黄芪甲苷增强姜黄素抗肠道病毒71型的应用

1.本发明涉及黄芪甲苷的药物新用途，特别是涉及黄芪甲苷用于肠道病毒71型感染的药物新用途。


背景技术：

2.手足口病主要是由柯萨奇病毒a16型（coxsackievirus a16，ca16）和肠道病毒71型（enterovirus 71，ev71）感染引起，其中，重症患者多由ev71感染引起，病情进展迅速，可表现为脑膜炎、脑炎、脑脊髓炎、肺水肿、循环障碍等，以脑干脑炎最为凶险，极少数病例病情危重，可致死亡，存活病例可留有后遗症。
3.2016年上半年正式上市用于预防ev71感染所致手足口病的疫苗，是目前唯一可用于预防手足口病的疫苗。接种手足口病疫苗可以显著降低手足口病的流行，但我国疫苗的接种率并不高，截至2021年底，全国平均累计接种率仅有32%（以2014年出生人口队列计算），还不足以形成群体免疫屏障。手足口病疫苗接种也存在地区不平衡情况，东部和发达地区接种率高，西部地区接种率偏低。而且ev71存在基因型的变异，现有疫苗是否可以发挥保护作用尚不清楚。
4.目前尚无治疗手足口病的特效药物，主要是采用干扰素（interferon，ifn）和利巴韦林（rbv）进行对症治疗。因此，寻找有效且特异的抗ev71药物，是我们亟待解决的问题。
5.姜黄素（curcumin，cur）是一种从姜科植物姜黄等的根茎中提取的黄色色素，现有研究报道其具有抑制炎症反应、抗氧化、抗类风湿等作用。
6.huang hsing-i等研究发现，cur在浓度20μm时，可以在人结肠癌（ht29）细胞中发挥抗ev71的作用（huang hi, chio cc, lin jy. inhibition of ev71 by curcumin in intestinal epithelial cells. plos one. 2018 jan 25; 13(1): e0191617.）。
7.同样，20μm的cur也可以在非洲绿猴肾（vero）细胞中发挥抗ev71作用（qin y, lin l, chen y, wu s, si x, wu h, zhai x, wang y, tong l, pan b, zhong x, wang t, zhao w, zhong z. curcumin inhibits the replication of enterovirus 71 in vitro. acta pharm sin b. 2014 aug; 4(4): 284-94.）。
8.在ev71感染人神经母细胞瘤（sh-sy5y）细胞后，20
µ
m的cur仅可以发挥轻微的抗ev71作用，但20
µ
m cur联合250 iu/ml ifn-α却能显著抑制ev71的复制（wang y, dan k, xue x, chen b, chen c. curcumin assists anti-ev71 activity of ifn-α by inhibiting ifnar1 reduction in sh-sy5y cells. gut pathog. 2022 feb 12; 14(1): 8.）。
9.上述文献揭示了cur在ev71感染的不同细胞中均可以发挥其抗ev71的作用，但显而易见，其cur的药物剂量均较大。


技术实现要素：

10.本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种黄芪甲苷增强姜黄素抗肠道病毒
71型的应用。
11.黄芪甲苷（astragaloside iv，ast-iv）是黄芪注射液的质量标准，也是黄芪的有效活性成分，具有抗炎，增强免疫，抗氧化等作用。
12.本发明研究发现，黄芪甲苷可以增强姜黄素的抗ev71作用，黄芪甲苷与姜黄素联合使用时，只需要小剂量的姜黄素，就可以实现其抗ev71的作用。
13.因此，本发明首先是提供了黄芪甲苷在制备治疗手足口病的药物中的应用。
14.进而，本发明还提供了黄芪甲苷在制备治疗ev71感染的药物中的应用。
15.进一步地，本发明还具体提供了黄芪甲苷在制备治疗ev71感染引起的手足口病的药物中的应用。
16.更具体地，基于本发明研究发现的黄芪甲苷能够增强姜黄素对ev71感染引起的细胞毒性的保护作用的现象，本发明提供了黄芪甲苷在制备协同姜黄素治疗ev71感染引起的手足口病的药物中的应用。
17.特别地，本发明还进一步提供了黄芪甲苷与姜黄素组成的药物组合物在制备治疗ev71感染引起的手足口病的药物中的应用。
18.其中，所述的药物组合物中，黄芪甲苷与姜黄素的剂量摩尔比为1∶2～2.5。
19.更优选地，所述的药物组合物中，黄芪甲苷与姜黄素的剂量摩尔比为1∶2～2.3。
20.更进一步地，本发明还提供了一种用于治疗ev71感染引起的手足口病的药物，所述药物中包含有药物活性成分黄芪甲苷和姜黄素或其药学上可接受的盐，还包含有药学上可接受的载体或赋形剂。
21.在本发明所述的用于治疗ev71感染引起的手足口病的药物中，所述的药物活性成分黄芪甲苷具体是用于增强另一药物活性成分姜黄素的抗ev71作用，从而有效减少姜黄素的使用剂量。
22.本发明采用cck-8法检测了3.5μm ast-iv与7.5
µ
m cur联合应用对ev71感染引起的细胞毒性的保护作用，进一步采用western blot法和tcid
50
法检测了3.5μm ast-iv与7.5
µ
m cur联合应用的抗ev71作用，通过细胞实验证明，当以7.5
µ
m cur与3.5μm ast-iv共同对ev71感染的ges-1细胞实施干预后，能够起到较好的抗ev71作用，保护ges-1细胞由ev71引起细胞毒性的损伤作用。而当cur单独用药时，7.5
µ
m cur并无抗ev71的作用，只有大于等于20
µ
m的cur才可以体现出其抗ev71的作用。
23.因此，本发明ast-iv与cur联合用药，药物剂量低，药理效果好，且毒性低，预示着其良好的药用前景。
附图说明
24.图1是ast-iv与cur干预ges-1细胞后的细胞毒性检测结果。
25.图2是不同浓度cur干预对ev71感染ges-1细胞增殖活力的影响。
26.图3是不同浓度cur干预后ev71感染ges-1细胞的形态变化。
27.图4是western blot检测不同浓度cur对染毒细胞干预后细胞中vp1蛋白水平的表达。
28.图5是tcid
50
法检测不同浓度cur对染毒细胞干预后上清中的病毒滴度。
29.图6是cur与ast-iv共同干预对ev71感染ges-1细胞形态变化的影响。
30.图7是cur与ast-iv共同干预对ev71感染ges-1细胞增殖活力的影响。
31.图8是western blot检测cur与ast-iv共同干预后染毒细胞中vp1蛋白水平的表达。
32.图9是tcid
50
法检测cur与ast-iv共同干预后染毒细胞上清中的病毒滴度。
33.图中：与对照组相比，****p＜0.0001；与ev71感染组相比，##p＜0.01，###p＜0.001。
实施方式
34.下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步的详细描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，从而使本领域技术人员能很好地理解和利用本发明，而不是限制本发明的保护范围。
35.本发明实施例中涉及到的生产工艺、实验方法或检测方法，若无特别说明，均为现有技术中的常规方法，且其名称和/或简称均属于本领域内的常规名称，在相关用途领域内均非常清楚明确，本领域内技术人员能够根据该名称理解常规工艺步骤并应用相应设备，按照常规条件或制造商建议的条件进行实施。
36.本发明实施例中使用的各种仪器、设备、原料或试剂，并没有来源上的特殊限制，均为可以通过正规商业途径购买获得的常规产品，也可以按照本领域技术人员熟知的常规方法进行制备。
37.实施例1：ast-iv、cur干预对ges-1细胞的毒性检测。
38.取对数生长期的ges-1细胞，接种于96孔板上，分别以终浓度3.5
µ
m，7
µ
m，10.5
µ
m，14
µ
m的ast-iv和终浓度7.5
µ
m，10
µ
m，15
µ
m，20
µ
m，25
µ
m的cur干预ges-1细胞24h作为不同的实验组，并以未干预的ges-1细胞作为对照组，纯培养基作为空白组。
39.在培养结束前2h，每孔加入20
µ
l的cck8试剂，继续培养至结束时间后，用酶标仪在450nm处测定各孔细胞的吸光度a值，cck-8法检测细胞的增殖活力。
40.细胞存活率/%=(实验组a值﹣空白组a值)/(对照组a值﹣空白组a值)
×
100%。
41.结果如图1所示，a)中浓度为3.5
µ
m，7
µ
m，10.5
µ
m，14
µ
m的ast-iv对ges-1细胞的增殖活力均无影响；b)中浓度为7.5
µ
m，10
µ
m，15
µ
m，20
µ
m，25
µ
m的cur同样对ges-1细胞的增殖活力均无影响。
42.实施例2：cur对ev71感染ges-1细胞的保护作用。
43.将1
×
104个/ml ges-1细胞接种于96孔板，分别加入浓度0
µ
m，7.5
µ
m，10
µ
m，15
µ
m，20
µ
m和25
µ
m的cur干预2h，然后加入ev71感染24h，形成ev71感染组，ev71 7.5
µ
m cur组，ev71 10
µ
m cur组，ev71 15
µ
m cur组，ev71 20
µ
m cur组，ev71 25
µ
m cur组共6个实验组。
44.同时以未感染ev71和cur干预的ges-1细胞作为对照组，纯培养基作为空白组。
45.在ev71感染结束前2h，各组中加入20μl的cck8试剂，直到培养结束，在450nm处用酶标仪测定吸光度a值，计算细胞存活率，检测细胞的活力。
46.检测结果如图2所示，与对照组相比，ev71感染细胞的活力出现了明显减低。与ev71感染组相比，以7.5
µ
m，10
µ
m，15
µ
m cur对ev71感染细胞进行干预后，细胞活力并无明显升高，而以20
µ
m，25
µ
m cur干预ev71感染细胞后，细胞活力出现了明显提高。
47.上述结果表明，只有浓度20
µ
m以上的cur才对ev71感染引起的细胞毒性具有明显
的保护作用。
48.进而，将对数生长期的1
×
106个/ml的ges-1细胞接种于6孔板，按照上述同样的处理方法分为对照组，ev71感染组，ev71 7.5
µ
m cur组，ev71 10
µ
m cur组，ev71 15
µ
m cur组，ev71 20
µ
m cur组和ev71 25
µ
m cur组，以不同浓度cur干预2h后，ev71感染24h，倒置显微镜下观察不同分组ges-1细胞的形态变化，并拍照。
49.图3中相比对照组，ev71感染ges-1细胞后，细胞数目明显减低，细胞皱缩，悬浮细胞明显增多。与ev71感染组相比，7.5
µ
m，10
µ
m，15
µ
m cur对ev71感染的细胞干预后，细胞形态无明显改变，但20
µ
m，25
µ
m cur干预ev71感染细胞后，细胞数目明显增多，细胞形态出现恢复。以上结果同样表明了20
µ
m，25
µ
m cur对ev71感染引起的细胞损伤具有明显的保护作用。
50.收集除对照组外的上述形态观察后各组细胞于1.5ml ep管中，每管加入细胞裂解液60
µ
l提取蛋白，12% sds-page凝胶分离vp1蛋白，western blot法检测细胞中vp1蛋白水平。
51.结果如图4中a，b所示，与ev71感染组相比，7.5
µ
m，10
µ
m，15
µ
m cur对ev71感染细胞干预后，细胞中结构蛋白vp1水平无明显改变，而20
µ
m，25
µ
m cur对ev71感染细胞干预后，细胞中vp1蛋白水平明显减低，表明20
µ
m，25
µ
m的cur可以抑制细胞中病毒的复制。
52.将1
×
104个/ml的rd-a细胞接种于96孔板中，37℃，5% co2细胞培养箱中培养过夜。收集除对照组外的各组细胞上清，依次从10-1
～10-11
作10倍稀释。将稀释好的病毒加入96孔板中，每一稀释度接种一纵列，共8孔，11个稀释度分别加入11纵列，每孔加入100
µ
l，同时设置不染毒的对照组。
53.将96孔板放入培养箱中继续培养，每12h观察并记录一次，连续观察4～7天，使用reed-muench两氏法对结果进行计算：距离比例=(高于50%病变率的百分数-50%)/(高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数)，lgtcid
50
=距离比例
×
稀释度对数之间的差 高于50%病变率的稀释度的对数。
54.结果如图5所示，与ev71感染组相比，7.5
µ
m，10
µ
m，15
µ
m cur对ev71感染细胞干预后，细胞上清中的病毒滴度无明显改变，但20
µ
m，25
µ
m cur对ev71感染的细胞进行干预后，细胞上清中病毒滴度明显减低。以上结果表明，20
µ
m，25
µ
m的cur可以抑制病毒的释放。
55.实施例3：cur与ast-iv共同作用对ev71感染ges-1细胞的保护作用。
56.将对数生长期的1
×
106个/ml的ges-1细胞接种于6孔板，分为对照组，ev71感染组，ev71 ast-iv组，ev71 cur组和ev71 ast-iv cur组。
57.先在ev71 ast-iv组加入浓度3.5
µ
m的ast-iv，ev71 cur组加入浓度7.5
µ
m的cur，ev71 ast-iv cur组加入浓度3.5
µ
m的ast-iv和浓度7.5
µ
m的cur，提前干预ges-1细胞2h后，再将除对照组外的其他各组以ev71感染24h。倒置显微镜下观察不同分组ges-1细胞的形态变化，并拍照。
58.结果如图6所示，与对照组相比，ev71感染ges-1细胞后，细胞数目明显减少，细胞皱缩，悬浮细胞明显增多。单独干预的ev71 3.5
µ
m ast-iv组和ev71 7.5
µ
m cur组与ev71感染组相比，细胞数目及细胞形态无明显变化；但共同作用的ev71 3.5
µ
m ast-iv 7.5
µ
m cur组的细胞数目明显增多，细胞形态恢复。
59.将1
×
104个/ml ges-1细胞接种于96孔板，分为对照组，ev71感染组，ev71 ast-iv
组，ev71 cur组和ev71 ast-iv cur组。
60.先在ev71 ast-iv组加入浓度3.5
µ
m的ast-iv，ev71 cur组加入浓度7.5
µ
m的cur，ev71 ast-iv cur组加入浓度3.5
µ
m的ast-iv和浓度7.5
µ
m的cur，提前干预ges-1细胞2h后，再将除对照组外的其他各组以ev71感染24h。
61.在ev71感染结束前2h，各组中加入20μl的cck8试剂，直到培养结束，在450nm处用酶标仪测定吸光度a值，计算细胞存活率，检测细胞活力。
62.结果如图7所示，与对照组相比，ev71感染细胞的活力出现了明显减低。与ev71感染组相比，单独干预的ev71 3.5
µ
m ast-iv组与ev71 7.5
µ
m cur组的细胞活力并无明显升高，但共同作用的ev71 3.5
µ
m ast-iv 7.5
µ
m cur组的细胞活力出现明显升高。
63.上述结果表明，3.5
µ
m ast-iv与7.5
µ
m cur联合用药，对ev71感染引起的细胞毒性具有明显的保护作用。
64.收集除对照组外的上述形态观察后各组细胞于1.5ml ep管中，每管加入细胞裂解液60
µ
l提取蛋白，12% sds-page凝胶分离vp1蛋白，western blot法检测细胞中vp1蛋白水平。
65.结果如图8中a，b所示，与ev71感染组相比，ev71 3.5
µ
m ast-iv组、ev71 7.5
µ
m cur组细胞中结构蛋白vp1水平无明显改变，而ev71 3.5
µ
m ast-iv 7.5
µ
m cur组细胞中vp1蛋白水平明显减低。以上结果表明3.5
µ
m ast-iv与7.5
µ
m cur联合用药可以抑制细胞中病毒的复制。
66.将1
×
104个/ml的rd-a细胞接种于96孔板中，37℃，5% co2细胞培养箱中培养过夜。收集除对照组外的各组细胞上清，依次从10-1
～10-11
作10倍稀释。将稀释好的病毒加入96孔板中，每一稀释度接种一纵列，共8孔，11个稀释度分别加入11纵列，每孔加入100
µ
l，同时设置不染毒的对照组。
67.将96孔板放入培养箱中继续培养，每12h观察并记录一次，连续观察4～7天，使用reed-muench两氏法计算病毒滴度。
68.结果如图9所示，与ev71感染组相比，ev71 3.5
µ
m ast-iv组与ev71 7.5
µ
m cur组上清中病毒滴度无明显改变，但ev71 3.5
µ
m ast-iv 7.5
µ
m cur组上清中病毒滴度却明显减低。上述结果同样表明了3.5
µ
m ast-iv与7.5
µ
m cur联合用药，可以抑制病毒的释放。
69.本发明以上实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制本发明仅为以上所述实施例。本领域普通技术人员在不脱离本发明原理和宗旨的情况下，针对这些实施例进行的各种变化、修改、替换和变型，均应包含在本发明的保护范围之内。