rna核酸适配体传感器
技术领域
1.本发明涉及用于优化异源rna在细胞中表达的方法。同样，本发明涉及能够定量表达rna的细胞。
背景技术：
2.近年来的研究使人们意识到，rna不仅仅是一种过渡分子，它还具有多种调节和酶促功能。例如，已经描述了许多小rna在基因表达的调节中起关键作用，并且rna序列中的高阶结构，如核糖开关或核酶，充当mrna表达的调节因子(breaker，r.r.natural and engined nucleaned acids as tools to explored biology.nature 2004:432838-845.nellen，w.,and c.hammann.small rnas:analysis and regulatory functions.nucleic acids and molecular biology.springer-verlag2005,heidelberg,germany)。基于其作为过渡分子(mrna)、人工小干扰rna分子(sirnas)、催化活性rna分子(核酶)、调节或相互作用rna分子(rna核酸适配体)的功能，rna在治疗、生物农药和其他应用中具有作为活性成分的多用途潜力(khan，a.u.ribozyme:a clinic tool.clin.chim.acta 2006:367,20-27.fletcher,s.j.,reeves,p.t.,hoang,b.t.&mitter,n.a基于rnai的生物农药展望.front.plant sci.11,(2020).cagliari,d.et al.非转化rnai对害虫和植物病害的管理.frontiers in plant science vol.10(2019).zotti,m.et al.rna干扰技术在作物防治节肢动物害虫、病原体和线虫中的应用.pest management science vol.74 1239-1250(2018).vallazza,b.et al.重组信使rna技术及其在癌症免疫治疗、转录替代治疗、多能干细胞诱导等方面的应用.wiley interdisciplinary reviews:rnavol.6 471
ꢀ‑
499(2015).sahin,u.,karik
ó
,k.&t
ü
reci,o.基于信使核糖核酸的疗法开发一类新药.nature reviews drug discovery vol.13 759-780(2014).pardi,n.,hogan,m.j.&weissman,d.信使核糖核酸疫苗技术的最新进展.current opinion in immunology vol.65 14-20(2020).)。为了进行进一步阐明这些功能所需的测定，并为了提供用于应用的基于rna的活性成分，需要能够产生大量给定rna的技术。
3.产生rna最直接的方法之一是体外转录rna。这种方法是基于对所有生命形式中控制rna合成的酶过程的模仿。用于此目的的一个常见系统是t7 rna聚合酶，它从dna模板开始，可以在几个小时的反应时间内产生高达毫克量的rna。然而，并不是所有的dna序列都同样适合通过t7聚合酶进行转录。此外，在3'末端非特异性添加核苷酸的问题导致了不均匀性，这在检查调节功能时可能是至关重要的。此外，这种方法也是劳动密集型的。此外，体外转录反应的可扩展性以及给定rna的最大可实现量是有限的，这使得在合理的时间内大量提供给定rna具有挑战性且成本高昂。
4.化学合成目前通常用于生产小于10个核苷酸和最多80个核苷酸的rna寡核苷酸。合成是在固体载体如聚苯乙烯或可控孔玻璃上进行的，并涉及在3’至5’方向上添加相应的核苷酸。由于反应条件可以优化，化学合成可以产生任何给定的rna，而不考虑其序列。然
而，该方法本身不适合生产具有超过100个核苷酸的较大rna分子，并且成本也很高。
5.相反，大rna分子可以通过重组表达系统有效地产生，类似于重组蛋白的工业生产。大肠杆菌已被用于这一目的，但并非没有困难：细胞内核糖核酸酶的降解、转录物的大的3
′
端和5
′
端异质性以及低rna滴度阻碍了广泛的应用(ponchon l，dardel f.recombinant rna technology:the trna scaffold.nat methods.2007；4:571-6.)。替代宿主可能提供更好的解决方案(suzuki h，ando t,umekage s,tanaka t,kikuchi y.extracellular production of an rna aptamer by ribonuclease-free marine bacteria harboring engineered plasmids:a proposal for industrial rna drug production.appl environ microbiol.2010；76:786-93.)。然而，到目前为止，它们尚未开发到为现有系统提供可行替代品的阶段(baronti，l.,karlsson,h.,m.et al.a guide to large-scale rna sample preparation.anal bioanal chem.2018:410,3239-3252.)。
技术实现要素：
6.为了优化重组rna表达系统，需要一种快速可靠的方法来鉴定对给定rna分子表现出高表达的细胞。
7.该问题通过一种用于优化细胞中感兴趣的异源rna序列的生产的方法来解决，该方法包括以下步骤：
8.a)将能够表达感兴趣的异源rna的载体引入多个细胞中，其中所述的rna用rna标签标记，所述的rna标签包含
[0009]-能够稳定荧光团的核酸适配体，以及
[0010]-能够稳定所述的核酸适配体的支架；
[0011]
b)在允许感兴趣的异源rna表达的条件下，在培养基中培养细胞；
[0012]
c)将所述的荧光团加入所述的培养基中；
[0013]
d)鉴定那些显示出最高荧光强度并因此显示出感兴趣的rna的高表达的细胞。
[0014]
同样，该问题通过一种生产感兴趣的异源rna的方法来解决，该方法包括以下步骤：
[0015]
a)将能够表达感兴趣的异源rna的载体引入多个细胞，其中所述的rna用rna标签标记，所述的rna标签包含能够稳定荧光团的核酸适配体和能够稳定所述的核酸适配体的支架；
[0016]
b)在允许感兴趣的异源rna表达的条件下，在培养基中培养细胞；
[0017]
c)将所述的荧光团加入所述的培养基中；
[0018]
d)鉴定和分离那些显示出最高荧光强度并因此显示出感兴趣的rna的高表达的细胞；
[0019]
e)从在步骤d)中分离的细胞中去除步骤a)的第一载体；
[0020]
f)将能够在没有rna标签的情况下表达感兴趣的异源rna的第二载体引入步骤e)获得的细胞中；
[0021]
g)通过培养在步骤f)中获得的细胞来产生感兴趣的rna。
[0022]
该问题还通过一种用于比较不同细胞对感兴趣的异源rna序列的生产能力的方法
来解决，该方法包括以下步骤：
[0023]
a)将能够表达感兴趣的异源rna的载体引入多个细胞中，其中所述的rna用rna标签标记，所述的rna标签包含
[0024]-能够稳定荧光团的核酸适配体，以及
[0025]-能够稳定所述的核酸适配体的支架；
[0026]
b)在允许感兴趣的rna表达的条件下，在培养基中培养细胞；
[0027]
c)将所述的荧光团加入所述的培养基中；
[0028]
比较所述的多个细胞之间的荧光强度。
[0029]
此外，该问题通过携带能够表达感兴趣的异源rna的载体的微生物细胞来解决，其中所述的rna用rna标签标记，所述的rna标签包含
[0030]-能够稳定荧光团的核酸适配体，以及
[0031]-能够稳定核酸适配体的rna支架。
附图说明
[0032]
图1显示未经(左图)和经(右图)n-甲基-n
’‑
硝基-n-亚硝基胍(mnng)处理的谷氨酸棒状杆菌atcc 13032δcg2273 pjc1-pf1-u1a-f30::西兰花/uucg-tf1的100000个代表性细胞的前向散射特性(x轴)和530nm荧光特性(y轴)的细胞仪采集。矩形表示用于分离高荧光细胞的分选门。(参见实施例1d)。
[0033]
图2显示添加荧光团dfhbi后，谷氨酸棒状杆菌atcc 13032_δcg2273_16s rrna-西兰花的荧光增加了x倍。所描述的荧光诱导通过细胞术分析记录为中值荧光(488ex/530-30em)，并通过菌株谷氨酸棒状杆菌atcc 13032_δcg2273_16s rrna-西兰花的未染色培养物的中值荧光(48ex/530-30m)进行归一化。
[0034]
图3显示通过逆转录定量pcr确定的与对照菌株谷氨酸棒状杆菌atcc 13032_δcg2273相比，菌株谷氨酸棒菌atcc 13032_δcg2273_16s rrna-西兰花中f30::西兰花的相对转录水平。
[0035]
图4显示添加荧光团dfhbi或to1后，菌株谷氨酸棒状杆菌atcc 13032_δcg2273_pjc1_pf1-u1a-tf1，谷氨酸棒状杆菌atcc 13032_δcg2273_pjc1_pf1-u1a-f30::西兰花/uucg-tf1和谷氨酸棒状杆菌atcc 13032_δcg2273_pjc1_pf1-u1a-f30::芒果3-tf1的荧光增加x倍。所描述的荧光诱导通过细胞术分析记录为中值荧光(488ex/530-30em)，并分别通过未染色培养物的中值荧光(488ex/530-30mm)进行归一化。
[0036]
图5显示在t7启动子的控制下表达α微管蛋白正义rna与f30::西兰花的融合以及相应的α微管蛋白反义rna的dna构建体的设计原理。此外，还显示所得dsrna的方案和相应的序列长度。箭头表示rnase a的活性，导致图7中可见的片段，l3。
[0037]
图6显示添加荧光团dfhbi后，菌株谷氨酸棒状杆菌atcc 13032_δcg2273_pjc1和谷氨酸棒状杆菌atcc 13032_δcg2273_pjc1_dsrna_pt7-α微管蛋白-f30::西兰花的荧光增加了x倍。所描述的荧光诱导通过细胞术分析记录为中值荧光(488ex/530-30em)，并分别通过未染色培养物的中值荧光(488ex/530-30mm)进行归一化。
[0038]
图7显示dsrna梯(美国马萨诸塞州伊普斯维奇新英格兰生物实验室)，谷氨酸棒状杆菌atcc 13032(de3)_δcg2273 pjc1总rna(l1)，谷氨酸棒状杆菌atcc 13032(de3)_δ
硫代吡喃半乳糖苷(iptg)、光、麦芽糖、甲醇、丙酸盐或通过提高培养温度来诱导感兴趣的rna的表达。
[0052]
除了下面列出的元素之外，载体可以包括表达、分子克隆和复制所必需或增强的额外元件。例如，载体可以包含选择或标记基因，例如编码β-半乳糖苷酶的lacz、编码荧光素酶的luc、编码氯霉素转移酶的cat或其他表达对抗生素耐药性的抗性基因。载体还可以包括复制起点、多克隆位点和/或转录终止子。
[0053]
由载体表达的感兴趣的rna是异源rna，即在宿主细胞的野生型中不表达的rna分子。感兴趣的rna的序列不受限制，可以是任何天然或人工产生的rna序列。在一个实施方案中，感兴趣的rna是mrna、病毒rna、逆转录病毒rna、反义rna、复制子rna、双顺反子或多顺反子rna、小干扰rna或免疫刺激rna。在一个实施方案中，感兴趣的rna具有20-10000个核苷酸的长度。
[0054]
用rna标签标记感兴趣的rna。本文中的“标记”是指rna标签与感兴趣的rna连接，并且该标签与感兴趣的rna一起表达。在从载体表达异源rna时，不从感兴趣的rna中去除rna标签。根据本发明，标签不必直接连接到感兴趣的rna，尽管这是优选的实施方案。但是rna标签和感兴趣的rna也可以通过核苷酸间隔序列分离。
[0055]
本发明中使用的rna标签包括核酸适配体。“核酸适配体”在本文中被理解为指能够结合小分子荧光团的rna寡核苷酸。通常，核酸适配体是10-100个碱基的核酸寡核苷酸，其与小分子以高亲和力结合以诱导其荧光。在结合事件发生之前，核酸适配体和靶小分子都不是强荧光的，但核酸适配体与其靶分子的结合激活了靶分子的荧光。能够结合感兴趣分子的核酸适配体可以通过指数富集(selex)通过配体的系统进化产生(paige，j.s.，wu，k.y.and jaffrey，s.r.rna mimics of green fluorescent protein.science；2011；333,642-6.)。文献中描述了各种核酸适配体(ouellet，j.(2016)rna fluorescence with light-up aptamers.front.chem.4,1-12.bouhedda,f.,autour,a.,and ryckelynck,m.(2017)light-up rna aptamers and their cognate fluorogens:from their development to their applications.int.j.mol.sci.19,44.)。本发明中使用的优选核酸适配体序列包括：
[0056]
seq id no:1
[0057]
核酸适配体ii-mini3-4:
[0058]
agguucgaagcuuuugcuuggacgaaccg
[0059]
seq id no:2
[0060]
芒果:
[0061]
gaagggacggugcggagaggaga
[0062]
seq id no:3
[0063]
芒果2:
[0064]
gaaggagaggagaggaagaggaga
[0065]
seq id no:4
[0066]
芒果3:
[0067]
ggaaggauugguaugugguaua
[0068]
seq id no:5
[0069]
芒果4:
[0070]
cgagggaguggugaggaugaggcga
[0071]
seq id no:6
[0072]
菠菜:
[0073]
gacgcaacugaaugaaauggugaaggacggguccagguguggcugcuucggca gugcagcuuguugaguagagugugagcuccguaacuagucgcguc
[0074]
seq id no:7
[0075]
菠菜2:
[0076]
gauguaacugaaugaaauggugaaggacggguccaguaggcugcuucggcagc cuacuuguugaguagagugugagcuccguaacuaguuacauc
[0077]
seq id no:8
[0078]
西兰花:
[0079]
agacggucggguccagauauucguaucugucgaguagagugugggcu
[0080]
seq id no:13
[0081]
玉米:
[0082]
cgaggaaggaggucugaggaggucacug
[0083]
seq id no:14
[0084]
橙色西兰花:
[0085]
gagacgcaacugaaugaaauggugaaggagacggucggguccaggugcacaaa uguggccuguugaguagcgugugggcuccguaacuagucgcgucac
[0086]
seq id no:65
[0087]
橙色西兰花短款:
[0088]
agacggucggguccaggugcacaaauguggccuguugaguagcgugugggcu
[0089]
seq id no:15
[0090]
红色西兰花:
[0091]
gagacgcaacugaaugaaauguuuucggagacggucggguccagucccaacga uguuggcuguugaguagugugugggcuccguaacuagucgcgucac
[0092]
seq id no:66
[0093]
红色西兰花短款:
[0094]
agacggucggguccagucccaacgauguuggcuguugaguagugugugggcu
[0095]
seq id no:16
[0096]
嫩菠菜:
[0097]
aaggacggguccguugaguagagugugag
[0098]
本发明中使用的rna标签中包含的核酸适配体能够结合荧光团，即在光激发时发出荧光的有机分子。发光强度基本上取决于荧光团与核酸适配体的结合，因为荧光团的结构在与核酸适配体结合时是稳定的。这种稳定性导致激发能优选地离解为荧光。这意味着根据本发明，荧光团的发光在与核酸适配体结合后强烈增加。
[0099]
本发明中使用的荧光团是可以容易地进入细胞的无毒小分子。先前已经描述了能够与这些核酸适配体结合的核酸适配体和荧光团对。可被核酸适配体结合的荧光团包括
(z)-4-(2-羟基亚苄基)-1,2-二甲基-1h-咪唑-5(4h)-酮(2-hbi)，(5z)-5-[(3,5-二氟-4-羟基苯基)亚甲基]-3,5-二氢-2,3-二甲基-4h-咪唑-4-酮(dfhbi)，(5z)-5-[(3,5-二氟-4-羟基苯基)亚甲基]-3,5-二氢-2-甲基-3-(2,2,2-三氟乙基)-4h-咪唑-4-酮(dfhbi-1t)，dfhbi-2t，2-(4-(二甲基氨基)亚苄基)-1h-茚-1,3(2h)-二酮(dmabi)，(z)-4-(3,5-二甲基-4-羟基亚苄基)-1,2-二甲基-1h-咪唑-5(4h)-酮(dmhbi)，3,5-二氟-4-羟基亚苄基咪唑啉-2-肟(dfho)，2-(2-甲基苯并[d]噻唑-3-鎓-3-基)乙酸盐(2-(2-methylbenzo[d]thiazol-3-ium-3-yl)acetate)(to1)，4-[(e)-2-(乙酰基苯基氨基)乙烯基]-1-甲基喹啉碘化物(to3)和(n-(6-氨基己基)-2-(2,6-二叔丁基-4-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)-1h，1'h-2,5'-二苯并[d]咪唑-2'-基)苯氧基)乙酰胺)(hoechst 1c)。
[0100]
在优选的实施方案中，核酸适配体包含seq id no:1，并且荧光团是hoechst 1c。在另一个优选实施方案中，核酸适配体包含seq id no:2，并且荧光团是to1或to3。在另一个优选实施方案中，核酸适配体包含seq id no:3，并且荧光团是to1或to3。在另一个优选实施方案中，核酸适配体包含seq id no:4，并且荧光团是to1或to3。在另一个优选实施方案中，核酸适配体包含seq id no:5，并且荧光团是to1或to3。在另一个优选实施方案中，核酸适配体包含seq id no:6，并且荧光团是2-hbi、dfhbi、dfhbi-1t、dfhbi-2t、dmabi或dmhbi中的任何一种。在另一个优选实施方案中，核酸适配体包含seq id no:7，并且荧光团是2-hbi、dfhbi、dfhbi-1t、dfhbi-2t、dmabi或dmhbi中的任何一种。在另一个优选实施方案中，核酸适配体包含seq id no:8，并且荧光团是2-hbi、dfhbi、dfhbi-1t、dfhbi-2t、dmabi或dmhbi中的任何一种。在另一个优选实施方案中，核酸适配体包含seq id no:13、14、15、65或66，并且荧光团是dfho。在另一个优选实施方案中，核酸适配体包含seq id no:16，并且荧光团是dhfbi或dhfbi-1t。
[0101]
本发明中使用的rna标签进一步包括rna支架。rna支架可以是能够稳定核酸适配体、支持功能性核酸适配体结构的形成和减少核酸适配体降解的任何核苷酸序列。根据本发明的rna支架包括至少一个由nnnn表示的插入位点。在本发明中使用的载体中，nnnn被相应的核酸适配体取代。
[0102]
在一个实施方案中，支架包括两个插入位点，例如seq id no:11和12。根据本发明，可以将一个或两个核酸适配体插入这样的支架中。如果插入两个核酸适配体，则可以将相同或不同的核酸适配体插入两个插入位点。这方面的例子是seq id no:77和78。如果将相同的核酸适配体插入两个插入位点，则在添加荧光团之后发射的荧光信号将比仅存在一个核酸适配体时更强。使用两种不同的核酸适配体具有这样的优点，即表达感兴趣的rna的细胞将发出两个不同的荧光信号。这可能有利于排除误报。
[0103]
如果只有一个核酸适配体被插入到具有两个插入位点的支架中，则第二个插入位点可以被任何间隔序列取代。在一个优选的实施方案中，间隔序列包括四个核苷酸。在一个特别优选的实施方案中，间隔序列是uucg或ttcg。
[0104]
在优选的实施方案中，rna支架包含以下序列之一：
[0105]
seq id no:9
[0106]
trna
lys
:
[0107]
gcccggauagcucagucgguagagcagnnnncggguccaggguucaagucccu guucgggcgcca
[0108]
seq id no:10
[0109]
v5:
[0110]
ugccuggcgaccauagcgauugnnnncaauuagcgccgaugguaguguggggu uuccccaugugagaguaggacaucgccaggcau
[0111]
seq id no:11
[0112]
f29:
[0113]
uugucacguguaugugggnnnncccacauacuuuguugauccnnnnggaucaaucauggcaa
[0114]
seq id no:12
[0115]
f30:
[0116]
uugccauguguaugugggnnnncccacauacucugaugauccnnnnggaucau ucauggcaa
[0117]
在一个实施方案中，rna标签包含seq id no:17至64，69，77或78中的任何一个。在一个优选的实施方案中，rna标签包含seq id no:69。
[0118]
seq id no:17
[0119]
trnalys::核酸适配体ii-mini3-4
[0120]
gcccggauagcucagucgguagagcagagguucgaagcuuuugcuuggacgaa ccgcggguccaggguucaagucccuguucgggcgcca
[0121]
seq id no:18
[0122]
trnalys::芒果
[0123]
gcccggauagcucagucgguagagcaggaagggacggugcggagaggagacgg guccaggguucaagucccuguucgggcgcca
[0124]
seq id no:19
[0125]
trnalys::芒果2
[0126]
gcccggauagcucagucgguagagcaggaaggagaggagaggaagaggagacg gguccaggguucaagucccuguucgggcgcca
[0127]
seq id no:20
[0128]
trnalys::芒果3
[0129]
gcccggauagcucagucgguagagcagggaaggauugguaugugguauacggg uccaggguucaagucccuguucgggcgcca
[0130]
seq id no:21
[0131]
trnalys::芒果
[0132]
4gcccggauagcucagucgguagagcagcgagggaguggugaggaugaggcga cggguccaggguucaagucccuguucgggcgcca
[0133]
seq id no:22
[0134]
trnalys::菠菜
[0135]
gcccggauagcucagucgguagagcaggacgcaacugaaugaaauggugaaggacggguccagguguggcugcuucggcagugcagcuuguugaguagagugugagcuccguaacuagucgcguccggguccaggguucaagucccuguucgggcgcca
[0136]
seq id no:23
[0137]
trnalys::菠菜2
[0138]
gcccggauagcucagucgguagagcaggauguaacugaaugaaauggugaaggacggguccaguaggcu
gcuucggcagccuacuuguugaguagagugugagcuccguaacuaguuacauccggguccaggguucaagucccuguucgggcgcca
[0139]
seq id no:24
[0140]
trnalys::西兰花
[0141]
gcccggauagcucagucgguagagcagagacggucggguccagauauucguau cugucgaguagagugugggcucggguccaggguucaagucccuguucgggcgccaseq id no:25
[0142]
trnalys::玉米
[0143]
gcccggauagcucagucgguagagcagcgaggaaggaggucugaggaggucac ugcggguccaggguucaagucccuguucgggcgcca
[0144]
seq id no:26
[0145]
trnalys::橙色西兰花
[0146]
gcccggauagcucagucgguagagcagagacggucggguccaggugcacaaauguggccuguugaguagcgugugggcucggguccaggguucaagucccuguucgggcgcca
[0147]
seq id no:27
[0148]
trnalys::红色西兰花
[0149]
gcccggauagcucagucgguagagcagagacggucggguccagucccaacgauguuggcuguugaguagugugugggcucggguccaggguucaagucccuguucgggcgcca
[0150]
seq id no:28
[0151]
trnalys::嫩菠菜
[0152]
gcccggauagcucagucgguagagcagaaggacggguccguugaguagagugu gagcggguccaggguucaagucccuguucgggcgcca
[0153]
seq id no:29
[0154]
v5::核酸适配体ii-mini3-4
[0155]
ugccuggcgaccauagcgauugagguucgaagcuuuugcuuggacgaaccgcaauuagcgccgaugguagugugggguuuccccaugugagaguaggacaucgccaggcau
[0156]
seq id no:30
[0157]
v5::芒果
[0158]
ugccuggcgaccauagcgauuggaagggacggugcggagaggagacaauuagc gccgaugguagugugggguuuccccaugugagaguaggacaucgccaggcau
[0159]
seq id no:31
[0160]
v5::芒果2
[0161]
ugccuggcgaccauagcgauuggaaggagaggagaggaagaggagacaauuag cgccgaugguagugugggguuuccccaugugagaguaggacaucgccaggcau
[0162]
seq id no:32
[0163]
v5::芒果3
[0164]
ugccuggcgaccauagcgauugggaaggauugguaugugguauacaauuagcgccgaugguagugugggguuuccccaugugagaguaggacaucgccaggcau
[0165]
seq id no:33
[0166]
v5::芒果4
guugauccnnnnggaucaaucauggcaa
[0195]
seq id no:43
[0196]
f29::芒果2
[0197]
uugucacguguauguggggaaggagaggagaggaagaggagacccacauacuu uguugauccnnnnggaucaaucauggcaa
[0198]
seq id no:44
[0199]
f29::芒果3
[0200]
uugucacguguaugugggggaaggauugguaugugguauacccacauacuuug uugauccnnnnggaucaaucauggcaa
[0201]
seq id no:45
[0202]
f29::芒果4
[0203]
uugucacguguaugugggcgagggaguggugaggaugaggcgacccacauacu uuguugauccnnnnggaucaaucauggcaa
[0204]
seq id no:46
[0205]
f29::菠菜
[0206]
uugucacguguauguggggacgcaacugaaugaaauggugaaggacggguccagguguggcugcuucggcagugcagcuuguugaguagagugugagcuccguaacuagucgcguccccacauacuuuguugauccnnnnggaucaaucauggcaa
[0207]
seq id no:47
[0208]
f29::菠菜2
[0209]
uugucacguguauguggggauguaacugaaugaaauggugaaggacggguccaguaggcugcuucggcagccuacuuguugaguagagugugagcuccguaacuaguuacauccccacauacuuuguugauccnnnnggaucaaucauggcaa
[0210]
seq id no:48
[0211]
f29::西兰花
[0212]
uugucacguguaugugggagacggucggguccagauauucguaucugucgagu agagugugggcucccacauacuuuguugauccnnnnggaucaaucauggcaa
[0213]
seq id no:49
[0214]
f29::玉米
[0215]
uugucacguguaugugggcgaggaaggaggucugaggaggucacugcccacau acuuuguugauccnnnnggaucaaucauggcaa
[0216]
seq id no:50
[0217]
f29::橙色西兰花
[0218]
uugucacguguaugugggagacggucggguccaggugcacaaauguggccuguugaguagcgugugggcucccacauacuuuguugauccnnnnggaucaaucauggcaa
[0219]
seq id no:51
[0220]
f29::红色西兰花
[0221]
uugucacguguaugugggagacggucggguccagucccaacgauguuggcuguugaguagugugugggcucccacauacuuuguugauccnnnnggaucaaucauggcaa
[0222]
seq id no:52
[0223]
f29::嫩菠菜
[0224]
uugucacguguaugugggaaggacggguccguugaguagagugugagcccaca uacuuuguugauccnnnnggaucaaucauggcaa
[0225]
seq id no:53
[0226]
f30::核酸适配体ii-mini3-4
[0227]
uugccauguguaugugggagguucgaagcuuuugcuuggacgaaccgcccaca uacucugaugauccnnnnggaucauucauggcaa
[0228]
seq id no:54
[0229]
f30::芒果:
[0230]
uugccauguguauguggggaagggacggugcggagaggagacccacauacucu gaugauccnnnnggaucauucauggcaa
[0231]
seq id no:55
[0232]
f30::芒果2:
[0233]
uugccauguguauguggggaaggagaggagaggaagaggagacccacauacuc ugaugauccnnnnggaucauucauggcaa
[0234]
seq id no:56
[0235]
f30::芒果3:
[0236]
uugccauguguaugugggggaaggauugguaugugguauacccacauacucugaugauccnnnnggaucauucauggcaa
[0237]
seq id no:57
[0238]
f30::芒果4
[0239]
uugccauguguaugugggcgagggaguggugaggaugaggcgacccacauacucugaugauccnnnnggaucauucauggcaa
[0240]
seq id no:58
[0241]
f30::菠菜
[0242]
uugccauguguauguggggacgcaacugaaugaaauggugaaggacggguccagguguggcugcuucggcagugcagcuuguugaguagagugugagcuccguaacuagucgcguccccacauacucugaugauccnnnnggaucauucauggcaa
[0243]
seq id no:59
[0244]
f30::菠菜2
[0245]
uugccauguguauguggggauguaacugaaugaaauggugaaggacggguccaguaggcugcuucggcagccuacuuguugaguagagugugagcuccguaacuaguuacauccccacauacucugaugauccnnnnggaucauucauggcaa
[0246]
seq id no:60
[0247]
f30::西兰花
[0248]
uugccauguguaugugggagacggucggguccagauauucguaucugucgaguagagugugggcucccacauacucugaugauccnnnnggaucauucauggcaa
[0249]
seq id no:61
[0250]
f30::玉米
[0251]
uugccauguguaugugggcgaggaaggaggucugaggaggucacugcccacauacucugaugauccnnnnggaucauucauggcaa
[0252]
seq id no:62
[0253]
f30::橙色西兰花
[0254]
uugccauguguaugugggagacggucggguccaggugcacaaauguggccuguugaguagcgugugggcucccacauacucugaugauccnnnnggaucauucauggcaa
[0255]
seq id no:63
[0256]
f30::红色西兰花
[0257]
uugccauguguaugugggagacggucggguccagucccaacgauguuggcuguugaguagugugugggcucccacauacucugaugauccnnnnggaucauucauggcaa
[0258]
seq id no:64
[0259]
f30::嫩菠菜
[0260]
uugccauguguaugugggaaggacggguccguugaguagagugugagcccaca uacucugaugauccnnnnggaucauucauggcaa
[0261]
seq id no:77
[0262]
f30-西兰花-西兰花
[0263]
uugccauguguaugugggagacggucggguccagauauucguaucugucgaguagagugugggcucccacauacucugaugauccagacggucggguccagauauucguaucugucgaguagagugugggcuggaucauucauggcaa
[0264]
seq id no:78
[0265]
f30-西兰花-芒果
[0266]
uugccauguguaugugggagacggucggguccagauauucguaucugucgaguagagugugggcucccacauacucugaugauccgaagggacggugcggagaggagaggaucauucauggcaa
[0267]
本发明中使用的载体可以通过本领域已知的任何方法引入细胞中，例如通过转化、转染或病毒转导。本领域技术人员知道如何可以进一步优化这些方法以确保载体以足够的量存在于每个细胞中。本发明设想，一旦载体被引入细胞，就可以将其整合到染色体中。这种整合可能不一定包括完整的载体序列，而是在给定的遗传环境中表达靶rna所需的载体片段。
[0268]
根据本发明的方法旨在通过鉴定增加rna产生的细胞或培养条件来优化rna产生。因此，在一个实施方案中，本发明方法中使用的细胞携带可能影响rna表达的染色体遗传突变。可以使用本领域已知的任何技术对细胞进行诱变，例如，通过uv辐射的随机诱变或定点诱变，例如通过crispr-cas。
[0269]
在另一个实施方案中，细胞携带不同的载体，这些载体都能够表达相同的感兴趣的rna，但载体中包含的其他元素不同，因此来自载体的rna产量不同。
[0270]
一旦将载体引入细胞中，就在允许异源rna表达的条件下培养细胞。在感兴趣的异源rna的表达是有条件的情况下，可以首先在不诱导表达的情况下培养细胞，并在一段时间后诱导表达。
[0271]
在一个实施方案中，细胞之间的培养条件是变化的，例如关于温度、溶解氧水平、
搅拌速度、压力或培养基。该实施方案允许鉴定用于表达异源rna的最佳培养条件。因此，本发明的方法也可用于优化生产感兴趣的特定rna的培养条件。
[0272]
在细胞培养足够长的时间以表达来自载体的异源rna后，将能够结合标记有异源rna的核酸适配体的荧光团添加到培养基中，并允许其进入细胞，在那里它可以结合核酸适配体。本领域已知如何确定培养基中荧光团的合适浓度。
[0273]
在那些具有高浓度感兴趣的异源rna的细胞中，标签以更高的量存在，因此更高量的荧光团将被结合并发出荧光。相反，那些仅显示出低浓度的包括标签的感兴趣rna的细胞将携带较少活化的荧光团，即与核酸适配体结合的荧光团并因此发射较少的荧光。重要的是，存在于细胞中但未与核酸适配体结合的荧光团将仅表现出非常弱或没有荧光。
[0274]
每个细胞发出的荧光程度可以使用本领域已知的任何技术来确定。在一个实施方案中，通过光谱法评估细胞。在优选实施方案中，通过流式细胞术根据细胞的荧光水平对细胞进行分选。这允许识别并同时分离那些显示出高水平荧光的细胞。随后可以分析分离的细胞携带的遗传改变或载体中的染色体遗传改变。同样，可以确定产生最高数量荧光细胞的那些培养条件。
[0275]
在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于比较不同细胞对感兴趣的异源rna序列的生产能力的方法，包括以下步骤：
[0276]
d)将能够表达感兴趣的异源rna的载体引入多个细胞中，其中所述的rna用rna标签标记，包含
[0277]
·
能够稳定荧光团的核酸适配体以及
[0278]
·
能够稳定核酸适配体的支架；
[0279]
e)在允许感兴趣的rna表达的条件下，在培养基中培养细胞；
[0280]
f)将所述的荧光团加入所述的培养基中；
[0281]
g)比较所述的多个细胞之间的荧光强度。
[0282]
在另一个方面，本发明涉及一种生产感兴趣的rna的方法，包括以下步骤：
[0283]
a)将能够表达感兴趣的异源rna的第一载体引入多个细胞，其中所述的rna用rna标签标记，所述的rna标签包含能够稳定荧光团的核酸适配体和能够稳定所述的核酸适配体的支架；
[0284]
b)在允许感兴趣的异源rna表达的条件下，在培养基中培养细胞；
[0285]
c)将所述荧光团加入所述培养基中；
[0286]
d)鉴定和分离那些显示出最高荧光强度并因此显示出感兴趣的rna的高表达的细胞；
[0287]
e)从在步骤d)中分离的细胞中去除步骤a)的第一载体；
[0288]
f)将能够在没有rna标签的情况下表达感兴趣的异源rna的第二载体引入步骤e)获得的细胞中；
[0289]
g)通过培养在步骤f)中获得的细胞来产生感兴趣的rna。
[0290]
根据本发明的方法生产感兴趣的rna包括第一识别细胞，在rna标签的帮助下显示出感兴趣的rna的高表达，然后使用这些细胞生产感兴趣rna。
[0291]
因为希望最终产物不包括任何不必要的序列，所以一旦鉴定出合适的细胞，就在rna生产之前移除能够表达感兴趣的标记rna的载体。载体的去除可以通过制备电活性细胞
来实现，如前所述(tauch，a.，kirchner，o.，b.，s.，p
ü
hler，a.,and kalinowski，j.efficient electrotransformation of corynebacterium diphtheriae with a mini-replicon derived from the corynebacterium glutamicum plasmid pga.curr.microbiol.2002；45,362-367)和在不添加dna模板的情况下对这些细胞进行电穿孔。这增加了自发载体丢失的可能性。随后用与第一载体相同的第二载体转化细胞，不同之处在于第二载体不包含rna标签。然后将这些细胞用于产生感兴趣的rna。
[0292]
所产生的rna的提取和纯化可以根据本领域已知的方法进行。同样，在提取后可以使用已知的技术对所产生的rna的量进行定量。
[0293]
本发明的方法允许通过特异性选择表现出感兴趣rna高表达的细胞来最大化感兴趣rna的产生。因为本发明中使用的载体可以很容易地被工程化以携带任何感兴趣的rna，所以本发明提供了一种快速、有效和普遍适用的方法，以在生产某种rna分子时节省成本和时间。
[0294]
在第三个方面，本发明涉及携带能够表达感兴趣的异源rna的载体的微生物细胞，其中所述的rna用rna标签标记，所述的rna标签包含
[0295]-能够稳定荧光团的核酸适配体，以及
[0296]-能够稳定核酸适配体的rna支架。
[0297]
根据本发明的细胞携带能够表达感兴趣的异源rna的载体。“携带”在本文中的定义是指细胞含有或包含载体，该载体作为染色体外质粒或整合到其一条或几条染色体中。
[0298]
因为本发明的细胞表达的异源rna被标记，所以一旦将相应的荧光团添加到细胞中，就可以对其进行检测和定量。因此，根据本发明的细胞可以基于它们产生的异源rna的量而容易且方便地进行分类和分离(例如通过流式细胞术)。
[0299]
实施例
[0300]
在下文中，参考附图和实施例更详细地描述本发明，然而这些附图和实施方案并不旨在限制本发明。
[0301]
实施例1
[0302]
a)载体pjc1-pf1-u1a-f30::西兰花/uucg-tf1和pjc1-pf1-u1a-tf1的构建
[0303]
质粒载体的构建是通过化学合成合成dna片段(pjc1-pf1-u1a-tf1的seq id no:72和pjc1-pf1-u1a-f30::西兰花/uucg-tf1的seq id no:71)的方式并将其连接到pjc1中(cremer,j.,treptow,c.,eggeling,l.,and sahm,h.regulation of enzymes of lysine biosynthesis in corynebacterium glutamicum.microbiol.1988；134,3221-3229)。seq id no:71含有启动子p
f1
(seq id no:67)，即先前描述的非编码重组u1a*-rna(seq id no:68)(hashiro,s.,mitsuhashi,m.,and yasueda,h.overexpression system for recombinant rna in corynebacterium glutamicum using a strong promoter derived from corynephage bfk20.j.biosci.bioeng.2019；128,255-263)，f30支架(seq id no:69)，在第一整合点具有西兰花核酸适配体(seq id no：8)，在第二整合点具有“uucg间隔”，以及终止子序列t
f1
(seq id no:70)。seq id no:72包含启动子p
f1
(seq id no:67)、非编码重组u1a*-rna(seq id no:68)和终止子序列t
f1
(seq id no:70)，但既没有支架也没有核酸适配体序列。
[0304]
在用限制性内切酶xbai和sali切割合成的dna片段并随后纯化反应混合物之后，
将切下的dna片段用于与载体pjc1的单独连接反应，该载体pjc1也用xbai或sali线性化并去磷酸化。将连接混合物直接用于转化大肠杆菌xl1-蓝，并在含有50μg/ml卡那霉素的lb板上进行转化子的选择。将生长在这些板上并因此对卡那霉素具有抗性的16个菌落用于菌落pcr。用引物pjc1_check_f(seq id no:73)和pjc1_check_rev(seq id no:74)进行菌落pcr，以分析合成片段是否插入载体pjc1中。在琼脂糖凝胶中对菌落pcr产物的分析显示，在所分析的样品中，预期的pcr产物具有521bp(pjc1-pf1-u1a-tf1)和626bp(pjc1-pf1-u1a-f30::西兰花/uucg-tf1)的大小，于是培养四个菌落用于更大规模的质粒制备。培养16小时后，通过离心收集这些培养物并制备质粒dna。用菌落pcr中使用的引物对其中两种质粒制剂进行测序。插入物的序列分析显示与预期序列100％一致。所得质粒分别命名为pjc1-pf1-u1a-tf1(seq id no:76)和pjc1-pf1-u1a-f30::西兰花/uucg-tf1(seq id no:75)。
[0305]
seq id no:67
[0306]
pf1:
[0307]
ctcgagcgggacggtcgaaccagcttcaagcgaccggatgagtatgttacagtaga tagcg
[0308]
seq id no:68
[0309]
靶rna:
[0310]
agcgggagaccgctcgaccttagttctcctgttgcgggggagttcatgggatccag gtacccagggcgaggcttatccattgcactccggatgtgctgacccctg
[0311]
seq id no:69
[0312]
f30，插入位点1为西兰花，插入位点2为“ttcg”:
[0313]
ttgccatgtgtatgtgggagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagag tgtgggctcccacatactctgatgatccttcgggatcattcatggcaa
[0314]
seq id no:70
[0315]
tf1:
[0316]
ctagcatagcataaaataacgccccaccttcttaacgggaggtggggcgttattttt acggggatcgct
[0317]
seq id no:71
[0318]
seq id no:67-70组合，在5'-端具有xbai识别位点，在3'-端具有sali识别位点：
[0319]
ctgtctctagactcgagcgggacggtcgaaccagcttcaagcgaccggatgagtatgttacagtagatagcgagcgggagaccgctcgaccttagttctcctgttgcgggggagttcatgggatccaggtacccagggcgaggcttatccattgcactccggatgtgctgacccctgttgccatgtgtatgtgggagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcccacatactctgatgatccttcgggatcattcatggcaagctagcatagcataaaataacgccccaccttcttaacgggaggtggggcgttatttttacggtcgacctgtcseq id no:72
[0320]
seq id no:67，68和70，在5'-端具有xbai识别位点，在3'-端具有sali识别位点：
[0321]
ctgtctctagactcgagcgggacggtcgaaccagcttcaagcgaccggatgagtatgttacagtagatagcgagcgggagaccgctcgaccttagttctcctgttgcgggggagttcatgggatccaggtacccagggcgaggcttatccattgcactccggatgtgctgacccctggctagcatagcataaaataacgccccaccttcttaacgggaggtggggcgttatttttacggtcgacctgtc
[0322]
seq id no:73
[0323]
pjc1_check_f:
[0324]
tgaagaccgtcaaccaaagg
[0325]
seq id no:74
[0326]
pjc1_check_rev:
[0327]
tgccgggaagctagagtaag
[0328]
seq id no:75
[0329]
pjc1-pf1-u1a-f30::西兰花/uucg-tf1
[0330]
ccgagaagttttttacaaaaggcaaaaactttttcgggatcgacagaaataaaacgatcgacggtacgcaacaaaaaagcgtcaggatcgccgtagagcgattgaagaccgtcaaccaaaggggaagcctccaatcgacgcgacgcgcgctctacggcgatcctgacgcagatttttagctatctgtcgcagcgccctcagggacaagccacccgcacaacgtcgcgagggcgatcagcgacgccgcagggggatcctctagactcgagcgggacggtcgaaccagcttcaagcgaccggatgagtatgttacagtagatagcgagcgggagaccgctcgaccttagttctcctgttgcgggggagttcatgggatccaggtacccagggcgaggcttatccattgcactccggatgtgctgacccctgttgccatgtgtatgtgggagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcccacatactctgatgatccttcgggatcattcatggcaagctagcatagcataaaataacgccccaccttcttaacgggaggtggggcgttatttttacggtcgacctgcagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccttaataagatgatcttcttgagatcgttttggtctgcgcgtaatctcttgctctgaaa
[0331]
acgaaaaaaccgccttgcagggcggtttttcgaaggttctctgagctaccaactctttg
[0332]
aaccgaggtaactggcttggaggagcgcagtcaccaaaacttgtcctttcagtttagcc
[0333]
ttaaccggcgcatgacttcaagactaactcctctaaatcaattaccagtggctgctgcca
[0334]
gtggtgcttttgcatgtctttccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgc
[0335]
agcggtcggactgaacggggggttcgtgcatacagtccagcttggagcgaactgccta
[0336]
cccggaactgagtgtcaggcgtggaatgagacaaacgcggccataacagcggaatgac
[0337]
accggtaaaccgaaaggcaggaacaggagagcgcacgagggagccgccagggggaa
[0338]
acgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccaccactgatttgagcgtcagatttc
[0339]
gtgatgcttgtcaggggggcggagcctatggaaaaacggctttgccgcggccctctcac
[0340]
ttccctgttaagtatcttcctggcatcttccaggaaatctccgccccgttcgtaagccatt
[0341]
tccgctcgccgcagtcgaacgaccgagcgtagcgagtcagtgagcgaggaagcggaat
[0342]
atatcctgtatcacatattctgctgacgcaccggtgcagccttttttctcctgccacatga
[0343]
agcacttcactgacaccctcatcagtgccaacatagtaagccagtatacactccgctagc
[0344]
gctgaggtctgcctcgtgaagaaggtgttgctgactcataccaggcctgaatcgcccca
[0345]
tcatccagccagaaagtgagggagccacggttgatgagagctttgttgtaggtggacc
[0346]
agttggtgattttgaacttttgctttgccacggaacggtctgcgttgtcgggaagatgc
[0347]
gtgatctgatccttcaactcagcaaaagttcgatttattcaacaaagccacgttgtgtct
[0348]
caaaatctctgatgttacattgcacaagataaaaatatatcatcatgaacaataaaactgt
[0349]
ctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaacgtctt
[0350]
gctcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctc
[0351]
gcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgc
[0352]
cagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatg
[0353]
gtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatcc
[0354]
gtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccgggaaaaca
[0355]
gcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttga
[0356]
tgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaatt
[0357]
gtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacga
[0358]
atgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatgg
[0359]
ctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataagcttttgccattct
[0360]
caccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatt
[0361]
tttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaat
[0362]
cgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagt
[0363]
tttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataat
[0364]
cctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttcta
[0365]
atcagaattggttaattggttgtaacactggcagagcattacgctgactt
[0366]
gacgggacggcggctttgttgaataaatcgaacttttgctgagttgaagg
[0367]
atcagatcacgcatcttcccgacaacgcagaccgttccgtggcaaagcaa
[0368]
aagttcaaaatcaccaactggtccacctacaacaaagctctcatcaaccg
[0369]
tggctccctcactttctggctggatgatggggcgattcaggcctggtatg
[0370]
agtcagcaacaccttcttcacgaggcagacctcagcgctcaaagatgcag
[0371]
gggtaaaagctaaccgcatctttaccgacaaggcatccggcagttcaaca
[0372]
gatcgggaagggctggatttgctgaggatgaaggtggaggaaggtgatgt
[0373]
cattctggtgaagaagctcgaccgtcttggccgcgacaccgccgacatga
[0374]
tccaactgataaaagagtttgatgctcagggtgtagcggttcggtttatt
[0375]
gacgacgggatcagtaccgacggtgatatggggcaaatggtggtcaccat
[0376]
cctgtcggctgtggcacaggctgaacgccggaggatcaagtcggtcaagc
[0377]
caagcgcaaccagcggcaccgccgcgagcaacgtcgcaagggcgatcagg
[0378]
ggacgatttttgcgaagaatttccacggtaagaatccaatctctcgaatt
[0379]
tagggtgaaagaagcttggcataggggtgtgcacgaactcggtggaggaa
[0380]
atttccgcggggcaaggcttcgcgaagcggagtcgcggcagtggctttga
[0381]
agatctttgggagcagtccttgtgcgcttacgaggtgagccggtggggaa
[0382]
ccgttatctgcctatggtgtgagcccccctagagagcttcaagagcaatc
[0383]
agcccgacctagaaaggaggccaagagagagacccctacggggggaaccg
[0384]
ttttctgcctacgagatggcacatttactgggaagctttacggcgtcctc
[0385]
gtggaagttcaatgcccgcagacttaagtgctctattcacggtctgacgt
[0386]
gacacgctaaattcagacatagcttcattgattgtcggccacgagccagt
[0387]
ctctccctcaacagtcataaaccaacctgcaatggtcaagcgatttcctt
[0388]
tagctttcctagcttgtcgttgactggacttagctagtttttctcgctgt
[0389]
gctcgggcgtactcactgtttgggtctttccagcgttctgcggccttttt
[0390]
accgccacgtcttcccatagtggccagagcttttcgccctcggctgctct
[0391]
gcgtctctgtctgacgagcagggacgactggctggcctttagcgacgtag
[0392]
ccgcgcacacgtcgcgccatcgtctggcggtcacgcatcggcggcagatc
[0393]
aggctcacggccgtctgctccgaccgcctgagcgacggtgtaggcacgct
[0394]
cgtaggcgtcgatgatcttggtgtcttttaggcgctcaccagccgctttt
[0395]
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[0396]
ggcacgccctggagcagtccagaggacacggacgccgtcgatcagctctc
[0397]
cagacgcttcagcggcgctcggcaggcttgcttcaagcgtggcaagtgct
[0398]
tttgcttccgcagtggcttttcttgccgcttcgatacgtgcccgtccgct
[0399]
agaaaactcctgctcatagcgttttttaggtttttctgtgcctgagatca
[0400]
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[0401]
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[0402]
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[0403]
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[0404]
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[0405]
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[0406]
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[0407]
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[0408]
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[0409]
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[0410]
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[0411]
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[0412]
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[0413]
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[0414]
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[0415]
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[0417]
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[0418]
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[0421]
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[0422]
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[0423]
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[0424]
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[0426]
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[0427]
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[0428]
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[0429]
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[0430]
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[0431]
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[0433]
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[0434]
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[0435]
tcgtgatgcttgtcaggggggcggagcctatggaaaaacggctttgccgc
[0436]
ggccctctcacttccctgttaagtatcttcctggcatcttccaggaaatc
[0437]
tccgccccgttcgtaagccatttccgctcgccgcagtcgaacgaccgagc
[0438]
gtagcgagtcagtgagcgaggaagcggaatatatcctgtatcacatattc
[0439]
tgctgacgcaccggtgcagccttttttctcctgccacatgaagcacttca
[0440]
ctgacaccctcatcagtgccaacatagtaagccagtatacactccgctag
[0441]
cgctgaggtctgcctcgtgaagaaggtgttgctgactcataccaggcctg
[0442]
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[0443]
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[0444]
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[0445]
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[0446]
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[0447]
gcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacggga
[0448]
aacgtcttgctcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttat
[0449]
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[0450]
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[0451]
caaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaact
[0452]
ggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtact
[0453]
cctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccgggaaaacagcatt
[0454]
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[0455]
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[0456]
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[0457]
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[0458]
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[0459]
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[0460]
cgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcag
[0461]
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[0462]
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[0463]
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[0464]
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[0465]
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[0466]
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[0467]
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[0468]
ccctcactttctggctggatgatggggcgattcaggcctggtatgagtca
[0469]
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[0470]
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[0471]
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[0472]
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[0473]
ctgataaaagagtttgatgctcagggtgtagcggttcggtttattgacga
[0474]
cgggatcagtaccgacggtgatatggggcaaatggtggtcaccatcctgt
[0475]
cggctgtggcacaggctgaacgccggaggatcaagtcggtcaagccaagc
[0476]
gcaaccagcggcaccgccgcgagcaacgtcgcaagggcgatcaggggacg
[0477]
atttttgcgaagaatttccacggtaagaatccaatctctcgaatttaggg
[0478]
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[0479]
cgcggggcaaggcttcgcgaagcggagtcgcggcagtggctttgaagatc
[0480]
tttgggagcagtccttgtgcgcttacgaggtgagccggtggggaaccgtt
[0481]
atctgcctatggtgtgagcccccctagagagcttcaagagcaatcagccc
[0482]
gacctagaaaggaggccaagagagagacccctacggggggaaccgttttc
[0483]
tgcctacgagatggcacatttactgggaagctttacggcgtcctcgtgga
[0484]
agttcaatgcccgcagacttaagtgctctattcacggtctgacgtgacac
[0485]
gctaaattcagacatagcttcattgattgtcggccacgagccagtctctc
[0486]
cctcaacagtcataaaccaacctgcaatggtcaagcgatttcctttagct
[0487]
ttcctagcttgtcgttgactggacttagctagtttttctcgctgtgctcg
[0488]
ggcgtactcactgtttgggtctttccagcgttctgcggcctttttaccgc
[0489]
cacgtcttcccatagtggccagagcttttcgccctcggctgctctgcgtc
[0490]
tctgtctgacgagcagggacgactggctggcctttagcgacgtagccgcg
[0491]
cacacgtcgcgccatcgtctggcggtcacgcatcggcggcagatcaggct
[0492]
cacggccgtctgctccgaccgcctgagcgacggtgtaggcacgctcgtag
[0493]
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[0494]
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[0495]
gccctggagcagtccagaggacacggacgccgtcgatcagctctccagac
[0496]
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[0497]
ttccgcagtggcttttcttgccgcttcgatacgtgcccgtccgctagaaa
[0498]
actcctgctcatagcgttttttaggtttttctgtgcctgagatcatgcga
[0499]
gcaacctccataagatcagctaggcgatccacgcgattgtgctgggcatg
[0500]
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[0501]
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[0502]
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[0503]
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[0504]
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[0505]
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[0506]
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[0507]
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[0508]
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[0509]
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[0510]
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[0511]
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[0512]
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[0513]
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[0514]
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[0515]
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[0516]
tgacacgtcctgggcggccacggccacacgaaacgcggcatttacgatgt
[0517]
ttgtcatgcctgcgggcaccgcgccacgatcgcggataattctcgctgcc
[0518]
gcttccagctctgtgacgaccatggccaaaatttcgctcgggggacgcac
[0519]
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[0520]
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[0521]
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[0522]
gtaggcgcaactgattcgatcctccactactgtgcgtcctcctggcgctg
[0523]
ccgagcacgcagctcgtcagccagctcctcaagatccgccacgagagttt
[0524]
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[0525]
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[0526]
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[0527]
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[0528]
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[0529]
cacgaagcgggactttgcgcagctcaggggtgctaaaaattttgtatcgc
[0530]
acttgatttttccgaaagacagattatctgcaaacggtgtgtcgtatttc
[0531]
tggcttggtttttaaaaaatctggaatcgaaaatttgcggggcga
[0532]
b)pjc1-pf1-u1a-f30::西兰花/uucg-tf1和pjc1-pf1-u1a-tf1转化谷氨酸棒状杆菌
[0533]
根据tauch等人，2002(tauch,a.,kirchner,o.,b.,s.,p
ü
hler,a.,and kalinowski,j.efficient electrotransformation of corynebacterium diphtheriae with a mini-replicon derived from the corynebacterium glutamicum plasmid pga 1.curr.microbiol.2002；45,362-367t)制备谷氨酸棒状杆菌菌株atcc 13032δcg2273的感受态细胞，并用pjc1 pf1 u1a f30::西兰花/uucg-tf1和pjc1-pf1-u1a-tf1转化。转化子的选择是在有15μg/ml卡那霉素的cgiii(menkel，e.,thierbach,g.,eggeling,l.,and sahm,h.influence of increased aspartate availability on lysine formation by a recombinant strain of corynebacterium glutamicum and utilization of fumarate.appl.environ.microbiol.1989；55,684-688)琼脂(1％)板上进行的。由此获得的克隆被命名为谷氨酸棒状杆菌atcc 13032δcg2273 pjc1-pf1-u1a-f30::西兰花/uucg-tf1或谷氨酸棒状杆菌atcc 13032
△
cg2273 pjc1-pf1-u1a-tf1，这取决于用于转化的质粒。
[0534]
c)谷氨酸棒状杆菌atcc 13032δcg2273 pjc1-pf1-u1a-f30::西兰花/uucg-tf1的突变
[0535]
将产生的菌株谷氨酸棒状杆菌atcc 13032δcg2273 pjc1-pf1-u1a-f30::西兰花/uucg-tf1在cgiii培养基中培养过夜，温度为30℃，转速为120rpm，总体积为10ml，培养基中加入15μg/ml卡那霉素。使用来自该预培养物的细胞制备在5ml总体积的磷酸盐缓冲盐水(pbs)中od
600
为0.5的细胞悬浮液。将n-甲基-n
’‑
硝基-n-亚硝基胍(mnng)添加至最终浓度为25μg/ml。孵育20分钟后，取1.5ml样品，离心(2000rpm，2分钟)并重悬于2ml pbs中。该洗涤步骤重复两次，然后在1.5ml pbs中最终重悬，并转移到含有15μg/ml卡那霉素的15ml新鲜cgiii培养基中。将培养物在无挡板摇瓶中30℃、120rpm下培养16小时。
[0536]
d)通过荧光激活细胞分选(facs)鉴定和分离显示最高荧光强度并因此高表达感兴趣rna的细胞
[0537]
使用最终浓度为500μm dfhbi的pbs将来自c)的再生培养物稀释至od为0.6。孵育10m后，在配备有70μm喷嘴的ariaiii高速细胞分选机(bd biosciences，franklin lakes，nj，usa)中分析细胞悬浮液，并在70psi的鞘压下运行。使用488nm蓝色固体激光器进行激发。将前向散射特性(fsc)记录为小角度散射，将侧散射特性(ssc)记录为488nm激光器的正交散射。502nm长通和530/30nm带通滤波器的组合用于荧光检测。facsdiva 8.0.1(bd biosciences，san jose，usa)用于facs控制和数据分析。在数据采集之前，通过fsc-h与
pf1-u1a-tf1转化由此产生的无质粒菌株，以能够在没有由f30支架和西兰花组成的标签的情况下产生靶rna。与对照菌株谷氨酸棒状杆菌atcc 13032δcg2273 pjc1-pf1-u1a-tf1相比，根据e)中所述的菌株的培养以及如f)中所描述的所产生的rna的提取和分析证实了靶rna的产生增加。
[0546]
该实验表明，本发明通过将迄今为止不显著的表型(rna产生)与荧光输出连接，能够从诱变的细胞培养基中分离出具有改进的目的异源rna产生的细胞。
[0547]
实施例2
[0548]
a)pk19msb_16s rrna-西兰花载体的构建
[0549]
通过化学合成的方式合成的dna片段(16s rrna-西兰花的seq id no:79)，并将其插入pk19mobsacb的限制性位点ecori和hindiii中，得到质粒pk19msb_16s rrnb-西兰花(seq id no:80)(从美国南旧金山twist bioscience订购)，从而实现质粒的构建。seq id no:79包含核酸适配体整合位点(seq id no:81)上游601bp、用于验证正整合的限制性位点(seq id no:122:tctaga)、插入位点中具有西兰花核酸适配体的f30支架(seq id no:69)和靶整合位点下游479bp(seq id no:83)。
[0550]
seq id no:79
[0551]
seq id no:81,82,83and 69组合:
[0552]
cgcacaagcggcggagcatgtggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctgggcttgacatggaccggatcggcgtagagatacgttttcccttgtggtcggttcacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtcttatgttgccagcacattgtggtgggtactcatgagagactgccggggttaactcggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgtccagggcttcacacatgctacaatggtcggtacagcgagttgccacaccgtgaggtggagctaatctcttaaagccggcctcagttcggattggggtctgcaactcgaccccatgaagtcggagtcgctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcatgaaagttggtaacacccgaagccagtggcccaaccttttaggggggagctgtcgaaggtgggatcggcgattgggacgaagtcgtaacaaggtagccgtaccggaaggtgcggctggatctagattgccatgtgtatgtgggagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcccacatactctgatgatccttcgggatcattcatggcaacctcctttctaaggagctttattaacccacatcagactgtgtctggttggtgggttgttggtgttggaacccgtatgtggttgccatcaacatatttttaatcgggtggagatgacccctcgggtgacaacaacacagcaaacagtgctgtgattaataggtggcatgctgttgggtgtctggaatgacatcgcaagcatcaccttttggtggtgtgtgtgggttgtttctaacatcgagcatcgtcaacacgggtagagaatgttgtgttctttggttgtggtgggggtggtgtgttgtgtgagaactgtatagtggacgcgagcatctttatttttttgttttttgttgtgtgataccgaacgcgcccgcactttgtgtgtgggttatagtattttgtttgttgttttgtagggcacacggtggatgccttggcatatcaagccgatgaaggacgtgagaggctgcgttatgcctcg
[0553]
seq id no:80
[0554]
pk19msb_16s rrna-西兰花:
[0555]
cgcacaagcggcggagcatgtggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctgggcttgacatggaccggatcggcgtagagatacgttttcccttgtggtcggttcacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtcttatgttgccagcacattgtggtgggtactcatgagagactgccggggttaactcggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgtccagggcttcacacatgctacaatggtcggtacagcgagttgccacaccgtgaggtggagctaatctcttaaagccggcctcagttcggattg
gggtctgcaactcgaccccatgaagtcggagtcgctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcatgaaagttggtaacacccgaagccagtggcccaaccttttaggggggagctgtcgaaggtgggatcggcgattgggacgaagtcgtaacaaggtagccgtaccggaaggtgcggctggatctagattgccatgtgtatgtgggagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcccacatactctgatgatccttcgggatcattcatggcaacctcctttctaaggagctttattaacccacatcagactgtgtctggttggtgggttgttggtgttggaacccgtatgtggttgccatcaacatatttttaatcgggtggagatgacccctcgggtgacaacaacacagcaaacagtgctgtgattaataggtggcatgctgttgggtgtctggaatgacatcgcaagcatcaccttttggtggtgtgtgtgggttgtttctaacatcgagcatcgtcaacacgggtagagaatgttgtgttctttggttgtggtgggggtggtgtgttgtgtgagaactgtatagtggacgcgagcatctttatttttttgttttttgttgtgtgataccgaacgcgcccgcactttgtgtgtgggttatagtattttgtttgttgttttgtagggcacacggtggatgccttggcatatcaagccgatgaaggacgtgagaggctgcgttatgcctcgaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtat
[0556]
tgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggc
[0557]
gagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataac
[0558]
gcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggcc
[0559]
gcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacg
[0560]
ctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctg
[0561]
gaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcct
[0562]
ttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcgg
[0563]
tgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgc
[0564]
tgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgcca
[0565]
ctggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacag
[0566]
agttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcg
[0567]
ctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaa
[0568]
accaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaa
[0569]
aggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaa
[0570]
actcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttt
[0571]
tggggtgggcgaagaactccagcatgagatccccgcgctggaggatcatccagccctg
[0572]
atagaaacagaagccactggagcacctcaaaaacaccatcatacactaaatcagtaagt
[0573]
tggcagcatcacccgacgcactttgcgccgaataaatacctgtgacggaagatcacttc
[0574]
gcagaataaataaatcctggtgtccctgttgataccgggaagccctgggccaacttttg
[0575]
gcgaaaatgagacgttgatcggcacgtaagaggttccaactttcaccataatgaaataa
[0576]
gatcactaccgggcgtattttttgagttatcgagattttcaggagctgatagaaacagaa
[0577]
gccactggagcacctcaaaaacaccatcatacactaaatcagtaagttggcagcatcac
[0578]
ccgacgcactttgcgccgaataaatacctgtgacggaagatcacttcgcagaataaata
[0579]
aatcctggtgtccctgttgataccgggaagccctgggccaacttttggcgaaaatgaga
[0580]
cgttgatcggcacgtaagaggttccaactttcaccataatgaaataagatcactaccggg
[0581]
cgtattttttgagttatcgagattttcaggagctctttggcatcgtctctcgcctgtcccc
[0582]
tcagttcagtaatttcctgcatttgcctgtttccagtcggtagatattccacaaaacagc
[0583]
agggaagcagcgcttttccgctgcataaccctgcttcggggtcattatagcgattttttc
[0584]
ggtatatccatcctttttcgcacgatatacaggattttgccaaagggttcgtgtagacttt
[0585]
ccttggtgtatccaacggcgtcagcggggcaggataggtgaagtaggcccacccgcga
[0586]
gcgggtgttccttcttcactgtcccttattcgcacctggcggtgctcaacgggaatcctg
[0587]
ctctgcgaggctggccggctaccgccggcgtaacagatgagggcaagcggatggctga
[0588]
tgaaaccaagccaaccaggaagggcagcccacctatcaaggtgtactgccttccagac
[0589]
gaacgaagagcgattgaggaaaaggcggcggcggccggcatgagcctgtcggcctacc
[0590]
tgctggccgtcggccagggctacaaaatcacgggcgtcgtggactatgagcacgtccgc
[0591]
gagggcgtcccggaaaacgattccgaagcccaacctttcatagaaggcggcggtggaa
[0592]
tcgaaatctcgtgatggcaggttgggcgtcgcttggtcggtcatttcgctcggtacccat
[0593]
cggcattttcttttgcgtttttatttgttaactgttaattgtccttgttcaaggatgctgtc
[0594]
tttgacaacagatgttttcttgcctttgatgttcagcaggaagctcggcgcaaacgttg
[0595]
attgtttgtctgcgtagaatcctctgtttgtcatatagcttgtaatcacgacattgtttcct
[0596]
ttcgcttgaggtacagcgaagtgtgagtaagtaaaggttacatcgttaggatcaagatc
[0597]
catttttaacacaaggccagttttgttcagcggcttgtatgggccagttaaagaattaga
[0598]
aacataaccaagcatgtaaatatcgttagacgtaatgccgtcaatcgtcatttttgatccg
[0599]
cgggagtcagtgaacaggtaccatttgccgttcattttaaagacgttcgcgcgttcaatt
[0600]
tcatctgttactgtgttagatgcaatcagcggtttcatcacttttttcagtgtgtaatcat
[0601]
cgtttagctcaatcataccgagagcgccgtttgctaactcagccgtgcgttttttatcgc
[0602]
tttgcagaagtttttgactttcttgacggaagaatgatgtgcttttgccatagtatgcttt
[0603]
gttaaataaagattcttcgccttggtagccatcttcagttccagtgtttgcttcaaatact
[0604]
aagtatttgtggcctttatcttctacgtagtgaggatctctcagcgtatggttgtcgcctg
[0605]
agctgtagttgccttcatcgatgaactgctgtacattttgatacgtttttccgtcaccgtc
[0606]
aaagattgatttataatcctctacaccgttgatgttcaaagagctgtctgatgctgatacg
[0607]
ttaacttgtgcagttgtcagtgtttgtttgccgtaatgtttaccggagaaatcagtgtag
[0608]
aataaacggatttttccgtcagatgtaaatgtggctgaacctgaccattcttgtgtttgg
[0609]
tcttttaggatagaatcatttgcatcgaatttgtcgctgtctttaaagacgcggccagcg
[0610]
tttttccagctgtcaatagaagtttcgccgactttttgatagaacatgtaaatcgatgtgt
[0611]
catccgcatttttaggatctccggctaatgcaaagacgatgtggtagccgtgatagtttg
[0612]
cgacagtgccgtcagcgttttgtaatggccagctgtcccaaacgtccaggccttttgca
[0613]
gaagagatatttttaattgtggacgaatcaaattcagaaacttgatatttttcattttttt
[0614]
gctgttcagggatttgcagcatatcatggcgtgtaatatgggaaatgccgtatgtttcctt
[0615]
atatggcttttggttcgtttctttcgcaaacgcttgagttgcgcctcctgccagcagtgc
[0616]
ggtagtaaaggttaatactgttgcttgttttgcaaactttttgatgttcatcgttcatgtc
[0617]
tccttttttatgtactgtgttagcggtctgcttcttccagccctcctgtttgaagatggca
[0618]
agttagttacgcacaataaaaaaagacctaaaatatgtaaggggtgacgccaaagtata
[0619]
cactttgccctttacacattttaggtcttgcctgctttatcagtaacaaacccgcgcgatt
[0620]
tacttttcgacctcattctattagactctcgtttggattgcaactggtctattttcctcttt
[0621]
tgtttgatagaaaatcataaaaggatttgcagactacgggcctaaagaactaaaaaatc
[0622]
tatctgtttcttttcattctctgtattttttatagtttctgttgcatgggcataaagttgcc
[0623]
tttttaatcacaattcagaaaatatcataatatctcatttcactaaataatagtgaacggc
[0624]
aggtatatgtgatgggttaaaaaggatcgatcctctagcgaaccccagagtcccgctca
[0625]
gaagaactcgtcaagaaggcgatagaaggcgatgcgctgcgaatcgggagcggcgata
[0626]
ccgtaaagcacgaggaagcggtcagcccattcgccgccaagctcttcagcaatatcacg
[0627]
ggtagccaacgctatgtcctgatagcggtccgccacacccagccggccacagtcgatga
[0628]
atccagaaaagcggccattttccaccatgatattcggcaagcaggcatcgccatgggtc
[0629]
acgacgagatcctcgccgtcgggcatccgcgccttgagcctggcgaacagttcggctg
[0630]
gcgcgagcccctgatgctcttcgtccagatcatcctgatcgacaagaccggcttccatcc
[0631]
gagtacgtgctcgctcgatgcgatgtttcgcttggtggtcgaatgggcaggtagccgga
[0632]
tcaagcgtatgcagccgccgcattgcatcagccatgatggatactttctcggcaggagca
[0633]
aggtgagatgacaggagatcctgccccggcacttcgcccaatagcagccagtcccttcc
[0634]
cgcttcagtgacaacgtcgagcacagctgcgcaaggaacgcccgtcgtggccagccac
[0635]
gatagccgcgctgcctcgtcttggagttcattcagggcaccggacaggtcggtcttgac
[0636]
aaaaagaaccgggcgcccctgcgctgacagccggaacacggcggcatcagagcagcc
[0637]
gattgtctgttgtgcccagtcatagccgaatagcctctccacccaagcggccggagaac
[0638]
ctgcgtgcaatccatcttgttcaatcatgcgaaacgatcctcatcctgtctcttgatcag
[0639]
atcttgatcccctgcgccatcagatccttggcggcaagaaagccatccagtttactttgc
[0640]
agggcttcccaaccttaccagagggcgccccagctggcaattccggttcgcttgctgtc
[0641]
cataaaaccgcccagtctagctatcgccatgtaagcccactgcaagctacctgctttctc
[0642]
tttgcgcttgcgttttcccttgtccagatagcccagtagctgacattcatccggggtcag
[0643]
caccgtttctgcggactggctttctacgtgttccgcttcctttagcagcccttgcgccct
[0644]
gagtgcttgcggcagcgtgaagctagcttatcgcgccattcgccattcaggctgcgcaa
[0645]
ctgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggg
[0646]
gatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgt
[0647]
aaaacgacggccagtgaatt
[0648]
seq id no:81
[0649]
靶整合地点(上游):
[0650]
cgcacaagcggcggagcatgtggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctgggcttgacatggaccggatcggcgtagagatacgttttcccttgtggtcggttcacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtcttatgttgccagcacattgtggtgggtactcatgagagactgccggggttaactcggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgtccagggcttcacacatgctacaatggtcggtacagcgagttgccacaccgtgaggtggagctaatctcttaaagccggcctcagttcggattggggtctgcaactcgaccccatgaagtcggagtcgctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcatgaaagttggtaacacccgaagccagtggcccaaccttttaggggggagctgtcgaaggtgggatcggcgattgggacgaagtcgtaacaaggtagccgtaccggaaggtgcggctgga
[0651]
seq id no:82
[0652]
用于验证正整合的限制位点
[0653]
tctaga
[0654]
seq id no:83
[0655]
靶整合位点(下游)：
[0656]
cctcctttctaaggagctttattaacccacatcagactgtgtctggttggtgggttgttggtgttggaacccgtatgtggttgccatcaacatatttttaatcgggtggagatgacccctcgggtgacaacaacacagcaaacagtgctgtgattaataggtggcatgctgttgggtgtctggaatgacatcgcaagcatcaccttttggtggtgtgtgtgggttgtttctaacatcgagcatcgtcaacacgggtagagaatgttgtgttctttggttgtggtgggggtggtgtgttgtgtgagaactgtatagtggacgcgagcatctttatttttttgttttttgttgtgtgataccgaacgcgcccgcactttgtgtgtgggttatagtattttgtttgttgttttgtagggcacacggtggatgccttggcatatcaagccgatgaaggacgtgagaggctgcgttatgcctcg
[0657]
b)通过使用质粒pk19msb_16s rrna-西兰花的转化和选择，在谷氨酸棒状杆菌atcc 13032δcg2273的16s rrna的3'端整合f30::西兰花
[0658]
根据tauch等人，2002(tauch,a.,kirchner,o.,b.,s.,p
ü
hler,a.,and kalinowski,j.efficient electrotransformation of corynebacterium diphtheriae with a mini-replicon derived from the corynebacterium glutamicum plasmid pga 1.curr.microbiol.2002；45,362-367t)制备谷氨酸棒状杆菌菌株atcc 13032δcg2273的感受态细胞，并通过电穿孔用pk19msb_16s rrna-西兰花转化。转化子的选择是在有25μg/ml卡那霉素的bhi(脑心输注)琼脂(1％)板上进行的。第一次和第二次重组如niebisch和bott，2001(niebisch and bott.molecular analysis of the cytochrome bc1-aa3 branch of the corynebacterium glutamicum respiratory chain containing an unusual diheme cytochrome c1.arch.microbiol.2001；175,282-294)先前所述进行。使用引物16s rrna-西兰花_for(seq id no:84)和16s rrna-西兰花_rev(seq id no:85)通过菌落pcr验证得到的克隆。所得到的pcr产物被限制性内切酶xbai消化，因为只有成功整合核酸适配体的克隆才能被xbai吸收。谷氨酸棒状杆菌atcc 13032δcg2273的基因组包含六个rrn簇拷贝(rrna、rrnb、rrnc、rrnd、rrne、rrnf)，每个包含16srrna、23s rrna和5s rrna(martin，barreiro，gonzalez-lavado，barriuso.ribosomal rna and ribosomal proteins in corynebacteria.2003.j biotechnol.4；104(1-3):41-53).由于所有rrn簇具有很高的序列相似性，所有六个簇都是f30::西兰花的潜在整合位点。为此，使用通用引物(16srrna-西兰花_rev，seq id no:85)和簇特异性引物(rrna_rev seq id no:86，rrnb_rev seq id no:87，rrnc_rev seq id no:88，rrnd_rev seq id no:89，rrne_rev seq id no:90，rrnf_rev seq id no:91)，通过菌落pcr再次测试在第一次菌落pcr和消化中显示阳性整合的菌株。为了进一步的研究，使用了一个在rrna簇的3'端含有16s rrna-f30::西兰花融合物的克隆。由此产生的菌株被命名为谷氨酸棒状杆菌atcc 13032δcg2273_16s rrna-西兰花。
[0659]
seq id no:84
[0660]
16s rrna-西兰花_for:
[0661]
gtcttccacgacttctgtgc
[0662]
seq id no:85
[0663]
16s rrna-西兰花_rev:
[0664]
gtgtaaacctccacaccagc
[0665]
seq id no:86
[0666]
rrna_rev:
[0667]
cttgacctgggaagttgcg
[0668]
seq id no:87
[0669]
rrnb_rev:
[0670]
gcaagattgcttgctaccac
[0671]
seq id no:88
[0672]
rrnc_rev:
[0673]
agaaactcggagcgaccatc
[0674]
seq id no:89
[0675]
rrnd_rev:
[0676]
cgtcacacatcgctctacag
[0677]
seq id no:90
[0678]
rrne_rev:
[0679]
gaagccttcccatcaagcatc
[0680]
seq id no:91
[0681]
rrnf_rev:
[0682]
cacatcaaggtgacacggag
[0683]
c)使用荧光活化细胞分选(facs)培养和验证细胞
[0684]
将产生的菌株谷氨酸棒状杆菌atcc 13032δcg2273_16s rrna-西兰花在bhi琼脂平板上划线，在30℃下培养过夜。将生长的细胞重悬于cgiii培养基中，并在含有2ml cgiii培养液的管中将od
600
调节至0.75。将细胞在30℃和120rpm下孵育4小时。随后，使用最终浓度为500μm dfhbi的pbs将细胞稀释至od
600
为0.6。使用实施例1d)中已经描述的ariaiii高速细胞分选器对细胞进行分析。与未染色的细胞相比，dfhbi染色的细胞显示出显著增加的荧光输出(参见图2)。
[0685]
d)rna的提取和16s rrna-西兰花的逆转录定量pcr定量
[0686]
根据实施例1f)分离rna，每个样品使用1.38
×
109个细胞。根据wolf等人的方案进行逆转录定量pcr(qpcr)(wolf，timo et al.(2017)the malr type regulator acrc is a transcriptional repressor of acarbose biosynthetic genes in actinoplanes sp.se50/110,bmc genomics)，在罗氏公司(德国曼海姆)的96系统中的96孔板(sarstedt，n
ü
mbrecht，德国)中使用sensifast sybr no-rox一步试剂盒(bioline，london，united kingdom)，使用96sw 1.1(罗氏，曼海姆，德国)。相对rna量计算为2-δcq
。δcq计算为菌株谷氨酸棒状杆菌atcc 13032δcg2273_16s rrna-西兰花与基因组中没有f30::西兰花整合的对照菌株谷氨酸棒状杆菌atcc 13032δcg2273的平均cq的差异。对于qpcr，引物对qpcr_broc_fw(seq id no:92)和qpcr_broc_rev(seq id no:93)用于扩增结合f30::西兰花片段的233bp片段。结果显示了相对转录物水平，并验证
了菌株谷氨酸棒状杆菌atcc 13032δcg2273_16s rrna-西兰花制备的rna样品中16s rrna-f30::西兰花转录物的存在(参见图3)。
[0687]
seq id no:92
[0688]
qpcr_broc_fw:
[0689]
tcatgaaagttggtaacacccgaag
[0690]
seq id no:93
[0691]
qpcr_broc_rev:
[0692]
ttgccatgaatgatcccgaaggat
[0693]
该实验显示了迄今为止不显著的表型(rna产生)与荧光输出的成功连接。在这个实验中，产生的rna长度为1545个核苷酸，是从革兰氏阳性细菌细胞的染色体转录而来。因此，根据实施例1中所示的程序，使用本发明可以优化染色体基因座中编码的长rna的发酵生产。
[0694]
实施例3
[0695]
a)载体puc18_pt7-u1a-f30::西兰花/uucg-t7的构建
[0696]
通过化学合成合成的dna片段(pt7-u1a-f30::西兰花/uucg-tt7的seq id no:94)并将其连接到puc18中得到质粒puc18-pt7-u1a-f30::西兰花/uucg-tt7(seq id no：95，从美国南旧金山twist bioscience订购)进行质粒的构建(norrander j,kempe t,messing j.construction of improved m13 vectors using oligodeoxynucleotidedirected mutagenesis.gene.1983oec；26(1):1 01-6.)。seq id no:94包含启动子p
t7
(seq id no:66)、感兴趣的rna(seq id no:68)、在第一整合点具有西兰花核酸适配体和在第二整合点具有“uucg间隔”的f30支架(seq id no:69)和终止子序列t
t7
(seq id no:97)。
[0697]
在用限制性内切酶ecori和hindiii切割合成的dna片段并随后纯化反应混合物之后，将切下的dna片段用于与载体puc18的连接反应，该载体puc18也已用ecori和hindiii线性化并去磷酸化。将连接混合物直接用于转化大肠杆菌dh5α，并在含有100μg/ml羧苄青霉素的lb板上进行转化子的筛选。16个菌落生长在这些平板上，因此对羧苄青霉素具有耐药性，用于菌落pcr。用引物puc18_check_f(seq id no:98)和puc18_check_rev(seq id no:99)进行菌落pcr，以分析合成的片段是否插入载体puc18中。在琼脂糖凝胶上对菌落pcr产物的分析显示预期的pcr产物具有428bp的大小(puc18-pt7-u1a-f30::西兰花/uucg-t7)，于是培养三个菌落用于更大规模的质粒制备。培养16小时后，通过离心收集这些培养物，并制备质粒dna。用菌落pcr中使用的引物对其中两种质粒制剂进行测序，插入物的序列显示与预期序列100％一致。所得质粒命名为puc18-pt7-u1a-f30::西兰花/uucg-t7(seq id no:95)。
[0698]
seq id no:94
[0699]
seq id no:68、69、96和97组合，在5'-端具有ecori识别位点，在3'-端具有hindll识别位点：
[0700]
gaattctaatacgactcactatagagcgggagaccgctcgaccttagttctcctgttgcgggggagttcatgggatccaggtacccagggcgaggcttatccattgcactccggatgtgctgacccctgttgccatgtgtatgtgggagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcccacatactctgatgatccttcgggatcattcatggcaactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgaagctt
[0701]
seq id no:95
[0702]
puc18-pt7-u1a-f30::西兰花/uucg-tt7:
[0703]
aattctaatacgactcactatagagcgggagaccgctcgaccttagttctcctgttgcgggggagttcatgggatccaggtacccagggcgaggcttatccattgcactccggatgtgctgacccctgttgccatgtgtatgtgggagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcccacatactctgatgatccttcgggatcattcatggcaactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgaagcttggcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatg
cttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacg
[0704]
seq id no:96
[0705]
p
t7
:
[0706]
taatacgactcactatag
[0707]
seq id no:97
[0708]
t
t7
:
[0709]
ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg
[0710]
seq id no:98
[0711]
puc18_check_f:
[0712]
ttccggctcgtatgttgtg
[0713]
seq id no:99
[0714]
puc18_check_rev:
[0715]
aggcgattaagttgggtaacg
[0716]
b)用puc18 pt7 u1a f30::西兰花/uucg-tt7转化大肠杆菌ht115
[0717]
为了在大肠杆菌ht115细胞中转化质粒((timmons,court,fire(2001)ingestion of bacterially expressed dsrnas can produce specific and potent genetic interference in caenorhabditis elegans.gene 263(2001)103-112)，使用根据chung等人，1989(chung,niemela,miller(1989).one-step preparation of competent escherichia coli:transformation and storage of bacterial cells in the same solution.proc natl acad sci usa 86,2172-2175).)的转化和储存溶液(tss)转化方案。将目标菌株的单个菌落接种在含有3ml lb培养基的试管中，并生长直到od
600
达到0.3和0.8之间。随后，将培养物在冰上冷却10分钟。加入等体积(3ml)的冰冷的2x tss(8g/l细菌-胰蛋白酶、5g/l酵母提取物、5g/l nacl、200g/l peg 8000)，并通过避免加热细胞来彻底涡旋管。将细菌悬浮液在冰上再孵育10分钟。向1ml感受态细胞中加入至少10ng质粒dna，并通过涡旋混合。然后将悬浮液在冰上放置30分钟，并将200μl培养物接种在含有100μg/ml羧苄青霉素的lb琼脂板(1％)上。
[0718]
c)使用荧光激活细胞分选(facs)对大肠杆菌ht115_puc18_pt7-u1a-f30::西兰花/uucg-tt7细胞的培养和表型验证
[0719]
将大肠杆菌ht115_puc18_pt7-u1a-f30::西兰花/uucg-tt7细胞从单个菌落接种到含有2ml 2x yt培养基(16g/l胰蛋白酶、10g/l酵母提取物和5g/l nacl)和100μg/ml羧苄青霉素的试管中，并在37℃和120rpm下培养过夜。第二天，使用预培养物接种2ml含有100μg/ml羧苄青霉素的新鲜2x yt培养基，od
600
为0.1。细胞在37℃和120rpm下生长，三小时后，通过添加0.4mm iptg诱导t7 rna聚合酶的表达。继续培养四个小时。然后，使用最终浓度为50μm dfhbi的pbs将细胞稀释至od
600
为0.6。孵育10分钟后，如实施例1d)中所述，通过facs分析细胞悬浮液。dfhbi染色的大肠杆菌ht115_puc18_pt7-u1a-f30::西兰花/uucg-tt7细胞与未染色的细胞相比显示出显著增加的荧光。
[0720]
该实验显示了迄今为止不显著的表型(rna产生)与荧光输出的成功连接。在这个实验中，产生的rna是从革兰氏阴性细菌细胞中的载体转录出来的。因此，根据实施例1中所示的程序，使用本发明可以使用革兰氏阴性细菌细胞优化rna的发酵生产。
[0721]
实施例4
[0722]
a)载体pjc1-pf1-u1a-f30::芒果3-tf1的构建
[0723]
质粒的构建是通过化学合成的方式合成的dna片段(pf1-u1a-f30::芒果3-tf1的seq id no:100，从美国旧金山南部的twist bioscience订购)及其连接到pjc1(cremer,j.,treptow,c.,eggellng,l.,and sahm,h.regulation of enzymes of lysine biosynthesis in corynebacterium glutamicum.microbiol.1988；134,3221-3229)。seq id no:100包含启动子p
f1
(seq id no:67)、感兴趣的rna(seq id no:68)、在整合点具有芒果3核酸适配体的f30支架(seq id no:101)和终止子序列t
f1
(seq id no:70)。
[0724]
在用限制性内切酶xbai和sali切割合成的dna片段并随后纯化反应混合物之后，将切下的dna片段用于与载体pjc1的连接反应中，该载体也已用xbai或sali线性化并去磷酸化。将连接混合物直接用于转化大肠杆菌dh5α，并在含有50μg/ml卡那霉素的lb板上进行转化子的筛选。16个菌落生长在这些平板上，因此对卡那霉素具有抗性，用于菌落pcr。用引物pjc1_check_f(seq id no:73)和pjc1_check_rev(seq id no:74)进行菌落pcr，以分析合成的片段是否插入载体pjc1中。在琼脂糖凝胶上对菌落pcr产物的分析显示预期的pcr产物具有682bp的大小(pjc1-pf1-u1a-f30::芒果3-tf1)，于是培养三个菌落用于更大规模的质粒制备。培养16小时后，通过离心收集这些培养物，并制备质粒dna。用菌落pcr中使用的引物对其中两种质粒制剂进行测序，插入物的序列显示与预期序列100％一致。所得质粒命名为pjc1-pf1-u1a-f30::芒果3-tf1(seq id no:102)。
[0725]
seq id no:100
[0726]
seq id no:67，68，101，70组合，5'-端的xbai识别位点、3'-端的sali识别位点和序列101上游的saci识别位点：
[0727]
ctgtctctagactcgagcgggacggtcgaaccagcttcaagcgaccggatgagtatgttacagtagatagcgagcgggagaccgctcgaccttagttctcctgttgcgggggagttcatgggatccaggtacccagggcgaggcttatccattgcactccggatgtgctgacccctgggagctcttgccatgtgtatgtgggggaaggattggtatgtggtatacccacatactctgatgatccttcgggatcattcatggcaagctagcatagcataaaataacgccccaccttcttaacgggaggtggggcgttatttttacgtcgac
[0728]
seq id no:101
[0729]
f30，芒果3在其插入位点1和“ttcg”在插入位点2：
[0730]
ttgccatgtgtatgtgggggaaggattggtatgtggtatacccacatactctgatgat ccttcgggatcattcatggcaa
[0731]
seq id no:102
[0732]
pjc1-pf1-u1a-f30::芒果3-tf1:
[0733]
ctagactcgagcgggacggtcgaaccagcttcaagcgaccggatgagtatgttacagtagatagcgagcgggagaccgctcgaccttagttctcctgttgcgggggagttcatgggatccaggtacccagggcgaggcttatccattgcactccggatgtgctgacccctgggagctcttgccatgtgtatgtgggggaaggattggtatgtggtatacccacatactctgatgatccttcgggatcattcatggcaagctagcatagcataaaataacgccccaccttcttaacgggaggtggggcgttatttttacgtcgacctgcagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccag
atggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccttaataagatgatcttcttgagatcgttttggtctgcgcgtaatctcttgctctgaaaacgaaaaaaccgccttgcagggcggtttttcgaaggttctctgagctaccaactctttgaaccgaggtaactggcttggaggagcgcagtcaccaaaacttgtcctttcagtttagccttaaccggcgcatgacttcaagactaactcctctaaatcaattaccagtggctgctgccagtggtgcttttgcatgtctttccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcggactgaacggggggttcgtgcatacagtccagcttggagcgaactgcctacccggaactgagtgtcaggcgtggaatgagacaaacgcggccataacagcggaatgacaccggtaaaccgaaaggcaggaacaggagagcgcacgagggagccgccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccaccactgatttgagcgtcagatttcgtgatgcttgtcaggggggcggagcctatggaaaaacggctttgccgcggccctctcacttccctgttaagtatcttcctggcatcttccaggaaatctccgccccgttcgtaagccatttccgctcgccgcagtcgaacgaccgagcgtagcgagtcagtgagcgaggaagcggaatatatcctgtatcacatattctgctgacgcaccggtgcagccttttttctcctgccacatgaagcacttcactgacaccctcatcagtgccaacatagtaagccagtatacactccgctagcgctgaggtctgcctcgtgaagaaggtgttgctgactcataccaggcctgaatcgccccatcatccagccagaaagtgagggagccacggttgatgagagc
[0734]
tttgttgtaggtggaccagttggtgattttgaacttttgctttgccacggaacggtctgc
[0735]
gttgtcgggaagatgcgtgatctgatccttcaactcagcaaaagttcgatttattcaaca
[0736]
aagccacgttgtgtctcaaaatctctgatgttacattgcacaagataaaaatatatcatc
[0737]
atgaacaataaaactgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatat
[0738]
tcaacgggaaacgtcttgctcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttata
[0739]
tgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgta
[0740]
tgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatg
[0741]
atgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgacca
[0742]
tcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccggga
[0743]
aaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgc
[0744]
tggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcg
[0745]
atcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcga
[0746]
gtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcat
[0747]
aagcttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataacc
[0748]
ttatttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcag
[0749]
accgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattaca
[0750]
gaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcat
[0751]
ttgatgctcgatgagtttttctaatcagaattggttaattggttgtaacactggcagagc
[0752]
attacgctgacttgacgggacggcggctttgttgaataaatcgaacttttgctgagttg
[0753]
aaggatcagatcacgcatcttcccgacaacgcagaccgttccgtggcaaagcaaaagt
[0754]
tcaaaatcaccaactggtccacctacaacaaagctctcatcaaccgtggctccctcact
[0755]
ttctggctggatgatggggcgattcaggcctggtatgagtcagcaacaccttcttcacg
[0756]
aggcagacctcagcgctcaaagatgcaggggtaaaagctaaccgcatctttaccgaca
[0757]
aggcatccggcagttcaacagatcgggaagggctggatttgctgaggatgaaggtgga
[0758]
ggaaggtgatgtcattctggtgaagaagctcgaccgtcttggccgcgacaccgccgac
[0759]
atgatccaactgataaaagagtttgatgctcagggtgtagcggttcggtttattgacgac
[0760]
gggatcagtaccgacggtgatatggggcaaatggtggtcaccatcctgtcggctgtggc
[0761]
acaggctgaacgccggaggatcaagtcggtcaagccaagcgcaaccagcggcaccgc
[0762]
cgcgagcaacgtcgcaagggcgatcaggggacgatttttgcgaagaatttccacggta
[0763]
agaatccaatctctcgaatttagggtgaaagaagcttggcataggggtgtgcacgaact
[0764]
cggtggaggaaatttccgcggggcaaggcttcgcgaagcggagtcgcggcagtggctt
[0765]
tgaagatctttgggagcagtccttgtgcgcttacgaggtgagccggtggggaaccgtta
[0766]
tctgcctatggtgtgagcccccctagagagcttcaagagcaatcagcccgacctagaaa
[0767]
ggaggccaagagagagacccctacggggggaaccgttttctgcctacgagatggcaca
[0768]
tttactgggaagctttacggcgtcctcgtggaagttcaatgcccgcagacttaagtgct
[0769]
ctattcacggtctgacgtgacacgctaaattcagacatagcttcattgattgtcggccac
[0770]
gagccagtctctccctcaacagtcataaaccaacctgcaatggtcaagcgatttccttta
[0771]
gctttcctagcttgtcgttgactggacttagctagtttttctcgctgtgctcgggcgtac
[0772]
tcactgtttgggtctttccagcgttctgcggcctttttaccgccacgtcttcccatagtg
[0773]
gccagagcttttcgccctcggctgctctgcgtctctgtctgacgagcagggacgactgg
[0774]
ctggcctttagcgacgtagccgcgcacacgtcgcgccatcgtctggcggtcacgcatcg
[0775]
gcggcagatcaggctcacggccgtctgctccgaccgcctgagcgacggtgtaggcacg
[0776]
ctcgtaggcgtcgatgatcttggtgtcttttaggcgctcaccagccgcttttaactggta
[0777]
tcccacagtcaaagcgtggcgaaaagccgtctcatcacgggcggcacgccctggagca
[0778]
gtccagaggacacggacgccgtcgatcagctctccagacgcttcagcggcgctcggca
[0779]
ggcttgcttcaagcgtggcaagtgcttttgcttccgcagtggcttttcttgccgcttcga
[0780]
tacgtgcccgtccgctagaaaactcctgctcatagcgttttttaggtttttctgtgcctg
[0781]
agatcatgcgagcaacctccataagatcagctaggcgatccacgcgattgtgctgggca
[0782]
tgccagcggtacgcggtgggatcgtcggagacgtgcagtggccaccggctcagcctat
[0783]
gtgaaaaagcctggtcagcgccgaaaacgcgggtcatttcctcggtcgttgcagccag
[0784]
caggcgcatattcgggctgctcatgcctgctgcggcatacaccggatcaatgagccagat
[0785]
gagctggcatttcccgctcagtggattcacgccgatccaagctggcgctttttccaggc
[0786]
gtgcccagcgctccaaaatcgcgtagacctcggggtttacgtgctcgattttcccgccg
[0787]
gcctggtggctcggcacatcaatgtccaggacaagcacggctgcgtgctgcgcgtgcg
[0788]
tcagagcaacatactggcaccgggcaagcgattttgaaccaactcggtataacttcggc
[0789]
tgtgtttctcccgtgtccgggtctttgatccaagcgctggcgaagtcgcgggtcttgct
[0790]
gccctggaaattttctctgcccaggtgagcgaggaattcgcggcggtcttcgctcgtcc
[0791]
agccacgtgatcgcagcgcgagctcgggatgggtgtcgaacagatcagcggaaaattt
[0792]
ccaggccggtgtgtcaatgtctcgtgaatccgctagagtcatttttgagcgctttctccc
[0793]
aggtttggactgggggttagccgacgccctgtgagttaccgctcacggggcgttcaac
[0794]
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[0795]
acgctgctgccgattcggtgcaggtggtggcggcgctgacacgtcctgggcggccacg
[0796]
gccacacgaaacgcggcatttacgatgtttgtcatgcctgcgggcaccgcgccacgatc
[0797]
gcggataattctcgctgccgcttccagctctgtgacgaccatggccaaaatttcgctcgg
[0798]
gggacgcacttccagcgccatttgcgacctagccgcctccagctcctcggcgtggcgtt
[0799]
tgttggcgcgctcgcggctggctgcggcacgacacgcatctgagcaatattttgcgcgc
[0800]
cgtcctcgcgggtcaggccggggaggaatcaggccaccgcagtaggcgcaactgattc
[0801]
gatcctccactactgtgcgtcctcctggcgctgccgagcacgcagctcgtcagccagct
[0802]
cctcaagatccgccacgagagtttctaggtcgctcgcggcactggcccagtctcgtgat
[0803]
gctggcgcgtccgtcgtatcgagagctcggaaaaatccgatcaccgtttttaaatcgac
[0804]
ggcagcatcgagcgcgtcggactccagcgcgacatcagagagatccatagctgatgatt
[0805]
cgggccaattttggtacttcgtcgtgaaggtcatgacaccattataacgaacgttcgtta
[0806]
aagtttttggcggaaaatcacgcggcacgaaaattttcacgaagcgggactttgcgca
[0807]
gctcaggggtgctaaaaattttgtatcgcacttgatttttccgaaagacagattatctgc
[0808]
aaacggtgtgtcgtatttctggcttggtttttaaaaaatctggaatcgaaaatttgcggg
[0809]
gcgaccgagaagttttttacaaaaggcaaaaactttttcgggatcgacagaaataaaa
[0810]
cgatcgacggtacgcaacaaaaaagcgtcaggatcgccgtagagcgattgaagaccgt
[0811]
caaccaaaggggaagcctccaatcgacgcgacgcgcgctctacggcgatcctgacgca
[0812]
gatttttagctatctgtcgcagcgccctcagggacaagccacccgcacaacgtcgcgag
[0813]
ggcgatcagcgacgccgcagggggatcct
[0814]
b)质粒pjc1-pf1-u1a-f30::芒果3-tf1转化谷氨酸棒状杆菌atcc 13032δcg2273
[0815]
根据tauch等人，2002(tauch,a.,kirchner,o.,b.,s.,p
ü
hler,a.,and kalinowski,j.efficient electrotransformation of corynebacterium diphtheriae with a mini-replicon derived from the corynebacterium glutamicum plasmid pga 1.curr.microbiol.2002；45,362-367)制备谷氨酸棒杆菌菌株atcc 13032δcg2273的感受态细胞，并用pjc1-pf1-u1a-f30::芒果3-tf1转化。转化子的选择是在含有25μg/ml卡那霉素的cgiii(menkel,e.,thierbach,g.,eggeling,l.,and sahm,h.influence of increased aspartate availability on iysine formation by arecombinant strain of corynebacterium glutamicum and utilization of fumarate.appl.environ.microbiol.1989；55,684-688)琼脂(1％)板上进行的。由此获得的克隆命名为谷氨酸棒状杆菌atcc 13032δcg2273 pjc1-pf1-u1a-f30::芒果3-tf1。
[0816]
c)使用荧光激活细胞分选(facs)的细胞培养和表型验证
[0817]
产生的菌株谷氨酸棒状杆菌atcc 13032δcg2273_pjc1-pf1-u1a-f30:芒果3-tf1以及菌株谷氨酸棒状杆菌atcc 13032δcg2273_pjc1-pf1-u1a-f30:西兰花/uucg-tf1和谷氨酸棒状杆菌atcc 13032δcg2273_pjc1-pf1-u1a-ft1(参见实施例1)在含有25μg/ml卡那霉素的bhi琼脂板上划线，并在30℃下培养。将生长的细胞重悬于含有25μg/ml卡那霉素的cgiii培养基中，并在含2ml有25μmg/ml卡那菌素的培养基的试管中将od
600
调节至0.75。将细胞在30℃和120rpm下孵育18小时。随后，使用最终浓度为500μm dfhbi或0.1μm to1的pbs将细胞稀释至od
600
为0.6。使用实施例1d)中已经描述的ariaiii高速细胞分选机分析染色和未染色的细胞。dfhbi染色的谷氨酸棒状杆菌atcc 13032δcg2273_pjc1-pf1-u1a-f30::西兰花/uucg-tf1与未染色的细胞相比，荧光输出增加了约六倍(见图4)。谷氨酸棒状杆菌
atcc 13032δcg2273 pjc1-pf1-u1a-f30::芒果3-tf1和谷氨酸棒状杆菌atcc 13032δcg2273_pjc1-pf1-u1a-tf1在添加荧光团dfhbi后没有显示出增加的荧光输出。to1染色的谷氨酸棒状杆菌atcc 13032δcg2273 pjc1-pf1-u1a-f30::芒果3-tf1细胞显示，与未染色的细胞相比，荧光输出增加了约六倍(见图4)。添加to1后，与对照菌株相比，菌株谷氨酸棒状杆菌atcc 13032δcg2273_pjc1-pf1-u1a-f30::西兰花/uucg-tf1和谷氨酸棒状杆菌atcc 13032
△
cg2273_pjc1-pf1-u1a-tf1的细胞显示出约1.2倍的荧光轻微增加，这表明使用荧光团to1对细胞染色的特异性略有降低。
[0818]
该实验显示了迄今为止不显著的表型(rna产生)与荧光输出的成功连接。在这个实验中，将产生的rna与f30支架和两种不同的核酸适配体，西兰花或芒果3融合。分别通过补充荧光团dfhbi或to1来诱导荧光发射。根据实施例1中所示的程序，因此，使用本发明，使用两种核酸适配体中的任一种及其各自的荧光团来优化rna的发酵生产是可能的。
[0819]
实施例5
[0820]
a)载体pjc1-pf1-u1a-f30::玉米-tf1的构建
[0821]
质粒的构建是通过化学合成的方式合成的dna片段(pf1-u1a-f30::玉米-tf1的seq id no:103，从美国旧金山南部的twist bioscience订购)及其连接到pjc1(cremer,j.,treptow,c.,eggeling,l.,and sahm,h.regulation of enzymes of lysine biosynthesis in corynebacterium glutamicum.microbiol.1988；134,3221-3229)，得到质粒pjc1-pf1-u1a-f30::玉米-tf1(seq id no:cc3)。seq id no:103包含启动子p
f1
(seq id no:67)、感兴趣的rna(seq id no:68)、在第一整合点具有玉米核酸适配体且在第二整合点(seq id no:104)具有uucg的f30支架和终止子序列t
f1
(seq id no:70)。
[0822]
在用限制性内切酶xbai和sali切割合成的dna片段并随后纯化反应混合物之后，将切下的dna片段用于与载体pjc1的连接反应中，该载体也已用xbai或sali线性化并去磷酸化。将连接混合物直接用于转化大肠杆菌dh5α，并在含有50μg/ml卡那霉素的lb板上进行转化子的筛选。16个菌落生长在这些板上，因此对卡那霉素具有抗性，用于菌落pcr。用引物pjc1_check_f(seq id no:73)和pjc1_check_rev(seq id no:74)进行菌落pcr，以分析合成的片段是否插入载体pjc1中。在琼脂糖凝胶上对菌落pcr产物的分析显示预期的pcr产物具有682bp的大小(pjc1-pf1-u1a-f30::玉米-tf1)，于是培养三个菌落用于更大规模的质粒制备。培养16小时后，通过离心收集这些培养物，并制备质粒dna。用菌落pcr中使用的引物对其中两种质粒制剂进行测序，插入物的序列显示与预期序列100％一致。所得质粒命名为pjc1-pf1-u1a-f30::玉米-tf1(seq id no:105)。
[0823]
seq id no:103
[0824]
seq id no:67，68，cc2，70组合，5'-端的xbai识别位点、3'-端的sali识别位点：
[0825]
ctgtctctagactcgagcgggacggtcgaaccagcttcaagcgaccggatgagtatgttacagtagatagcgagcgggagaccgctcgaccttagttctcctgttgcgggggagttcatgggatccaggtacccagggcgaggcttatccattgcactccggatgtgctgacccctgggagctcttgccatgtgtatgtgggcgaggaaggaggtctgaggaggtcactgcccacatactctgatgatccttcgggatcattcatggcaagctagcatagcataaaataacgccccaccttcttaacgggaggtggggcgttatttttacgtcgac
[0826]
seq id no:104
[0827]
f30，玉米在其插入位点1和“ttcg”在插入位点2：
[0828]
ttgccatgtgtatgtgggcgaggaaggaggtctgaggaggtcactgcccacata
[0829]
ctctgatgatccttcgggatcattcatggcaa
[0830]
seq id no:105
[0831]
pjc1-pf1-u1a-f30::玉米-tf1
[0832]
ctagactcgagcgggacggtcgaaccagcttcaagcgaccggatgagtatgttacagtagatagcgagcgggagaccgctcgaccttagttctcctgttgcgggggagttcatgggatccaggtacccagggcgaggcttatccattgcactccggatgtgctgacccctgggagctcttgccatgtgtatgtgggcgaggaaggaggtctgaggaggtcactgcccacatactctgatgatccttcgggatcattcatggcaagctagcatagcataaaataacgccccaccttcttaacgggaggtggggcgttatttttacgtcgacctgcagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccttaataagatgatcttcttgagatcgttttggtctgcgcgtaatctcttgctctgaaaacgaaaaaaccgccttgcagggcggtttttcgaaggttctctgagctaccaactctttgaaccgaggtaactggcttggaggagcgcagtcaccaaaacttgtcctttcagtttagccttaaccggcgcatgacttcaagactaactcctctaaatcaattaccagtggctgctgccagtggtgcttttgcatgtctttccgggttggactcaag
[0833]
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[0834]
ccagcttggagcgaactgcctacccggaactgagtgtcaggcgtggaatgagacaaac
[0835]
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[0836]
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[0837]
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[0838]
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[0839]
tctccgccccgttcgtaagccatttccgctcgccgcagtcgaacgaccgagcgtagcga
[0840]
gtcagtgagcgaggaagcggaatatatcctgtatcacatattctgctgacgcaccggtgc
[0841]
agccttttttctcctgccacatgaagcacttcactgacaccctcatcagtgccaacatag
[0842]
taagccagtatacactccgctagcgctgaggtctgcctcgtgaagaaggtgttgctgac
[0843]
tcataccaggcctgaatcgccccatcatccagccagaaagtgagggagccacggttgat
[0844]
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[0845]
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[0846]
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[0847]
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[0848]
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[0849]
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[0850]
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[0851]
ccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttc
[0852]
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[0853]
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[0854]
tgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaac
[0855]
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[0856]
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[0857]
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[0858]
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[0862]
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[0864]
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[0865]
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[0866]
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[0867]
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[0868]
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[0869]
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[0870]
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[0871]
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[0872]
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[0874]
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[0875]
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[0878]
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[0879]
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[0880]
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[0881]
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[0882]
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[0883]
gtggccagagcttttcgccctcggctgctctgcgtctctgtctgacgagcagggacgac
[0884]
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[0885]
tcggcggcagatcaggctcacggccgtctgctccgaccgcctgagcgacggtgtaggc
[0886]
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[0887]
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[0888]
gcagtccagaggacacggacgccgtcgatcagctctccagacgcttcagcggcgctcg
[0889]
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[0890]
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[0891]
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[0892]
gcatgccagcggtacgcggtgggatcgtcggagacgtgcagtggccaccggctcagcc
corynebacterium glutamicum and utilization of fumarate.appl.environ.microbiol.1989；55,684-688)琼脂(1％)板上用25μg/ml卡那霉素进行的。由此获得的克隆命名为谷氨酸棒状杆菌atcc 13032δcg2273 pjc1-pf1-u1a-f30::玉米-tf1。
[0926]
c)使用荧光活化细胞分选(facs)进行细胞培养和表型验证
[0927]
将产生的菌株谷氨酸棒状杆菌atcc 13032δcg2273_pjc1-pf1-u1a-f30::玉米-tf1在含有25μg/ml卡那霉素的bhi琼脂平板上划线，并在30℃下培养。将生长的细胞重悬于含有25μg/ml卡那霉素的cgiii培养基中，并在含2ml有25μmg/ml卡那菌素的培养基的试管中将od
600
调节至0.75。将细胞在30℃和120rpm下孵育18小时。随后，使用最终浓度为500μm dfho的pbs将细胞稀释至od
600
为0.6。使用实施例1d)中已经描述的ariaiii高速细胞分选机分析染色和未染色的细胞。与未染色的细胞相比，dfho染色的谷氨酸棒状杆菌atcc 13032δcg2273_pjc1-pf1-u1a-f30::玉米-tf1细胞显示出显著增加的荧光输出。
[0928]
该实验显示了迄今为止不显著的表型(rna产生)与荧光输出的成功连接。在这个实验中，将产生的rna与f30支架和两种不同的核酸适配体(西兰花或玉米)融合。分别通过补充荧光团dfhbi或dfho来诱导荧光发射。根据实施例1中所示的程序，因此，使用本发明，使用两种核酸适配体中的任一种及其各自的荧光团来优化rna的发酵生产是可能的。
[0929]
实施例6
[0930]
a)载体pjc1_dsrna_pt7-α微管蛋白-f30::西兰花和pjc1_dsrna_pt7-cyp3-f30::西兰花的构建
[0931]
质粒的构建是通过化学合成的方式合成dna片段(dsrna_pt7-α微管蛋白-f30::西兰花的seq id no:106)及其连接到载体pjc1(seq id no:107)的限制性位点bamhi和ecori(cremer,j.,treptow,c.,eggeling,l.,and sahm,h.regulation of enzymes of lysine biosynthesis in corynebacterium glutamicum.microbiol.1988；134,3221-3229)，制成质粒pjc1_dsrna_pt7-α微管蛋白-f30::西兰花(seq id no:108)(从美国南旧金山twist bioscience订购)。seq id no:106包含启动子p
t7
(seq id no:96)，一个编码来自瓦罗阿破坏菌(varroa destructor)的411bpα微管蛋白rna的核苷酸序列(seq id no:110)(garbian et al.,2012,bidirectional transfer of rnai between honey bee and varroa destructor:varroa gene silencing reduces varroa population,plos pathogens)，f30支架，在第一整合点具有西兰花核酸适配体，在第二整合点具有“uucg间隔”(seq id no:69)，终止子序列t
t7
(seq id no:97)，第二t7启动子(seq id no:96)，编码411bpα微管蛋白反义rna的核苷酸序列(seq id no:111)和终止子序列t
f1
(seq id no:70)。设计的一般原理如图5所示。
[0932]
seq id no:106
[0933]
dsrna_pt7-α微管蛋白-f30::西兰花:
[0934]
taatacgactcactatagggcgaatggagaacatcgcacaggacttcggtaaaaagtgccgattgggcttcgccatctacccggctccgcaggtttccactgccgttgtcgaaccatacaactcggttttgacgacacatgccaccctcgaacacgctgactgcgtattcatgatggataatgaggcgatctatcagatctgtcgtcggaatcttggagttgaacgaccggcgtatcaaaatctcaatcgactgattagccaggccgtttcggcgataaccgcttctctacgtttttccggagcgttgaatgttgacctcaacgaatttcagacgaatctcgtcccctacccgcgaatccatttcccgctcgtcacttatgctccgattatttcggctgagaaggctcatcacgagcaacataacgtactggaatacgtattgccatgtgtatg
tgggagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcccacatactctgatgatccttcgggatcattcatggcaagtcgacctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaagtatcatccacatatgagtactctaatacgactcactatagggcgattccagtacgttatgttgctcgtgatgagccttctcagccgaaataatcggagcataagtgacgagcgggaaatggattcgcgggtaggggacgagattcgtctgaaattcgttgaggtcaacattcaacgctccggaaaaacgtagagaagcggttatcgccgaaacggcctggctaatcagtcgattgagattttgatacgccggtcgttcaactccaagattccgacgacagatctgatagatcgcctcattatccatcatgaatacgcagtcagcgtgttcgagggtggcatgtgtcgtcaaaaccgagttgtatggttcgacaacggcagtggaaacctgcggagccgggtagatggcgaagcccaatcggcactttttaccgaagtcctgtgcgatgttctccatatagcataaaataacgccccaccttcttaacgggaggtggggcgttattttta
[0935]
seq id no:107
[0936]
pjc1
[0937]
ccgagaagttttttacaaaaggcaaaaactttttcgggatcgacagaaataaaacgatcgacggtacgcaacaaaaaagcgtcaggatcgccgtagagcgattgaagaccgtcaaccaaaggggaagcctccaatcgacgcgacgcgcgctctacggcgatcctgacgcagatttttagctatctgtcgcagcgccctcagggacaagccacccgcacaacgtcgcgagggcgatcagcgacgccgcagggggatcctctagagtcgacctgcagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccttaataagatgatcttcttgagatcgttttggtc
[0938]
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[0939]
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[0940]
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[0941]
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[0942]
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[0943]
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[0944]
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[0945]
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[0946]
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[0947]
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[0948]
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[0949]
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[0950]
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[0951]
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[0952]
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[0953]
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[0954]
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[0955]
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[0956]
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[0957]
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[0958]
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[0967]
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[0968]
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[0971]
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[0972]
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gttatctgcctatggtgtgagcccccctagagagcttcaagagcaatcagcccgaccta
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gaaaggaggccaagagagagacccctacggggggaaccgttttctgcctacgagatgg
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cacatttactgggaagctttacggcgtcctcgtggaagttcaatgcccgcagacttaag
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ccacgagccagtctctccctcaacagtcataaaccaacctgcaatggtcaagcgatttc
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[0996]
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[1000]
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[1003]
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[1010]
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[1011]
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[1012]
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[1014]
gacgctgctgccgattcggtgcaggtggtggcggcgctgacacgtcctgggcggccac
[1015]
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[1016]
cgcggataattctcgctgccgcttccagctctgtgacgaccatggccaaaatttcgctcg
[1017]
ggggacgcacttccagcgccatttgcgacctagccgcctccagctcctcggcgtggcgt
[1018]
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[1028]
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[1029]
seq id no:108
[1030]
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[1031]
aacgtcttgctcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaac
atggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccgggaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattt
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[1043]
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[1055]
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[1056]
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[1057]
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[1058]
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[1059]
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[1060]
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[1061]
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[1062]
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[1063]
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[1064]
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[1065]
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[1066]
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[1067]
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[1068]
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[1069]
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[1070]
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[1071]
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[1072]
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[1073]
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[1074]
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[1075]
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[1076]
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[1077]
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[1078]
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[1079]
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[1080]
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[1081]
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[1082]
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[1083]
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[1084]
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[1085]
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[1086]
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[1087]
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[1088]
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[1089]
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[1090]
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[1091]
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[1092]
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[1093]
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[1094]
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[1095]
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[1096]
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[1097]
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[1098]
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[1099]
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[1100]
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[1101]
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[1102]
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[1103]
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[1104]
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[1105]
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[1106]
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[1107]
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[1108]
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[1109]
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[1110]
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[1111]
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[1112]
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[1113]
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[1114]
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[1115]
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[1116]
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[1117]
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[1118]
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[1119]
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[1120]
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[1121]
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[1122]
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[1123]
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[1124]
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[1125]
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[1126]
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[1127]
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[1128]
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[1129]
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[1130]
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[1131]
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[1132]
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[1133]
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[1134]
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[1135]
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[1136]
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[1137]
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[1138]
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[1139]
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[1140]
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[1141]
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[1142]
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[1143]
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[1144]
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[1145]
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[1146]
seq id no:110
[1147]
来自varroa destructor的α-微管蛋白rna：
[1148]
atggagaacatcgcacaggacttcggtaaaaagtgccgattgggcttcgccatctacccggctccgcaggtttccactgccgttgtcgaaccatacaactcggttttgacgacacatgccaccctcgaacacgctgactgcgtattcatgatggataatgaggcgatctatcagatctgtcgtcggaatcttggagttgaacgaccggcgtatcaaaatctcaatcgactgattagccaggccgtttcggcgataaccgcttctctacgtttttccggagcgttgaatgttgacctcaacgaatttcagacgaatctcgtcccctacccgcgaatccatttcccgctcgtcacttatgctccgattatttcggctgagaaggctcatcacgagcaacataacgtactggaa
[1149]
seq id no:111
[1150]
α-微管蛋白反义rna:
[1151]
ttccagtacgttatgttgctcgtgatgagccttctcagccgaaataatcggagcataagtgacgagcgggaaatggattcgcgggtaggggacgagattcgtctgaaattcgttgaggtcaacattcaacgctccggaaaaacgtagagaagcggttatcgccgaaacggcctggctaatcagtcgattgagattttgatacgccggtcgttcaactccaagattccgacgacagatctgatagatcgcctcattatccatcatgaatacgcagtcagcgtgttcgagggtggcatgtgtcgtcaaaaccgagttgtatggttcgacaacggcagtggaaacctgcggagccgggtagatggcgaagcccaatcggcactttttaccgaagtcctgtgcgatgttctccatb)谷氨酸棒状杆菌atcc 13032δcg2273的cg1121-cg1122中lambda de3区域的整合
[1152]
在lacuv5启动子控制下的t7 rna聚合酶由λde3噬菌体构建体表达(moffat er al.(1984)nucleotide sequence of the gene for bacteriophage t7 rna polymerase,j mol biol 173 265-269)。kortmann及其同事使用de3片段构建质粒pk18mobsacb-de3(seq id no:115)，用于整合到谷氨酸棒状杆菌的cg1121和cg1122的基因间区域((kortmann,kuhl,klaffl,bott.2015.a chromosomally encoded t7 rna polymerasedependent gene expression system for corynebacterium glutamicum_construction and comparative evaluation at the single-cell level.microbial biotechnology,8(2)253-265)。根据tauch等人，2002(tauch,a.,kirchner,o.,b.,s.,p
ü
hler,a.,and kalinowski,j.efficient electrotransformation of corynebacterium diphtheriae with a mini-replicon derived from the corynebacterium glutamicum plasmid pga 1.curr.microbiol.2002；45,362-367)制备谷氨酸棒杆菌菌株atcc 13032δcg2273的感受态细胞，并用pk18mobsacb-oe3通过电穿孔转化。转化子的选择是在含有25μg/ml卡那霉素的bhi(脑心输注)琼脂(1％)平板上进行的。第一次和第二次重组如niebisch和bott，2001先前所述进行(niebisch and bott.molecular analysis of the cytochrome bc1-aa3 branch of the corynebacterium glutamicum respiratory chain containing an unusual diheme cytochrome c1.arch.microbiol.2001；175,282-294).使用引物de3_for(seq id no:116)和de3_rev(seq id no:117)通过菌落pcr验证得到的克隆。由此产生的菌株命名为谷氨酸棒状杆菌atcc 13032(de3)_δcg2273。
[1153]
seq id no:115
[1154]
pk18mobsacb-de3:
[1155]
ctagcttcacgctgccgcaagcactcagggcgcaagggctgctaaaggaagcggaacacgtagaaagccagtccgcagaaacggtgctgaccccggatgaatgtcagctactgggctatctggacaagggaaaacgcaagcgcaaagagaaagcaggtagcttgcagtgggcttacatggcgatagctagactgggcggttttatggacagcaagcgaaccggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaagtaaactggatggctttcttgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagatctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactccaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcg
[1156]
atcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccag
[1157]
gctcaaggcgcggatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgct
[1158]
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[1159]
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[1160]
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[1161]
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[1162]
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[1163]
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[1164]
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[1165]
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[1166]
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[1167]
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[1168]
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[1169]
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[1170]
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[1171]
gcgcaactcaagcgtttgcgaaagaaacgaaccaaaagccatataaggaaacatacgg
[1172]
catttcccatattacacgccatgatatgctgcaaatccctgaacagcaaaaaaatgaaaa
[1173]
atatcaagtttctgaatttgattcgtccacaattaaaaatatctcttctgcaaaaggcctg
[1174]
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[1175]
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[1176]
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[1177]
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[1178]
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[1179]
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[1180]
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[1181]
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[1182]
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[1183]
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[1184]
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[1185]
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[1187]
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[1188]
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[1189]
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[1190]
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[1191]
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[1192]
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[1193]
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[1194]
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[1195]
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[1196]
ccgggacgccctcgcggacgtgctcatagtccacgacgcccgtgattttgtagccctgg
[1197]
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[1198]
cgctcttcgttcgtctggaaggcagtacaccttgataggtgggctgcccttcctggttg
[1199]
gcttggtttcatcagccatccgcttgccctcatctgttacgccggcggtagccggccagc
[1200]
ctcgcagagcaggattcccgttgagcaccgccaggtgcgaataagggacagtgaagaa
[1201]
ggaacacccgctcgcgggtgggcctacttcacctatcctgccccgctgacgccgttgga
[1202]
tacaccaaggaaagtctacacgaaccctttggcaaaatcctgtatatcgtgcgaaaaag
[1203]
gatggatataccgaaaaaatcgctataatgaccccgaagcagggttatgcagcggaaaa
[1204]
gcgctgcttccctgctgttttgtggaatatctaccgactggaaacaggcaaatgcagga
[1205]
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[1206]
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[1207]
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[1208]
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[1209]
gcaaagtgcgtcgggtgatgctgccaacttactgatttagtgtatgatggtgtttttgag
[1210]
gtgctccagtggcttctgtttctatcagctcctgaaaatctcgataactcaaaaaatacg
[1211]
cccggtagtgatcttatttcattatggtgaaagttggaacctcttacgtgccgatcaacg
[1212]
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[1213]
tatttattctgcgaagtgatcttccgtcacaggtatttattcggcgcaaagtgcgtcggg
[1214]
tgatgctgccaacttactgatttagtgtatgatggtgtttttgaggtgctccagtggcttc
[1215]
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[1216]
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[1217]
cgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttg
[1218]
agatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccag
[1219]
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[1220]
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[1221]
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[1222]
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[1223]
ggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaac
[1224]
gacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagcattgagaaagcgccacgcttcccg
[1225]
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[1226]
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[1227]
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[1228]
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[1229]
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[1230]
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[1231]
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[1232]
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[1233]
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[1234]
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[1235]
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[1236]
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[1237]
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[1238]
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[1239]
gcgacactccgcggcaaaaactaaccaaggatttaaaagtcttcaaaatgacaactctt
[1240]
tcacgtaagttcttcgtttctgctaccacagccctggcggcagtcgcactggttgcgtg
[1241]
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[1242]
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[1243]
ttgattgcgtagccgcaccaactcagcaacctgctgaaatctcactaaactgtgcaatg
[1244]
gatattgatcggctcacggatatttcttggagcgaatgggatactgattccgcaactgga
[1245]
accggtacccgcatcgtaaccgctgcaaatggtcaagagaccgaaaccgaagatattga
[1246]
ggtgaagctttccttccccaccgagtcttcccaaggcctagtgttcactcaggtcaccg
[1247]
tcgatggacaggttctcttcctctaatcctccataattagagagcgtaaggcccctactt
[1248]
cctgttttaggaaataggggccttttgttgtcttctcctggaggctatttaagaagttta
[1249]
aattgtgtccatgagttcgctcgagaactgcgcaactcgtgaaaggtaggcggatccag
[1250]
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[1251]
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[1252]
atgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttct
[1253]
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[1254]
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[1255]
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[1256]
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[1257]
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[1258]
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[1259]
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[1260]
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[1261]
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[1262]
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[1263]
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[1264]
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[1265]
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[1266]
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[1267]
tctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaag
[1268]
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[1269]
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[1270]
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[1271]
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[1272]
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[1273]
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[1274]
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[1275]
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[1276]
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[1277]
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[1278]
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[1279]
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[1280]
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[1281]
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[1282]
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[1283]
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[1284]
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[1285]
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[1286]
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[1287]
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[1288]
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[1289]
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[1290]
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[1291]
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[1292]
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[1293]
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[1294]
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[1295]
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[1296]
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[1297]
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[1298]
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[1299]
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[1300]
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[1301]
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[1302]
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[1303]
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[1304]
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[1305]
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[1306]
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[1307]
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[1308]
gaggtaggtggtcgcgcggttaacttgcttcctagtgaaaccgttcaggacatctacgg
[1309]
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[1310]
acgaagtagttaccgtgaccgatgagaacactggtgaaatctctgagaaagtcaagct
[1311]
gggcactaaggcactggctggtcaatggctggcttacggtgttactcgcagtgtgacta
[1312]
agcgttcagtcatgacgctggcttacgggtccaaagagttcggcttccgtcaacaagtg
[1313]
ctggaagataccattcagccagctattgattccggcaagggtctgatgttcactcagccg
[1314]
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[1315]
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[1316]
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[1317]
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[1318]
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[1319]
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[1320]
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[1321]
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[1322]
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[1323]
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[1324]
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[1325]
gtatggcaatgacagtttgagacggccacaggcgattctgagaagccattttctttggg
[1326]
cgccgtggcagtttttattgggtcccaccgccgaactgcatattcgaaccaaggagcct
[1327]
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[1328]
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[1329]
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[1330]
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[1331]
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[1332]
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[1333]
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[1334]
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[1335]
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[1336]
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[1337]
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[1338]
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[1339]
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[1340]
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[1341]
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[1342]
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[1343]
seq id no:117
[1344]
de3_rev
[1345]
tctctgagctgctggccaac
[1346]
c)谷氨酸棒状杆菌atcc 13032(de3)_δcg2273与pjc1_dsrna_pt7-α微管蛋白-f30::西兰花或pjc1_dsrna_pt7-cyp3-f30::西兰花的转化
[1347]
根据tauch等人，2002(tauch,a.,kirchner,o.,b.,s.,p
ü
hler,a.,and kalinowski,j.efficient electrotransformation of corynebacterium diphtheriae with a mini-replicon derived from the corynebacterium glutamicum plasmid pga 1.curr.microbiol.2002；45,362-367)制备谷氨酸棒杆菌菌株atcc 13032(de3)_δcg2273的感受态细胞，并用pjc1or pjc1_dsrna_pt7-α微管蛋白-f30::西兰花转化。转化子的选择是在含有25μg/ml卡那霉素的bhi琼脂(1％)平板上进行的((menkel,e.,thierbach,g.,eggeling,l.,and sahm,h.influence of increased aspartate availability on iysine formation by a recombinant strain of corynebacterium glutamicum and utilization of fumarate.appl.environ.microbiol.1989；55,684-688)。由此获得的克隆被命名为谷氨酸棒状杆菌atcc 13032(de3)_δcg2273 pjc1或谷氨酸棒状杆菌atcc13032(de3)_δcg2273 pjc1_dsrna_pt7-α微管蛋白-f30::西兰花，这取决于用于转化的质粒。
[1348]
d)使用荧光激活细胞分选(facs)培养用于表型验证的细胞
[1349]
将产生的菌株谷氨酸棒状杆菌atcc 13032(de3)_δcg2273 pjc1和谷氨酸棒状杆菌atcc 13032(de3)_δcg2273 pjc1_dsrna_pt7-α微管蛋白-f30::西兰花，在含有25μg/ml卡那霉素的bhi琼脂平板上划线，并在30℃下培养。将生长的细胞重悬于含有25μg/ml卡那霉素的cgiii培养基中，并在含有2ml含抗生素的培养基的试管中将od
600
调节至0.75。细胞在30℃和120rpm下孵育，培养6小时后用1.5mm iptg诱导。之后，继续培养6小时。随后，使用最终浓度为500μm dfhbi的pbs将细胞稀释至od
600
为0.6。使用实施例1d)中已经描述的ariaiii高速细胞分选器对细胞进行分析。与未染色的细胞相比，dfhbi染色的谷氨酸棒状杆菌atcc 13032(de3)_δcg2273 pjc1_dsrna_pt7-α微管蛋白-f30::西兰花显示出约5倍的荧光输出增加，而dfhbi染的谷氨酸棒菌atcc 13032(de3)_δcg2273 pjc1显示出约1，2倍的荧光产量增加(见图6)。
[1350]
e)从d)中分离的细胞中提取感兴趣的rna
[1351]
使用c)中分析的培养基，使用monarch总rna试剂盒(new england biolabs，ipswich，ma，usa)将来自培养物的1.38
×
109个细胞用于rna提取，如实施例1中所述。
[1352]
f)通过rnaseiii和rnasea消化形成双链rna产物的验证
[1353]
通过rnase a消化形成双链rna产物的验证。
[1354]
根据制造商的建议(applichem gmbh，darmstadt，germany)，将从谷氨酸棒状杆菌atcc 13032(de3)_δcg2273 pjc1_dsrna_pt7-α微管蛋白-f30::西兰花的培养物中分离的
总共2μgrna用50ngrnase a在室温、300mm nacl存在下处理一个小时，以去除mrna，rrna并去除靶rna的单链部分(参见图5)。rnase a处理后，使用t2030 monarch rna清理试剂盒(new england biolabs，ipswich，ma，usa)纯化反应物。dsrna ladder(new england biolabs，ipswich，ma，usa)，e)中提取的分离的总rna和rnase a处理的rna使用配备有dnf-471rna试剂盒的安捷伦片段分析仪(安捷伦科技公司，santa clara，ca，usa)进行分析。仅在谷氨酸棒状杆菌atcc 13032(de3)_δcg2273 pjc1_dsrna_pt7-α微管蛋白-f30::西兰花的总rna提取中可见的两条带，类似于靶rna片段的计算片段大小(522nt，较低片段)和包括α微管蛋白asrna链末端的f1终止子(575nt，较大片段)的靶rna的计算片段大小(参见图7)。rnase a反应后，可以看到一个与α微管蛋白dsrna大小完全相同的片段，所有的mrna和rrna都被降解。
[1355]
该实验显示了迄今为止不显著的表型(dsrna产生)与荧光输出的成功连接。在这个实验中，产生的dsrna具有411个核苷酸的长度，并从载体上转录。因此，根据实施例1中所示的程序，使用本发明可以优化dsrna的发酵生产。
[1356]
实施例7
[1357]
a)载体pjc1-pt7-egfp-西兰花-tt7和pjc1-pt7-luc2-西兰花-tt7的构建
[1358]
质粒的构建是通过化学合成的方式合成dna片段(pt7-egfp-西兰花-tt7的seq id no:118和pt7-luc2-西兰花-tt7的seq id no:119)来实现的，并将其插入pjc1的限制性位点bamhi和ecorv中，从而产生质粒pjc1_pt7-egfp-西兰花-tt7(seq id no:120)和pjc1-pt7-luc2-西兰花-tt7(seq id no:121)(订购自美国旧金山南部的twist bioscience)。seq id no:118包含t7启动子(seq id no:96)、编码增强型绿色荧光蛋白(由维多利亚绿锥虫修饰)的基因egfp(seq id no:112)、在插入位点具有西兰花核酸适配体的f30支架(seq id no:69)和t7终止子(seq id no:97)。seq id no:119包含t7启动子(seq id no:96)、编码火绒萤光素酶(photinus pyralis)的基因luc2(seq id no:82)、在插入位点具有西兰花核酸适配体的f30支架(seq id no:69)和t7终止子(seq id no:97)。
[1359]
seq id no:118
[1360]
pt7-egfp-西兰花-tt7(seq id no:96,112,69和97组合):
[1361]
taatacgactcactatagggagacccaagctggctagcgtttaaacttaagcttcgaattctgcagtcgacggtaccgcgggcccgggatccaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaatacgtattgccatgtgtatgtgggagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcccacatactctgatgatccttcgggatcattcatggcaagtcgacctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg
[1362]
seq id no:119
[1363]
pt7-luc2-西兰花-tt7(seq id no:96,82,69和97组合):
[1364]
taatacgactcactatagggagacccaagctggctagcgtttaaacttaagcttggcaatccggtactgttggtaaagccaccatggaagatgccaaaaacattaagaagggcccagcgccattctacccactcgaagacgggaccgccggcgagcagctgcacaaagccatgaagcgctacgccctggtgcccggcaccatcgcctttaccgacgcacatatcgaggtggacattacctacgccgagtacttcgagatgagcgttcggctggcagaagctatgaagcgctatgggctgaatacaaaccatcggatcgtggtgtgcagcgagaatagcttgcagttcttcatgcccgtgttgggtgccctgttcatcggtgtggctgtggccccagctaacgacatctacaacgagcgcgagctgctgaacagcatgggcatcagccagcccaccgtcgtattcgtgagcaagaaagggctgcaaaagatcctcaacgtgcaaaagaagctaccgatcatacaaaagatcatcatcatggatagcaagaccgactaccagggcttccaaagcatgtacaccttcgtgacttcccatttgccacccggcttcaacgagtacgacttcgtgcccgagagcttcgaccgggacaaaaccatcgccctgatcatgaacagtagtggcagtaccggattgcccaagggcgtagccctaccgcaccgcaccgcttgtgtccgattcagtcatgcccgcgaccccatcttcggcaaccagatcatccccgacaccgctatcctcagcgtggtgccatttcaccacggcttcggcatgttcaccacgctgggctacttgatctgcggctttcgggtcgtgctcatgtaccgcttcgaggaggagctattcttgcgcagcttgcaagactataagattcaatctgccctgctggtgcccacactatttagcttcttcgctaagagcactctcatcgacaagtacgacctaagcaacttgcacgagatcgccagcggcggggcgccgctcagcaaggaggtaggtgaggccgtggccaaacgcttccacctaccaggcatccgccagggctacggcctgacagaaacaaccagcgccattctgatcacccccgaaggggacgacaagcctggcgcagtaggcaaggtggtgcccttcttcgaggctaaggtggtggacttggacaccggtaagacactgggtgtgaaccagcgcggcgagctgtgcgtccgtggccccatgatcatgagcggctacgttaacaaccccgaggctacaaacgctctcatcgacaaggacggctggctgcacagcggcgacatcgcctactgggacgaggacgagcacttcttcatcgtggaccggctgaagagcctgatcaaatacaagggctaccaggtagccccagccgaactggagagcatcctgctgcaacaccccaacatcttcgacgccggggtcgccggcctgcccgacgacgatgccggcgagctgcccgccgcagtcgtcgtgctggaacacggtaaaaccatgaccgagaaggagatcgtggactatgtggccagccaggttacaaccgccaagaagctgcgcggtggtgttgtgttcgtggacgaggtgcctaaaggactgaccggcaagttggacgcccgcaagatccgcgagattctcattaaggccaagaagggcggcaagatcgccgtgtaataattctagatacgtattgccatgtgtatgtgggagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcccacatactctgatgatccttcgggatcattcatggcaagtcgacctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg
[1365]
seq id no:120
[1366]
pjc1-pt7-egfp-西兰花-tt7:
[1367]
ccgagaagttttttacaaaaggcaaaaactttttcgggatcgacagaaataaaacgatcgacggtacgcaacaaaaaagcgtcaggatcgccgtagagcgattgaagaccgtcaaccaaaggggaagcctccaatcgacgcgacgcgcgctctacggcgatcctgacgcagatttttagctatctgtcgcagcgccctcagggacaagccacccgcacaacgtcgcgagggcgatcagcgacgccgcagggtagtactcagctgtaatacgactcactatagggagacccaagctggctagcgtttaaacttaagcttcgaattctgcagtcgacggtaccgcgggcccgggatccaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttc
aaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaatacgtattgccatgtgtatgtgggagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcccacatactctgatgatccttcgggatcattcatggcaagtcgacctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaagatatcatccaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaac
[1368]
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[1369]
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[1370]
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[1371]
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[1372]
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[1374]
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[1375]
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[1378]
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[1379]
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[1380]
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[1381]
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[1382]
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[1384]
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[1385]
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[1394]
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utr-luc2(萤火虫)：
[1602]
ggagacccaagctggctagcgtttaaacttaagcttggcaatccggtactgttggtaaagccaccatggaagatgccaaaaacattaagaagggcccagcgccattctacccactcgaagacgggaccgccggcgagcagctgcacaaagccatgaagcgctacgccctggtgcccggcaccatcgcctttaccgacgcacatatcgaggtggacattacctacgccgagtacttcgagatgagcgttcggctggcagaagctatgaagcgctatgggctgaatacaaaccatcggatcgtggtgtgcagcgagaatagcttgcagttcttcatgcccgtgttgggtgccctgttcatcggtgtggctgtggccccagctaacgacatctacaacgagcgcgagctgctgaacagcatgggcatcagccagcccaccgtcgtattcgtgagcaagaaagggctgcaaaagatcctcaacgtgcaaaagaagctaccgatcatacaaaagatcatcatcatggatagcaagaccgactaccagggcttccaaagcatgtacaccttcgtgacttcccatttgccacccggcttcaacgagtacgacttcgtgcccgagagcttcgaccgggacaaaaccatcgccctgatcatgaacagtagtggcagtaccggattgcccaagggcgtagccctaccgcaccgcaccgcttgtgtccgattcagtcatgcccgcgaccccatcttcggcaaccagatcatccccgacaccgctatcctcagcgtggtgccatttcaccacggcttcggcatgttcaccacgctgggctacttgatctgcggctttcgggtcgtgctcatgtaccgcttcgaggaggagctattcttgcgcagcttgcaagactataagattcaatctgccctgctggtgcccacactatttagcttcttcgctaagagcactctcatcgacaagtacgacctaagcaacttgcacgagatcgccagcggcggggcgccgctcagcaaggaggtaggtgaggccgtggccaaacgcttccacctaccaggcatccgccagggctacggcctgacagaaacaaccagcgccattctgatcacccccgaaggggacgacaagcctggcgc
agtaggcaaggtggtgcccttcttcgaggctaaggtggtggacttggacaccggtaagacactgggtgtgaaccagcgcggcgagctgtgcgtccgtggccccatgatcatgagcggctacgttaacaaccccgaggctacaaacgctctcatcgacaaggacggctggctgcacagcggcgacatcgcctactgggacgaggacgagcacttcttcatcgtggaccggctgaagagcctgatcaaatacaagggctaccaggtagccccagccgaactggagagcatcctgctgcaacaccccaacatcttcgacgccggggtcgccggcctgcccgacgacgatgccggcgagctgcccgccgcagtcgtcgtgctggaacacggtaaaaccatgaccgagaaggagatcgtggactatgtggccagccaggttacaaccgccaagaagctgcgcggtggtgttgtgttcgtggacgaggtgcctaaaggactgaccggcaagttggacgcccgcaagatccgcgagattctcattaaggccaagaagggcggcaagatcgccgtgtaa
[1603]
b)质粒pjc1-pt7-egfp-西兰花-tt7和pjc1-pt7-luc2-西兰花-tt7在谷氨酸棒状杆菌atcc 13032(de3)_δcg2273中的转化
[1604]
谷氨酸棒状杆菌atcc 13032(de3)_δcg2273的构建在实施例5b中进行了描述。根据tauch等人，2002(tauch,a.,kirchner,o.,b.,s.,p
ü
hler,a.,and kalinowski,j.efficient electrotransformation of corynebacterium diphtheriae with a mini-replicon derived from the corynebacterium glutamicum plasmid pga 1.curr.microbiol.2002；45,362-367)，制备谷氨酸棒状杆菌菌株atcc 13032(de3)_δcg2273的感受态细胞，并通过电穿孔用载体pjc1-pt7-egfp-西兰花-tt7或用pjc1-pt7-luc2-西兰花-tt7转化。转化子的选择是在含有25μg/ml卡那霉素的bhi琼脂(1％)平板上进行的。由此获得的克隆被命名为谷氨酸棒状杆菌atcc 13032(de3)_δcg2273_pjc1_pt7-egfp-西兰花-tt7和谷氨酸棒状杆菌atcc 13032(de3)_δcg2273_pjc1_pt7-luc2-西兰花-tt7。
[1605]
c)使用荧光活化细胞分选(facs)的细胞培养和表型验证
[1606]
将产生的谷氨酸棒状杆菌atcc 13032(de3)_δcg2273_pjc1_pt7-egfp-西兰花-tt7和谷氨酸棒状杆菌atcc 13032(de3)_δcg2273_pjc1_pt7-luc2-西兰花-tt7，在含有25μg/ml卡那霉素的bhi琼脂平板上划线，在30℃下培养过夜。将生长的细胞重悬于含有25μg/ml卡那霉素的cgiii培养基中，并在含2ml有抗生素的cgiii培育基的试管中将od
600
调节至0.75。细胞在30℃和120rpm下孵育，培养6小时后用1.5mm iptg诱导。之后，继续培养6小时。随后，使用最终浓度为500μm dfhbi的pbs将细胞稀释至od
600
为0.6。使用实施例1d)中已经描述的ariaiii高速细胞分选器对细胞进行分析。与未染色的细胞相比，dfhbi染色的细胞显示出显著增加的荧光输出(参见图7)。
[1607]
d)rna的提取及rt-pcr分析
[1608]
根据实施例1f)从1.38
×
109个细胞中分离rna。为了验证得到的rna片段，使用one-taq一步rt-pcr试剂盒(new england biolabs，ipswich，ma，usa)进行逆转录酶pcr(rt-pcr)，其中引物egfp_for(seq id no:109)和西兰花_rev(seq id no:113)用于验证egfp-西兰花片段的内部，引物luc2_for(seq id no:114)和brococli_rev(seq id no:113)以验证luc2-西兰花片段的内部部分。最初，使用protoscriptii逆转录酶从rna中产生cdna，随后，使用上述引物通过onetaq热启动dna聚合酶扩增得到的cdna片段。在制备的rna样品中鉴定出831bp大小的谷氨酸棒状杆菌atcc 13032(de3)_δcg2273_pjc1_pt7-egfp-西兰花-tt7(总转录长度为973nts)和1774bp大小的谷氨酸棒状杆菌atcc 13032(de3)_δcg2273_pjc1_pt7-luc2-西兰花-tt7(总转录长度为1894nts)。作为阳性对照，使用上述引
物通过onetaq热启动dna聚合酶扩增载体pjc1_pt7-egfp-西兰花-tt7和pjc1_pt7-luc2-西兰花-tt7。作为阴性对照，在不进行逆转录酶步骤的情况下，通过onetaq热启动dna聚合酶扩增rna样品。琼脂糖凝胶上没有出现条带，表明制备的rna样品不含原始载体dna(参见图8)。
[1609]
seq id no:109
[1610]
egfp_for:
[1611]
atggtgagcaagggcgagga
[1612]
seq id no:113
[1613]
西兰花_rev:
[1614]
ttgccatgaatgatcccgaag
[1615]
seq id no:114
[1616]
luc2_for:
[1617]
atggaagatgccaaaaacattaagaag
[1618]
该实验显示了迄今为止不显著的表型(rna产生)与荧光输出的成功连接。在这个实验中，产生的rna具有973或1894个核苷酸的长度，并从载体上转录。因此，根据实施例1中所示的程序，使用本发明可以优化长度为至少1894个核苷酸的rna的生产。
再多了解一些
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