促进甜菜的再生和转化的制作方法

1.本发明涉及植物再生和体细胞胚发生诱导的技术领域，优选在甜菜和玉米中的植物再生和体细胞胚发生诱导。
技术背景
2.通过组织培养再生完整植物的能力是一个被充分描述和很多应用的现象。从体细胞再生植物最常用的方法包括在含有生长调节剂的培养基上培养外植体以诱导愈伤组织形成，然后从去分化的愈伤组织中进行器官发生或胚发生。由于再生过程的长度以及由于外植体去分化及随后再分化新组织和器官时发生的许多发育事件，因此难以在分子遗传水平上剖析体外再生现象。突变体筛选和功能研究在鉴别控制发育途径的蛋白质方面特别有帮助。
3.控制再生的蛋白质是那些从感受态体细胞诱导体细胞胚发生的蛋白质。baby boom(bbm)ap2/erf结构域蛋白是一种种子和根分生组织表达的转录因子，其被鉴定为在欧洲油菜(brassica napus)小孢子衍生的胚培养物中胚发育的标志物(boutilier,kim,et al.("ectopic expression of baby boom triggers a conversion from vegetative to embryonic growth."the plant cell 14.8(2002):1737-1749.)。作者描述了从欧洲油菜未成熟花粉粒体外诱导胚发育(小孢子胚发生)中涉及baby boom(bbm)，其显示出与转录因子ap2/erf家族相似并且在发育的胚和种子中优先表达。bbm在拟南芥属(arabidopsis)和芸苔属(brassica)植物中的异位表达导致在转基因幼苗上自发形成体细胞胚和子叶样结构。然而，异位bbm表达诱导了其它多效性表型，包括赘生物生长以及叶和花形态改变。
4.florez,sergio l.,et al.("enhanced somatic embryogenesis in theobroma cacao using the homologous baby boom transcription factor."bmc plant biology 15.1(2015):121.)描述了使用源自可可树(theobroma cacao)的转录因子baby boom(bbm)来促进可可树体细胞从植物状态向胚性状态的转变。虽然tcbbm的瞬时异位表达仅提供了胚发生潜力的适度增强，但组成型过表达显著增加了体细胞胚发生增殖，但似乎也抑制了随后的发育。
5.srinivasan,chinnathambi,et al.("heterologous expression of the baby boom ap2/erf transcription factor enhances the regeneration capacity of tobacco(nicotiana tabacum l.)."planta 225.2(2007):341.)通过拟南芥和欧洲油菜bbm基因的异源表达，查验了bbm异位表达对烟草(nicotiana tabacum l.)发育和再生能力的影响。35s::bbm烟草品系表现出许多表型，包括愈伤组织形成、叶皱折以及不育，但其没有经历自发的体细胞胚发生。由于初级转化体的雄性和雌性完全不育，因此无法评估具有严重异位表达表型的35s::bbm植物在幼苗阶段增强的再生。因此，通过在35s启动子的控制下表达类固醇诱导的、翻译后控制的bbm融合蛋白(bbm:gr)，产生了具有强失误表达(misexpression)表型的可育bbm异位表达品系。这些品系在施用dex后表现出自发的枝芽(shoot)和根形成，而体细胞胚发生可以从培养在补加细胞分裂素的培养基上的体外萌发
的幼苗下胚轴诱导。
6.wo201 1003850a1描述了一种在转化期间通过诱导bbm提供可育植物的一般方法。然而，恢复可育植物需要植物生长激素或细胞分裂素等植物激素。
7.迄今为止，通过bbm转化诱导体细胞胚发生，且仅针对辣椒(capsicum annuum)、烟草(nicotiana tabacum)、拟南芥(arabidopsis thaliana)、欧洲油菜(brassica napus)、可可(theobroma cacao)、毛白杨(populus tomentosa)进行了描述，但从未涉及经济最相关作物之一的甜菜(beta vulgaris)。基于转化的体细胞胚发生以前在甜菜中不可能进行，所述转化对甜菜生物技术工艺的总体时间表具有积极影响。
8.发明概述
9.在本发明中，发现bbm能够促进甜菜(beta vulgaris)和玉米(zea mays)的体细胞胚发生。体细胞胚发生是以一种激素非依赖性的方式实现的，从而获得可育的植物。本发明描述了在甜菜和玉米中诱导体细胞胚发生和植物再生的核苷酸和方法。本发明产生了没有多效性表型的可育植物，使得可以转化顽拗基因型(recalcitrant genotype)、降低体细胞无性系变异和高频率的共转化。通常，与其它再生方法相比，这种方法显著缩短了植物再生所需的时间，并且所获得的植物的质量也明显改良。所获得的植物的高质量对于根特征(例如重量、蔗糖含量)以及对于叶参数(例如光合作用)可具有特殊价值。
10.特别地，本发明涉及一种不依赖于基因型的基于愈伤组织的再生方法，所述方法通过使用bbm的诱导型或组成型表达产生可育植物。转化率显著增加。植物再生是激素非依赖性的，支持体细胞胚发生并避免器官发生(如无根的枝芽形成)。本发明显著缩短了甜菜转化所需的时间。
11.因此，根据第一方面，本发明提供了一种促进甜菜的体细胞胚发生或器官发生的方法，包括以下步骤：
12.(a1)(a)从至少一个甜菜植物细胞诱导愈伤组织形成，和
13.(b)将包含选自以下的编码核苷酸序列的表达盒引入到步骤(a)中使用的至少一个植物细胞或引入到步骤(a)中获得的愈伤组织的至少一个细胞中：
14.(i)seq id no:1的核苷酸序列，或与seq id no:1的序列至少80％相同的序列；和
15.(ii)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽具有seq id no:2的氨基酸序列或与seq id no:2的序列至少80％相同的序列，
16.其中所述核苷酸序列可操作地连接到异源组成型调节元件或异源诱导型调节元件；或
17.(a2)提供外植体，其来自甜菜植物的组织并且包含至少一个细胞，所述细胞包含具有选自以下的编码核苷酸序列的表达盒：
18.(i)seq id no:1的核苷酸序列或与seq id no:1的序列至少80％相同的序列；和
19.(ii)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽具有seq id no:2的氨基酸序列或与seq id no:2的序列至少80％相同的氨基酸序列，
20.其中所述核苷酸序列可操作地连接到异源组成型调节元件；或
21.(a3)提供外植体，其来自甜菜植物的组织并且包含至少一个细胞，所述细胞包含具有选自以下的编码核苷酸序列的表达盒：
22.(i)seq id no:1的核苷酸序列或与seq id no:1的序列至少80％相同的序列；和
23.(ii)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽具有seq id no:2的氨基酸序列或与seq id no:2的序列至少80％相同的氨基酸序列，
24.其中所述核苷酸序列可操作地连接到异源诱导型调节元件；和
25.(b1)在促进胚和/或枝芽从所述愈伤组织中生长的条件下培养步骤(a1)中获得的愈伤组织，其中在所述愈伤组织中，所述多肽从所述表达盒组成型表达或在异源诱导型表达系统的诱导时从所述表达盒表达；或
26.(b2)在促进胚从外植体中生长的条件下培养步骤(a2)的外植体，其中在所述外植体中，所述多肽从所述表达盒组成型表达；或
27.(b3)在促进枝芽从外植体中生长的条件下培养步骤(a3)的外植体，其中在所述外植体中，所述多肽在异源诱导型表达系统诱导时从所述表达盒表达。
28.在本发明的方法中，使用经过修饰的甜菜细胞或外植体，所述修饰使其能够表达衍生自欧洲油菜bbm的多肽，所述多肽包含seq id no:2的氨基酸序列或与seq id no:2至少80％相同的氨基酸序列。为此，使用根据本发明的变体(a1)的方法，将含有相应编码核酸序列的表达盒直接插入细胞中。或者，变体(a2)和(a3)使用外植体，其来自包含至少一个包含所述表达盒的细胞的甜菜植物的组织。
29.本文中使用的复数“植物细胞”必须不能理解为需要最少数量的植物细胞。原则上，只有一个植物细胞就足够了。
30.所述编码核苷酸序列包含：
31.(i)seq id no:1的核苷酸序列，或与seq id no:1的序列至少80％、优选至少85％、至少90％、更优选至少95％、至少98％或至少99％相同的序列；或
32.(ii)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽具有seq id no:2的氨基酸序列，或与seq id no:2的序列至少80％、优选至少85％、至少90％、更优选至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。
33.为了简单起见，上述多核苷酸和多肽被称为“bnbbm衍生的核酸”或“bnbbm衍生多肽”。然而，这并不意味着这些化合物是从bnbbm获得的，而仅仅意味着其序列衍生自bnbbm的序列。所述多核苷酸和多肽的获得方式基本上不受限制。
34.为了本发明的目的，以百分比表示的两个相关核苷酸序列或氨基酸序列的“序列相同性”是指两个最佳比对序列中具有相同残基的位置数(
×
100)除以比较的位置数。缺口，即在比对中某残基存在于一个序列中但不存在于另一序列中的位置，被视为具有不相同残基的位置。两个序列的比对通过needleman和wunsch算法(needlemman and wunsch1970)进行。上述计算机辅助序列比对可以使用标准软件程序方便地进行，例如欧洲分子生物学开放软件套件(emboss)中执行的程序needle，例如版本6.3.1.2(trends in genetics 16(6),276(2000))，其默认参数为例如蛋白质矩阵＝eblosum62，gapopen＝10.0和gaextend＝0.5。
35.编码核苷酸序列与异源组成型调节元件或异源诱导型调节元件可操作地连接。表述“可操作连接”是指嵌合基因的所述元件以这样一种方式相互连接，即它们功能是协调的，并允许编码序列的表达，即它们是功能性连接的。例如，当启动子能够确保另一核苷酸序列的转录和最终表达时，则所述启动子与所述另一核苷酸序列是功能性连接的。如果两个蛋白质编码核苷酸序列以可以形成第一和第二蛋白质或多肽的融合蛋白的方式连接，则
它们是彼此功能上或可操作地连接的。
36.所述异源组成型调节元件优选是组成型启动子。所述异源诱导型调节元件可以是诱导型启动子或诱导型表达系统。
37.术语“诱导型启动子”是指应答内源性或外源性刺激的存在例如化合物(化学诱导剂)或应答环境、激素、化学和/或发育信号而选择性表达编码序列或功能性rna的启动子。诱导型启动子包括例如由光、热、胁迫、盐胁迫、渗透压胁迫、植物激素或化学物质如乙醇、脱落酸(aba)、茉莉酸酯(jasmonate)、水杨酸或安全剂诱导的启动子。
38.在转基因中用于靶向表达的启动子综述于potenza at al.,2004。一些非生物胁迫启动子是拟南芥(arabidospsis thaliana)或水稻(oryza sativa)dreb基因启动子(dubouzet et al.,2003；lee et al.,2004；pellegrineschi at al.,2004)；水稻sisap1、cdpk7或wsi基因启动子(mukhopadhyay et al.,2004；saijo et al.,2000；takahashi at al.,1994)，拟南芥rd29基因启动子(yamaguchi-shinozaki and shinozaki 1993)。也可以使用一些植物热诱导型启动子，来自拟南芥的hsp18.2或hsp101(yoshida at al.,1995；young at al.,2005)、来自大豆(glycine max)的hsp17.6或hsp17.3(severin and schoffl,1990；saidi at al.,2005)。dna微阵列已经用于鉴别胁迫调节的序列(rabbani at al.,2003；ep 1 452 596；wo 02/16655)。对胁迫应答的信号传导途径包括脱落酸信号传导，因此aba诱导型启动子也可以是强胁迫诱导型启动子，如大麦(horgum vulgare)a22和hva1启动子(shen at al.,1993；straub et al.,1994)、玉米rab 17、dbf1和dbf2(villardel et al.,1990；kizis and pages,2002)，拟南芥abf3(genbank登录号ak175851)，以及水稻(oryza sativa)rab21(mundy and chua,1988)。
39.植物中使用的化学诱导型表达系统和化学诱导剂的组合的一些实例是由乙醇诱导的来自构巢曲霉(a.nidulans)的alca启动子(rosian at al.,2001)或由蜕皮激素激动剂诱导的来自云杉色卷蛾(c.fumiferana)的蜕皮激素受体(koo at al.,2004)。
40.在另一个实施方案中，从编码核苷酸序列表达多肽由化学物质间接诱导。例如，可以使用gvg基因，其编码修饰的大鼠糖皮质激素反应性转录因子，以复合物的形式保留在植物胞质溶胶中。在应用地塞米松时，这种复合物解离，使gvg蛋白进入细胞核并与靶dna序列(uas)结合。来自uas启动子的转录使得所述多肽产生。这被认为是地塞米松诱导的(尽管是间接的)启动子，用于控制多肽表达(aoyama and chua(1997))。在这种情况下，应用地塞米松将诱导多肽的表达及其活性。优选地，诱导型表达系统选自基于蜕皮激素或地塞米松的表达系统。
41.当基因导致表达产物形成时，称该基因被表达。表达产物是指由编码这种产物的核酸、dna或rna例如本文所述的第二核酸的转录和任选翻译产生的中间产物或终产物。在转录过程中，在调节区、特别是启动子控制下的dna序列被转录成rna分子。rna分子本身可以形成表达产物，或者当其能够被翻译成肽或蛋白质时，其可以是中间产物。当作为基因表达的最终产物的rna能够例如与另一核酸或蛋白质相互作用时，称该基因编码作为表达产物的rna分子。rna表达产物的实例包括抑制性rna，例如有义rna(共抑制)、反义rna、核酶、mirna或sirna、mrna、rrna和trna。当基因表达的最终产物是蛋白质或肽时，称该基因编码作为表达产物的蛋白质。
42.本文所用的核酸(分子)或核苷酸(序列)或多核苷酸是指dna和rna。dna还包括
cdna和基因组dna。核酸分子可以是单链或双链的，可以化学合成，也可以通过体外甚至体内的生物表达而产生。
43.很明显，无论何时通过参考相应dna分子的核苷酸序列来定义rna分子的核苷酸序列，核苷酸序列中的胸腺嘧啶(t)都应该被尿嘧啶(u)取代。从应用的上下文将清楚是指rna还是dna分子。
44.如本文所用“包含“或类似用语应解释为指定所述特征、整数、步骤或组分的存在，但不排除一个或多个特征、整数或步骤或组分或其一组的存在或加入。因此，例如包含核苷酸或氨基酸序列的核酸或蛋白质可包含比实际上列举的那些更多的核苷酸或氨基酸，即嵌入一个更大的核酸或蛋白质中。包含功能上或结构上限定的dna区域的嵌合基因可以包含其它dna区域等。
45.适于诱导愈伤组织的植物细胞包括植物胚细胞和体细胞。提供这些植物细胞的方式对于根据本发明的方法来说并不重要。植物细胞既可以以分离的形式使用，也可以作为植物组织的一部分使用。例如，胚细胞或体细胞植物细胞可以由从植物中分离的外植体提供。分离自外植体的细胞或者外植体直接用于诱导愈伤组织。植物的哪一部分适合获得外植体取决于特定的植物物种。通常，合适的植物细胞可以从植物的下胚轴、枝芽、叶、芽、花和根中获得。优选地，在本发明的方法中使用从植物分离的外植体或其部分。
46.为了诱导愈伤组织的形成，将植物细胞在培养基中培养。原则上，可以使用本领域已知的任何培养基，特别是通常用于诱导愈伤组织形成的培养基。根据所讨论的植物，培养基的组成可能会有所不同。原则上，可以向培养基中加入几种类型的基础盐混合物，但优选地，培养基包括改良的murashige和skoog(ms)培养基、white’s培养基或木本植物培养基，最优选ms培养基。先前的研究表明，在ms培养基中单独或相互组合存在适当量和浓度的植物生长素和细胞分裂素有利于愈伤组织的诱导。根据本发明，这些组分也可以优先添加到培养基中。示例的植物生长素包括萘乙酸(naa)、吲哚-3-乙酸(iaa)和吲哚-3-丁酸(iba)。示例的细胞分裂素包括6-苄基氨基嘌呤(bap)和6-糠基氨基嘌呤(激动素)。
47.在步骤(a1)(b)中，将包含编码核苷酸序列的表达盒引入到步骤(a)中使用的至少一个植物细胞中或引入到步骤(a)中获得的愈伤组织的至少一个细胞中。将包含编码核苷酸序列的表达盒引入植物细胞的步骤(b)可导致其稳定整合到植物细胞或其后代细胞的基因组中。或者，将表达盒引入植物细胞可导致编码多肽在植物细胞或其后代细胞中的瞬时出现。就本发明而言，“瞬时转化”是指插入的序列未(稳定)整合到植物细胞的基因组中。根据本发明，优选稳定整合到基因组中。
48.表达盒的引入可以通过任何方式进行。许多方法可用于将感兴趣的核酸转移到植物细胞中。一种示例的载体介导的方法是农杆菌介导的转化，例如对于甜菜由lindsay&gallois,1990,journal of experimental botany和kischenko et al.,2005,cell biology international所述，或者对于玉米由ishida et al.,2007,(“agrobacterium-mediated transformation of maize.”nature protocols,2(7),1614-1621)所述。其它合适的技术包括粒子轰击和电穿孔。
49.根据本发明方法的变体(a2)和(a3)，使用外植体，其来自包含至少一个包含上述表达盒的细胞的甜菜植物的组织。优选地，表达盒被稳定地整合到至少一个植物细胞的基因组中或其后代细胞中。外植体原则上可以以任何方式获得，例如如上文针对变体(a1)所
述。优选地，所述外植体从叶组织、下胚轴组织、花组织、枝芽组织、茎尖分生组织或根尖组织获得。
50.在步骤(b1)、(b2)或(b3)中，在表达多肽的条件下进行培养。培养优选在不含植物激素的培养基中进行。术语“植物激素”在本文中被理解为影响植物细胞和组织生长发育的化学物质。植物生长激素包括以下五类化学物质：植物生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸(aba)和乙烯。除了这五类外，还有两类化学物质通常被视为植物生长调节剂：油菜素甾醇和多胺。为了诱导植物组织的再生，通常使用一种或多种细胞分裂素和一种或多种植物生长素的组合。然而，根据本发明，在培养步骤(b1)、(b2)和(b3)中优选不使用植物激素。研究发现，在培养基中没有植物激素的情况下，对植物发育的负面副作用(如体细胞无性系变异)会减少。因此，根据不同基因型调节培养基组分的复杂性也降低了。
51.此外，发现步骤(b1)和(b2)中不存在植物激素促进了体细胞胚而不是枝芽(shoot)的形成。因此，在优选的实施方案中，在步骤(b1)或(b2)中从愈伤组织直接生长胚。因此，避免了繁琐的生根过程，从而缩短了转到温室的时间。
52.通过在无激素转化中使用bnbbm增强体细胞胚的形成，导致植物发育而没有明显的表型，从而可以快速验证性状候选基因，尤其是根性状和根组织特异性启动子。此外，还可以与其它遗传元件的共同递送和基因组编辑技术的应用相结合。
53.显著的时间节省是植物转化的第二个改进。在所描述的方法中，t0植物可以直接用于不同类型的分析，而通常t1植物用于这种分析的常规转化方法。这是必要的，因为通过器官发生产生的常规t0植物具有明显的表型，不形成合适的主根，即甜菜的特定贮藏器官。
54.由于在所描述的发明中使用t0植物，可以为上述分析过程节省长达2.5年的时间。
55.由于如上所述具有bnbbm衍生多肽的诱导型和组成型表达的植物材料的再生能力增加，还增强了其它遗传元件(例如遗传工程组分)的共递送效率。可以获得更多的转基因或修饰的植物，及另外由此可以转化不可转化的基因型。因此，根据本发明的另一方面，如上所述的bnbbm衍生多肽的有益作用可以用于产生转基因植物的方法以及产生经遗传修饰/编辑的植物的方法中。已经发现，在顽拗性植物物种或植物基因型中，可以通过使用如上所述的bnbbm衍生多肽来提高转化效率。随着具有bnbbm衍生多肽的诱导型和组成型表达的植物组织的再生能力增加，也导致更有效的共转化率，这例如对于基因组编辑组分的递送是重要的。这已经通过获得sdn 1事件成功得到证明。当在培养愈伤组织的步骤中存在如本文所定义的bnbbm衍生多肽时，从已经转化或基因编辑并且可能具有修饰基因组的修饰的植物细胞中再生植物得到显著改善。此外，本发明的方法能够显著节省时间，这在当产生经过编辑的甜菜杂交体时尤其明显。可以节省长达6-7年的时间，因为编辑事件可以直接在最终杂交体的两个亲本系内产生，代替首先在顺从型基因型中引入必要的修饰以进行转化，然后通过耗时的杂交和育种步骤将其带到特定杂交体的亲本系中。
56.根据这个实施方案，所述方法进一步包括以下步骤：
57.(c1)将至少一个感兴趣的核苷酸序列引入到步骤(a1)(a)中使用的所述至少一个植物细胞或其前体中，引入到步骤(al)(a)中获得的愈伤组织的至少一个细胞中，其自身或其后代随后用于步骤(a1)(b)中或已经用于步骤(a1)(b)中，或引入步骤(a2)或(a3)的至少一个植物细胞中，和/或
58.(c2)修饰步骤(a1)(a)中使用的至少一个植物细胞或其前体的基因组，修饰步骤
(a1)(a)中获得的愈伤组织的至少一个细胞的基因组，其自身或其后代随后用于步骤(a1)(b)中或已经用于步骤(a1)(b)中，或修饰步骤(a2)或(a3)的至少一个植物细胞的基因组，通过引入单链dna断裂(ssb)诱导酶或双链dna断裂(dsb)诱导酶，所述酶优选识别所述细胞基因组中预定位点，和任选的修复核酸分子，或者引入单链dna断裂(ssb)诱导酶，所述酶优选识别所述细胞基因组中预定位点并与碱基编辑器酶(base editor enzyme)融合，其中所述基因组修饰选自：
59.i.至少一个核苷酸的置换；
60.ii.至少一个核苷酸的缺失；
61.iii.至少一个核苷酸的插入；或
62.iv.上述i.至iii.的任何组合。
63.引入至少一个感兴趣的核苷酸序列的步骤(c1)可以使用本领域公知的任何合适的方法进行。有许多方法可用于将感兴趣的核酸转移到植物细胞中。一种示例的载体介导的方法是农杆菌介导的转化，例如对于甜菜由lindsay&gallois,1990,journal of experimental botany,and kischenko et al.,2005,cell biology international所述，或者对于玉米由ishida et al.,2007,(“agrobacterium-mediated transformation of maize.”nature protocols,2(7),1614-1621)所述。其它合适的技术包括粒子轰击和电穿孔。
64.根据本发明的感兴趣的核苷酸序列可以是dna或rna序列，例如mrna、sirna、mirna等。更特别地，感兴趣的核酸序列编码至少一种表型性状。优选地，由所述dna或rna赋予的表型性状可以选自对生物胁迫的抗性/耐受性，包括病原体抗性/耐受性，其中病原体可以是病毒、细菌、真菌或动物病原体，对非生物胁迫的抗性/耐受性，包括抗寒性/耐受性、干旱胁迫抗性/耐受性，渗透抗性/耐受性、热胁迫抗性/耐受性、寒冷或霜冻胁迫抗性/耐受性、氧化胁迫抗性/耐受性、重金属胁迫抗性/耐受性、盐胁迫或水涝抗性/耐受性、倒伏抗性/耐受性、抗裂荚性/耐受性、或对一种或多种除草剂如草甘膦、草铵膦、2,4-d，麦草畏(dicamba)、als抑制剂等的抗性/耐受性。所述至少一种感兴趣的表型性状还可以选自对感兴趣的另一农艺性状的修饰，包括产量增加、开花时间修饰、种子颜色修饰、胚乳组成修饰、营养含量修饰或感兴趣途径的代谢工程。
65.根据本发明的一个实施方案，引入至少一个感兴趣的核苷酸序列的步骤(c1)产生植物细胞的瞬时转化。在另一个实施方案中，进行稳定的转化，其中将步骤(c1)中感兴趣的核苷酸序列插入植物细胞的基因组中。
66.在步骤(c2)中，修饰植物细胞的基因组可以通过单链dna断裂(ssb)或双链dna断裂(dsb)诱导酶或碱基编辑器酶来实现，其优选识别所述细胞基因组中预定位点。
67.如本文所用，“双链dna断裂诱导酶”或“dsbi酶”是一种能够在被称为“识别位点”的特定核苷酸序列上诱导双链dna断裂的酶。因此，“单链dna或rna断裂诱导酶”或“ssb/酶”是一种能够在特定核苷酸序列上诱导单链dna或rna断裂的酶。
68.为了能够在预定的靶位点处断裂，所述酶优选包括结合结构域和裂解结构域。能够诱导双链或单链断裂的特定酶是核酸酶及其变体，其不再包含核酸酶功能，而是作为与另一种酶组合的识别分子操作。近年来，已经开发了许多合适的核酸酶，特别是定制的核酸内切酶，包括例如大范围核酸酶、锌指核酸酶、tale核酸酶、衍生自格氏嗜盐碱杆菌
(natronobacterium gregoryi)的argonaute核酸酶，以及crispr核酸酶，包括例如作为规律间隔成簇短回文重复序列(crispr)系统的一部分的cas、cpf1、casx或casy核酸酶。因此，在本发明的一个优选方面中，dsb或ssb诱导酶选自crispr系统，如crispr/cas9、crisprzcpfl、crispr/casx、crispr/casy、crispr-csm1或crispr/mad7，优选crispr/cas9核酸内切酶、crisprcmad7核酸内切酶或crisprzcpfl核酸内切酶，锌指核酸酶(zfn)、归巢核酸内切酶和大范围核酸酶以及tal效应子核酸酶。
69.罕见裂解(rare-cleaving)核酸内切酶是具有优选约14至70个连续核苷酸的识别位点的酶，因此即使在较大的基因组(如大多数植物基因组)中也具有非常低的裂解频率。归巢核酸内切酶，也称为大范围核酸酶(meganucleases)，构成了这种罕见裂解核酸内切酶家族。它们可以由内含子、独立基因或间插序列编码，并具有显著的结构和功能特性，将其与更经典的限制酶(通常来自细菌限制性修饰ii型系统)区分开来。它们的识别位点具有普遍的不对称性，这与大多数限制性酶识别位点的特征性二重对称性形成对比。由内含子或内含肽(inteins)编码的几种归巢核酸内切酶已被证明能促进其各自的遗传元件归巢到等位基因无内含子或无内含肽位点。通过在无内含子或无内含肽等位基因中产生位点特异性双链断裂，这些核酸酶产生发生重组的末端，参与复制编码序列的基因转换过程，并在dna水平上插入内含子或间插序列。wo 03/004659的表i(第17至20页)提供了其它罕见裂解大范围核酸酶及其各自的识别位点的列表(所述专利通过引用并入本文)。
70.此外，可以使用方法来设计定制的罕见裂解核酸内切酶，其基本上识别所选择的任何靶核苷酸序列。简言之，嵌合的限制酶可以使用设计用于识别特定核苷酸序列的锌指结构域和来自天然限制酶(如fokl)的非特异性dna裂解结构域之间的杂交来制备。这样的方法已经描述于例如wo 03/080809、wo 94/18313或wo 95/09233以及isalan et al.(2001).a rapid,generally applicable method to engineer zinc fingers illustrated by targeting the hiv-1promoter.nature biotechnology,19(7),656；liu et al.(1997).design of polydactyl zinc-finger proteins for unique addressing within complex genomes.proceedings of the national academy of sciences,94(11),5525-5530.)。
71.定制设计的核酸内切酶的另一个实例包括tale核酸酶(talen)，其基于来自细菌黄单胞菌属(xanthomonas)的转录激活物样效应子(tale)与核酸酶(例如fokl或其变体)的催化结构域融合。这些tale的dna结合特异性由串联排列的34/35个氨基酸重复单元的重复可变二残基(rvd)定义，使得一个rvd特异性识别靶dna中的一个核苷酸。所述重复单元可以被组装以识别基本上任何靶序列，并与核酸酶的催化结构域融合以产生序列特异性核酸内切酶(参见例如boch et al.(2009).breaking the code of dna binding specificity of tal-type iii effectors.science,326(5959),1509-1512；moscou&bogdanove(2009).asimple cipher governs dnarecognition by tal effectors.science,326(5959),1501-1501；及wo 2010/079430、wo 2011/072246、wo 2011/154393、wo 2011/146121、wo 2012/001527、wo 2012/093833、wo 2012/104729、wo 2012/138927、wo 2012/138939)。wo 2012/138927进一步描述了具有各种催化结构域及其组合的单体(紧凑型)talen和tale。
72.最近，已描述了一种新型的可定制核酸内切酶系统，即所谓的crispr/cas系统。自然环境中的crispr系统描述了一种分子复合物，其包含至少一种小的个体非编码rna与cas
核酸酶或另一crispr核酸酶如cpf1核酸酶组合(zetsche et al.,cpf1 is a single rna-guides endonuclease of a class 2crispr-cas system",cell,163,pp.1-13,october 2015)，可以产生特定的dna双链断裂。目前，crispr系统分为两类包括五种类型的crispr系统，例如使用cas9作为效应子的ii型系统和使用cpf1作为效应子分子的v型系统(makarova et al.,nature rev.microbiol.,2015)。在人工crispr系统中，合成的非编码rna和crispr核酸酶和/或任选的修饰的crispr核酸内切酶，被修饰为充当切口酶或缺乏任何核酸酶功能，可以与至少一种组合crrna和/或tracrrna功能的合成或人工的引导rna或grna组合使用(makarova et al.,2015，如上)。自然系统中由crispr/cas介导的免疫应答需要crispr-rna(crrna)，其中控制crispr核酸酶特异性激活的这种引导rna的成熟在各种crispr系统之间存在显著差异，迄今为止已经对其进行了表征。首先，侵入dna(也被称为间隔区)被整合在crispr基因座近端的两个相邻重复区之间。ii型crispr系统编码cas9核酸酶作为干扰步骤的关键酶，该系统含有crrna和反式激活rna(tracrrna)作为引导基序。这些rna杂交并形成双链(ds)rna区域，这些区域被rnaselll识别并可被裂解以形成成熟的crrna。然后这些又与cas分子结合，以便将核酸酶特异性地引导至靶核酸区域。重组grna分子可以包含可变dna识别区和cas相互作用区，因此可以不依赖于特异性靶核酸和所需的cas核酸酶进行特异性设计。作为进一步的安全机制，pam(前间隔序列相邻基序)必须存在于靶核酸区域中；这些是dna序列，直接在cas9/rna复合物识别的dna后面。化脓性链球菌(streptococcus pyogenes)cas9的pam序列已被描述是“ngg”或“nag”(标准iupac核苷酸代码)(jinek et al,"aprogrammable dual-rna-guided dnaendonuclease in adaptive bacterial immunity",science 2012,337:816-821)。金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)cas9的pam序列是“nngrrt”或“nngrr(n)”。进一步的变体crispr/cas9系统是已知的。因此，脑膜炎奈瑟菌(neisseria meningitidis)cas9在pam序列nnnngatt裂解。嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)cas9在pam序列nnagaaw裂解。最近，已经针对弯曲杆菌(campylobacter)的crispr系统描述了另一种pam基序nnnnryac(wo 2016/0217373 a1)。对于cpf1核酸酶，已经描述了没有tracrrna的cpf1-crrna复合物通过短的富含t的pam有效地识别和裂解靶dna，这与由cas9系统识别的通常富含g的pam形成对比(zetsche et al.，如上)。此外，通过使用修饰的crispr多肽，可以获得特定的单链断裂。cas切口酶与各种重组grna的联合使用也可以通过双dna缺口(dnanicking)诱导高度特异性的dna双链断裂。此外，通过使用两个grna，可以优化dna结合的特异性，从而优化dna裂解。同时，可以获得更多的crispr效应子，如最初针对细菌描述的casx和casy效应子，并代表可以用于基因组工程目的的其它效应子(burstein et al.,“new crispr-cas systems from uncultivated microbes”,nature,2017,542,237-241)。
73.dsbi/ssbi酶的裂解位点与dna或rna上诱导双链断裂的确切位置有关。裂解位点可以包含在或不包含在dsbi/ssbi酶的识别位点中(与之重叠)，并因此称dsbi/ssbi酶的裂解位点位于其识别位点处或附近。dsbi/ssbi酶的识别位点，有时也称为结合位点，是被dsbi/ssbi酶(特异性)识别并决定其结合特异性的核苷酸序列。例如，talen或znf单体具有分别由其rvd重复序列或zf重复序列决定的识别位点，而其裂解位点由其核酸酶结构域(例如fokl)决定，并且通常位于识别位点之外。在二聚体talen或zfn的情况下，裂解位点位于各个单体的两个识别/结合位点之间，发生裂解的这种间插dna或rna区域被称为间隔区。
74.本领域技术人员将能够选择识别某识别位点并在预选/预定位点处或附近的裂解位点诱导dsb或ssb的dsbi/ssbi酶，或者设计这种dsbi/ssbi酶。或者，可以使用任何常规转化方法或通过与在其基因组中具有dsbi/ssbi酶识别位点的生物体杂交将dsbi/ssbi酶识别位点引入靶基因组，然后可以在所述dsbi/ssbi酶的裂解位点处或附近引入任何所需核酸。
75.如本文所用，“碱基编辑器酶”或“编辑的碱基”是指具有与其所衍生于之中的蛋白质相同的催化活性的蛋白质或其片段，所述蛋白质或其片段被单独或作为分子复合物(在本文中称为碱基编辑复合物)提供时，具有介导靶向碱基修饰的能力，即感兴趣碱基的转换导致感兴趣的点突变，进而可导致靶向突变，如果碱基转换不引起沉默突变，而是由包含待用碱基编辑器转换的位置的密码子编码的氨基酸的转换。优选地，根据本发明的至少一种碱基编辑器临时或永久地与至少一种位点特异性效应子连接，或任选地与至少一种位点特异性效应子复合物的组分连接。所述连接可以是共价和/或非共价连接。
76.本文公开的任何碱基编辑器或位点特异性效应子、或其催化活性片段、或碱基编辑器复合物或位点特异性效应子复合物的任何组分可以作为核酸片段引入细胞中，所述核酸片段代表或编码dna、rna或蛋白质效应子，或者其可以作为dna、rna和/或蛋白质或其任意组合被引入。修复断裂有两种主要而不同的途径：同源重组和非同源末端连接(nhej)。同源重组需要存在同源序列作为模板(例如，“供体”)来指导细胞修复过程，并且修复的结果是无错误和可预测的。在没有用于同源重组的模板(或“供体”)序列的情况下，细胞通常试图通过非同源末端连接(nhej)过程修复断裂。
77.在这个实施方案的特别优选的方面中，将修复核酸分子额外引入植物细胞中。如本文所用，“修复核酸分子”是单链或双链dna分子或rna分子，其用作模板以在裂解位点附近的预选位点或在裂解位点进行基因组dna修饰。如本文所用，“用作基因组dna修饰的模板”是指所述修复核酸分子被拷贝或整合在预选位点，这是通过侧翼区与预选位点侧翼的靶基因组中相应同源区域之间的同源重组，任选地与在修复核酸分子的两端之一处的非同源末端连接(nhej)组合(例如在仅有一个侧翼区域的情况下)进行。通过同源重组的整合将允许所述修复核酸分子与靶基因组在直至核苷酸水平的精确连接，而nhej可导致在修复核酸分子和基因组dna之间连接处的小插入/缺失。
78.如本文所用，“基因组修饰”是指所述基因组至少改变了一个核苷酸。这可以通过置换至少一个核苷酸和/或缺失至少一个核苷酸和/或插入至少一个核苷酸而发生，只要与修饰前预选基因组靶位点的核苷酸序列相比导致总体上至少一个碱基变化即可，从而可以例如通过本领域技术人员熟知的诸如测序或pcr分析等技术鉴定所述修饰。
79.如本文所用，“预选位点”、“预定位点”或“预定义位点”表示基因组(例如核基因组或叶绿体基因组)中预期插入、置换和/或缺失一个或多个核苷酸的特定核苷酸序列。这可以例如是在先前引入的外源dna或转基因中或与其连接的的内源性基因座或特定核苷酸序列。预先选择的位点可以是特定的核苷酸位置，在该位置处(该位置之后)意在插入一个或多个核苷酸。预选位点还可以包含一个或多个核苷酸的序列，这些核苷酸将被置换(替换)或缺失。
80.如在本技术的上下文中所使用的，术语“约”是指所列举值的 /-10％，优选所列举值的 /-5％。例如，约100个核苷酸(nt)应理解为介于90和110nt之间，优选介于95和105nt
之间。
81.如本文所用，“侧翼区”是修复核酸分子的一个区域，其核苷酸序列与预选位点侧翼(即上游或下游)的dna区域的核苷酸序列同源。很明显，侧翼区域的长度和序列相同性百分比的选择应使所述侧翼区域与预选位点上游或下游的相应dna区域之间能够进行同源重组。与修复核酸分子的侧翼dna区域具有同源性的预选位点侧翼的dna区域也被称为基因组dna中同源区域。
82.为了具有足够的同源性用于重组，修复核酸分子的侧翼dna区域的长度可以变化，并且长度应该至少为约10个核苷酸(nt)、约15nt、约20nt、约25nt、约30nt、约40nt或约50nt。然而，侧翼区可以尽可能长(例如高达约100-150kb，例如完整的细菌人工染色体(bac))。优选地，侧翼区为约50nt至约2000nt，例如约100nt、200nt、500nt或1000nt。此外，感兴趣的dna侧翼区不需要与同源区(预选位点侧翼的dna区)相同，并且与预选位点侧翼的dna区域可以具有约80％至约100％的序列相同性，优选具有约95％至约100％的序列相同性。侧翼区域越长，对同源性的要求就越不严格。此外，为了在预选位点实现靶dna序列的置换而不改变相邻dna序列的dna序列，侧翼dna序列应优选与预选位点侧翼的上游和下游dna区域相同。
83.如本文所用，“上游”表示核酸分子上更靠近所述核酸分子5’端的位置。同样，术语“下游”是指核酸分子上更靠近所述核酸分子3’端的位置。为免生疑问，核酸分子及其序列通常沿其5’至3’方向(从左到右)表示。
84.为了靶向预选位点的序列修饰，必须选择侧翼区，使得上游侧翼区的3’端和/或下游侧翼区的5’端与预定位点的端点对齐。因此，上游侧翼区域的3’端确定了预定位点的5’端，而下游侧翼区域的5’端确定了预定位点的3’端。
85.如本文所用，位于所述裂解(和/或识别)位点之外或远离所述位点的所述预选位点，意味着要进行基因组修饰的位点(预选位点)不包含dsbi/ssbi酶或碱基编辑器酶的裂解位点和/或识别位点，即预选位点与裂解(和/或识别)位点不重叠。在这方面，之外/远离因此意味着裂解(和/或识别)位点的上游或下游。
86.在本发明中，发现bnbbm在甜菜转化中增强体细胞胚的形成，并导致具有高质量的植物，与从种子生长的植物相当。所获得的植物的高质量已经通过不存在显然可见表型得到了验证，也通过根系特征如根的重量、蔗糖含量以及叶参数如光合作用得到实验性验证。在基于农杆菌的转化以及基因枪转化方法组合bnbbm诱导的体细胞胚发生后，观察到了植物质量的提高。
87.在无激素转化中使用bnbbm增强了体细胞胚形成，导致植物发育而没有明显的表型，这允许快速验证性状候选基因，尤其是根性状和根组织特异性启动子，此外其还可以与基因组编辑技术的应用相结合。
88.显著的时间节省是植物转化的第二个改进。在所描述的方法中，t0植物可以直接用于不同类型的分析，而通常t1植物用于常规的转化方法来进行这种分析。这是必要的，因为通过器官发生产生的常规t0植物具有明显的表型，未形成合适的主根，即甜菜的特定贮藏器官。
89.由于在所描述的本发明中使用t0，可以为上述分析过程节省长达2.5年的时间。此外，在使用t0植物时，还存在在甜菜中进行瞬时基因组编辑的可能性。因此，这种在t0水平
的植物分析代表了本发明的优选实施方案。
90.产生基因工程化的甜菜杂交体所节省的时间甚至更多。可以节省长达6-7年的时间，因为编辑可以直接在产生杂交体的亲本中产生，而不是在许多单粒型(monogerm)亲本系中产生(图29)。本发明的进一步改进是从这个方法获得的植物中体细胞无性系变异较少和转基因植物种子产量显著增加。这尤其对于甜菜植物通常是一个大问题，并导致不同品系的可用性受到严重限制。本发明的另一个方面涉及一种产生甜菜植物的方法。已经发现，使用上述体细胞胚发生和器官发生的方法，即使对于顽拗性植物物种或植物基因型，也可以产生完整的植物。此外，发现利用本发明，得到的甜菜植物显示没有多效性表型。
91.因此，本发明提供了一种生产甜菜植物的方法，所述方法包括如上文参考步骤(a1)-(a3)和(b1)-(b3)所述的体细胞胚发生或器官发生，任选如上文参考步骤(c1)和(c2)所述的转化或基因组修饰，以及从得自上述公开的方法的步骤(b1)、(b2)或(b3)的胚和/或枝芽再生甜菜植物，特别是得自步骤(c1)的转基因植物和/或得自步骤(c2)的修饰的植物。
92.优选地，选择体细胞胚发生的条件，使得在步骤(b1)或(b2)中直接形成胚。这可以如上所述实现，例如通过在不含植物激素的培养基中进行培养。从衍生自在无激素培养基中的体细胞胚发生的枝芽中，生长幼苗，其具有天然根而不是从体外枝芽人工诱导的不定根，这样使得可以在t0水平上进行生理学分析。此外，与使用公开的方案产生的植物相比，获得的植物质量显然更好。与现有技术相比，由于减少了组织培养工作，这导致了巨大的时间和成本节约。因此，这种在t0水平的生理学分析代表了本发明的优选实施方案。
93.本发明的主题也包括通过上述方法获得或可获得的植物。因此，本发明的一个实施方案是通过上述转化植物细胞和产生甜菜植物的方法获得或可获得的转基因甜菜植物(权利要求12)，以及其后代植物或一部分，其中所述其后代或一部分包含作为转基因的至少一个感兴趣的核苷酸序列。
94.本发明的另一个实施方案是通过上述修饰植物细胞的基因组并产生甜菜植物的方法获得或可获得的遗传修饰的植物(权利要求12)以及其后代植物或一部分，其中所述后代或一部分包含通过上述修饰方法引入的基因组中的修饰。
95.本发明的另一主题是衍生自上述转基因植物或遗传修饰的植物的植物细胞或种子。这样的植物细胞优选包含编码瞬时或稳定整合的bnbbm衍生多肽和单链dna断裂(ssb)-或双链dna断裂(dsb)-诱导酶或碱基编辑器酶的多核苷酸，其优选识别所述细胞基因组中的预定位点，及任选的修复核酸分子。编码bnbbm衍生多肽的多核苷酸优选可操作地连接到合适的调控序列，使得植物细胞能够表达bnbbm衍生多肽。例如，调控序列是指“启动子”，指的是核苷酸序列，通常位于其编码序列的上游(5’)，通过识别rna聚合酶和正确转录所需的其它因子来控制编码序列的表达。“组成型启动子”是指在几乎所有组织和任何时间指导基因表达的启动子。组成型启动启动子的实例包括camv 35s启动子、双camv 35s启动子(70s启动子)、胭脂碱合酶(nos)启动子、bdef1启动子或泛素启动子，如pcllbi4或zmllbil。“受调控的启动子”是指以时间和/或空间调节的方式而非组成性地指导基因表达的启动子，包括组织特异性启动子和诱导型启动子。它包括天然序列和合成序列以及可以是合成序列和天然序列的组合的序列。不同的启动子可以指导基因在不同组织或细胞类型中的表达，或在不同的发育阶段或响应不同的环境条件而表达。可用于植物细胞中的各种类型的新启动子不断被发现，并且是本领域技术人员所熟知的。“组织特异性启动子”是指并非在所有植
物细胞中表达、而是仅在特定器官(如叶或种子)、特定组织(如胚或子叶)、或特定细胞类型(如叶薄壁组织或种子储存细胞)中表达的受调控的启动子。这些还包括在果实成熟期间在发育中的种子或果实中、在完全分化的叶中或在衰老开始时受到暂时调节的启动子(例如在胚发生的早期或晚期)。“诱导型启动子”是指那些可以在一种或多种细胞类型中通过外部刺激(如化学物质、光、激素、胁迫或病原体)启动的受调控启动子。诱导型启动子的实例是可由蜕皮激素、地塞米松、乙醇诱导的启动子。这样的启动子在现有技术中是众所周知的(例如，samalova et al.(2005).pop6/lhgr:a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco.the plant journal,41(6),919-935；gatz&lenk(1998).promoters that respond to chemical inducers.trends in plant science,3(9),352-358.)。
96.本发明的另一个主题是植物细胞，其包含编码瞬时或稳定整合的bnbbm衍生多肽和单链dna断裂(ssb)-或双链dna断裂(dsb)-诱导酶或碱基编辑器酶的多核苷酸，其优选识别所述细胞基因组中的预定位点，以及任选的修复核酸分子，其中优选编码bnbbm衍生多肽的多核苷酸与合适的调控序列操作性连接，使得植物细胞能够表达所述多肽。当进行上述用于修饰植物细胞的基因组的方法时，可以获得这样的植物细胞。
97.通过纯生物学方法获得的细胞、植物、后代植物和植物部分不是本发明的主题。
98.本发明的另一个方面是编码如上所述的bnbbm衍生多肽的核酸在从愈伤组织或组织外植体中进行体细胞胚发生或器官发生和/或甜菜植物再生的方法中的用途。特别地，本发明公开了包含选自以下的编码核苷酸序列的核酸在从愈伤组织或组织外植体进行体细胞胚发生或器官发生和/或植物再生的方法中、在直接或间接再生甜菜植物的方法中、在转化甜菜植物细胞的方法中、或在修饰甜菜植物细胞的基因组的方法中的用途：
99.(i)seq id no:1的核苷酸序列或与seq id no:1的序列至少80％相同的序列；和
100.(ii)编码具有seq id no:2的氨基酸序列或与seq id no:2的序列至少80％相同的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
101.根据本发明的另一个方面，上述方法和用途中bnbbm衍生多肽的活性可以与编码wus2多肽的多核苷酸、编码wus2肽的mrna或wus2多肽组合。
102.就本发明而言，bnbbm的活性也可用于特定植物材料的快速繁殖。这有助于繁殖具有特定表型或遗传组成的个体植物，例如特定的杂交植物。当使用体细胞胚发生方法时，可以在不需要通过经典的种子生产方法生产种子的情况下产生这种特定植物的胚。繁殖植物的遗传组成保持不变。产生的胚可以被封装在基质中，从而使所述胚存活，也可以使所述胚生长为整个植物的人工种子。
103.根据这个实施方案，本发明提供了繁殖植物的方法，包括以下步骤：
104.(a1)提供外植体，所述外植体来自植物的组织并且包含至少一个细胞，所述细胞包含具有以下核苷酸序列的表达盒：
105.(i)具有seq id no:1的多肽编码序列或与seq id no:1的序列至少80％相同的编码序列；或
106.(ii)编码具有seq id no:2的氨基酸序列或与seq id no:2的序列至少80％相同的氨基酸序列的多肽，
107.其中所述核苷酸序列与异源组成型调节元件可操作地连接；或
biotechnology,33(5),510-517)；或基于例如tale激活物或dcas9激活物的合成的转录因子可以被引入细胞中，在此其能够结合启动子上或附近的靶向识别位点并激活wus2基因的转录(cheng et al.(2013).multiplexed activation of endogenous genes by crispr-on,an rna-guided transcriptional activator system.cell research,23(10),1163.)；或者可以通过例如敲除(无效突变体)或敲低来减少通过转录后抑制调节wus2基因表达的植物细胞中的microrna(mirna)的量，以增加植物细胞中翻译的wus2多肽的量。
124.根据植物种类以及细胞类型，需要不同水平的基因或表达激活，以便在再生发生时在植物细胞中存在足够量的wus2多肽。本领域技术人员可以使用各种技术来测量内源性或引入基因的实际表达水平，例如qpcr、rt-pcr、northern印迹或微阵列。这些方法允许本领域技术人员通过常规工作来调节wus2基因的表达水平，从而提高来自不同组织或体细胞和生殖细胞(例如小孢子)的再生能力。在优选的实施方案中，在植物细胞中，编码wus2多肽的内源基因的表达水平增加至少2倍、3倍或5倍，优选增加10倍、25倍或50倍，更优选增加100倍、200倍或500倍。
125.如以上进一步描述的，可以通过应用一种或多种激活物或其前体来诱导植物细胞中内源基因的表达水平增强。这些激活物或其前体可以应用于培养植物细胞的培养基，然后被植物细胞主动或被动吸收。此外，一种或多种激活物或其前体可以通过显微注射、电穿孔或基因枪轰击直接引入植物细胞。除了上述合成的转录激活物之外，从现有技术中已知许多其它激活物，其可用于提高内源性基因的表达水平，特别是内源性wus2基因的表达水平。近年来，化学植物遗传学和化学植物生物学的技术领域出现了用小分子处理生物系统以特异性干扰细胞功能。小分子在不同的系统中被商业化用作药物、除草剂和杀真菌剂，但近年来，它们也越来越多地被用作基因调控的工具。例如，化学遗传学涉及通过筛选化合物文库来发现具有各种细胞功能的小分子效应子(dejonghe&russinova(2017).plant chemical genetics:from phenotype-based screens to synthetic biology.plant physiology,pp-01805；kawasumi,m.,&nghiem,p.(2007).chemical genetics:elucidating biological systems with small-molecule compounds.journal of investigative dermatology,127(7),1577-1584.)。这种适合于激活靶基因如wus2的表达的小分子效应子可以通过遵循不同策略的化学筛选来鉴定(dejonghe&russinova，2017)。可以获得综合的化合物文库，其允许对无数小分子进行简单筛选并鉴定可用于激活wus2等基因的基因表达的效应子。如上所述，提高内源性基因如wus2的表达水平的另一种方法是应用所谓的合成的转录激活物。它们通常通过将识别结构域和至少一个激活物结构域的融合来设计。所述识别结构域可以来源于已知的系统，如锌指、tal效应子或crispr；为了激活，将例如单纯疱疹病毒衍生的vp-16或vp-64激活结构域与识别结构域的融合可以引起转录的增加。较弱的激活结构域，如人nf-kb的ad，增添了基因激活的多种选择。此外，如内源性启动子所示，激活物的组合可用于引入协同效应(moore et al.(2014).“transcription activator-like effectors:a toolkit for synthetic biology.”acs synthetic biology,3(10),708-716.；us 2002/0046419 a1；lowder et al.(2017).“multiplexed transcriptional activation or repression in plants using crispr-dcas9-based systems.”plant gene regulatory networks:methods and protocols,167-184.)。合成的转录激活物可以递送到植物细胞，也可以作为前体引入植物细胞，即作为编码这种人工
或合成的转录激活物或其结构域的dna或rna分子，或作为稍后在细胞中或在细胞的特定区室中激活的非活性形式的转录激活物。最后，wus2基因的增强表达也可以通过上游负调节因子的失活或通过产生对这种负调节因子具有抗性的bbm基因的突变版本来实现。
126.根据上述方面，本发明进一步提供了以下项目：
127.[01]一种促进玉米(zea mays)的体细胞胚发生或器官发生的方法，包括以下步骤：
[0128]
(a)提供包含至少一个植物细胞的玉米植物的未成熟胚或成熟胚，以及
[0129]
(b)在所述至少一个植物细胞中引入：
[0130]
(i)包含第一核苷酸序列的表达盒，所述第一核苷酸序列：
[0131]
(i)具有seq id no:1的多肽编码序列或与seq id no:1的序列至少80％相同的序列；或
[0132]
(ii)编码具有seq id no:2的氨基酸序列或与seq id no:2的序列至少80％相同的序列的多肽，
[0133]
其中所述第一核苷酸序列可操作地连接到第一异源调节元件；及
[0134]
(ii1)包含第二核苷酸序列的表达盒，所述第二核苷酸序列：
[0135]
(i)具有seq id no:12的多肽编码序列，或与seq id no:12的序列具有至少80％、优选至少85％、至少90％、更优选至少95％、至少98％或至少99％相同性的序列；或
[0136]
(ii)编码具有seq id no:13的氨基酸序列或与seq id no:13的序列具有至少80％、优选至少85％、至少90％、更优选至少95％、至少98％或至少99％相同性的序列的多肽，
[0137]
其中所述第二核苷酸序列可操作地连接到所述第一异源调节元件或第二异源调节元素；或
[0138]
(ii2)编码多肽的mrna，所述多肽具有seq id no:13的氨基酸序列，或与seq id no:13的序列具有至少80％、优选至少85％、至少90％、更优选至少95％、至少98％或至少99％相同性的序列；或
[0139]
(ii3)具有seq id no:13的氨基酸序列或与seq id no:13的序列具有至少80％、优选至少85％、至少90％、更优选至少95％、至少98％或至少99％相同性的序列的多肽；或
[0140]
(ii4)在所述至少一个植物细胞中诱导内源基因的表达水平增强，所述内源基因编码具有seq id no:13的氨基酸序列或与seq id no:13的序列具有至少80％、优选至少85％、至少90％、更优选至少95％、至少98％或至少99％相同性的序列的多肽，以及
[0141]
(c)从在步骤(b)中获得的细胞或其后代诱导愈伤组织形成；和
[0142]
(d)在促进从愈伤组织中生长出胚和/或枝芽的条件下培养所述愈伤组织，其中在所述愈伤组织中，所述第一多肽从表达盒中表达，以及所述第二多肽从表达盒中表达，由引入的mrna翻译，由所述内源基因增强表达，或者被呈递。
[0143]
[02]根据项目[01]的方法，其中所述第一和第二异源调节元件选自组成型启动子、诱导型启动子或诱导型表达系统。
[0144]
[03]根据项目[01]或[02]所述的方法，其中在步骤(b)中，所述表达盒的引入导致其稳定地整合到所述至少一个植物细胞的基因组中或其后代细胞基因组中。
[0145]
[04]根据项目[01]至[03]中任一项所述的方法，其中步骤(d)中的培养是在不含
植物激素的培养基中进行。
[0146]
[05]根据项目[01]至[04]中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括农杆菌介导的转化、粒子轰击、电穿孔或显微注射。
[0147]
[06]根据项目[01]至[05]中任一项所述的方法，还包括以下步骤：
[0148]
(i)将至少一个感兴趣的核苷酸序列引入到步骤(b)中使用的所述至少一个植物细胞或其前体中，或引入到步骤(b)中获得的细胞中，和/或
[0149]
(ii)修饰步骤(b)中使用的所述至少一个植物细胞或其前体的基因组或在步骤(b)中获得的细胞的基因组，通过在所述细胞中引入单链dna断裂(ssb)诱导酶或双链dna断裂(dsb)诱导酶，其优选识别所述细胞基因组中的预定位点，及任选的修复核酸分子，或者通过引入单链dna断裂(ssb)诱导酶，其优选识别所述细胞基因组中的预定位点，并与碱基编辑器酶融合，
[0150]
其中所述基因组的修饰选自：
[0151]
i.至少一个核苷酸的置换；
[0152]
ii.至少一个核苷酸的缺失；
[0153]
iii.至少一个核苷酸的插入；
[0154]
iv.上述i至iii的任何组合。
[0155]
[07]一种从愈伤组织再生玉米植物的方法，包括根据项目[01]至[05]中任一项的方法的体细胞胚发生或器官发生，任选根据项目[06](i)或(ii)的转化或基因组修饰，以及从根据项目[01]至[05]中任一项的方法的步骤(d)获得的胚和/或枝芽再生植物，特别是根据项目[06]的方法的步骤(i)获得转基因植物和/或根据项目[06]的方法的步骤(ii)获得修饰的植物。
[0156]
[08]通过项目[07]所述的方法获得或可获得的转基因玉米植物或其后代植物。
[0157]
[09]通过项目[07]所述的方法获得或可获得的经修饰的玉米植物或其后代植物。
[0158]
[10]根据项目[08]所述的植物细胞或植物种子，其中所述植物细胞或种子包含作为转基因的所述至少一个感兴趣的核苷酸序列。
[0159]
[11]根据项目[09]的植物细胞或植物种子，其中所述植物细胞或种子包含基因组中的修饰。
[0160]
通过纯生物学方法获得的细胞、植物、后代植物和植物部分不是本发明的主题。
[0161]
[12]第一核酸和第二核酸在直接或间接再生玉米植物的方法中、在转化玉米植物细胞的方法中、或在修饰玉米植物植物细胞的基因组的方法中的用途，
[0162]
所述第一核酸包含以下核苷酸序列：
[0163]
(i)具有seq id no:1的多肽编码序列或与seq id no:1的序列至少80％相同的序列；或
[0164]
(ii)编码具有seq id no:2的氨基酸序列或与seq id no:2的序列至少80％相同的序列的多肽；
[0165]
第二核酸包含以下核苷酸序列：
[0166]
(i)具有seq id no:12的多肽编码序列或与seq id no:12的序列至少80％相同的序列；或
[0167]
(ii)编码具有seq id no:13的氨基酸序列或与seq id no:3的序列至少80％相同
的序列的多肽。
[0168]
除非在实施例中另有说明，否则所有重组dna技术均根据如下所述标准方案进行：sambrook et al.(1989)molecular cloning:a laboratory manual,second edition,cold spring harbor laboratory press,ny及volumes 1and 2of ausubel et al.(1994)current protocols in molecular biology,current protocols,usa。植物分子研究的标准材料和方法描述于r.d.d.cray的plant molecular biology labfax(1993)，由bios scientific publications ltd(uk)和blackwell scientific publications,uk联合出版。标准分子生物学技术的其它参考文献包括sambrook and russell(2001)molecular cloning:a laboratory manual,third edition,cold spring harbor laboratory press,ny；volumes i and ii of brown(1998)molecular biology labfax,second edition,academic press(uk)。聚合酶链反应的标准材料和方法可见于dieffenbach and dveksler(1995)pcr primer:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press及mcpherson at al.(2000)pcr-basics:from background to bench,first edition,springer verlag,germany。
[0169]
本文提及或引用的所有专利、专利申请、出版物或公开披露(包括互联网上的出版物)均以引用的方式整体并入本文。
[0170]
本发明将参照本文描述的以下附图和实施例进行进一步描述。然而，应当理解，本发明不限于这样的实施例。
附图说明
[0171]
图1：在具有和不具有dex可诱导的bbm-gr表达的甜菜中的枝芽形成。a：在不施用dex诱导剂的情况下无枝芽形成；b：在用dex诱导剂处理后形成许多枝芽(箭头所指)。
[0172]
图2：dex可诱导的35s bnbbm-gr植物看起来与从没有转基因的组织培养物中再生的对照植物(对照)相当。
[0173]
图3：在顺从(amenable)和顽拗基因型中，bnbbm提高了甜菜中基于愈伤组织的转化效率(转化率的量化)。a：诱导型系统-对照组、不含dex诱导剂的bnbbm-gr和含dex诱导剂的bbbm-gr之间再生植物百分比的比较。b：组成型过表达-对照组和35s bnbbm过表达之间的比较。在a和b中用在组成型启动子下的tdt表达构建体转化的甜菜植物用作对照。
[0174]
图4：35s bnbbm(组成型表达)产生胚(b，箭头指示胚(e))和幼苗(c，箭头指示根(r)和幼苗(s))，而甜菜的标准基于愈伤组织的转化只产生枝芽(a，箭头指示来源于器官发生的枝芽，但没有根(s*))。利用35s bnbbm表达可以产生总共很多转基因事件(d)。
[0175]
图5：35s bnbbm植物从叶连续产生胚样结构(箭头所指)。
[0176]
图6：35s bnbbm在无激素培养基上主要产生胚(b)，而在含有激素的正常再生培养基上产生枝芽和胚(a)。
[0177]
图7：bnbbm-gr直接从叶触发再生(在dex培养基培养3周后；(b)；箭头指示枝芽)。对照(a)是来源于用dex可诱导的35s-bnbbm-gr系统转化的但在不含dex诱导剂的培养基中培养的植物的植物材料。
[0178]
图8：如实施例6所述直接从叶再生的植物显示出正常形态。
[0179]
图9：bnbbm打破了甜菜中的顽拗性。顽拗基因型的35s:bnbbm过表达的愈伤组织
(b)，与相同基因型的没有bnbbm过表达的对照愈伤组织(a)的比较。箭头指示枝芽。c：如b所示的顽拗基因型的再生的转基因植物。
[0180]
图10：在两种不同的基因型(顺从型(左)和顽拗型(右))中，具有载体70s-tdt的对照构建体相对于用载体35s::bnbbm-gr和具有可诱导bnbbm的载体70s-tdt共转化的比较。
[0181]
图11：在基因枪递送(biolistic delivery)后组成型zmwus2过表达与组成型bnbbm过表达组合促进玉米再生。箭头指示荧光胚结构。
[0182]
图12：ipr232-ps-01载体图。
[0183]
图13：ipr252-ps-01载体图。
[0184]
图14：ipr 252-pk-02载体图。
[0185]
图15：在无激素培养基上和使用bnbbm再生的体外to植物显示出正常的根系发育。
[0186]
图16：在无激素培养基中通过bnbbm的胚发生。a：含有激素的培养基；b：不含激素的培养基。通过改变培养基组分，即完全去除ga3和bap，体细胞胚形成显著增加。
[0187]
图17：来自无激素培养基的幼苗和来自有激素的培养基的枝芽的比较。a：在含有植物激素ga3和bap的培养基上再生的枝芽；b：在无激素培养基上再生的幼苗。
[0188]
图18：在没有激素的培养基上生长的幼苗(a和b)，发育正常的根系，左：俯视图；右：仰视图。
[0189]
图19：通过粒子轰击获得的转基因35s bnbbm-gr植物。a：体外培养的幼苗(左：俯视图；右：仰视图)；b：转移到温室后的小植株。
[0190]
图20：来源于无激素方案的植物发育出强健的根系。
[0191]
图21：来源于无激素方案的植物发育出正常的地上部分(转移到温室一个月后)。
[0192]
图22：在温室4个月后主根(植物1)的形态分析。
[0193]
图23：在温室4个月后主根(植物2)的形态分析。
[0194]
图24：来自无激素转化方案的转基因植物的分析。
[0195]
a.光合作用速率[μe]；
[0196]
b.主根的蔗糖浓度[μmol/g]。
[0197]
图25：35s-bnbbm-gr植物是可育的(一步成苗(one-seedling)方案)。
[0198]
a.每株植物的种子产量(kg)；
[0199]
b.每株植物产生的活种子。
[0200]
图26：种子产量对比。
[0201]
图27：在温室中发育4个月后的主根比较。
[0202]
a.种子衍生的植物的主根；
[0203]
b.通过无激素转化获得的植物的主根。
[0204]
图28：野生型种子衍生的植物和得自无激素转化方案的转基因植物的主根参数。
[0205]
a.种子衍生的野生型植物和得自无激素转化方案的转基因35s-bnbbm-gr植物的主根重量(g)比较；
[0206]
b.种子衍生的野生型植物和得自无激素转化方案的转基因35s-bnbbm-gr植物的蔗糖含量(pmol/g fw)比较。
[0207]
图29：sdn-1杂交体田间试验的概念性节省时间。
实施例
[0208]
1.bnbbm的表达
[0209]
bnbbm诱导表达的原理是基于大鼠糖皮质激素受体结构域与转录因子bnbbm的融合(bnbbm-gr)。在用地塞米松诱导后，gr受体结构域将改变构象，从而使bnbbm-gr蛋白进入细胞核并产生所需的反应。
[0210]
二元质粒ipr232-ps-01和ipr252-ps-01由kws按照标准克隆程序产生。t-dna还含有新霉素磷酸转移酶ii(nptii)基因，该基因赋予对一系列氨基糖苷类抗生素如卡那霉素或巴龙霉素的抗性，并用于选择转基因植物细胞和组织。nos启动子和pag7终止子位于nptii基因的侧翼。二元载体的骨架含有分别用于在大肠杆菌和根癌农杆菌中进行质粒复制的cole1和pvs1起点；以及赋予链霉素i大观霉素抗性用于细菌选择的aada基因。
[0211]
通过标准程序将二元质粒转化到agl-1农杆菌菌株中。
[0212]
2.dex诱导的35s bnbbm-gr在含激素的组织培养基中增强从甜菜愈伤组织的枝芽形成
[0213]
通过采用以下方法诱导甜菜愈伤组织：以微繁殖枝芽为起始材料。将枝芽在含有ms盐、30g/l蔗糖、0.25mg/l苄基腺嘌呤(bap)和10g/l琼脂(ph 6.0)的培养基中增殖。为了诱导松散型(friable)愈伤组织，将叶外植体在含有ms盐、15g/l蔗糖、2mg/l bap和8g/l琼脂(ph6.0)的培养基中培养7-8周。
[0214]
对于农杆菌介导的转化，将松散型愈伤组织置于含有ms盐、30g/l蔗糖、1mg/l ga3、1mg/l tdz和10g/l琼脂(ph 6.0)的培养基中，并在24℃避光保持1周。将携带ipr232-ps-01载体的农杆菌(图12)在含有5g/l胰蛋白胨、2.5g/l酵母提取物、1g/l nacl、5g/l甘露醇、0.1g/l mgso4×
7h2o、0.25g/l kh2po4、1g/l谷氨酸(ph 7.0)并补充适当抗生素的培养基中在28℃生长24小时。
[0215]
为愈伤组织以od
600
＝0.3接种农杆菌悬浮液，将愈伤组织和农杆菌在含有440mg/l cacl2×
2h2o、170mg/l kh2po4、1.9g/l kno3、180.7mg/l mgsc、1.65g/l nh4no3、2mg/l bap、40pg/l乙酰丁香酮、20g/l蔗糖、2g/l葡萄糖和10g/l琼脂(ph 6.0)的培养基上在21℃避光培养3天。
[0216]
将愈伤组织在含有ms盐(duchefa#0222)、30g/l蔗糖、1mg/l ga3、1mg/l tdz、500mg/l timentin和10g/l琼脂(ph 6.0)的培养基中传代培养，并在24℃避光温育1周。
[0217]
为了选择转基因愈伤组织，将样品转移到含有ms盐(duchefa#0222)、30g/l蔗糖、1mg/l ga3、1mg/l tdz、500mg/l timentin、10g/l琼脂(ph 6.0)和100mg/l巴龙霉素的培养基中。将1pm地塞米松(dex)加入到用于诱导bnbbm-gr蛋白的选择培养基中。
[0218]
bnbbm的诱导表达原理是基于大鼠糖皮质激素受体结构域(gr)与转录因子bnbbm的融合(bnbbm-gr)。在用地塞米松(dex)诱导后，gr受体结构域将改变构象，从而使bnbbm-gr蛋白进入细胞核并产生所需的反应。
[0219]
分离再生枝芽并在在含有ms盐、30g/l蔗糖、0.25mg/l苄基腺嘌呤(bap)、100mg/l卡那霉素和10g/l琼脂(ph 6.0)的培养基中繁殖。从在温室生长的枝芽分离叶外植体，进行dna提取和pcr分析，以确认转基因的存在。选择的枝芽在含有ms盐、30g/l蔗糖、6.25mg/l naa和10g/l琼脂(ph 6.0)的培养基中生根，并转移到温室中进行种子生产。
[0220]
图1显示，使用dex，许多枝芽由愈伤组织形成(b)，而没有dex，只有很少或没有枝
芽形成(a)。与非转基因野生型植物(对照)相比，从dex诱导的枝芽形成中获得的转基因植物在土壤中生长表现出相似的形态(见图2)。
[0221]
因此，与不含dex的培养基相比，在dex培养基上甜菜愈伤组织的枝芽形成增加。在土壤上未经诱导的转基因35s-bnbbm-gr植物确实未表现出明显的表型。
[0222]
3.bnbbm显著提高了甜菜愈伤组织转化效率
[0223]
对于转化率的定量a)，已经对于顺从型基因型和顽拗型基因型测试了如上述基于dex/gr的诱导型bnbbm系统以及bnbbm的组成型过表达。作为对照，用携带荧光标记基因tdtomato的载体转化相应的基因型。
[0224]
a)如上所述，在培养基中添加和不添加dex的情况下测试诱导型bnbbm系统。图3a显示了从诱导枝芽生长的再生转基因植物的定量。显然，通过dex诱导，转基因植物形成的频率显著增加。在这两种基因型中，观察到转化效率增加了7至8倍，在顽拗型基因型中达到约18％，在顺从型2基因型中高达约70％。
[0225]
b)对于在camv 35s启动子控制下的bnbbm的组成型过表达，通过计数每个平板获得的转基因植物来确定转化效率(关于详细的转化方案见实施例4)。产生的转基因植物是从枝芽(来源于器官发生)或从愈伤组织产生的胚(来源于胚发生)中生长的(图9)。图3b显示了非常相似的趋势。组成型表达bnbbm的转化效率对于顺从型基因型和顽拗型基因型增加了至少十倍。
[0226]
因此，由于bnbbm-gr与dex的组合，基于愈伤组织的转化，在适应性和难抗性基因型中，基于愈伤组织的转化效率显著提高。在甜菜基因型中打破顽拗性的类似结果也通过组成型表达获得。
[0227]
4.组成型(过)表达产生胚和幼苗
[0228]
除了使用了载体ipr252-ps-01代替ipr232-ps-01载体之外，使用了与实施例2中描述的相同的转化方案。作为阴性对照，已经产生了实施例2中所述的愈伤组织，但没有发生农杆菌感染。为了进行枝芽诱导和繁殖，收获愈伤组织并将其转移到含有ms盐、30g/l蔗糖、1mg/l ga3、1mg/l tdz和10g/l琼脂(ph 6.0)的枝芽诱导培养基中。将愈伤组织在24℃的光/暗周期(16小时/8小时)中温育1-2周。将再生的枝芽置于含有ms盐、30g/l蔗糖、0.25mg/l bap和10g/l琼脂(ph 6.0)的培养基中并培养，使植物在24℃的光/暗周期(16小时/8小时)条件下生长。
[0229]
至于诱导型表达，即使是bnbbm的组成型表达也会引起胚和幼苗的发育(见图4b和c)，而甜菜的标准的基于愈伤组织的转化只产生枝芽(见图4a)。这表明bnbbm的组成型表达触发胚发生和器官发生。与对照相比，可以产生许多转基因事件(图4d)。
[0230]
因此，bnbbm在甜菜中的组成型和诱导型表达形成体细胞胚和枝芽，而标准的基于愈伤组织的转化仅产生枝芽。
[0231]
5.35s bnbbm植物持续从叶产生胚
[0232]
来源于不同bnbbm过表达品系的叶材料显示出在叶上连续产生胚的现象(图5)。这些胚可以被分离并生长成整株植物。因此，这种方法可以用于单个高价值植物的快速繁殖。
[0233]
因此，具有bnbbm组成型表达的植物从叶连续产生胚。
[0234]
6.在无激素培养基上的组成型(过)表达
[0235]
除了未给培养基提供植物激素tdz和ga3之外，使用了与实施例4中所述相同的方
案。
[0236]
从具有bnbbm组成型表达的愈伤组织中，在无激素培养基上主要可以获得胚(图6b)。当这种组织被置于含有激素的正常再生培养基上时，产生枝芽和胚(图6a)。
[0237]
7.枝芽从叶中的直接再生
[0238]
如实施例2中所述，从甜菜dex诱导的35s-bnbbm-gr转基因植物切下叶材料。将叶材料在dex和含激素的培养基上培养。在培养基上培养3周后，bnbbm触发叶材料的枝芽再生(图7)。尚未观察到胚生成。
[0239]
从培养的叶段再生的植物没有表现出明显的表型(图8)。
[0240]
8.与诱导型bnbbm的共转化
[0241]
对于共转化，将携带每种感兴趣载体的农杆菌以1:1的比例混合(载体35s::bnbbm-gr和载体70s-tdt)。用获得的农杆菌悬浮液接种愈伤组织。将愈伤组织和农杆菌在21℃避光培养3天，随后如实施例2中所述进行传代培养。共转化显示出植物组织的再生能力显著提高，从而在顺从型和顽拗型基因型中产生更有效的共转化率(图10)。此外，如果bnbbm已经表达，则提前三周获得共转化体。对于与35s bnbbm和载体70s-tdt的共转化获得了相同的结果。
[0242]
共转化效率的提高对于共转化植物细胞的植物基因组的靶向修饰的基因组编辑组分的共递送具有特别重要的意义。通过共递送crispr/cpf1系统，在与bnbbm和所述基因组编辑组分共转化后成功获得sdn-1事件。
[0243]
9.使用bnbbm和避免使用激素在to水平上对主根(贮藏器官)的发育产生积极影响
[0244]
对于甜菜，特别是甜菜或红甜菜，从愈伤组织体外再生的植物总是表现出非典型表型，特别是关于下胚轴和根。通常，没有发育出正常的根体，因此例如甜菜或红甜菜的to世代不可用于测试根相关性状，例如糖积累、线虫抗性、甜菜丛根病抗性等或启动子表达分析。令人惊讶的是，本发明人发现，通过bnbbm诱导但不含激素再生的植物发育出正常的主根。因此，根相关性状的表型分析和贮藏根成分的分析在to水平上是可能的。图15显示了用诱导型bnbbm和不经激素处理再生的to植物。
[0245]
10.玉米的基因枪递送方法
[0246]
通过微粒轰击，一个或多个的增强基因(boost gene)、增强多肽(booster polypeptide)、基因组工程组分和/或转基因通过金粒子被共同递送到玉米的未成熟胚中。基因枪递送根据wo 2019/238911a1中描述的方案进行。
[0247]
可以使用例如bio-rad pds-1000/he粒子枪或手持式helios基因枪系统将增强基因、增强多肽、基因组工程组分和/或转基因递送到靶细胞中。不止一种构建体可以与基因组工程组分同时共同递送到靶细胞中。对于玉米植物的基因枪转化，使用质粒ipr252-pk-02(图14)。
[0248]
图11显示了zmwus2、bnbbm和荧光标记物tdt的基因枪共递送。轰击一个月后，荧光胚性结构形成，这表明bnbbm与zmwus2组合促进了从不成熟胚再生玉米。
[0249]
11.植物在有激素和无激素培养基上的发育
[0250]
将甜菜愈伤组织用35s bnbbm-gr转化，并将其置于含有激素(ga3和bap)或不含激素的标准培养基上。通过省略激素ga3和bap作为培养基组分，与在含有激素的培养基上培养的愈伤组织相比，体细胞胚形成更明显(图16a和b)。在标准方案中，枝芽的发育是清晰可
见的。在随后的发育中，在无激素培养基上培养的胚衍生的幼苗发育出正常的根系(图17b)，而在含有激素的培养基上培育的枝芽没有根系(图17a)。这种植物发育方案也被称为一步成苗(one-seedling)方案。
[0251]
图18a和图18b中，示出植物是由在无激素培养基上生长的幼苗发育而成。这些植物没有明显的表型，在没有人工诱导根系生长的情况下发育成正常根系。
[0252]
可以证实，通过农杆菌转化(见图16-18)以及粒子轰击(图19)可以实现对bnbbm的这种有益作用。通过粒子轰击转化获得的转基因35s bnbbm-gr植物在体外也发育出合适的根系(图19a)。在转移到温室后，这些植物不会发展出明显可见表型(图19b)，并且具有类似于通过农杆菌介导的转化获得的植物的外观。
[0253]
12.植物转移到土壤中并在温室中培育后的发育
[0254]
根据发育状况，在1至3个月后将植物从无激素培养基转移到土壤中，并在温室中培育1个月。在图20中，显示了这种甜菜植物的根系，其是由生长在无激素培养基上的幼苗发育而成的。所述植物表现出强健的根系，并且这些植物的地上部分发育为没有明显的表型(图21)。
[0255]
在温室中4个月后，对主根的形态进行了评估。在横截面中，观察主根形态的总体大小以及总体外观无明显异常(图22和23)。除了主根形态，还分析了光合作用速率(图24a)和主根中的蔗糖浓度(图24b)。
[0256]
如图24a所示，对于三种植物，每天测定两次光合作用速率。所有结果均约在15microeinstein至25microeinstein范围内。
[0257]
在图24b中，三种不同植物的主根中蔗糖含量的结果以pmol/g表示，结果在475至505μmol/g之间。
[0258]
淀粉和可溶性糖含量
[0259]
提取：将植物材料用80％乙醇在80℃下提取1h。可溶性糖溶于乙醇。将提取物在真空离心机的帮助下干燥，并将材料在水中分解。如果剩余的提取材料尚未被乙醇提取，则将其研磨，并再次用0.2n koh在95℃下提取1小时。淀粉在这个步骤中部分水解并溶解。在将样品冷却至室温后，加入1m乙酸以将ph设定为5-6。通过加入适量的淀粉葡萄糖苷酶和α-淀粉酶，在37℃下培养至少4小时，并在室温下过夜，淀粉被降解为葡萄糖。
[0260]
浓度测定：使用任何类型的光度计，通过组合的光学-酶学测试，使用水溶液测量葡萄糖、果糖、蔗糖和淀粉(通过葡萄糖测定)的浓度。测量缓冲液含有100mm hepes ph7.4、1mm nad、2mm atp、10mm mgcl2和适量的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。在加入水相提取物之后，在l＝340nm(0值)波长测量消光度/吸光度。为了测量葡萄糖，加入适量的己糖激酶并测量足够长的时间，以将所有葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸，将果糖转化为果糖-6-磷酸。为了测量果糖，加入适量的磷酸葡萄糖异构酶，将所有的果糖-6-磷酸转化为葡萄糖-6-磷酸。为了测量蔗糖，加入适量的果糖苷酶(β-果糖苷酶)，将蔗糖完全分解为葡萄糖和果糖，进而进一步转化为葡萄糖-6-磷酸中间体。每当在这一系列酶反应中产生葡萄糖-6-磷酸时，其会被进一步氧化为葡萄糖酸-6-磷酸，同时nad被还原为nadh。后一种还原给出了相应浓度的读数，因为nad不吸收340nm波长的光，而nadh吸收。借助于nadh在340nm的消光系数和lambert beer定律引用，可以计算溶液中nadh的浓度。已知葡萄糖和果糖会产生等摩尔浓度的nadh，可以计算出这两种糖的浓度。对于1摩尔蔗糖，形成2摩尔nadh。通过还已知所述方法中使用
的液体的样品重量和体积，可以根据测量的浓度计算葡萄糖、果糖、蔗糖和淀粉的量(以己糖摩尔单位/质量计)。
[0261]
所述来自无激素转化的植物的数据在种子衍生植物的正常范围内。
[0262]
通过无激素转化方案获得的转基因35s bnbbm-gr植物显示出正常发育和适当发育的根系，此外，这些植物也是可育的，如图25所示。从5种不同的转基因植物中测定了每株植物的种子重量(单位：kg)(图25)，此外还计算了每株植物的活种子(图25)。
[0263]
4株植物的种子重量结果约为0.015kg/株植物，其中一株植物有近0.045kg的种子。从所有5种测试植物中获得了活种子；然而结果显示，每株植物30个活种子至每株植物1100个活种子的一定范围。
[0264]
在图26中，在植物之间比较每株植物的活种子数量，所述植物是通过不含bnbbm的标准基于农杆菌转化获得的植物、所述含bnbbmm的无激素转化方法获得的植物，以及作为参考的衍生自sb系9bs0448种子的植物。结果表明，转基因35s bnbbm-gr植物的种子产量高于通过标准基于农杆菌转化方法获得的植物的种子产量。
[0265]
13.来自在无激素环境中衍生的第二批植物的主根的分析
[0266]
在温室中生长4个月后，从种子衍生的甜菜植物或从实施例9衍生的转基因35s bnbbm-gr植物收获主根。如图27和图28所示，未发现明显差异。
[0267]
此外，对主根重量(图28)以及蔗糖含量(pmol/g fw(鲜重))(图28)进行了分析。在图28a中，显示了wt(野生型)种子衍生植物和来自无激素方法的转基因35s bnbbm-gr的根重。结果在大约100-350g之间变化。已经测定蔗糖含量值在350-520pmol/g fw之间。
[0268]
总之，这些结果表明，来自所述无激素方案的转基因植物的主根重量以及蔗糖含量与源自种子的野生型对照相当。
[0269]
序列：
[0270]