生产复合体的方法、判定微生物包含的方法以及鉴定所包含的微生物的方法与流程

1.本公开涉及一种用于生产复合体的方法、一种用于判定微生物包含的方法以及一种用于鉴定所包含的微生物的方法。


背景技术：

2.过去，食品、药品、化妆品、日用品等产品的微生物检验例如按照图1或图2所示的程序进行(例如，专利文献1(jp 2006-230335 a)、专利文献2(jp 2017-006012a))。传统的微生物检验程序需要约4个步骤：(1)核酸(dna、rna)提取；(2)核酸扩增；(3)微阵列检测；以及(4)微生物(菌种)鉴定。通常，通过对样品中的核酸进行荧光标记并使标记的核酸与微阵列上的探针进行杂交来进行微阵列检测。在本公开中，术语“杂交”是指核酸分子的至少部分或在其分子结构的一部分中包含核酸的分子的核酸区域(例如，修饰的核酸或变性的核酸)互补地形成复合体的情况或形成这种复合体的实验或操作。
3.更具体而言，使用核酸提取试剂盒从存在于检验对象中的细菌中提取dna或rna。使用所提取的核酸(dna或rna)作为模板，通过聚合酶链式反应(pcr)或其他方式来扩增核酸。在扩增时，根据需要，使用荧光标记引物对目标核酸进行荧光标记。将扩增后的核酸施加到在其上固定有检测探针的微阵列(例如dna微阵列)以进行杂交。杂交完成后，使用荧光计检查与dna微阵列结合的核酸。通过进行这样的操作，可以判定细菌包含，并且在包含细菌的情况下，可以判定(鉴定)菌种。如图2所示，在通过pcr或其他方式扩增核酸时，可以基于扩增结果来判定是否存在细菌。有细菌存在时，也就是说，在观察到扩增的情况下，可以对样品进行微阵列检测，从而可以鉴定所包含的细菌。
4.引文列表
5.专利文献
6.专利文献1：jp 2006-230335 a
7.专利文献2：jp 2017-006012 a


技术实现要素：

8.技术问题
9.在根据图1所示的程序进行微生物检验的情况下，也对不含微生物(细菌)的样品进行微阵列检测。这不利地增加了检验成本。在根据图2所示的程序进行微生物检验的情况下，进行实时pcr通常需要约1至2小时，由于需要用于除去污染物的纯化步骤，所述程序较复杂，并且由于酶的使用，检验成本进一步增加。
10.因此，本公开提供了能够容易进行的一种用于生产复合体的方法、一种用于判定微生物包含的方法以及一种用于鉴定所包含的微生物的方法。
11.问题的解决方案
12.为了提供这样的方法，我们进行了集中的研究。结果，我们发现，通过使用多个特
定标记分子产生包含目标的复合体，可以提供这样的方法。这导致了本公开的完成。
13.本公开的一个或多个实施例描述如下。
14.[1]一种用于生产复合体的方法，所述复合体包含样品中含有的目标，所述方法包括：
[0015]
步骤(a)，使含有所述目标的样品与标记分子a、标记分子b以及标记分子c接触，并且形成包含所述目标、所述标记分子a、所述标记分子b以及所述标记分子c的复合体；以及
[0016]
步骤(b)，分离所述复合体，
[0017]
其中，
[0018]
所述目标是核酸，
[0019]
所述标记分子a包含能够与所述目标的一部分杂交并且与所述目标的核酸序列基本互补的核酸序列，
[0020]
所述标记分子b包含能够与所述目标的一部分杂交并且与所述目标的核酸序列基本互补的核酸序列，
[0021]
所述标记分子a的所述基本互补的核酸序列能够与所述目标的一部分杂交，并且所述标记分子b的所述基本互补的核酸序列能够与所述目标的另一部分杂交，
[0022]
所述标记分子c包含能够与所述标记分子a的一部分杂交并且与所述标记分子a的核酸序列基本互补的核酸序列，并且
[0023]
所述标记分子a或所述标记分子c中的至少一个具有荧光体。
[0024]
[2]根据[1]所述的用于生产复合体的方法，其中，所述标记分子b具有磁性微粒或金属微粒中的至少一种。
[0025]
[3]根据[1]所述的用于生产复合体的方法，其中，
[0026]
所述步骤(a)包括使含有目标的样品与标记分子a、标记分子b、标记分子c以及标记分子d接触，并且形成包含所述目标、所述标记分子a、所述标记分子b、所述标记分子c以及所述标记分子d的复合体，
[0027]
所述标记分子d具有能够与所述标记分子b的一部分杂交并且与所述标记分子b的核酸序列基本互补的核酸序列，并且
[0028]
所述标记分子b或所述标记分子d中的至少一个具有磁性微粒或金属微粒中的至少一种。
[0029]
[4]根据[1]至[3]中任一项所述的用于生产复合体的方法，其中，
[0030]
所述标记分子a具有x区域、y区域和z区域，
[0031]
所述标记分子c具有x区域和y区域，
[0032]
x区域是与x区域的核酸序列基本互补的核酸序列，
[0033]
y区域是与y区域的核酸序列基本互补的核酸序列，并且
[0034]
z区域是能够与所述目标的一部分杂交并且与所述目标的核酸序列基本互补的核酸序列。
[0035]
[5]根据[4]所述的用于生产复合体的方法，其中，
[0036]
所述标记分子a在其分子中具有两个或更多个选自x区域或y区域的至少一种，并且所述标记分子c在其分子中具有x区域和y区域，
[0037]
所述标记分子c在其分子中具有两个或更多个选自x区域或y区域的至少一种，并
且所述标记分子a在其分子中具有x区域和y区域，或者
[0038]
所述标记分子a在其分子中具有两个或更多个选自x区域或y区域的至少一种，并且所述标记分子c在其分子中具有两个或更多个选自x区域和y区域的至少一种。
[0039]
[6]根据[3]所述的用于生产复合体的方法，其中，
[0040]
所述标记分子b具有u区域、v区域和w区域，
[0041]
所述标记分子d具有u区域和v区域，
[0042]
u区域是与u区域的核酸序列基本互补的核酸序列，
[0043]
v区域是与v区域的核酸序列基本互补的核酸序列，并且
[0044]
w区域是能够与所述目标的一部分杂交并且与所述目标的核酸序列基本互补的核酸序列。
[0045]
[7]根据[6]所述的用于生产复合体的方法，其中，
[0046]
所述标记分子b在其分子中具有两个或更多个选自u区域或v区域的至少一种，并且所述标记分子d在其分子中具有u区域和v区域，
[0047]
所述标记分子d在其分子中具有两个或更多个选自u区域或v区域的至少一种，并且所述标记分子b在其分子中具有u区域和v区域，或者
[0048]
所述标记分子b在其分子中具有两个或更多个选自u区域或v区域的至少一种，并且所述标记分子d在其分子中具有两个或更多个选自u区域和v区域的至少一种。
[0049]
[8]一种用于在检验对象中判定微生物包含的方法，该方法包括：
[0050]
步骤(1)，在所述检验对象包含所述微生物的情况下，通过在提取源自所述微生物的核酸的条件下处理所述检验对象来获得样品；
[0051]
步骤(2)，使所述样品与标记分子a、标记分子b以及标记分子c接触，并且在所述样品含有源自所述微生物的核酸的情况下，形成包含所述目标、所述标记分子a、所述标记分子b以及所述标记分子c的复合体；并且
[0052]
步骤(3)，在形成复合体的情况下分离所述复合体，
[0053]
其中，
[0054]
所述目标是源自所述微生物的核酸，
[0055]
所述标记分子a包含能够与所述目标的一部分杂交并且与所述目标的核酸序列基本互补的核酸序列，
[0056]
所述标记分子b包含能够与所述目标的一部分杂交并且与所述目标的核酸序列基本互补的核酸序列，
[0057]
所述标记分子a的所述基本互补的核酸序列能够与所述目标的一部分杂交，并且所述标记分子b的所述基本互补的核酸序列能够与所述目标的另一部分杂交，
[0058]
所述标记分子c包含能够与所述标记分子a的一部分杂交并且与所述标记分子a的核酸序列基本互补的核酸序列，并且
[0059]
所述标记分子a或所述标记分子c中的至少一个具有荧光体。
[0060]
[9]根据[8]所述的用于判定微生物包含的方法，其中，所述标记分子b具有磁性微粒或金属微粒中的至少一种。
[0061]
[10]根据[8]所述的用于判定微生物包含的方法，其中，
[0062]
所述步骤(2)包括使样品与标记分子a、标记分子b、标记分子c以及标记分子d接
触，并且在所述样品含有源自所述微生物的核酸的情况下，形成包含所述目标、所述标记分子a、所述标记分子b、所述标记分子c以及所述标记分子d的复合体，
[0063]
所述标记分子d具有能够与所述标记分子b的一部分杂交并且与所述标记分子b的核酸序列基本互补的核酸序列，并且
[0064]
所述标记分子b或所述标记分子d中的至少一个具有磁性微粒或金属微粒中的至少一种。
[0065]
[11]根据[8]至[10]中任一项所述的用于判定微生物包含的方法，其中，所述步骤(1)包括：
[0066]
将检验对象引入容器的步骤；
[0067]
密封所述容器的步骤；以及
[0068]
将密封在所述容器中的检验对象在密封状态下加热到100℃或更高的步骤。
[0069]
[12]一种用于鉴定在检验对象中包含的微生物的方法，该方法包括：
[0070]
步骤(2)，使源自所述检验对象的样品与标记分子a、标记分子b以及标记分子c接触，并且在所述样品含有源自所述微生物的核酸的情况下，形成包含所述目标、所述标记分子a、所述标记分子b以及所述标记分子c的复合体；
[0071]
步骤(3)，在形成复合体的情况下分离所述复合体；以及
[0072]
步骤(4)，鉴定所述复合体中含有的所述目标的核酸序列所源自的微生物，
[0073]
其中，
[0074]
所述目标是源自所述微生物的核酸，
[0075]
所述标记分子a包含能够与所述目标的一部分杂交并且与所述目标的核酸序列基本互补的核酸序列，
[0076]
所述标记分子b包含能够与所述目标的一部分杂交并且与所述目标的核酸序列基本互补的核酸序列，
[0077]
所述标记分子a的所述基本互补的核酸序列能够与所述目标的一部分杂交，并且所述标记分子b的所述基本互补的核酸序列能够与所述目标的另一部分杂交，
[0078]
所述标记分子c包含能够与所述标记分子a的一部分杂交并且与所述标记分子a的核酸序列基本互补的核酸序列，并且
[0079]
所述标记分子a或所述标记分子c中的至少一个具有荧光体。
[0080]
[13]根据[12]所述的用于鉴定所包含的微生物的方法，其中，所述标记分子b具有磁性微粒或金属微粒中的至少一种。
[0081]
[14]根据[12]所述的用于鉴定所包含的微生物的方法，其中，
[0082]
所述步骤(2)包括使源自检验对象的样品与标记分子a、标记分子b、标记分子c以及标记分子d接触，并且在所述样品含有源自所述微生物的核酸的情况下，形成包含所述目标、所述标记分子a、所述标记分子b、所述标记分子c以及所述标记分子d的复合体，
[0083]
所述标记分子d具有能够与所述标记分子b的一部分杂交并且与所述标记分子b的核酸序列基本互补的核酸序列，并且
[0084]
所述标记分子b或所述标记分子d中的至少一个具有磁性微粒或金属微粒中的至少一种。
[0085]
[15]根据[12]-[14]中任一项所述的用于鉴定所包含的微生物的方法，其中，在所
述步骤(2)之前，所述方法包括：
[0086]
步骤(1)，在所述检验对象包含所述微生物的情况下，通过在提取源自所述微生物的核酸的条件下处理所述检验对象来获得样品。
[0087]
本发明的有益效果
[0088]
本公开提供了能够容易进行的一种用于生产复合体的方法、一种用于判定微生物包含的方法以及一种用于鉴定所包含的微生物的方法。
附图说明
[0089]
图1示出了说明根据传统微生物检验技术的一个或多个实施例的程序的流程图。
[0090]
图2示出了说明根据传统微生物检验技术的一个或多个实施例的程序的流程图。
[0091]
图3示意性地示出了标记分子a的一个或多个实施例。
[0092]
图4示意性地示出了标记分子c的一个或多个实施例。
[0093]
图5示意性地示出了标记分子b的一个或多个实施例。
[0094]
图6示意性地示出了复合体的一个或多个实施例。
[0095]
图7示出了说明根据本公开的用于鉴定微生物的方法的一个或多个实施例的程序的流程图。
[0096]
图8示出了在示例中使用的目标dna、标记分子a、标记分子c以及标记分子b的序列。
具体实施方式
[0097]
以下，详细地描述根据本公开的用于生产复合体的方法、用于判定微生物包含的方法以及用于鉴定所包含的微生物的方法。根据本公开的一个方面的用于生产复合体的方法包括生产包含目标的复合体。目标是核酸。用于生产复合体的方法也作为用于判定微生物包含的方法以及用于鉴定所包含的微生物的方法的一部分来进行。
[0098]
(用于生产复合体的方法)
[0099]
根据本公开的用于生产复合体的方法包括生产包含样品中含有的目标的复合体，该方法包括：
[0100]
步骤(a)，使含有目标的样品与标记分子a、标记分子b以及标记分子c接触，并且形成包含目标、标记分子a、标记分子b以及标记分子c的复合体；以及
[0101]
步骤(b)，分离复合体。
[0102]
目标是核酸，并且总体而言，该核酸包含特定序列。标记分子a包含能够与目标的一部分杂交并且与目标的核酸序列基本互补的核酸序列。标记分子b包含能够与目标的一部分杂交并且与目标的核酸序列基本互补的核酸序列。标记分子a的基本互补的核酸序列能够与目标的一部分杂交，并且标记分子b的基本互补的核酸序列能够与目标的另一部分杂交。标记分子c包含能够与标记分子a的一部分杂交并且与标记分子a的核酸序列基本互补的核酸序列。标记分子a或标记分子c中的至少一个具有荧光体。
[0103]
样品是在用于生产复合体的方法中所使用的组分。总体而言，样品是通过处理检验对象而获得的组分。例如，在检验对象中包含微生物的情况下，通过在提取源自微生物的核酸的条件下处理检验对象来获得样品。作为提取核酸的条件，可以采用传统条件。例如，
可以采用与作为pcr的前处理而进行的处理类似的技术。核酸的提取可以使用市售的提取试剂盒来进行。
[0104]
总体而言，目标是包含特定序列的核酸，其可以是dna或rna。总体而言，目标是源自微生物的核酸。微生物的示例包括(但不特别限于)细菌、藻类、黏菌和病毒。特定序列可以根据例如要检测的目标微生物来适当地确定。
[0105]
如上所述，标记分子a包含能够与目标的一部分杂交并且与目标的核酸序列基本互补的核酸序列，并且标记分子b包含能够与目标的一部分杂交并且与目标的核酸序列基本互补的核酸序列。标记分子a的基本互补的核酸序列能够与目标的一部分杂交，并且标记分子b的基本互补的核酸序列能够与目标的另一部分杂交。标记分子c包含能够与标记分子a的一部分杂交并且与标记分子a的核酸序列基本互补的核酸序列。具体而言，复合体包含目标、与目标的一部分杂交的标记分子a、与目标的另一部分杂交的标记分子b、以及与标记分子a的一部分杂交的标记分子c。
[0106]
本公开所使用的术语“基本互补的核酸序列”是指与给定序列完全互补的核酸序列以及在能够与给定序列杂交的条件下具有一个或多个核苷酸的错配、缺失或添加的核酸序列。在一些实施例中，核酸序列中错配的核苷酸的数目可以是5或更少、2或更少、或者1或更少。在一些实施例中，核酸序列中缺失或添加的核苷酸的数目可以是5个或更少、2个或更少、或者1个或更少。
[0107]
标记分子a或标记分子c中的至少一个具有荧光体。在一些实施例中，标记分子a和标记分子c可以都具有荧光体。在一些实施例中，荧光体可以位于标记分子a和标记分子c中的任何位置，并且荧光体可以位于分子末端(例如，5’末端或3’末端)。具体而言，标记分子a可以在分子末端具有荧光体，并且标记分子c可以在分子末端具有荧光体。
[0108]
对荧光体没有特别限制，只要其能够发射荧光即可。在一些实施例中，激发波长可以在紫外线范围内(例如，280nm至380nm)或在可见光范围内(例如，380nm至830nm)。在一些实施例中，荧光体可以具有在可见光范围内(例如，380nm至830nm)的发射波长。在一些实施例中，发射波长可以从激发波长向较长波长侧偏移15nm或更多。在一些其他实施例中，发射波长可偏移20nm至100nm或更多。
[0109]
对荧光体没有特别限制。例如，可以使用有机荧光分子、无机荧光体、量子点以及包含多种荧光体(例如有机荧光分子、无机荧光体和量子点)的荧光体集成纳米颗粒。有机荧光分子的示例包括edans、香豆素、fam、fitc、cy2、tf2、tf3、hex、joe、tet、cy3、cy5、alexa532、alexa610、alexa647、atto532、atto633、ifluor 532以及ifluor 647。量子点的示例包括565、585、605以及705。或者，可以使用负载在树脂(例如，聚烯烃、聚苯乙烯或丙烯酸树脂)或玻璃上的荧光体(例如，有机荧光分子、无机荧光体或量子点)。
[0110]
在一些实施例中，标记分子a可以包含x区域、y区域和z区域，标记分子c可以包含x区域和y区域，x区域可以包含与x区域的核酸序列基本互补的核酸序列，y区域可以包含与y区域的核酸序列基本互补的核酸序列，标记分子a可以包含除x区域、y区域或z区域的核酸序列以外的核酸序列，并且标记分子c可以包含除x区域或y区域的核酸序列以外的核酸序列。
[0111]
标记分子a和标记分子c的具体组合的示例包括以下3种实施例：标记分子a在其分
子中具有两个或更多个选自x区域或y区域的至少一种并且标记分子c在其分子中具有x区域和y区域的一个或多个实施例；标记分子c在其分子中具有两个或更多个选自x区域和y区域的至少一种并且标记分子a在其分子中具有x区域和y区域的一个或多个实施例；以及标记分子a在其分子中具有两个或更多个选自x区域或y区域的至少一种并且标记分子c在其分子中具有两个或更多个选自x区域和y区域的至少一种的一个或多个实施例。根据这样的实施例，复合体可以包含多个标记分子a和多个标记分子c。这提高了荧光观察中的亮度。
[0112]
在一些实施例中，标记分子a可以在其分子中具有x区域和2个y区域，并且标记分子c可以在其分子中具有y区域和2个x区域。
[0113]
在一些实施例中，在标记分子a中，x区域可以比y区域更靠近5’末端，并且在标记分子c中，x区域可以比y区域更靠近5’末端。在一些实施例中，标记分子a从5’末端起可以包含x区域、(第一)y区域和(第二)y区域的核酸序列。在一些实施例中，标记分子c从5’末端起可以包含(第一)x区域、(第二)x区域和y区域的核酸序列。在标记分子a中，z区域的核酸序列可以与x区域或y区域的核酸序列不同，并且x区域或y区域中的至少一个的核酸序列可以包含z区域的核酸序列。图3示意性地示出标记分子a的一个或多个实施例。图3所示的标记分子a从5’末端起包含x区域、(第一)y区域和(第二)y区域的核酸序列，并且在3’末端处包含荧光体。z区域横跨x区域的一部分和(第一)y区域的一部分。图4示意性地示出标记分子c的一个或多个实施例。图4所示的标记分子c从5’末端起包含(第一)x区域、(第二)x区域和y区域的核酸序列，并且在3’末端处包含荧光体。在图3中所示的标记分子a与目标杂交的情况下，其用于在x区域和(第一)y区域与目标杂交。由于标记分子a具有(第二)y区域，因此标记分子c的y区域能够与(第二)y区域杂交。当另一个标记分子a与标记分子c进一步杂交时，复合体中将含有标记分子c和多个标记分子a。
[0114]
在一些实施例中，标记分子b可以具有磁性微粒或金属微粒中的至少一种。在一些其他实施例中，标记分子b可以具有磁性微粒。对磁性微粒没有特别限制，只要这种微粒可以借助磁体进行收集即可。金属微粒是除磁性微粒以外的颗粒，并且可以使用任何金属微粒而没有特别限制，只要这样的颗粒由于高比重而能够通过沉淀收集即可。磁性微粒或金属微粒中的至少一种可以位于标记分子b中的任何位置。在一些实施例中，微粒可以位于分子末端(例如，5’末端或3’末端)。在一些实施例中，具体而言，标记分子b可以在分子末端处包含磁性微粒或金属微粒中的至少一种。在一些其他实施例中，标记分子b可以在分子末端包含磁性微粒。标记分子b包含能够与目标的一部分杂交并且与目标的核酸序列基本互补的核酸序列。这样的核酸序列也被称为“w区域”。标记分子b可以包含除w区域以外的核酸序列。图5示意性地示出标记分子b的一个或多个实施例。图5示意性地示出的标记分子b在5’末端处包含磁性微粒。
[0115]
图6示意性地示出复合体包含目标、标记分子a、标记分子b以及标记分子c的一个或多个实施例。在图6所示的复合体中，标记分子a与目标的一部分杂交，标记分子b与目标的另一部分杂交，并且标记分子c与标记分子a杂交。另外，另一个标记分子a与标记分子c杂交，并且另一个标记分子c进一步与其杂交。也就是说，复合体包含目标、多个标记分子a、标记分子b以及多个标记分子c。根据本公开的复合体包含标记分子b，因此，其可以借助于磁体或经由沉淀容易地收集。另外，由于复合体具有源自与目标反应的标记分子a和标记分子c的多个荧光体，因此在荧光观察中观察到高亮度。因此，在根据本公开的用于生产复合体
的方法中，即使目标以低浓度存在于样品中，也能够容易地观察到复合体。
[0116]
如上所述，步骤(a)包括使用标记分子a、标记分子b以及标记分子c作为标记分子。步骤(a)可以进一步包括使用其他标记分子。在包括使用其他标记分子的一个或多个实施例中，步骤(a)可以包括使含有目标的样品与标记分子a、标记分子b、标记分子c以及标记分子d接触并形成包含目标、标记分子a、标记分子b、标记分子c以及标记分子d的复合体。在这样的实施例中，标记分子d包含能够与标记分子b的一部分杂交并且与标记分子b的核酸序列基本互补的核酸序列。在这样的实施例中，标记分子b或标记分子d中的至少一个包含磁性微粒或金属微粒中的至少一种。在这样的实施例中，具体而言，复合体包含目标、与目标的一部分杂交的标记分子a、与目标的另一部分杂交的标记分子b、与标记分子a的一部分杂交的标记分子c、以及与标记分子b的一部分杂交的标记分子d。
[0117]
在包括使用标记分子d的一个或多个实施例中，标记分子b或标记分子d中的至少一个包含磁性微粒或金属微粒中的至少一种。在一些实施例中，标记分子b和标记分子d可以都包含磁性微粒或金属微粒中的至少一种，并且标记分子b和标记分子d可以都包含磁性微粒。磁性微粒或金属微粒中的至少一种可以位于标记分子b或标记分子d中的任何位置。例如，微粒可以位于分子末端(例如，5’末端或3’末端)。在一些实施例中，具体而言，标记分子b可以在分子末端处包含磁性微粒或金属微粒中的至少一种，并且标记分子d可以在分子末端处包含磁性微粒或金属微粒中的至少一种。
[0118]
在包括使用标记分子d的一个或多个实施例中，标记分子b可以包含u区域、v区域和w区域，标记分子d可以包含u区域和v区域，u区域可以包含与u区域的核酸序列基本互补的核酸序列，v区域可以包含与v区域的核酸序列基本互补的核酸序列，并且w区域可以包含能够与目标的一部分杂交并且与目标的核酸序列基本互补的核酸序列。标记分子b可以包含除u区域、v区域或w区域的核酸序列以外的核酸序列，并且标记分子d可以包含除u区域或v区域的核酸序列以外的核酸序列。
[0119]
在包括使用标记分子d的一个或多个实施例中，标记分子b和标记分子d的具体组合的示例包括以下3个实施例：标记分子b在其分子中具有两个或更多个选自u区域或v区域的至少一种并且标记分子d在其分子中具有u区域和v区域的一个或多个实施例；标记分子d在其分子中具有两个或更多个选自u区域和v区域的至少一种并且标记分子b在其分子中具有u区域和v区域的一个或多个实施例；以及标记分子b在其分子中具有两个或更多个选自u区域或v区域的至少一种并且标记分子d在其分子中具有两个或更多个选自u区域和v区域的至少一种的一个或多个实施例。
[0120]
在包括使用标记分子d的一个或多个实施例中，标记分子b可以包含w区域，该w区域包含与u区域或v区域的核酸序列不同的核酸序列，并且u区域或v区域中的至少一个的核酸序列可以包含w区域的核酸序列。
[0121]
在包括使用标记分子d的一个或多个实施例中，复合体将包含多个标记分子b以及多个标记分子d。这可促进借助于磁体的收集或经由沉淀的收集。
[0122]
在一个或多个实施例中，步骤(a)可以包括使含有目标的样品与标记分子a、标记分子b以及标记分子c接触。步骤(a)可以通过任何方法进行而没有特别限制。例如，可以同时或依次向样品添加标记分子a、标记分子b、标记分子c以及标记分子d(根据需要)。或者，也可以向含有标记分子a、标记分子b、标记分子c以及标记分子d(根据需要)的溶液添加样
品。样品例如源自检验对象。在样品制备过程中，样品可以用溶剂进行补充。可以使用的溶剂的示例是缓冲液或含有盐(例如钠盐)的水溶液。可以使用的缓冲液的示例包括盐水柠檬酸钠(ssc)缓冲液、church磷酸盐缓冲液以及盐水-磷酸钠-edta(sspe)缓冲液。在使用通过对检验对象进行下述步骤(1)而制备的样品的情况下，可以利用溶剂将样品补充至经过步骤(1)的检验对象(即，核酸提取物)的最终浓度的2至10倍的浓度(稀释2至10倍)。在连续添加的情况下，对添加的顺序没有特别限制。步骤(a)可以在空气中或在惰性气体气氛中进行。步骤(a)可以在常压、加压或减压下进行。从容易操作的观点出发，步骤(a)可以在常压下进行。步骤(a)可以在任何温度下进行，只要能够发生杂交即可。对这样的温度没有特别限制，可以为30℃至70℃。在一些实施例中，这样的温度可以为55℃至65℃。对步骤(a)的持续时间没有特别限制，可以为15至240分钟。在一些实施例中，这样的持续时间可以是30至60分钟。
[0123]
在一个或多个实施例中，对步骤(b)没有特别限制，只要能够收集在步骤(a)中形成的复合体即可。在使用包含磁性微粒的标记分子b或标记分子d的情况下，可以借助于磁体收集复合体。在使用包含金属微粒的标记分子b或标记分子d的情况下，可以使复合物沉淀，可以除去上清液，然后可以收集复合体。
[0124]
(用于判定微生物包含的方法)
[0125]
本公开的用于判定微生物包含的方法包括在检验对象中判定微生物包含，该方法包括：
[0126]
步骤(1)，在检验对象包含微生物的情况下，通过在提取源自微生物的核酸的条件下处理检验对象来获得样品；
[0127]
步骤(2)，使样品与标记分子a、标记分子b以及标记分子c接触，并且在样品含有源自微生物的核酸的情况下，形成包含目标、标记分子a、标记分子b以及标记分子c的复合体；并且
[0128]
步骤(3)，在形成复合体的情况下分离复合体。
[0129]
目标是源自微生物的核酸。总体而言，这样的核酸包含特定序列。标记分子a包含能够与目标的一部分杂交并且与目标的核酸序列基本互补的核酸序列。标记分子b包含能够与目标的一部分杂交并且与目标的核酸序列基本互补的核酸序列。标记分子a的基本互补的核酸序列能够与目标的一部分杂交，并且标记分子b的基本互补的核酸序列能够与目标的另一部分杂交。标记分子c包含能够与标记分子a的一部分杂交并且与标记分子a的核酸序列基本互补的核酸序列。标记分子a或标记分子c中的至少一个具有荧光体。
[0130]
根据本公开的用于判定微生物包含的方法，能够以快速的方式判定微生物包含，程序简单，并且不需要使用昂贵的试剂或酶。因此，可降低检验成本。
[0131]
要求对检验对象就其中的微生物包含进行评价。其示例包括食品、药品、化妆品和日用品。在没有任何处理的检验对象中，通常不能检测到目标核酸。因此，在检验对象包含微生物的情况下，在提取源自微生物的核酸的条件下对检验对象进行处理，并且将处理的产物用作样品。
[0132]
根据上述的用于判定微生物包含的方法，在以微生物来源的核酸序列为目标而得到复合体的情况下(换句话说，在荧光观察中观察到高亮度的情况下)，判定检验对象包含微生物。通常，检验对象不太可能包含微生物。因此，需要一种简单的方法来检验微生物包
含。因此，在一些实施例中，可以使用在尽可能多的微生物中共有的核酸序列作为与标记分子a或标记分子b杂交的序列。因此，可以通过少量的检验次数或使用少量类型的标记分子a或标记分子b来判定微生物包含。相反，在要判定特定微生物的包含的情况下，可以使用特定微生物特有的序列作为与标记分子a或标记分子b杂交的序列。因此，可以判定特定微生物的包含。
[0133]
在检验对象包含微生物的情况下，一个或多个实施例中的步骤(2)与上述用于生产复合体的制方法中的步骤(a)基本相同，并且一个或多个实施例中的步骤(3)与上述用于生产复合体的方法中的步骤(b)基本相同。在一些实施例中，更具体而言，如上所述，标记分子b可以包含磁性微粒或金属微粒中的至少一种。虽然步骤(a)包括使用标记分子a、标记分子b以及标记分子c，但是步骤(a)可以使用额外的其他标记分子来进行。例如，在包括使用其他标记分子的一个或多个实施例中，上述的步骤(2)可以包括使样品与标记分子a、标记分子b、标记分子c以及标记分子d接触，并且在样品含有源自微生物的核酸的情况下形成包含目标、标记分子a、标记分子b、标记分子c以及标记分子d的复合体。根据这样的实施例，标记分子d包含能够与标记分子b的一部分杂交并且与标记分子b的核酸序列基本互补的核酸序列。根据这样的实施例，标记分子b或标记分子d中的至少一个具有磁性微粒或金属微粒中的至少一种。在检验对象不包含微生物的情况下，在步骤(2)中将不形成复合体。因此，在检验对象不包含微生物的情况下，在步骤(3)中将不分离出复合体。在这种情况下，可以在步骤(3)中选择性地收集标记分子b或标记分子d(其可以任选使用)。因此，在一个或多个实施例中，在检验对象包含微生物的情况下，所收集的复合体在荧光观察中显示高亮度。这使得能够判定微生物包含。另外，在本实施例中，在检验对象不包含微生物的情况下，所收集标记分子b或标记分子d(其可以任选使用)在荧光观察中不显示高亮度。因此，可以判定检验对象不包含微生物。
[0134]
在一个或多个实施例中，步骤(1)可以包括在检验对象包含微生物的情况下，在提取源自微生物的核酸的条件下处理检验对象，对步骤(1)的细节没有特别限制。可以采用的步骤(1)的示例是高温高压提取法，其是公知的从细菌中提取核酸的方法。在一些实施例中，步骤(1)可以包括将检验对象引入容器中的步骤、密封容器的步骤、以及将密封在容器中的检验对象在密封状态下加热到100℃或更高的步骤。在一些实施例中，温度可以为100℃至180℃。在一些其他实施例中，温度可以为130℃至160℃。
[0135]
在步骤(1)中获得的样品可以不经任何处理而进行步骤(2)。或者，在步骤(1)和步骤(2)之间可以进行从样品中除去污染物的步骤或其他步骤。
[0136]
(用于鉴定所包含的微生物的方法)
[0137]
根据本公开的用于鉴定所包含的微生物的方法包括鉴定在检验对象中包含的微生物，并且该方法包括：
[0138]
步骤(2)，使源自检验对象的样品与标记分子a、标记分子b以及标记分子c接触，并且在样品含有源自微生物的核酸的情况下，形成包含目标、标记分子a、标记分子b以及标记分子c的复合体；
[0139]
步骤(3)，在形成复合体的情况下分离复合体；以及
[0140]
步骤(4)，鉴定复合体中含有的目标的核酸序列所源自的微生物。
[0141]
目标是源自微生物的核酸。总体而言，这样的核酸包含特定序列。标记分子a包含
能够与目标的一部分杂交并且与目标的核酸序列基本互补的核酸序列。标记分子b包含能够与目标的一部分杂交并且与目标的核酸序列基本互补的核酸序列。标记分子a的基本互补的核酸序列能够与目标的一部分杂交，并且标记分子b的基本互补的核酸序列能够与目标的另一部分杂交。标记分子c包含能够与标记分子a的一部分杂交并且与标记分子a的核酸序列基本互补的核酸序列。标记分子a或标记分子c中的至少一个具有荧光体。
[0142]
一个或多个实施例中的步骤(2)和步骤(3)与上述用于判定微生物包含的方法中的步骤(2)和步骤(3)相同。在一个或多个实施例中，也可以在步骤(2)之前进行关于上述用于判定微生物包含的方法所描述的步骤(1)。在一个或多个实施例中进行步骤(1)时，可以按照上述用于判定微生物包含的方法的情况，对在步骤(1)中获得的样品不经任何处理而进行步骤(2)。或者，在步骤(1)和步骤(2)之间可以进行从样品中除去污染物的步骤或其他步骤。
[0143]
正如关于上述用于判定微生物包含的方法所描述的，可以使用在尽可能多的微生物中共有的核酸序列作为与标记分子a或标记分子b杂交的序列。因此，在步骤(3)中分离出复合体的情况下，通常难以特异性地鉴定所包含的微生物。在根据本公开的用于鉴定所包含的微生物的方法中，步骤(4)使得能够鉴定目标的核酸序列所源自的微生物。因此，可以鉴定所包含的微生物。
[0144]
当在步骤(3)中分离出复合体的情况下进行步骤(4)。在步骤(4)中，可以鉴定目标的核酸序列所源自的微生物。对进行步骤(4)的具体方法没有特别限制。可以采用的手段的示例包括微阵列技术、pcr和测序。微阵列技术可以使用信号阵列来进行，或者可以采用包括使用用于微阵列检测的自组装标记的技术。可以根据例如jp 2015-043702a来进行包括使用信号阵列的方法。步骤(4)的示例包括：将复合体再次悬浮于约1n(例如0.5n至2n)的naoh溶液中；再次借助于磁体或经由离心收集标记分子b或标记分子d；用约1n(例如0.5n至2n)的hcl中和溶液；添加缓冲液(例如，ssc缓冲液)以将终浓度调整至约2至10倍(稀释2至10倍)；使用包含固定在其上的信号阵列探针的微阵列进行检测；并且鉴定菌种或检测特定基因。代替使用naoh溶液，可以将复合体加热至例如约95℃(即，90℃至100℃)，以使标记分子a至标记分子d与目标解离。在目标的量较少的情况下，可以通过pcr或其他方式扩增核酸，然后可以使用微阵列等进行检测。
[0145]
图7示出了包括步骤(1)至步骤(4)的用于鉴定所包含的微生物的方法的一个或多个实施例。在图7所示的一个或多个实施例中，进行步骤(1)至步骤(3)，例如通过荧光观察来检查复合体是否存在。在观察到荧光的情况下，检测到复合体，也就是说，判定检测为阳性，并且进行步骤(4)以鉴定所包含的微生物。在未观察到荧光的情况下，未检测到复合体；也就是说，判定检测为阴性，并且完成该程序。
[0146]
示例
[0147]
下文中，参照示例描述本公开，但是本公开不限于这些示例。
[0148]
示例和比较示例中使用的合成寡聚dna(445nt)(目标dna)的序列如序列表中的seq id no：1所示，标记分子a的序列如序列表中的seq id no：2所示，标记分子c的序列如序列表中的seq id no：3所示，并且标记分子b的序列如序列表中的seq id no：4所示。示例和比较示例中使用的标记分子a的x区域的序列如序列表中的seq id no：5所示，y区域的序列如序列表中的seq id no：6所示，z区域的序列如序列表中的seq id no：7所示，标记分子
c的x区域的序列如序列表中的seq id no：8所示，并且y区域的序列如序列表中的seq id no：9所示。标记分子b的w区域的序列与标记分子b的序列相同。这些序列也在图8中示出。
[0149]
将合成寡聚dna的合成外包给eurofins genomics，并由此获得合成寡聚dna。
[0150]
关于标记分子a，将dna合成和利用荧光分子(cy3)的3’末端修饰外包给eurofins genomics，并由此获得标记分子a。示例中使用的标记分子a具有在图3中示意性示出的结构，也就是说，标记分子a从5’末端起包含x区域、(第一)y区域和(第二)y区域的核酸序列，并在3’末端处包含荧光体。
[0151]
关于标记分子c，将dna合成和利用荧光分子(cy3)的3’末端修饰外包给eurofins genomics，并由此获得标记分子c。示例中使用的标记分子c具有在图4中示意性示出的结构，也就是说，标记分子c从5’末端起包含(第一)x区域、(第二)x区域和y区域的核酸序列，并在3’末端处包含荧光体。
[0152]
关于标记分子b，将dna合成和利用氨基的5’末端修饰外包给eurofins genomics，将nhs磁珠(thermo scientific)结合到所获得的氨基修饰的dna的氨基上，由此获得标记分子b。按照磁珠产品的说明书，将nhs磁珠结合到上述氨基上。示例中使用的标记分子b具有在图5中示意性示出的结构，也就是说，标记分子b包含w区域的核酸序列，并在5’末端处包含磁性微粒。
[0153]
[比较示例1]
[0154]
将包含大肠杆菌16s rdna序列(445nt)的合成寡聚dna用作目标。将合成寡聚dna用dw(去离子蒸馏水)进行稀释，将最终浓度调整为1nm，获得目标溶液。
[0155]
将目标溶液、标记分子b(最终浓度：100nm)以及标记分子a(最终浓度：100nm)在5倍稀释的ssc缓冲液(总体积40μl)中在60℃下孵育30分钟，并且使用磁体收集颗粒(包含目标、标记分子a以及标记分子b的复合体)。
[0156]
用ssc缓冲液(40μl)洗涤颗粒3次。再次添加ssc缓冲液(40μl)，使用磁体使颗粒会聚，并通过施加532nm的激光束观察颗粒的荧光。使用ccd(电荷耦合器件)检测器、532nm处的dpss(二极管泵浦固态)光源、玻璃池(6
×8×
1mm)以及用于荧光观察的通用光学系统进行荧光观察。
[0157]
由于使用磁体的情况下颗粒发生会聚，因此认为颗粒包含标记分子b。由于观察到荧光，因此认为颗粒包含标记分子a。由于标记分子b不会直接与标记分子a结合(杂交)，证实颗粒是包含目标、标记分子a以及标记分子b的复合体。
[0158]
作为阴性对照，在不添加目标分子的情况下进行类似检验。在不使用目标的阴性对照中基本上没有观察到荧光。
[0159]
[示例1]
[0160]
将包含大肠杆菌16s rdna序列(445nt)的合成寡聚dna用作目标。将合成寡聚dna用dw(去离子蒸馏水)进行稀释，将最终浓度调整为1nm，获得目标溶液。
[0161]
将目标溶液、标记分子b(最终浓度：100nm)、标记分子a(最终浓度：100nm)以及标记分子c(最终浓度：100nm)在5倍稀释的ssc缓冲液(总体积40μl)中在60℃下孵育30分钟，并且使用磁体收集颗粒(包含目标、标记分子a、标记分子b以及标记分子c的复合体)。
[0162]
用ssc缓冲液(40μl)洗涤颗粒3次。再次添加ssc缓冲液(40μl)，使用磁体使颗粒会聚，并通过施加532nm的激光束观察颗粒的荧光。
[0163]
由于使用磁体的情况下颗粒发生会聚，因此认为颗粒包含标记分子b。由于观察到比比较示例1更高水平的荧光，因此认为颗粒包含标记分子a以及标记分子c。由于标记分子b不会直接与标记分子a或c结合(杂交)，证实颗粒是包含目标、标记分子a、标记分子b以及标记分子c的复合体。
[0164]
作为阴性对照，在不添加目标的情况下进行类似检验。在不使用目标的阴性对照中基本上没有观察到荧光。
[0165]
表1示出了比较示例1中的荧光观察结果、示例1中的荧光观察结果以及示例1中的阴性对照的荧光观察结果。
[0166]
表1
[0167][0168]
本公开所描述的数值范围的上限和/或下限可以按照任意组合使用。例如，可以通过采用上限和下限的任意组合来限定数值范围，可以通过采用上限的任意组合来限定数值范围，或者可以通过采用下限的任意组合来限定数值范围。另外，在本公开使用的介词“至”表示的数值范围包括介词“至”之前和之后的值作为下限和上限。
[0169]
以上详细地描述了本公开。应当注意，具体构造不限于上述一个或多个实施例，并且在本公开中包括在本公开的范围内进行的设计修改。
[0170]
尽管仅针对有限数量的实施例描述了本公开，但是本领域技术人员在受益于本公开的情况下将理解，在不脱离本公开的范围的情况下可以设计出各种其他实施例。因此，本发明的范围应仅由所附权利要求限定。
[0171]
符号说明
[0172]
10：标记分子a
[0173]
11：x区域
[0174]
13：y区域
[0175]
15：z区域
[0176]
17：荧光体
[0177]
20：标记分子c
[0178]
21：x区域
[0179]
23：y区域
[0180]
30：标记分子b
[0181]
31：w区域
[0182]
33：磁性微粒
[0183]
40：目标