葛根素晶V型物质用于预防治疗糖尿病心肌病的用途

葛根素晶v型物质用于预防治疗糖尿病心肌病的用途
技术领域
1.本发明涉及葛根素晶v型物质的防治糖尿病并发的心肌损伤的作用，属于医药技术领域。


背景技术：

2.随着社会生活水平的提高，生活方式的改变，不良饮食习惯以及各种有害因素的综合作用，糖尿病患病人数正在快速、持续增长。2017年，死于糖尿病的患者达400万余人，预测显示，到2045年，大约有6.3亿人(约占成年人口的10％)将患上糖尿病，尤其是发展中国家的发病率大大升高，这一疾病不仅给患者及家属带来身心痛苦，也给社会带来巨大的经济负担[1,2]。
[0003]
糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,dcm)是糖尿病常见的微血管病变并发症，独立于高血压性心脏病、冠状动脉粥样硬化性心脏病及其他原因所致的心肌疾病，其特点是心肌扩张、肥厚，左心室舒张和收缩功能降低，进而发展为心力衰竭，是糖尿病患者高心力衰竭发生率和高死亡率的主要原因[3,4]。目前对糖尿病心肌病的治疗主要以提高心功能为主，并没有针对糖尿病心肌病的特殊有效药物。因此寻找有效治疗糖尿病心肌病的药物具有重要意义，也是心血管领域研究的重点。
[0004]
葛根素是从豆科植物野葛藤、葛根中的提取得到的异黄酮类化合物，化学结构式如式(i)：
[0005][0006]
经文献检索得到一篇发表在现代药物与临床杂志2017年第32卷第8期第7页关于“葛根素注射液辅助治疗不稳定型心绞痛的临床研究及其代谢组学作用机制”[5]文章，记载了葛根素注射液可从舒张血管、减轻炎症反应、稳定斑块及保护心肌细胞等多个方面起到辅助治疗不稳定型心绞痛的作用。但公开的内容重点在于葛根素注射液对不稳定型心绞痛的防治作用，并没有涉及糖尿病引起的心肌损伤，表现为左心室肥大、心肌胶原间质纤维化增加、脂肪浸润、左心室舒张功能不全单独存在或者早于收缩功能不全出现等。
[0007]
经文献检索得到一篇发表在中国病理生理杂志2019年第35卷第6期第6页关于“黄芪注射液联合葛根素注射液对2型糖尿病小鼠心肌的保护作用及其机制”文章[6]，记载了黄芪注射液联合葛根素注射液通过抑制内质网应激和caspase通路的活化从而抑制细胞凋
亡，对2型糖尿病小鼠心肌具有保护作用。该研究提示，葛根素溶解性低，注射液具有一定保护糖尿病心肌病的作用。但注射液给药不同于口服给药，而且公开的内容重点在于联合给药和注射给药，提示单独口服给药是完全不同的治疗方法和药物形式。
[0008]
越来越多的临床和试验证据证明了糖尿病对心脏结构和功能的影响，糖尿病引起的心功能不全将直接影响患者的生活质量、预后乃至寿命，应引起足够的重视。本发明是采用综合提取方法从葛根中提取制备的葛根素晶v型物质(晶体特征表征图谱如附图4所示)，经过大量动物实验研究，并经过多器官功能和结构的比较和作用机制的验证，与葛根素原料药(晶iv型)和已上市的葛根素注射液相比，发现了葛根素晶v型物质对糖尿病心肌病的预防和治疗作用，并且具有明显优势。与上述文献的内容完全不同，本发明的

技术实现要素：
主要涉及制备药物和药物组合，为临床提供防治由于糖尿病作为致病因素导致的心肌病变的药物。
[0009]
参考文献：
[0010]
[1]global estimates of diabetes prevalence for 2013and projections for 2035.diabetes research&clinical practice,2014.
[0011]
[2]worldwide trends in diabetes since 1980:a pooled analysis of 751population-based studies with 4.4 million participants.the lancet,2016.
[0012]
[3]diagnostic approaches for diabetic cardiomyopathy.cardiovascular diabetology,2017.
[0013]
[4]diabetic cardiomyopathy:pathophysiology,diagnostic evaluation and management.world journal of diabetes,2013.
[0014]
[5]现代药物与临床，2017年，第32卷，第8期，第7页。
[0015]
[6]中国病理生理杂志，2019年，第35卷，第6期，第6页。
发明内容
[0016]
本发明要解决的技术问题是提供一种葛根素晶
ⅴ
型物质或其药学上可接受的盐在制备预防、治疗和/或缓解糖尿病引起心肌损伤的药物中的用途
[0017]
为解决本发明的技术问题，本发明提供了如下技术方案：
[0018]
本发明的技术方案提供了如式(i)所示的葛根素晶
ⅴ
型物质或其药学上可接受的盐在制备预防、治疗和/或缓解糖尿病心肌病药物中的应用；
[0019]
本发明的一个实施方案提供葛根素晶v型物质对糖尿病心肌病大鼠空腹血糖的影响。
[0020]
本发明的一个实施方案提供葛根素晶v型物质对糖尿病心肌病大鼠糖耐量的影响。
[0021]
本发明的一个实施方案提供葛根素晶v型物质对糖尿病心肌病大鼠心脏重量和心重指数的影响，以此评价动物心脏功能变化。
[0022]
本发明的一个实施方案提供葛根素晶v型物质对糖尿病心肌病大鼠血糖和血脂生化指标的影响，以此评价动物糖尿病的病理状态。
[0023]
本发明的一个实施方案提供葛根素晶v型物质对糖尿病心肌病大鼠心肌酶谱的影响。
[0024]
本发明的一个实施方案提供葛根素晶v型物质对糖尿病心肌病大鼠心率变异性的影响。
[0025]
本发明的一个实施方案提供葛根素晶v型物质对糖尿病心肌病大鼠心肌组织病理变化的影响。
[0026]
本发明的一个实施方案提供葛根素晶v型物质对糖尿病心肌病大鼠心肌纤维化的影响。
[0027]
本发明的一个实施方案提供葛根素晶v型物质对糖尿病心肌病大鼠心肌超微结构的影响。
[0028]
本发明的一个实施方案提供葛根素晶v型物质对胰岛素抵抗、心肌肥大和心衰等糖尿病心肌病的影响。
[0029]
本发明的一个实施方案提供葛根素晶v型物质作为药物活性成分而制备开发出的各种供临床使用的片剂、胶囊、丸剂、针剂、缓释或控释药物制剂类型。
[0030]
本发明显示葛根素晶v型物质可降低糖尿病血糖，减轻糖尿病心肌纤维化和心肌肥大的作用，适用于糖尿病引起的心肌病变和心肌纤维化的治疗。
[0031]
本发明因此还涉及以本发明化合物作为活性成分的药物组合物。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅料结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的含量通常为0.1～95重量％。
[0032]
本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。
[0033]
给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。
[0034]
本发明化合物可以制成普通制剂、也可制成缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
[0035]
为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；润湿剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。
[0036]
还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双
层片和多层片。
[0037]
为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、粘合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。
[0038]
此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其他添加剂。
[0039]
为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。
[0040]
本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物每天的合适剂量范围为0.001～1000mg/kg体重，优选为0.1～1000mg/kg体重，更优选为1～1000mg/kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。
[0041]
本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症治疗合并使用。当本发明化合物与其他治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。
[0042]
有益技术效果：
[0043]
糖尿病心肌病是指发生于糖尿病患者，其与高血压、冠状动脉疾病及其他心脏病无关。该病在代谢紊乱及微血管病变的基础上引发心肌广泛灶性坏死，出现亚临床的心功能异常，最终进展为心律失常、心力衰竭及心源性休克，重症患者甚至猝死。流行病学、临床和实验研究表明高血糖是糖尿病心肌病的主要病因，糖尿病患者对心血管并发症和心力衰竭的易感性增加，研究表明糖尿病患者发生心力衰竭的风险约为非糖尿病患者的2至5倍，目前还缺少解决由糖尿病引起的心力衰竭的具体治疗策略，因此开发新的治疗药物刻不容缓，而葛根素晶v型物质针对糖尿病引起的心肌病具有显著的治疗作用。葛根素晶v型物质较原料药(晶iv型)能够明显改善糖尿病心肌病大鼠心肌的组织形态，并且减少胶原的沉积，减轻纤维化的症状和心肌超微结构损伤，说明葛根素晶v型物质能够减轻糖尿病引起的心肌收缩功能和舒张功能障碍。葛根素晶v型物质较原料药(晶iv型)能够明显改善由高血糖引起的心率变异性，显著降低糖尿病心肌病大鼠的心脏指数，表明葛根素晶v型物质能够减轻糖尿病引起的心律失常和心肌肥厚。葛根素晶v型物质较原料药(晶iv型)对于血糖生化指标和血脂生化指标作用显著，对糖尿病心肌病具有保护作用。可见葛根素晶v型物质对于由糖尿病引起的心肌损伤产生了不可预见的有益的治疗效果，这是多方面综合作用的结果，与阳性药二甲双胍、原料药和注射液分别比较有其独特性。
附图说明
[0044]
图1：葛根素晶v型物质对糖尿病心肌病大鼠心肌病理学改变的影响。he病理图片放大倍数为200倍。
[0045]
图2：葛根素晶v型物质对糖尿病心肌病大鼠心肌纤维化的影响。a：左图
×
2，右图
×
20；b：心肌胶原纤维含量统计结果。n＝6-8，mean
±
sem，
**
p《0.1与正常对照组比，
#
p《0.5与模型对照组比
[0046]
图3：葛根素晶v型物质对糖尿病心肌病大鼠心肌细胞超微结构的影响。
[0047]
图4：葛根素晶v型物质晶体特征表征图谱。a：葛根素晶v型物质粉末x射线衍射图(pxrd)，b：葛根素原料药粉末x射线衍射图(pxrd)，c：葛根素晶v型物质差示扫描量热法图谱，d：葛根素原料药差示扫描量热法图谱。
具体实施方式
[0048]
下面的实施例用于进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明的保护范围的任何限制。
[0049]
实验例1：葛根素晶v型物质对糖尿病心肌病大鼠空腹血糖的影响
[0050]
实验方法：sd大鼠200只，适应性喂养3天后，随机选取15只作为正常对照组(nc)，其余作为糖尿病心肌病造模组。正常对照组喂养标准大鼠饲料，糖尿病心肌病组喂养60％高脂饲料。4周后测定大鼠血脂水平，可见血脂水平升高。高脂饲料喂养6周后，所有动物过夜禁食12小时，造模组大鼠按0.5ml/100g体积腹腔注射30mg
·
kg-1
链脲佐菌素(streptozocin,stz)(临用时以ph 4.4的0.1mol
·
l-1
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液配置，置于冰上，现用现配。每次配制保证15分钟内用完)，正常对照组大鼠仅注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。注射stz 72小时及1周后，大鼠禁食4小时，尾尖取血，分别测定禁食血糖值。选定空腹血糖大于11.1mmol
·
l-1
的动物为ii型糖尿病大鼠模型。血糖稳定后，造模组大鼠按0.1ml/100g体积皮下注射5mg
·
kg-1
异丙肾上腺素(isoproterenol,iso)(临用时以生理盐水配置，避光放置，现用现配)，正常对照组大鼠仅注射生理盐水。造模成功的大鼠随机分为以下几组：模型对照组(dm)、二甲双胍组(met，150mg
·
kg-1
·
d-1
)、葛根素晶v型物质低剂量组(50mg
·
kg-1
·
d-1
)、中剂量组(100mg
·
kg-1
·
d-1
)、高剂量组(200mg
·
kg-1
·
d-1
)、葛根素原料药组(200mg
·
kg-1
·
d-1
)、葛根素注射液组(40mg
·
kg-1
·
d-1
)，每组各12只，合并正常对照组(nc)共8组。药品以口服灌胃形式给药(下同)，药物粉末用0.5％cmc-na配成混悬液，按体重0.5ml/100g灌胃给药，模型对照组和正常对照组给予等量0.5％cmc-na，每天一次，持续6周。实验结束时动物称重，大鼠禁食4小时，尾尖取血，测定空腹血糖值。
[0051]
实验结果：
[0052]
空腹血糖能反映机体胰岛β细胞的功能，一般表示基础胰岛素的分泌功能，是糖尿病最常用的检测指标。如表1所示糖尿病心肌病大鼠的空腹血糖明显高于正常对照组小鼠，说明在给药期间，模型动物的血糖一直处于较高水平，二甲双胍治疗6周后，其空腹血糖明显降低。葛根素晶v型物质给药组由于个体差异较大故不具有显著性差异，但呈现剂量依赖性，并且优于葛根素原料药和注射液组。
[0053]
表1葛根素晶v型物质对糖尿病心肌病大鼠空腹血糖的影响
[0054]
组别剂量(mg/kg)空腹血糖(mmol
·
l-1
)正常对照组 4.9
±
0.1模型对照组 17.8
±
0.5
**
二甲双胍组15016.3
±
0.4
#
葛根素晶v型物质低剂量组5016.3
±
0.7葛根素晶v型物质中剂量组10016.3
±
0.5葛根素晶v型物质高剂量组20015.5
±
1.0
葛根素原料药组20016.2
±
1.0葛根素注射液组4016.5
±
0.5
[0055]
n＝9～15，mean
±
sem，
**
p《0.01与正常对照组比，
#
p《0.5与模型对照组比。
[0056]
实验例2：葛根素晶v型物质对糖尿病心肌病大鼠口服糖耐量的影响
[0057]
实验方法：给药第40天，进行口服糖耐量实验(oral glucose tolerance test，ogtt)。动物禁食4h，尾尖取血，测定给糖前0min血糖水平。然后按0.5ml/100g体积，灌服30％葡萄糖溶液，分别于灌服葡萄糖后30min，60min，90min和120min尾尖取血，测定各时间点的血糖水平。绘制糖耐量曲线，并计算血糖-时间曲线下面积(area under curve，auc)，其中auc＝0.25
×
fbg 0h 0.5
×
fbg0.5h 0.75
×
fbg 1h 0.5
×
fbg 2h，其中fbg 0h表示0h的空腹血糖值。
[0058]
实验结果：
[0059]
如表2所示，二甲双胍、葛根素晶v型物质各剂量组、原料药及注射液组均可抑制血糖升高的趋势，与模型对照组相比血糖时间曲线下面积分别降低14.50％，8.69％，9.99％，15.56％，3.50％，8.65％，提示葛根素晶v型物质能够改善糖尿病心肌病大鼠糖耐量，作用机制与二甲双胍类似，均可抑制葡萄糖负荷后的血糖升高，效果优于原料药和注射液组。
[0060]
表2葛根素晶v型物质对糖尿病心肌病大鼠口服糖耐量的影响
[0061][0062][0063]
n＝8～15，mean
±
sem，
**
p《0.01与正常对照组比，
#
p《0.5，
##
p《0.01与模型对照组比。
[0064]
实验例3：葛根素晶v型物质对糖尿病心肌病大鼠心脏重量和心重指数的影响
[0065]
实验方法：实验结束时动物称重(body weight,bw)，作解剖，取大鼠心脏，0.9％生理盐水清洗，滤纸吸取残血，除去血管等附着物质，称量全心重(heart weight,hw),然后剪去心房和右心室，称取左心室重量(left ventricular weight,lvw),计算全心重指数(全
心重/体重，hw/bw)和左心室肥厚指数(左心室重量/体重，lvw/bw)。
[0066]
实验结果：
[0067]
给药6周，葛根素晶v型物质呈剂量依赖性降低全心重、全心重指数和左心室肥厚指数，其中高剂量组全心重指数和左心室肥厚指数降低显著，心脏重量虽有降低趋势，但差异不显著,效果均优于原料药和注射液组。
[0068]
表3葛根素晶v型物质对糖尿病心肌病大鼠心脏重量和心重指数的影响
[0069][0070][0071]
n＝12～14，mean
±
sem，
**
p《0.01与正常对照组比，
#
p《0.05与模型对照组比。
[0072]
实验例4：葛根素晶v型物质对糖尿病心肌病大鼠血糖和血脂生化指标的影响
[0073]
实验方法：实验结束时动物称重，腹主动脉取血，肝素抗凝，4℃，5000r离心15min，取上清。全自动生化分析仪检测甘油三酯(triglyceride,tg)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol,ldl)、游离脂肪酸(non-esterified fatty acid,nefa)、糖化血清蛋白(glycosylated serum protein,gsp)、总胆固醇(total cholesterol,tch)水平。
[0074]
实验结果：
[0075]
给药6周，葛根素晶v型物质呈剂量依赖性降低甘油三酯、低密度脂蛋白、游离脂肪酸、糖化血清蛋白、总胆固醇水平，高剂量组效果最为显著。
[0076]
表4葛根素晶v型物质对糖尿病心肌病大鼠血糖和血脂生化指标的影响
[0077][0078][0079][0080]
n＝12～14，mean
±
sem，
**
p《0.01与正常对照组比，
#
p《0.05，
##
p《0.01与模型对照组比。
[0081]
实验例5：葛根素晶v型物质对糖尿病心肌病大鼠心肌酶谱的影响
[0082]
实验方法：实验结束时动物称重，腹主动脉取血，肝素抗凝，4℃，5000r离心15min，取上清。全自动生化分析仪检测谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,ast)、乳酸脱
氢酶(lactate dehydrogenase,ldh)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes,ck-mb)水平。
[0083]
实验结果：
[0084]
心肌酶谱的检测可用于确定心肌缺血坏死或细胞膜通透性。葛根素晶v型物质可剂量依赖性降低ast、ldh、ck-mb水平。高剂量组优于原料药和注射液组。
[0085]
表5葛根素晶v型物质对糖尿病心肌病大鼠心肌酶谱的影响
[0086][0087]
n＝10～15，mean
±
sem，
**
p《0.01与正常对照组比，
#
p《0.05，
##
p《0.01与模型对照组比。
[0088]
实验例6：葛根素晶v型物质对糖尿病心肌病大鼠心率变异性的影响
[0089]
实验方法：给药40天后，大鼠仰卧固定在鼠板上，针状电极插入四肢皮下，记录ii导联心电图。
[0090]
实验结果：
[0091]
总体标准差(sdnn)反映交感神经和副交感神经之间的平衡性；低频高频功率比值(lf/hf)主要反映交感神经和副交感神经的平衡状态。葛根素晶v型物质可剂量依赖性的降低sdnn、rmssd以及低高频功率比值，其中以高剂量组效果最显著，且优于原料药与注射液
组。
[0092]
表6葛根素晶v型物质对糖尿病心肌病大鼠心率变异性的影响
[0093][0094]
n＝12～14，mean
±
sem，
**
p《0.01与正常对照组比，
#
p《0.05与模型对照组比。
[0095]
实验例7：葛根素晶v型物质对糖尿病心肌病大鼠心肌组织病理变化的影响
[0096]
实验方法：造模分组及给药方法同实验例1，末次给药后取大鼠心肌组织，用组织固定液固定，石蜡包埋后切片，切片经苏木精-伊红染色后，nikon eclipse ti-u显微镜观察心肌组织形态结构变化，并拍摄病理照片。
[0097]
实验结果：
[0098]
大鼠肝组织he染色结果如图1所示，正常组大鼠心肌纹理清晰，细胞形态和结构正常，无炎症细胞浸润；模型对照组心肌结构紊乱，细胞界限消失，广布局灶性坏死，心肌纤维凝固性坏死和断裂。葛根素晶v型物质治疗组能够不同程度的降低心肌病理改变，保持更多心肌细胞结构正常，减少炎症细胞浸润。
[0099]
实验例8：葛根素晶v型物质对糖尿病心肌病大鼠心肌纤维化的影响
[0100]
实验方法：造模分组及给药方法同实验例1，末次给药后取大鼠心肌组织，用组织固定液固定，石蜡包埋后切片，脱蜡水化，切片入regaud苏木精染液染核5～10min，充分水洗，蒸馏水洗。masson丽春红酸性复红液5～10min，2％冰醋酸水溶液浸洗数秒，1％磷钼酸分化3～5min。苯胺蓝染5min，冰醋酸浸洗。95％酒精、无水酒精、二甲苯逐级脱水至透明，中性树胶封固。光学显微镜观察病理改变。
[0101]
末次给药后取大鼠约0.1g左心室组织，按试剂盒说明书要求测定样品中羟脯氨酸含量。
[0102]
实验结果：
[0103]
masson染色结果如图2所示，正常对照组心肌组织结构正常，基本没有发生纤维化
改变。模型对照组心脏左室壁肌细胞明显减少，胶原纤维大量沉积，纤维化情况非常明显。葛根素晶v型物质各给药组大鼠的左心室胶原沉积减少，纤维化情况得到不同程度的改善。
[0104]
实验例9：葛根素晶v型物质对糖尿病心肌病大鼠心肌超微结构的影响
[0105]
实验方法：造模分组及给药方法同实验例1，末次给药后取大鼠心肌组织，用2.5％戊二醛固定，放置于4℃冰箱固定1.5h或更长时间。用0.1m pbs缓冲液漂洗30min
×
3次，2％锇酸固定液固定1.5h，用0.1m pbs缓冲液漂洗15min
×
3次。乙醇逐级脱水。纯丙酮 包埋液(1:2)渗透。包埋、超薄切片，2％醋酸铀-柠檬酸铅双染色。透射电镜观察，拍片。
[0106]
实验结果：
[0107]
透射电镜结果如图3所示，正常对照组心肌纤维含有大量肌丝，肌小节z线排列整齐；线粒体形态正常，嵴丰富。模型对照组心肌肌原纤维片状坏死、溶解，肌小节失去正常结构，肌纤维水肿；线粒体水肿、空泡变，嵴断裂和溶解；心肌间质可见较多的脂褐素。葛根素晶v型物质给药组心肌病变减轻，部分肌原纤维排列紊乱，无溶解、坏死；线粒体形态较为正常。