、（2）利用珊瑚精卵束自然上浮特性实现定向收集，提高精卵束收集效率，减少样品损失。

29、（3）采用物理过滤方式快速完成精子与卵子的分离纯化，操作简单，对卵子损伤小。

30、（4）减少精子在海水中的扩散和稀释，提高配子活性，有利于提高人工受精成功率。

31、（5）将精卵束收集、配子分离、人工受精和洗卵纯化集成为连续流程，适用于野外原位、船载作业及岸基培育等多种应用场景，具有较好的现场适应性，特别适用于远海操作不便环境。

32、（6）便于多亲本同步采集、编号及管理，有利于规模化杂交育种及珊瑚种质资源保存。

33、总之，本发明利用珊瑚精卵束具有正浮力的特性，通过收集结构快速定向收集目标亲本释放的精卵束，经破束和过滤分离获得来源明确的精子和卵子，再将不同亲本配子进行人工受精，并通过过滤洗卵去除残余精子及顶体酶，终止受精过程，从而获得可直接用于幼体培育或底播播种的纯化受精卵。该方法将精卵束收集、配子分离、人工受精和洗卵纯化集成为连续流程，可在远海原位、船载平台及岸基条件下实施，无需依赖实验室设备，具有操作简便、受精效率高、受精卵质量稳定和适于规模化生产等优点，可用于珊瑚杂交育种及珊瑚礁生态修复。