一种采用非衍生化的HPLC法测定L-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质的方法与流程

一种采用非衍生化的hplc法测定l-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质的方法
技术领域
1.本发明属于药物检测领域，具体涉及一种采用非衍生化的hplc法测定l-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质的方法。


背景技术：

2.l-丙氨酸异丙酯盐酸盐是一种手性氨基酯的盐酸盐，英文名为l-alanine isopropyl ester hydrochloride，是抗病毒原料药泰诺福韦艾拉酚胺(也称为：富马酸丙酚替诺褔韦，简称：taf)的关键起始原料，同时也是索非布韦的中间体,其化学结构式如下：
[0003][0004]
l-丙氨酸异丙酯盐酸盐及其杂质在紫外波长吸收弱，同时由于杂质与主成分具有相似的化学结构，这些杂质会参与后续反应在原料药taf成品中生成一系列衍生杂质，这些杂质在taf成品中很难清除。影响药品使用安全的主要因素就是杂质的控制和研究，为了确保药品安全性，杂质必须充分研究。
[0005]
目前l-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质(l-丙氨酸、l-丙氨酸甲酯盐酸盐、l-丙氨酸乙酯盐酸盐、l-丙氨酸叔丁酯盐酸盐)分析方法多为衍生方法。比如采用邻苯二甲醛(opa)柱前在线衍生hplc法，或采用fmoc-osu进行衍生。采用opa柱前衍生，使供试液与衍生试剂在进样前，在线自动化混合，完成衍生，该方法对试验仪器设备有要求，且衍生产物不稳定。因此建立一个快速、便捷、精准的l-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质的高效液相色谱分析方法十分必要。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于提供一种快速、便捷、精准的采用非衍生化的hplc法测定l-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质的方法。
[0007]
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008]
一种采用非衍生化的hplc法测定l-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质的方法(l-丙氨酸异丙酯盐酸盐记为laie，所述有关物质为l-丙氨酸、l-丙氨酸甲酯盐酸盐、l-丙氨酸乙酯盐酸盐、l-丙氨酸叔丁酯盐酸盐，分别记为laie-a、laie-b、laie-c、laie-e)，包括以下步骤：
[0009]
(1)制备供试品溶液
[0010]
取l-丙氨酸异丙酯盐酸盐，加流动相a溶解并定量稀释制成每1ml中含50
±
1mg l-丙氨酸异丙酯盐酸盐的溶液。
[0011]
(2)制备贮备液
[0012]
laie贮备液：取laie对照品25mg，置10ml量瓶中，加流动相a溶解并稀释至刻度，摇
匀；
[0013]
laie-a贮备液：取laie-a对照品500mg，置20ml量瓶中，加流动相a溶解并稀释至刻度，摇匀；
[0014]
laie-b贮备液：取laie-b对照品25mg，置10ml量瓶中，加流动相a溶解并稀释至刻度，摇匀；
[0015]
laie-c贮备液：取laie-c对照品25mg，置10ml量瓶中，加流动相a溶解并稀释至刻度，摇匀；
[0016]
laie-e贮备液：取laie-e对照品25mg，置10ml量瓶中，加流动相a溶解并稀释至刻度，摇匀；
[0017]
(3)制备系统适用性溶液
[0018]
取laie对照品、laie-a对照品、laie-b对照品、laie-c对照品、laie-e对照品，加流动相a溶解并稀释制成每1ml中含laie 50mg，含laie-a2.5mg，含laie-b、laie-c、laie-e各0.25mg的混合溶液，摇匀；
[0019]
(4)制备定位溶液
[0020]
laie定位溶液：量取laie贮备液1ml，置10ml量瓶中，加流动相a稀释至刻度，摇匀；
[0021]
laie-a定位溶液：量取laie-a贮备液1ml，置10ml量瓶中，加流动相a稀释至刻度，摇匀；
[0022]
laie-b定位溶液：量取laie-b贮备液200μl，置10ml量瓶中，加流动相a稀释至刻度，摇匀；
[0023]
laie-c定位溶液：量取laie-b贮备液200μl，置10ml量瓶中，加流动相a稀释至刻度，摇匀；
[0024]
laie-e定位溶液：量取laie-b贮备液200μl，置10ml量瓶中，加流动相a稀释至刻度，摇匀；
[0025]
(5)高效液相色谱法试验：
[0026]
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以20mm六氟磷酸钾:乙腈＝95:5为流动相a，以乙腈为流动相b，柱温为30
±
5℃，检测波长为210
±
2nm，流速为0.4
±
0.01ml/min，进样体积为5
±
0.1μl，精密量取上述供试品溶液、系统适用性溶液、各定位溶液，注入液相，记录色谱图。
[0027]
高效液相色谱法试验中，梯度洗脱如下：
[0028][0029]
优选地，柱温为30℃，检测波长为210nm，流速为0.4ml/min，进样体积为5μl。
[0030]
进一步地，所述20mm六氟磷酸钾的制备方法为：取六氟磷酸钾3.68g，加水溶解并稀释至1000ml，用磷酸调节ph值至2.0
±
0.05。
[0031]
供试品溶液色谱图中的杂质峰应满足以下条件：按峰面积归一化计算，laie-进一步地，供试a不得超过5.0％，laie-b、laie-c、laie-e均不得超过0.1％，其他单个杂质不得超过0.5％，总杂不得超过5.0％，小于总峰面积0.02％的色谱峰忽略不计。
[0032]
本发明提供了一种未经衍生的hplc方法，该方法所用色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(推荐为gl sciences inertsil ods-3，150mm
×
4.6mm，3μm或效能相当的色谱柱)，以20mm六氟磷酸钾:乙腈(95:5)为流动相a，以乙腈为流动相b，梯度洗脱，样品不经衍生直接进样，简化了反应操作，同时避免了产品降解和衍生不完全。
[0033]
本发明所述的高效液相色谱分析方法，采用梯度洗脱，实现了l-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质(l-丙氨酸、l-丙氨酸甲酯盐酸盐、l-丙氨酸乙酯盐酸盐、l-丙氨酸叔丁酯盐酸盐)在色谱柱上的有效分离，该方法专属性强、灵敏度高、精密度好、可以快速，便捷，精准的对l-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质进行测定。
附图说明
[0034]
图1为laie-a的标准曲线图。
[0035]
图2为laie-b的标准曲线图。
[0036]
图3为laie-c的标准曲线图。
[0037]
图4为laie-e的标准曲线图。
[0038]
图5为laie的标准曲线图。
[0039]
图6为供试品溶液有关物质色谱图。
具体实施方式
[0040]
本发明涉及的主要仪器设备
[0041]
thermo高效液相色谱仪配vanquish core tuv cad、agilent高效液相色谱仪、工作站waters-empower3
[0042]
试剂与药品：
[0043]
六氟磷酸钾(ar)、乙腈(色谱纯)、磷酸(分析纯)、水(纯化水)、l-丙氨酸对照品、l-丙氨酸甲酯盐酸盐对照品、l-丙氨酸乙酯盐酸盐对照品、l-丙氨酸叔丁酯盐酸盐对照品、l-丙氨酸异丙酯盐酸盐(样品)。
[0044]
20mm六氟磷酸钾：取六氟磷酸钾约3.68g，加水溶解并稀释至1000ml，用磷酸调节ph值至2.0
±
0.05。
[0045]
一、色谱条件
[0046]
1.以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(推荐为gl sciences inertsil ods-3，150mm
×
4.6mm，3μm或效能相当的色谱柱)。
[0047]
2.流动相：以20mm六氟磷酸钾-乙腈(95:5)为流动相a，以乙腈为流动相b。
[0048]
3.流速为每分钟0.4ml。
[0049]
4.检测波长为210nm。
[0050]
5.柱温为30℃。
[0051]
6.进样体积5μl。
[0052]
7.梯度洗脱
[0053][0054][0055]
二、溶液制备
[0056]
1.供试品溶液：取l-丙氨酸异丙酯盐酸盐适量，加流动相a溶解并定量稀释制成每1ml中约含50mgl-丙氨酸异丙酯盐酸盐的溶液。
[0057]
2.系统适用性溶液：取l-丙氨酸异丙酯盐酸盐对照品及l-丙氨酸(laie-a)、l-丙氨酸甲酯盐酸盐(laie-b)、l-丙氨酸乙酯盐酸盐(laie-c)、l-丙氨酸叔丁酯盐酸盐(laie-e)对照品各适量，加流动相a溶解并稀释制成每1ml中含l-丙氨酸异丙酯盐酸盐50mg，含laie-a2.5mg，含laie-b、laie-c、laie-e各0.25mg的混合溶液，摇匀。
[0058]
3.系统适用性要求：系统适用性溶液色谱图中，各色谱峰之间的分离度应符合规定。
[0059]
三、测定方法
[0060]
精密量取供试品溶液和系统适用性溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。
[0061]
四、计算方法及接受限度
[0062]
供试品溶液色谱图中如有杂质峰，按峰面积面积归一化计算，laie-a不得超过5.0％，laie-b、laie-c、laie-e均不得超过0.1％，其他单个杂质不得超过0.5％，总杂不得超过5.0％，小于总峰面积0.02％的色谱峰忽略不计。
[0063]
本发明所述的高效液相色谱分析方法，采用梯度洗脱，实现了l-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质(l-丙氨酸、l-丙氨酸甲酯盐酸盐、l-丙氨酸乙酯盐酸盐、l-丙氨酸叔丁酯盐酸盐)在色谱柱上的有效分离。
[0064]
本发明的分析方法对其系统适用性、专属性、溶液稳定性、线性范围、检测限与定量限、准确度、重复性、中间精密度、耐用性进行了验证，分析方法验证符合要求。
[0065]
实施例1色谱条件的选择
[0066]
波长的选择
[0067]
稀释剂：20mm六氟磷酸钾-乙腈(95:5)
[0068]
l-丙氨酸异丙酯盐酸盐溶液配制：称取l-丙氨酸异丙酯盐酸盐约10mg，置10ml量瓶中，加上述稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0069]
取l-丙氨酸异丙酯盐酸盐溶液作为供试品，稀释剂为空白校正液，按照紫外-可见分光光度法(中国药典2020版)于190nm-400nm进行扫描。结果显示供试品溶液在210nm处有最大吸收峰，因此将210nm确定为检测波长。
[0070]
实施例2专属性、系统适用性
[0071]
色谱条件：
[0072]
1.以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(推荐为gl sciences inertsil ods-3，150mm
×
4.6mm，3μm或效能相当的色谱柱)。
[0073]
2.流动相：以20mm六氟磷酸钾-乙腈(体积比95:5)为流动相a，以乙腈为流动相b。
[0074]
3.流速为每分钟0.4ml。
[0075]
4.检测波长为210nm。
[0076]
5.柱温为30℃。
[0077]
6.进样体积5μl。
[0078]
7.梯度洗脱
[0079][0080]
溶液配制：
[0081]
溶剂：流动相a
[0082]
laie贮备液：取laie对照品约25mg，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0083]
laie-a贮备液：取laie-a对照品约500mg，置20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得laie-a贮备液。
[0084]
laie-b贮备液：取laie-b对照品约25mg，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得laie-b贮备液。
[0085]
laie-c贮备液：取laie-c对照品约25mg，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得laie-c贮备液。
[0086]
laie-e贮备液：取laie-e对照品约25mg，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得laie-e贮备液。
[0087]
系统适用性溶液：称取laie工作对照品约500mg，置10ml容量瓶中，量取laie-a贮备液、laie-b贮备液、laie-c贮备液、laie-e贮备液各1ml，置同一10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
[0088]
laie定位溶液：量取laie贮备液1ml，置10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。
[0089]
laie-a定位溶液：量取laie-a贮备液1ml，置10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。
[0090]
laie-b定位溶液：量取laie-b贮备液200μl，置10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。
[0091]
laie-c定位溶液：量取laie-b贮备液200μl，置10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。
[0092]
laie-e定位溶液：量取laie-b贮备液200μl，置10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。
[0093]
精密量取上述溶液(空白溶剂、系统适用性溶液、各定位溶液)5μl，注入液相，记录色谱图。
[0094]
结果见表1。
[0095]
表1专属性试验结果
[0096][0097]
结果显示：空白溶剂不干扰本品有关物质检测，专属性、系统适用性符合规定实施例3溶液稳定性
[0098]
色谱条件：同实施例2
[0099]
溶液配制
[0100]
溶剂：流动相a
[0101]
供试品溶液：取l-丙氨酸异丙酯盐酸盐约500mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
[0102]
在上述供试品溶液配制后的0、3、6、12、18、24小时，精密量取5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
[0103]
结果见表2
[0104]
表2溶液稳定性试验结果-供试品溶液
[0105]
[0106]
结果显示：对照品溶液及供试品溶液在24小时内均稳定。
[0107]
实施例4线性、检测限、定量限
[0108]
色谱条件：同实施例2
[0109]
溶液配制
[0110]
溶剂：流动相a
[0111]
laie-b贮备液：取laie-b对照品约25mg，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得laie-b贮备液。
[0112]
laie-c贮备液：取laie-c对照品约25mg，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得laie-c贮备液。
[0113]
laie-e贮备液：取laie-e对照品约25mg，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得laie-e贮备液。
[0114]
混合杂质对照品贮备液：量取laie-b贮备液、laie-c贮备液、laie-e贮备液各4ml，置20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
[0115]
线性溶液-5：精密量取混合杂质对照品贮备液1ml，置5ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
[0116]
线性溶液-4：精密量取混合杂质对照品贮备液1.5ml，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
[0117]
线性溶液-3：精密量取混合杂质对照品贮备液1ml，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
[0118]
线性溶液-2：精密量取混合杂质对照品贮备液1ml，置20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
[0119]
线性溶液-1：精密量取混合杂质对照品贮备液1ml，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
[0120]
laie-a贮备液：laie-a贮备液：取laie-a对照品约500mg，置20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得laie-a贮备液。
[0121]
laie-a线性溶液-5：精密量取laie-a贮备液1ml，置5ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
[0122]
laie-a线性溶液-4：精密量取laie-a贮备液1.5ml，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
[0123]
laie-a线性溶液-3：精密量取laie-a贮备液1ml，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
[0124]
laie-a线性溶液-2：精密量取laie-a贮备液1ml，置20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
[0125]
laie-a线性溶液-1：精密量取laie-a贮备液1ml，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
[0126]
laie线性溶液-5：称取laie工作对照品约100mg，精密称定，置20ml容量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
[0127]
laie线性溶液-4：精密量取laie线性溶液-5 5ml，稀释至10ml。
[0128]
laie线性溶液-3：精密量取laie线性溶液-4 1ml，稀释至25ml。
[0129]
laie线性溶液-2：精密量取laie线性溶液-4 1ml，稀释至50ml。
[0130]
laie线性溶液-1：精密量取laie线性溶液-2 5ml，稀释至10ml。
[0131]
laie-b、laie-c、laie-e：线性溶液-1的s/n，逐级稀释，当稀释至s/n≈10时作为定量限，s/n≈3时作为检测限。
[0132]
laie：laie线性溶液-1的s/n，逐级稀释，当稀释至s/n≈10时作为定量限，s/n≈3时作为检测限。
[0133]
laie-a：laie-a线性溶液-1的s/n，逐级稀释，当稀释至s/n≈10时作为定量限，s/n≈3时作为检测限。
[0134]
精密量取空白溶液、上述线性溶液(线性溶液1-线性溶液5，laie-a线性溶液1-laie-a线性溶液5,laie线性溶液1-laie线性溶液5),定量限、检测限溶液(laie-b、laie-c、laie-e、laie、laie-a定量限,检测限溶液)各5μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。定量限与检测限试验结果见表3
[0135]
结果显示：laie-a浓度在0.493(mg/ml-4.935(mg/ml)范围内，线性方程y＝6.1693x 0.036，线性相关系数(r)为1.0000，峰面积与浓度线性关系良好，标准曲线图见图1；laie-b浓度在0.010(mg/ml)-0.105(mg/ml)范围内，线性方程y＝3.8676x-0.0015，线性相关系数(r)为0.9994，峰面积与浓度线性关系良好，标准曲线图见图2；laie-c浓度在0.010(mg/ml)-0.100(mg/ml)范围内，线性方程y＝4.6748x-0.0038，线性相关系数(r)为0.9997，峰面积与浓度线性关系良好，标准曲线图见图3；laie-e浓度在0.010(mg/ml)-0.097(mg/ml)范围内，线性方程y＝3.4737x 0.0042，线性相关系数(r)为0.9998，峰面积与浓度线性关系良好，标准曲线图见图4；laie浓度在0.025(mg/ml)-4.930(mg/ml)范围内，线性方程y＝4.7733x-0.0086，线性相关系数(r)为1.000，峰面积与浓度线性关系良好，标准曲线见图5
[0136]
表3定量限与检测限试验结果
[0137][0138]
结果显示：在拟定方案色谱条件下，线性良好，各杂质的loq低于供试品浓度的0.05％，lod低于供试品浓度的0.02％，完全能满足准确测定l-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质的要求。
[0139]
实施例5准确度
[0140]
色谱条件：同实施例2
[0141]
溶液配制
[0142]
溶剂：流动相a
[0143]
本底-供试品溶液：取l-丙氨酸异丙酯盐酸盐约500mg，精密称定，置10ml量瓶中，
加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
[0144]
laie-a贮备液：laie-a贮备液：取laie-a对照品约500mg，置20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得laie-a贮备液。
[0145]
laie-a对照品溶液：精密量取laie-a贮备液1ml，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
[0146]
laie-a50％供试品溶液：取l-丙氨酸异丙酯盐酸盐约500mg，精密称定，置10ml量瓶中，精密量取laie-a贮备液0.5ml，置同一10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。平行配制三份。
[0147]
laie-a100％供试品溶液：取l-丙氨酸异丙酯盐酸盐约500mg，精密称定，置10ml量瓶中，精密量取laie-a贮备液1ml，置同一10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。平行配制三份。
[0148]
laie-a150％供试品溶液：取l-丙氨酸异丙酯盐酸盐约500mg，精密称定，置10ml量瓶中，精密量取laie-a贮备液1.5ml，置同一10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。平行配制三份。
[0149]
laie-b贮备液：取laie-b对照品约25mg，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得laie-b贮备液。
[0150]
laie-c贮备液：取laie-c对照品约25mg，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得laie-c贮备液。
[0151]
laie-e贮备液：取laie-e对照品约25mg，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得laie-e贮备液。
[0152]
混合杂质对照品贮备液：量取laie-b贮备液、laie-c贮备液、laie-e贮备液各4ml，置20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
[0153]
laie-b/c/e混合杂质对照品溶液：精密量取混合杂质对照品贮备液1ml，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
[0154]
laie-b/c/e 50％供试品溶液：取l-丙氨酸异丙酯盐酸盐约500mg，精密称定，置10ml量瓶中，精密量取混合杂质对照品贮备液0.5ml，置同一10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。平行配制三份。
[0155]
laie-b/c/e 100％供试品溶液：取l-丙氨酸异丙酯盐酸盐约500mg，精密称定，置10ml量瓶中，精密量取混合杂质对照品贮备液1ml，置同一10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。平行配制三份。
[0156]
laie-b/c/e 150％供试品溶液：取l-丙氨酸异丙酯盐酸盐约500mg，精密称定，置10ml量瓶中，精密量取混合杂质对照品贮备液1.5ml，置同一10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。平行配制三份。
[0157]
精密量取空白溶液、上述溶液(本底供试品溶液，laie-a对照品溶液，laie-a50％供试品溶液，laie-a100％供试品溶液，laie-a150％供试品溶液，laie-b/c/e对照品溶液，laie-b/c/e50％供试品溶液，laie-b/c/e100％供试品溶液，laie-b/c/e150％供试品溶液)5μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；准确度试验结果见表4。
[0158]
表4准确度试验结果
[0159]
[0160][0161]
结果显示：在拟定方案色谱条件下，l-丙氨酸(laie-a)平均回收率98.4％，rsd1.3％；l-丙氨酸甲酯盐酸盐(laie-b)98.6％，rsd3.54％；l-丙氨酸乙酯盐酸盐(laie-c)98.2％，rsd4.75％；l-丙氨酸叔丁酯盐酸盐(laie-e)98.2％，rsd3.61％；表明该方法回收率好，准确度高。
[0162]
实施例6重复性
[0163]
色谱条件：同实施例2
[0164]
溶液配制
[0165]
溶剂：流动相a
[0166]
供试品溶液：取laie约500mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。平行配制6份。
[0167]
精密量取上述各溶液5μl，注入液相，记录色谱图。供试品溶液有关物质色谱图见图6，重复性试验结果见表5
[0168]
表5重复性试验结果(％)
[0169][0170]
结果显示：该方法重复性良好。
[0171]
实施例7中间精密度
[0172]
色谱条件：同实施例2
[0173]
溶液配制
[0174]
照实施例6溶液配制方法进行配制。在不同日期、不同分析人员、不同设备条件下，取同一批供试品进行有关物质检查，记录色谱图。中间精密度试验结果见表6
[0175]
表6中间精密度试验结果
[0176]
[0177][0178]
备注*：为重复性试验结果。
[0179]
结果显示：该方法中间精密度良好。
[0180]
实施例8耐用性试验
[0181]
本试验在拟定方案色谱条件下分别通过调整流速、柱温、流动相ph值、不同品牌色谱柱进行方法耐用性试验.。耐用性试验具体方案见表7
[0182]
表7耐用性试验具体方案
[0183][0184]
溶液配制
[0185]
溶剂：流动相a
[0186]
供试品溶液：取laie约500mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀至刻度，摇匀。
[0187]
系统适用性溶液：取l-丙氨酸异丙酯盐酸盐对照品及l-丙氨酸(laie-a)、l-丙氨酸甲酯盐酸盐(laie-b)、l-丙氨酸乙酯盐酸盐(laie-c)、l-丙氨酸叔丁酯盐酸盐(laie-e)对照品各适量，加流动相a溶解并稀释制成每1ml中含l-丙氨酸异丙酯盐酸盐50mg，含laie-a2.5mg，含laie-b、laie-c、laie-e各0.25mg的混合溶液，摇匀。
[0188]
精密量取上述各溶液5μl，分别于不同流速(
±
0.01ml)、不同柱温(
±
5℃)、不同ph值(
±
0.05)及更换色谱柱条件下测定，注入液相，记录色谱图。结果见表8-9
[0189]
表8耐用性试验结果-系统适用性
[0190]
[0191][0192]
表9耐用性试验杂质检出量结果(％)
[0193][0194]
以上各实施例结果表明：本发明的高效液相色谱分析方法专属性强、灵敏度高、精密度好、能准确、快速测定l-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质。
[0195]
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。