一种新型细胞外囊泡检测技术联合特异蛋白标志物的尿路上皮癌辅助诊断及应用

1.本发明涉及疾病辅助诊断技术领域，具体涉及一种新型细胞外囊泡检测技术联合特异蛋白标志物的尿路上皮癌辅助诊断及应用。


背景技术：

2.尿路上皮癌(urothelial carcinoma,uc)是起源于尿路上皮的一种多源性恶性肿瘤，包括肾盂癌、输尿管癌和膀胱癌。它是最常见的泌尿系统肿瘤，也是全球排名第九的最常见恶性肿瘤。该疾病常见于55岁以上男性，男女患病比例约为4:1。早期诊断和治疗可以使患者的5年生存率达到90％以上，因此，对尿路上皮癌的早期诊断和干预至关重要。
3.目前，病理活检是诊断尿路上皮癌的金标准。常用的辅助检查的方法包括诊断性电切术及病理检查、尿脱落细胞学检查、膀胱镜检查、尿液肿瘤标志物检测、尿膜蛋白酶原-2型试验、ct或mri扫描以及超声检查。然而，这些技术存在一些问题：
4.1.病理活检的取样范围受限：由于输尿管狭窄等原因，病理活检可能无法获取足够的组织样本。此外，如果患者出现不明原因的血尿，则需要反复检查，不仅增加了患者的痛苦，而且因检查的有创性增加了感染和出血的风险。
5.2.尿脱落细胞学检查的局限性：尿脱落细胞学检查的特异性较高，但其对于低级别尿路上皮癌的敏感性有所欠缺，导致较高的漏诊率。为了弥补低敏感度，需要增加检测次数，这增加了患者和医疗机构的经济压力和时间成本。此外，细胞脱落学检查对尿液样本的要求较为严格，如泌尿系统感染、结石、细胞增生等因素可能导致检测结果偏差。
6.3.膀胱镜检查的不适和风险：膀胱镜检查需要插入器械到尿道，对患者来说检测舒适度低，同时也存在感染和出血等风险。
7.4.尿液肿瘤标志物检测的问题：检测过程繁琐、耗时长，很难大规模应用于临床检测。与尿脱落细胞学检测类似，该技术对尿液样本有较高要求，如尿收集不符合标准或未及时检测需重新采样和检测。此外，该技术的高医疗成本也限制了其临床大规模应用。
8.5.尿膜蛋白酶原-2型试验的局限性：该试验虽然有一定的敏感性和特异性，但并非完全可靠，可能会受到其他因素的影响，如尿路感染或其他泌尿系统疾病。
9.6.ct扫描和mri扫描的辐射暴露和费用高昂：这些影像学检查需要使用辐射和昂贵的设备，同时也可能对患者造成一定的辐射暴露风险。
10.7.超声检查的限制：超声检查在探测膀胱和肾脏病变方面有一定的局限性，对于低级别尿路上皮癌或深部病变的检测可能不够敏感。
11.因此，迫切需要开发更加便捷、经济且精准的尿路上皮癌早期筛查及诊断手段。近年来，基于新兴的“液体活检”概念和技术开发的新型疾病诊断标志物，由于其具有组织器官特异性强、标志物疾病辨识度高、临床检测灵敏度高以及临床取样微量微创等技术优势，给尿路上皮癌的早期预警和诊断带来了重大的科学及技术突破。
12.细胞外囊泡(extracellular vesicles，evs)来源的诊断标志物检测是近年来发
展最迅速的液体活检技术之一。血液、唾液、尿液、脑脊液等多种体液中都能检出组织器官甚至细胞特异性的evs。evs是由细胞分泌的双层脂质结构的微颗粒，可以携带特定的分子信息，包括核酸、脂质、蛋白等，这些物质受其分泌的母细胞类型及细胞状态等多种因素影响，可以反映机体特定的病理生理状态。通过检测组织特异性蛋白或者肿瘤特异性蛋白，可以预测肿瘤的起源和进展。uroplakin是一种主要在尿路上皮细胞中表达的蛋白质，已知的四种亚型uroplakin ia，uroplakin ib，uroplakin ii，uroplakin-iii共同形成尿路上皮细胞表面的尿路上皮斑块。uroplakin ia，uroplakin ib是跨膜蛋白，主要负责尿路上皮细胞粘附、运动、激活和增殖功能。uroplakin ii和uroplakin-iii具有一个跨膜结构域，其c末端在细胞浆中，n末端在膀胱内，研究表明，uroplakin覆盖90％的尿路上皮，可作为尿路上皮细胞的特异性蛋白。fgfr3是一种受体型酪氨酸激酶，属于成纤维细胞生长因子受体家族。它在人体中广泛分布，并参与多种生物学过程，特别是细胞生长、分化和发育调控，有研究表明，fgfr3的基因突变有可能驱动上皮组织特异性癌变风险增高。cdkn2a在调控细胞周期和细胞增殖中具有关键作用，其突变或功能丧失与多种癌症的发生和进展密切相关。gata3是一种转录因子蛋白，参与调控多个基因的表达，从而影响细胞增殖、分化和功能。gata3在泌尿系统中的表达也很重要。它在肾小管细胞和膀胱上皮细胞中起着调控细胞增殖和分化的作用。gata3的异常表达与肾脏疾病和尿路上皮癌的发生有关。
13.基于evs的分子标志物在肿瘤的筛查、诊断、转移及预后方面具有巨大潜力。目前已经有许多研究专利致力于开发用于膀胱癌的生物标志物，以替代现有的检测手段。然而，到目前为止，在这个领域已知的生物标志物中，尚未出现一种测试方法或专利技术，能够凭借某个单一生物标志物在检测中同时具备较高的敏感度和特异性。
14.综上所述，现有的辅助诊断专利技术对于低级别尿路上皮癌的敏感性低，容易造成漏诊。因此，迫切需要发现一种或多种高敏感性和高特异性的生物标志物，并提供一种临床上易于推广、可用于筛查和常规检查的非侵入性尿路上皮癌测试系统。


技术实现要素：

15.为了克服上述现有技术中存在的不足，本发明提出了一种新型细胞外囊泡检测技术联合特异蛋白标志物的尿路上皮癌辅助诊断及应用。该方法联合尿路上皮细胞特异性蛋白标志物uroplakin ia，以及肿瘤相关的蛋白标志物fgfr3、cdkn2a、gata3中的一种或几种进行多重标记，利用流式仪来检测并捕获尿液样本中细胞外囊泡所携带的荧光信号，用于疾病的诊断和治疗目的的辅助诊断，以区别高级别尿路上皮癌患者、低级别尿路上皮癌患者和健康人群。
16.作为本发明的一个方面，本发明提供一种用于尿路上皮癌筛查与诊断的新型细胞外囊泡检测技术联合特异蛋白标志物，其包括uroplakin ia，以及fgfr3、cdkn2a、gata3中的一种或几种。
17.优选的，所述uroplakin ia、fgfr3、cdkn2a、gata3蛋白来源于细胞外囊泡。
18.优选的，所述细胞外囊泡来源于尿液。
19.优选的，所述uroplakin ia和fgfr3用于区分低级别尿路上皮癌和高级别尿路上皮癌。
20.优选的，所述尿路上皮癌包括肾盂、输尿管、膀胱和尿道的癌变中的一种或几种。
21.本发明的有益效果如下：
22.本发明旨在开发一种能够在尿液中有效识别尿路上皮来源的生物标志物的方法。该方法通过与疾病相关标志物联合、并采用多重标记同时检测，实现无创、高效、高敏感地通过尿液样本捕捉到尿路上皮组织癌变的信号。与常用的辅助检查方法相比，本发明具有以下优点：
23.1.非侵入性：新型细胞外囊泡检测技术无需创伤性取样，通过尿液收集即可获取肿瘤相关的细胞外囊泡及蛋白，避免了传统组织活检的痛苦和风险。
24.2.高敏感性：新型细胞外囊泡检测技术可以特异性地检测尿路上皮细胞来源的细胞外囊泡，从而提高了尿路上皮癌的检测敏感性，减少漏诊的可能性。
25.3.动态监测：尿液样本易于多次采集，可以有效区分高级别、低级别尿路上皮癌，可对尿路上皮癌进行动态监测，为尿路上皮癌提供了更好的临床管理指导。
26.4.方便和经济：尿液采集简便、快速，检测过程简易且耗时相对较短，成本较低，适用于大规模筛查和常规监测。
27.本研究提出一种新型细胞外囊泡检测技术联合特异蛋白标志物的尿路上皮癌辅助诊断及应用。该方法联合尿路上皮细胞特异性蛋白标志物uroplakin ia，以及肿瘤相关的蛋白标志物fgfr3、cdkn2a、gata3进行尿路上皮癌变的诊断/鉴别诊断。针对现有专利技术的成果，本研究发现的生物标志物在尿路上皮癌早期/低级别诊断中具有更高的敏感度和特异性，检测方法不易丢失样本中的重要信息。
附图说明
28.图1显示为本发明实施例提取的健康人群(nc)和尿路上皮癌人群(uc)尿液细胞外囊泡鉴定图，其中(a)透射电子显微镜检测nc和uc尿液细胞外囊泡形态大小无显著区别；(b)纳米颗粒追踪显示nc和uc尿液细胞外囊泡分布无显著差异；(c)蛋白质印迹显示nc和uc尿液细胞外囊泡上含有细胞外囊泡特异性蛋白tsg101和alix以及uroplakin ia、fgfr3、cdkn2a及gata3蛋白；(d)随机光学重建显微镜显示nc和uc尿液中存在着带有fgfr3、cdkn2a或gata3蛋白的来自尿路上皮细胞(uroplakin ia

)的细胞外囊泡。
29.图2显示为实施例提取的尿液细胞外囊泡纳米流式检测技术方案特异性和稳定性检测。(a)尿液中含有uroplakin ia、fgfr3、cdkn2a或gata3的细胞外囊泡的百分比显著高于同型igg对照组。同时，在提取尿液细胞外囊泡过程中废弃过滤液中的uroplakin ia

、fgfr3

、cdkn2a

、或gata3

颗粒的百分比显著降低。(b)uroplakinia、fgfr3、cdkn2a、和gata3抗体在不同稀释倍数和不同孵育时间下对细胞外囊泡的标记百分比保持稳定。
30.图3显示为本发明实施例1尿液中uroplakin ia、fgfr3、cdkn2a及gata3蛋白阳性细胞外囊泡纳米流式检测统计结果和诊断效能分析的roc曲线图，其中(a)为健康组和尿路上皮癌组uroplakin ia

/fgfr3

细胞外囊泡比例流式检测统计结果；(b)为健康组和尿路上皮癌组uroplakin ia

/gata3

细胞外囊泡比例流式检测统计结果；(c)为健康组和尿路上皮癌组uroplakin ia

/cdkn2a

细胞外囊泡比例流式检测统计结果；(d)uroplakin ia

/fgfr3

、uroplakin ia

/gata3

、uroplakin ia

/cdkn2a

联合分析区分健康对照组和尿路上皮癌组的诊断效能roc曲线图。
31.图4显示为本发明实施例2尿液中uroplakin ia、fgfr3、gata3及cdkn2a蛋白阳性
1-ig,proteintech)、uroplakin ia和gata3(5852,cell signaling technology)或uroplakin ia和cdkn2a(nb200-106,novus)各1-2ug调整至总体积5-10ul，分别加入5-10ul alexafluortm抗体标记试剂(z25308，z25002，z25302)置于26℃避光孵育20-40分钟后，加2-5ul b液，26℃避光孵育10-15分钟，最后加30-50ul pbs，至样本总体积为30-40ul。
45.③
标记后的抗体组合uroplakin ia和fgfr3、uroplakin ia和gata3或uroplakin ia和cdkn2a以3-5ul加入样本中，4℃，避光孵育，过夜。
46.3.流式上机检测：
47.每个样品加15-30ul 4-10％pfa，置于26℃暗处存放10-20分钟，每个样品加100-300ul pbs进行cytoflex流式分析。检测时流式细胞仪设置为vssc模式，采集效率为高，设置总采集颗粒数为100000-150000，每秒颗粒数控制在8000-20,000之间。
48.4.数据分析
49.使用cytexpert for cytoflex对数据进行记录、分析与导出，按照阈值设定圈门区分阳性颗粒群体与阴性颗粒群体，利用工具栏中的圈门工具选中直线以上的部分，红色区域为阳性标记荧光的细胞外囊泡，其他区域为未标记细胞外囊泡，导出阳性细胞外囊泡群体百分比数据并分析。
50.使用spss 22.0对检测数据进行统计学分析。使用t检验和受试者工作曲线(receiver operating characteristic，roc)对抗体组合uroplakin ia和fgfr3、uroplakinia和gata3或uroplakin ia和cdkn2a标记正常人群和尿路上皮癌数据进行分析；使用二元逻辑回归分析对抗体组合uroplakin ia和fgfr3、uroplakin ia和gata3、uroplakin ia和cdkn2a进行联合分析。
51.前期研究分析结果显示，uroplakin ia相较其他三种亚型(uroplakin ia，uroplakinib,uroplakin ii，uroplakin-iii蛋白)在尿液细胞外囊泡测试中具有更好的特异性及稳定性。最终本技术方案选取包含尿路上皮细胞特异性蛋白标志物uroplakin ia，以及肿瘤相关的蛋白标志物fgfr3、gata3和cdkn2a作为潜在的尿路上皮癌相关蛋白质靶标。经过对样本细胞外囊泡的荧光标记并检测后发现，尿液中含有uroplakin ia、fgfr3、gata3或cdkn2a的细胞外囊泡的百分比显著高于同型igg对照组。同时，在提取尿液细胞外囊泡过程中废弃滤过液中的uroplakin ia

、gata3

、cdkn2a

和fgfr3

颗粒的百分比显著降低(图2a)，表明本技术方案可进行特异性检测。最后，uroplakin ia、gata3、cdkn2a和fgfr3抗体在不同稀释倍数和不同孵育时间下对细胞外囊泡的标记百分比相对稳定(图2b)。
52.实施例1通过检测尿路上皮癌来源细胞外囊泡诊断尿路上皮癌
53.通过上述技术方案1-4对包含46例正常人群样本(nc)和34例尿路上皮癌样本(uc)的临床样本进行检测，结果如图3。具体为：
54.①
uroplakin ia

/fgfr3

细胞外囊泡比例在uc组显著低于nc组比例(p《0.001)，灵敏性为75％-85％，特异性为70％-80％，曲线下面积(area under the curve，auc)为0.80-0.85。
55.②
uroplakin ia

/gata3

细胞外囊泡比例在uc组显著低于nc组比例(p《0.01)，灵敏性为60％-70％，特异性为60％-71％，auc为0.70-0.80。
56.③
uroplakin ia

/cdkn2a

细胞外囊泡比例在uc组显著低于nc组比例(p《0.01)，灵敏性为70％-80％，特异性为60％-65％，auc为0.65-0.75。
57.④
使用逻辑回归分析对uroplakin ia

/fgfr3

、uroplakin ia

/gata3

、uroplakinia

/cdkn2a

结果进行联合分析，结果显示：uc组比例显著低于nc组，灵敏性为85％-95％，特异性为80％-90％，auc为0.85-0.95。
58.实施例2通过检测尿路上皮癌来源细胞外囊泡诊断低级别尿路上皮癌
59.通过上述技术方案1-4对包含46例正常人群样本(nc)和16例低级别尿路上皮癌(low-grade，lg)的临床样本进行检测，结果如图4。具体为：
60.①
uroplakin ia

/fgfr3

细胞外囊泡比例在lg组显著低于nc组比例(p《0.001)，灵敏性为70％-80％，特异性为70％-80％，auc为0.78-0.88。
61.②
uroplakin ia

/gata3

细胞外囊泡比例在lg组低于nc组比例(p＝0.18)，灵敏性为50％-60％，特异性为85％-95％，auc为0.60-0.70。
62.③
uroplakin ia

/cdkn2a

细胞外囊泡比例在lg组低于nc组比例(p＝0.195)，灵敏性为50％-60％，特异性为50％-60％，auc为0.60-0.70。
63.④
使用逻辑回归分析对uroplakin ia

/fgfr3

、uroplakin ia

/gata3

、uroplakinia

/cdkn2a

结果进行联合分析，能准确区分lg组和nc组，灵敏性为80％-90％，特异性为60％-70％，auc为0.80-0.90。
64.实施例3通过检测尿路上皮癌来源细胞外囊泡诊断高级别尿路上皮癌
65.通过技术方案1-4对包含46例正常人群样本(nc)和34例尿路上皮癌样本(uc)和18例高级别尿路上皮癌(high-grade，hg)的临床样本进行检测，结果如图5。具体为：
66.①
uroplakin ia

/fgfr3

细胞外囊泡比例在hg组显著低于nc组比例(p《0.001)，灵敏性为80％-90％，特异性为70％-80％，auc为0.80-0.90。
67.②
uroplakin ia

/gata3

细胞外囊泡比例在hg组显著低于nc组比例(p《0.01)，灵敏性为70％-80％，特异性为70％-80％，auc为0.70-0.80。
68.③
uroplakin ia

/cdkn2a

细胞外囊泡比例在hg组显著低于nc组比例(p《0.05)，灵敏性为80％-90％，特异性为60％-60％，auc为0.70-0.80。
69.④
使用逻辑回归分析对uroplakin ia

/fgfr3

、uroplakin ia

/gata3

、uroplakinia

/cdkn2a

结果进行联合分析，能准确区分hg组和nc组，灵敏性为80％-90％，特异性为75％-85％，auc为0.85-0.95。
70.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。