超级起泡细菌的制作方法

技术特征：
1.一种遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞，其包含修饰的rpsa基因、修饰的rpsa操纵子和/或修饰的30s核糖体蛋白s1蛋白质。2.权利要求1的遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞，其中与未修饰的细菌细胞相比，所述遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞能够分泌更多数量的nomv。3.权利要求1或2的遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞，其中所述遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞包含修饰的30s核糖体蛋白s1，其包含相对于野生型30s核糖体蛋白s1的一个或多个突变，其中：(i)与未修饰的革兰氏阴性菌细胞相比，相对于野生型30s核糖体蛋白s1的一个或多个突变引起nomv的释放增加；(ii)与未修饰的革兰氏阴性菌细胞相比，相对于野生型30s核糖体蛋白s1的一个或多个突变引起至少1.2倍、至少1.4倍、至少1.6倍、至少1.8倍、至少2.0倍、或至少2.5倍的nomv释放增加；(iii)与未修饰的革兰氏阴性菌细胞相比，相对于野生型30s核糖体蛋白s1的一个或多个突变引起至少2.0倍的nomv释放增加；(iv)相对于野生型30s核糖体蛋白s1的一个或多个突变包含至少5、至少10、至少25、至少50、至少75、至少100、至少110、至少125、5至150、25至130、100至130、或125至130个氨基酸的突变或缺失；(v)相对于野生型30s核糖体蛋白s1的一个或多个突变包含对应于百日咳博德特氏菌(b.pertussis)30s核糖体蛋白s1的氨基酸550至576的区域的至少5、至少10、至少15、至少20、或至少25个氨基酸的突变或缺失；(vi)相对于野生型30s核糖体蛋白s1的一个或多个突变包含对应于百日咳博德特氏菌30s核糖体蛋白s1的氨基酸473至576的区域的至少20、至少30、至少50、至少75、或至少100个氨基酸的突变或缺失；(vii)相对于野生型30s核糖体蛋白s1的一个或多个突变包含对应于百日咳博德特氏菌30s核糖体蛋白s1的氨基酸450至576的区域的至少20、至少30、至少50、至少100、或至少120个氨基酸的突变或缺失；(viii)相对于野生型30s核糖体蛋白s1的一个或多个突变包含来自30s核糖体蛋白s1的c末端端部的至少20、至少30、至少50、至少100、或至少120个连续氨基酸的截短；(ix)相对于野生型30s核糖体蛋白s1的一个或多个突变包含对应于百曰咳博德特氏菌30s核糖体蛋白s1的氨基酸560至576、552至576、500至576、485至576、460至576、或453至576的氨基酸的突变或缺失；和/或(x)所述遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞包含修饰的30s核糖体蛋白s1，其中所述修饰的30s核糖体蛋白s1相对于野生型30s核糖体蛋白s1是截短的。4.权利要求1至3中任一项的遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞，其中：(i)与未修饰的细菌细胞相比，所述遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞在液体培养物中生长时能够释放至少2.0倍的nomv，例如在液体培养物中生长时能够释放至少2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、5.5倍、6.0倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍的nomv；和/或(ii)与未修饰的细菌细胞相比，所述遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞在液体培养物中生
长时能够释放至少1.2倍、至少1.4倍、至少1.6倍、至少1.8倍或至少2.0倍的nomv。5.前述权利要求中任一项的遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞，其中：(i)所述遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞的培养物能够生成的生物质是在相同培养条件下生长的未修饰细菌细胞的培养物的生物质的至少10％，例如在相同培养条件下生长的未修饰细菌细胞的培养物的生物质的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％；(ii)所述遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞的培养物能够实现的浊度是在相同培养条件下生长的未修饰细菌细胞的培养物的浊度的至少10％，例如在相同培养条件下生长的未修饰细菌细胞的培养物的浊度的20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％；(iii)所述遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞的培养物能够实现的营养素摄取是在相同培养条件下生长的未修饰细菌细胞的培养物的营养素摄取的至少10％，例如在相同培养条件下生长的未修饰细菌细胞的培养物的营养素摄取的20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％；和/或(iv)所述遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞能够在未修饰的细菌细胞在相同培养条件下生长后不迟于120小时，例如在未修饰的细菌细胞在相同培养条件下生长后不迟于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或110小时达到稳定期。6.权利要求1至5中任一项的遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞，其中所述遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞包含修饰的rpsa基因，其中所述修饰的rpsa基因包含相对于野生型rpsa基因的一个或多个突变，并且相对于野生型rpsa基因的一个或多个突变存在于包含以下或由以下组成的指定的核苷酸序列中：a.相对于野生型rpsa基因的r3结构域的3
′
端上游的1至10个核苷酸，例如相对于野生型rpsa基因的r3结构域的3’端上游的11至20、21至50、或51至100个核苷酸；b.相对于野生型rpsa基因的r3结构域的3’端上游的1至100个核苷酸，例如相对于野生型rpsa基因的r3结构域的3’端上游的10至50、或20至30个核苷酸；c.相对于野生型rpsa基因1％至10％的核苷酸，例如相对于野生型rpsa基因11％至20％、21％至30％的核苷酸，其中所述指定的区域定位于相对于野生型rpsa基因的5
′
端和相对于野生型rpsa基因的r3结构域的3
′
端之间；d.相对于野生型rpsa基因1％至30％的核苷酸，例如相对于野生型rpsa基因5％至25％、10％至20％的核苷酸，其中所述指定的区域定位于相对于野生型rpsa基因的5
′
端和相对于野生型rpsa基因的r3结构域的3
′
端之间；e.相对于野生型rpsa基因的r3结构域的3’端下游的1至10个核苷酸，例如相对于野生型rpsa基因的r3结构域的3’端下游的11至20、21至50、或51至100个核苷酸；f.相对于野生型rpsa基因的r3结构域的3’端下游的1至100个核苷酸，例如相对于野生型rpsa基因的r3结构域的3’端下游的10至50、或20至30个核苷酸；g.相对于野生型rpsa基因的r4结构域的5’端下游的1至10个核苷酸，例如相对于野生型rpsa基因的r4结构域的5’端下游的11至20、21至50、或51至100个核苷酸；h.相对于野生型rpsa基因的r4结构域的5’端下游的1至100个核苷酸，例如相对于野生型rpsa基因的r4结构域的5’端下游的10至50、或20至30个核苷酸；
i.相对于野生型rpsa基因的r4结构域的3’端下游的1至10个核苷酸，例如相对于野生型rpsa基因的r4结构域的3’端下游的11至20、21至50、或51至100个核苷酸；j.相对于野生型rpsa基因的r4结构域的3’端下游的1至100个核苷酸，例如相对于野生型rpsa基因的r4结构域的3’端下游的10至50、或20至30个核苷酸；k.相对于野生型rpsa基因1％至10％的核苷酸，例如相对于野生型rpsa基因11％至20％、21％至30％的核苷酸，其中所述指定的区域定位于相对于野生型rpsa基因的r3结构域的3
′
端和相对于野生型rpsa基因的3
′
端之间；l.相对于野生型rpsa基因1％至30％的核苷酸，例如相对于野生型rpsa基因5％至25％、10％至20％的核苷酸，其中所述指定的区域定位于相对于野生型rpsa基因的r3结构域的3
′
端和相对于野生型rpsa基因的3
′
端之间；m.相对于野生型rpsa基因的3
′
端上游的1至5个核苷酸，例如相对于野生型rpsa基因的3
′
端上游的6至10、11至20、21至30、31至40、41至50、51至100、101至150、151至200、201至250、251至300、301至350、351至400、401至450、451至500个核苷酸；和/或n.相对于野生型rpsa基因的3
′
端上游的1至500个核苷酸，例如相对于野生型rpsa基因的3
′
端上游的50至450、100至400、150至380、200至378、或250至376个核苷酸。7.权利要求1至6中任一项的遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞，其中所述遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞包含修饰的rpsa基因，其中所述修饰的rpsa基因包含相对于野生型rpsa基因的一个或多个突变，并且其中相对于野生型rpsa基因的一个或多个突变：(i)包含在对应于编码百日咳博德特氏菌30s核糖体蛋白s1蛋白质的r4结构域的区域和/或编码百曰咳博德特氏菌30s核糖体s1蛋白在r3和r4结构域之间的一部分的区域的区域中的一个或多个突变；(ii)包含与未修饰的革兰氏阴性菌细胞相比，引起nomv的释放增加的一个或多个突变；(iii)与未修饰的革兰氏阴性菌细胞相比，引起至少1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍、2.0倍或2.5倍的nomv释放增加；(iv)与未修饰的革兰氏阴性菌细胞相比，引起至少2.0倍的nomv释放增加；(v)包含改变所编码的30s核糖体蛋白s1蛋白质的氨基酸序列的突变；(vi)包含改变30s核糖体蛋白s1蛋白质的区域的编码氨基酸序列的突变，所述区域对应于百曰咳博德特氏菌的r4结构域；(vii)包含改变所编码的30s核糖体蛋白s1蛋白质的突变，以修饰和/或缺失至少5、至少10、至少25、至少50、至少75、至少100、至少110、至少125、5至150、25至130、100至130、或125至130个氨基酸；(viii)包含改变所编码的30s核糖体蛋白s1蛋白质的突变，以缺失至少5、至少10、至少25、至少50、至少75、至少100、至少110、至少125、5至150、25至130、100至130、或125至130个氨基酸；(ix)包含对应于百日咳博德特氏菌rpsa基因的核苷酸1655至1731的区域的至少15、至少30、至少45、至少60或至少75个核苷酸的突变或缺失；(x)包含对应于百日咳博德特氏菌rpsa基因的核苷酸1424至1731的区域的至少60、至少90、至少150、至少225或至少300个核苷酸的突变或缺失；和/或
(xi)包含对应于百日咳博德特氏菌rpsa基因的核苷酸1355至1731的区域的至少60、至少90、至少150、至少225、至少300或至少360个核苷酸的突变或缺失。8.前述权利要求中任一项的遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞，其中所述遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞包含修饰的ihfb基因和/或修饰的ihf蛋白。9.一种遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞，其包含修饰的ihfb基因和/或修饰的ihf蛋白。10.权利要求8或9的遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞，其中：a.所述修饰的ihfb基因包含相对于野生型ihfb基因的一个或多个突变，其中所述一个或多个突变定位于ibfb基因的编码区内和/或ihfb基因的非编码区内；b.所述修饰的ihfb基因相对于野生型ihfb基因被敲除；c.所述修饰的ihf蛋白包含相对于野生型ihf蛋白的一个或多个突变；d.所述修饰的ihf蛋白包含相对于野生型ihf蛋白的一种或多种翻译后修饰；e.所述修饰的ihf蛋白相对于未修饰的细菌细胞的ihf蛋白是下调的；和/或f.所述修饰的ihf蛋白由修饰的ihfb基因编码。11.权利要求10的遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞，其中：(i)相对于野生型ihf蛋白的一个或多个突变包含至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、50至119、或80至119个氨基酸的缺失；(ii)相对于野生型ihf蛋白的一个或多个突变包含至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少100、至少110、50至119、或80至119个邻接氨基酸的缺失；(iii)与未修饰的革兰氏阴性菌细胞相比，相对于野生型ihf蛋白的一个或多个突变引起nomv释放的增加；(iv)与未修饰的革兰氏阴性菌细胞相比，相对于野生型ihf蛋白的一个或多个突变引起至少1.2倍、至少1.4倍、至少1.6倍、至少1.8倍、至少2.0倍或至少2.5倍的nomv释放增加；和/或(v)所述修饰的ihfb基因编码根据(i)至(iv)的修饰的ihf蛋白。12.前述权利要求中任一项的遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞，其选自大肠杆菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、乳糖奈瑟氏球菌、淋病奈瑟氏球菌、幽门螺杆菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、志贺氏菌属物种、流感嗜血杆菌、百日咳博德特氏菌、铜绿假单胞菌和粘膜炎莫拉氏菌。13.一种生成遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞的方法，其包括：(i)修饰野生型rpsa基因、操纵子、rna和/或30s核糖体蛋白s1蛋白质的步骤，使得修饰产生这样的遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞，当在培养基中生长时，与未修饰的细菌细胞相比，其将更多数量的nomv释放到培养基内；和/或(ii)提供修饰的30s核糖体蛋白s1的步骤，使得修饰产生这样的遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞，当在培养基中生长时，与未修饰的细菌细胞相比，其将更多数量的nomv释放到培养基内。14.一种用于制备nomv的方法，其包括以下步骤：a.接种含有适合于权利要求1至13中任一项的遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞生长的营养培养基的培养容器；b.在允许nomv通过所述细菌释放到培养基内的条件下，培养所述遗传修饰的革兰氏阴
性菌细胞；和c.从培养基中回收nomv；和d.将nomv与药学上可接受的稀释剂或载体混合。15.一种用于制备nomv的方法，其包括以下步骤：a.接种含有适合于遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞生长的营养培养基的培养容器；b.在允许nomv通过所述细菌释放到培养基内的条件下，培养所述遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞，其中所述条件包括添加根据权利要求3的修饰的30s核糖体蛋白s1；和c.从培养基中回收nomv；和d.将nomv与药学上可接受的稀释剂或载体混合。16.权利要求15的方法，其中所述革兰氏阴性菌细胞是权利要求1至12中任一项的革兰氏阴性菌细胞。17.一种nomv，其得自或可得自权利要求1至12中任一项的遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞、或者通过权利要求13的方法或通过权利要求14或15的方法获得或可获得的遗传修饰的革兰氏阴性菌细胞。18.一种疫苗，其包含权利要求17的nomv。19.权利要求17的nomv或权利要求18的疫苗，其用于药物中。

技术总结
本发明涉及通过修饰rpsA基因、rpsA操纵子和/或30S核糖体蛋白S 1进行遗传修饰的超级起泡的革兰氏阴性菌细胞，以及从所述遗传修饰的细菌细胞获得或可获得的天然外膜囊泡(nOMV)的领域。的领域。的领域。


技术研发人员：S
受保护的技术使用者：葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司
技术研发日：2021.12.10
技术公布日：2023/9/21