抗体-tlr激动剂缀合物、方法及其用途
1.相关申请的引用
2.本技术要求2020年8月20日提交的美国临时申请号63/068,342和2020年11月25日提交的美国临时申请号63/118,365的权益，所述美国临时申请的内容以引用的方式整体并入本文。
3.序列表
4.本技术含有已以ascii格式提交并特此以引用的方式整体并入的序列表。2021年8月12日创建的ascii副本命名为ambx_0234_00pct_st25.txt并且大小为80,620字节。
背景技术：
5.靶向分子或多肽，诸如抗体和其片段，以及tlr激动剂化合物可缀合在一起以产生tlr激动剂缀合物(tc)。tc可能适用于治疗疾病。
6.以引用的方式并入
7.在本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请均以引用的方式并入本文，其程度就如同每个单独的公布、专利或专利申请被具体和单独地指出以引用方式的并入一般。
技术实现要素：
8.本发明涉及具有一种或多种非天然编码氨基酸的靶向多肽，所述非天然编码氨基酸缀合至tlr的激动剂化合物，包括但不限于tlr7和/或tlr8。此类缀合物在本文中称为tlr激动剂缀合物(tc)。本发明的tc包括使用非天然编码氨基酸通过位点特异性缀合来缀合在一起的靶向生物分子或多肽和tlr激动剂化合物，以产生新型生物tlr激动剂缀合物(btc)。靶向生物分子或多肽可以是肿瘤靶向生物分子或多肽。
9.在附加的实施方案中，本发明还涉及进一步缀合至形成稳定二聚体或多聚体的水溶性聚合物的tc。本发明提供了新型tc，所述tc被设计、工程化或构建以增强、增加或改良它们的药代动力学和治疗特征。本发明的tc被设计为通过使用peg屏蔽和前药设计在非预期靶位点处阻断tlr的暴露来提供额外的靶特异性，例如其中peg屏蔽或前药在肿瘤微环境处的裂解释放活性有效载荷进一步增强特异性。在一些实施方案中，tc设计包含亲水性药物-接头或有效载荷-接头设计。在一些实施方案中，tc涉及包含peg屏蔽。在一些实施方案中，tc设计包含有包含一种或多种线性或分支的peg分子的peg屏蔽。在一些实施方案中，tc设计包含具有蛋白水解可裂解接头设计的前药方法。在一些实施方案中，tc设计包含蛋白水解可裂解接头设计和peg屏蔽。
10.在一方面，本公开提供了一种式(i)化合物：
[0011][0012]
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体或互变异构体，其中
[0013]
a是ch或n；
[0014]
x是o-r1、nh-r1、s-r1或h；
[0015]
yy是-onh2、-n3、-oh、马来酰亚胺、-cooh或-c(＝o)ch2y1，其中y1是卤化物；
[0016]
l1和l2中的每一个独立地为(ch2)m、(ch2)mc(＝o)、(ch2)
m-nh(ch2)n、(ch2)m-c(＝o)nh(ch2)n、(ch2)
m-oc(＝o)-nh-(ch2)n、(ch2)
m-nhc(＝o)-nh-(ch2)n、(ch2)
m-nh、(ch2)
m-nhc(＝o)、(ch2)
m-nhc(＝o)-(ch2)
n-nhc(＝o)-(ch2)
p
、c(＝o)-(ch2)n、c
3-c8杂环或不存在；其中m、n和p中的每一个独立地为0至12的整数；
[0017]
r1是h、c
1-c
12
烷基、取代的c
1-c
12
烷基、含氧c
1-c
12
烷基、c
3-c8杂环烷基、取代的c
3-c8杂环烷基、c
3-c8环烷基、取代的c
3-c8环烷基、-n3末端取代的c
1-c
12
烷基、(ch2)
q-(och2ch2)
r-ome，其中q和r中的每一个独立地为0至12的整数；
[0018]
r2是c
1-c6亚烷基、c
1-c
12
取代的亚烷基、c
3-c8亚环烷基、c
3-c8取代的亚环烷基、亚芳基、取代的c
6-c
10
亚芳基、包含1-3个杂原子的5-12元亚杂芳基、包含1-3个杂原子的取代的5-12元亚杂芳基或(och2ch2)
ss
，或其组合，或r2不存在；其中ss是1至12的整数，其中每个杂原子独立地为n、o或s；
[0019]
r3是氨基酸的侧链、c
1-c6亚烷基、c
1-c6取代的亚烷基、c
3-c8亚环烷基、c
3-c8亚杂环烷基、取代的c
3-c8亚环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、包含1-3个杂原子的5-12元亚杂芳基、包含1-3个杂原子的取代的5-12元亚杂芳基、含有氨基的c
1-c
12
亚烷基、含有羰基的c
1-c
12
亚烷基、含氧c
1-c
12
亚烷基、-n3末端c
1-c6亚烷基、-cch末端c
1-c6亚烷基、-sh末端c
1-c6亚烷基、-oh末端c
1-c6亚烷基、含氮c
1-c6亚烷基、-opo3h2末端c
1-c6亚烷基、-opo3h2末端亚芳基、葡糖苷酸末端c
1-c6亚烷基、-n3末端亚芳基、乙炔末端亚芳基、胺末端亚芳基、(ch2)s、(ch2)
s-c(＝o)、(ch2)
s-nh(ch2)
t
、(ch2)
s-c(＝o)nh(ch2)
t
、(ch2)
s-oc(＝o)-nh-(ch2)
t
、(ch2)
s-nhc(＝o)-nh-(ch2)
t
或其组合；或r3不存在；其中每个s和t独立地为0至6的整数；
[0020]
r4是h、c
3-c8环烷基、c
3-c8杂环烷基、c
3-c8取代的杂环烷基、芳基、取代的芳基、(ch2)
u-(och2ch2)
v-ome、二/三支链(ch2)
u-(och2ch2)
v-ome或其组合；或r4不存在；其中每个u和v独立地为1至48的整数。
[0021]
在一些实施方案中，r4包含peg部分。在一些实施方案中，peg部分是线性的、分支的或多臂的。在一些实施方案中，r4包含(ch2)
u-(och2ch2)
v-ome。在一些实施方案中，v是1至48的整数，u是1至12的整数，并且ss独立地为1至12的整数。在一些实施方案中，v是1至12的整数，u是1至12的整数，并且ss独立地为1至12的整数。在一些实施方案中，r3包含接头。在一些实施方案中，接头包含-onh2末端或马来酰亚胺末端或cooh末端或卤代乙酰基末端，每个末端均具有(ch2)m-(och2ch2)n-，其中m和n中的每一个独立地为1至12的整数。在一些实施方案中，peg部分的分子量为0.1kda至100kda或1kda至100kda。在一些实施方案中，peg部分的分子量为0.1kda至50kda或1kda至50kda。在一些实施方案中，a是ch。
[0022]
在一些实施方案中，化合物或其盐选自表4。在一些实施方案中，化合物是根据表4的化合物185、化合物186、化合物187、化合物188、化合物189、化合物190、化合物191、化合物213、化合物214、化合物216、化合物217、化合物218、化合物219、化合物220、化合物221、化合物222、化合物223、化合物224、化合物230、化合物233、化合物235、化合物238、化合物239、化合物240、化合物242、化合物244、化合物245、化合物246、化合物248、化合物251、化合物252、化合物253、化合物254、化合物255、化合物256、化合物257、化合物258、化合物
二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-6-peg24-酰氨基己酰胺(265)；(s)-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-6-peg8-酰氨基己酰胺(266)；(s)-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-6-(peg37)己酰胺(267)；(s)-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-6-(dpeg4-(m-dpeg8)3)己酰胺(268)；(s)-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-3-(4-羟苯基)丙酰胺(269)；(9-(4-((4-(2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)乙基)哌啶-1-基)甲基)苯甲基)-2-丁氧基-8-氧代-8,9-二氢-7h-嘌呤-6-基)氨基甲酸丁酯(272)；n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)丙酰胺(273)；(s)-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-3-(4-(((2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢-2h-吡喃-2-基)氧基)苯基)丙酰胺(275)；(r)-6-氨基-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)己酰胺(278)；(r)-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-6-peg24-酰氨基己酰胺(279)；(s)-4-(3-((2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)氨基)-2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-3-氧代丙基)磷酸二氢苯基酯(281)；(r)-n1-(6-((2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)氨基)-5-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-6-氧代己基)-n5-(dpeg4)-(mpeg8)3-戊二酰胺(282)；(r)-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-6-(peg8)酰氨基己酰胺(283)；n-(9-(4-((4-(2-氨乙基)哌啶-1-基)甲基)苯甲基)-2-丁氧基-8-氧代-8,9-二氢-7h-嘌呤-6-基)己酰胺(284)；n-(9-(4-((4-(2-氨乙基)哌啶-1-基)甲基)苯甲基)-2-丁氧基-8-氧代-8,9-二氢-7h-嘌呤-6-基)乙酰胺(285)；n-(9-(4-((4-(2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)乙基)哌啶-1-基)甲基)苯甲基)-2-丁氧基-8-氧代-8,9-二氢-7h-嘌呤-6-基)己酰胺(286)；n-(2-(1-(4-((6-乙酰氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2-(氨氧基)乙酰胺(287)；n-(9-(4-((4-(2-(氨氧基)乙基)哌啶-1-基)甲基)苯甲基)-2-丁氧基-8-氧代-8,9-二氢-7h-嘌呤-6-基)乙酰胺(296)；6-氨基-9-(4-((4-(2-(氨氧基)乙基)哌啶-1-基)甲基)苯甲基)-2-丁氧基-7h-嘌呤-8(9h)-酮(297)；n-(9-(4-(4,4'-双哌啶-1-基甲基)苯甲基)-2-丁氧基-8-氧代-8,9-二氢-7h-嘌呤-6-基)乙酰胺(299)；n-(9-(4-((1
’‑
(2-(氨氧基)乙酰基)-4,4'-双哌啶-1-基)甲基)苯甲基)-2-丁氧基-8-氧代-8,9-二氢-7h-嘌呤-6-基)乙酰胺(300)；n-(9-(4-((4-(2-氨乙基)哌啶-1-基)甲基)苯甲基)-2-丁氧基-8-氧代-8,9-二氢-7h-嘌呤-6-基)-3-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)丙烯酰胺(301)；n-(9-(4-((4-(2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)乙基)哌啶-1-基)甲基)苯甲基)-2-丁氧基-8-氧代-8,9-二氢-7h-嘌呤-6-基)-3-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)丙酰胺(302)；n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲
基)哌啶-4-基)乙基)-1-(氨氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(303)或n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-3-(2-(氨氧基)乙酰氨基)丙烯酰胺(304)。
[0024]
在另一方面，本公开提供了一种式(ii)化合物：
[0025][0026]
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体或互变异构体，其中
[0027]
a是ch或n；
[0028]
x是o-r1、nh-r1、s-r1或h；
[0029]
yy是h、-onh2、-n3、-oh、马来酰亚胺、-cooh或-c(＝o)ch2y1，其中y1是卤化物；
[0030]
l1和l2中的每一个独立地为(ch2)m、(ch2)mc(＝o)、(ch2)
m-nh(ch2)n、(ch2)
m-c(＝o)nh(ch2)n、(ch2)
m-oc(＝o)-nh-(ch2)n、(ch2)
m-nhc(＝o)-nh-(ch2)n、(ch2)
m-nh、(ch2)
m-nhc(＝o)、(ch2)
m-nhc(＝o)-(ch2)
n-nhc(＝o)-(ch2)
p
、c(＝o)-(ch2)n、亚芳基、取代的亚芳基、包含1-3个杂原子的5-12元亚杂芳基、包含1-3个杂原子的取代的5-12元亚杂芳基、包含1-3个杂原子的c
3-c8杂环或不存在；其中m、n和p中的每一个独立地为0至6的整数，其中每个杂原子独立地为n、o或s；
[0031]
l3是c(＝o)、-ch(r5)-、-(aa)
i-或亚芳基，或其组合，或l3不存在；其中每个aa独立地为氨基酸，其中i是1至6的整数；
[0032]
r5是nh-l4-y2或ch
2-l4-y2，其中y2是h或不存在；
[0033]
l4是c(＝o)、c(＝o)o-、-oc(＝o)-、-c(ch2o)
3-、-c(ch2ch2o)
3-、-(aa)
j-、亚芳基、取代的亚芳基、c
3-c8亚环烷基、c
3-c8取代的亚环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、包含1-3个杂原子的5-12元亚杂芳基、包含1-3个杂原子的取代的5-12元亚杂芳基、包含1-3个杂原子的5-12元亚杂环烷基、包含1-3个杂原子的取代的5-12元亚杂环烷基、c
1-c
12
亚烷基、-o-、-nh-、-s-、取代的c
1-c
12
亚烷基、-(ch2)
s-(och2ch2)
t-(ch2)
u-、(ch2)
s-(och2ch2)
t-ome、-n3、-sh、-oh、-nh2、-opo3h2、葡糖苷酸、乙炔或其组合，或l4不存在；其中每个aa独立地为氨基酸，其中j是1至6的整数，其中s和u中的每一个独立地为0至12的整数，其中t独立地为0至48的整数，其中每个杂原子独立地为n、o或s；
[0034]
r1是h、c
1-c
12
烷基、取代的c
1-c
12
烷基、含氧c
1-c
12
烷基、c
3-c8杂环烷基、取代的c
3-c8杂环烷基、c
3-c8环烷基、取代的c
3-c8环烷基、-n3末端取代的c
1-c
12
烷基、(ch2)
q-(och2ch2)
r-ome；其中q和r中的每一个独立地为0至12的整数；
[0035]
r2是c
1-c6亚烷基、c
1-c
12
取代的亚烷基、c
3-c8亚环烷基、c
3-c8取代的亚环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、包含1-3个杂原子的5-12元亚杂芳基、包含1-3个杂原子的取代的5-12元亚杂芳基、包含1-3个杂原子的5-12元亚杂环烷基、包含1-3个杂原子的取代的5-12元亚杂环烷基或(och2ch2)r，或其组合，或r2不存在；其中r是1至12的整数，其中每个杂原子独立地为n、o或s；
[0036]
r3是h或-c(＝o)r6、-c(＝o)or6；
[0037]
r6是c
1-c
12
烷基、取代的烷基、取代的芳基、ch
3-(ch2)
s-(och2ch2)
t-(ch2)
u-，其中s、
4-烯丙基-l-酪氨酸、4-丙基-l-酪氨酸、三-o-乙酰基-glcnacβ-丝氨酸、l-dopa、氟化苯丙氨酸、异丙基-l-苯丙氨酸、对叠氮基-l-苯丙氨酸、对酰基-l-苯丙氨酸、对苯甲酰基-l-苯丙氨酸、l-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-l-苯丙氨酸、异丙基-l-苯丙氨酸和对炔丙基氧基-l-苯丙氨酸。在一些实施方案中，一种或多种非天然编码氨基酸是对乙酰基-苯丙氨酸、4-叠氮基-l-苯丙氨酸、对叠氮基乙氧基苯丙氨酸或对叠氮基甲基-苯丙氨酸。在一些实施方案中，一种或多种非天然编码氨基酸是位点特异性掺入的。
[0042]
在一些实施方案中，tlr激动剂是tlr7激动剂、tlr8激动剂或tlr7/tlr8双重激动剂。在一些实施方案中，tlr激动剂包含一个或多个peg分子。
[0043]
在一些实施方案中，一个或多个peg分子是线性的、分支的、多臂的。在一些实施方案中，一个或多个peg分子介于0.1kda与100kda之间。在一些实施方案中，一个或多个peg分子介于0.1kda与50kda之间。
[0044]
在一些实施方案中，接头是双官能或多官能接头。在一些实施方案中，接头缀合至掺入抗体或抗体片段中的一种或多种非天然编码氨基酸。在一些实施方案中，接头是亲水性接头、可裂解接头或不可裂解接头。
[0045]
在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗患有疾病或疾患的受试者或患者的方法，所述方法包括向受试者或患者施用治疗有效量的式(i)或式(ii)的缀合物。在一些实施方案中，疾病或疾患是自身免疫疾病、慢性炎性疾病或癌症。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌、小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、胃肠胰腺肿瘤、宫颈癌、食管癌、结肠癌、结直肠癌、上皮细胞源癌症或肿瘤、肾癌、脑癌、胶质母细胞瘤、胰腺癌、骨髓性白血病、甲状腺癌、子宫内膜癌、淋巴瘤、胰腺癌、头颈癌或皮肤癌。在一些实施方案中，治疗方法还包括施用另一治疗剂。在一些实施方案中，另一治疗剂是化学治疗剂、激素剂、抗肿瘤剂、免疫刺激剂、免疫调节剂、免疫治疗剂或其组合。
[0046]
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含治疗有效量的上文所描述的免疫缀合物和药学上可接受的载剂或赋形剂的药物组合物。在一些实施方案中，本公开提供了一种用作药物的包含上文所描述的化合物或上文所描述的免疫缀合物的药物组合物。在一些实施方案中，本公开提供了上文所描述的免疫缀合物在制造药剂中的用途
[0047]
本发明提供抑制或减少肿瘤或癌症生长的方法，所述方法包括使肿瘤与有效量的本发明的tc接触以刺激肿瘤附近的患者的免疫系统。本发明提供了抑制或减少肿瘤或癌症生长的方法，所述方法包括使肿瘤与有效量的peg化tc，或本发明的tc的稳定二聚体或多聚体接触。在一个实施方案中，tc是非聚乙二醇化的或单聚乙二醇化的。在一个实施方案中，tc是二聚乙二醇化。在一个实施方案中，tc具有与其连接的多于一种和/或不同的tlr激动剂分子。在一个实施方案中，tc具有与其连接的多于一种和/或相同的tlr激动剂分子。本发明的另一个实施方案提供了使用本发明的tc来调节对肿瘤细胞的免疫响应的方法。在某些实施方案中，tc与至少一种化学治疗剂和/或至少一种免疫治疗剂共同施用。化学治疗剂可选自由以下组成的组：替莫唑胺、吉西他滨、多柔比星、环磷酰胺、紫杉醇、顺铂、氟嘧啶、紫杉烷、蒽环类、拉帕替尼、卡培他滨、来曲唑、帕妥珠单抗、多西他赛、ifn-α。
[0048]
在一些实施方案中，tc包含靶向多肽，包括但不限于包含一种或多种非天然编码氨基酸的抗原结合多肽(abp)。在一些实施方案中，abp包含完整的抗体重链。在一些实施方
案中，abp包含完整的抗体轻链。在一些实施方案中，abp包含抗体轻链的可变区。在一些实施方案中，abp包含抗体重链的可变区。在一些实施方案中，abp包含抗体轻链的至少一个cdr。在一些实施方案中，abp包含抗体重链的至少一个cdr。在一些实施方案中，abp包含轻链的至少一个cdr和重链的至少一个cdr。在一些实施方案中，abp包含fab。在一些实施方案中，abp包含两个或更多个fab。在一些实施方案中，abp包含(fab’)2。在一些实施方案中，abp包含两个或更多个(fab’)2。在一些实施方案中，abp包含scfv。在一些实施方案中，abp包含两个或更多个scfv。在一些实施方案中，abp包含微型抗体。在一些实施方案中，abp包含两种或更多种微型抗体。在一些实施方案中，abp包含双链抗体。在一些实施方案中，abp包含两种或更多种双链抗体。在一些实施方案中，abp包含轻链可变区和重链可变区。在一些实施方案中，abp包含完整的轻链和完整的重链。在一些实施方案中，abp包含一个或多个fc结构域或其部分。在一些实施方案中，abp包含上述实施方案中的任一个的组合。在一些实施方案中，abp包含上述实施方案中的任一个的同二聚体、异二聚体、同多聚体或异多聚体。在一些实施方案中，abp包含与结合配偶体结合的多肽，其中结合配偶体包含抗原、多肽、核酸分子、聚合物或其他分子或物质。在一些实施方案中，abp与非抗体支架分子或物质缔合。在一些实施方案中，抗原是肿瘤抗原。
[0049]
toll样受体(tlr)检测广泛范围的保守病原体相关分子模式(pamp)。所述tlr在感知入侵病原体和随后启动先天免疫响应方面发挥重要作用。人类tlr家族有10个已知的成员，它们是i型跨膜蛋白，所述跨膜蛋白具有细胞外富含亮氨酸结构域和含有保守toll/白细胞介素(il)-1受体(tir)结构域的胞质尾区。在这个家族中，tlr3、tlr7、tlr8和tlr9位于核内体内。tlr7和tlr8可通过与特定的小分子配体(即tlr7激动剂或tlr8激动剂)或其天然配体(即单链rna，ssrna)结合来激活。在激动剂与tlr7或tlr8结合后，其二聚化形式的受体被认为经受结构变化，导致随后在其胞质结构域处募集衔接蛋白，包括髓样分化初级响应基因88(myd88)。在通过myd88通路启动受体信号级联后，胞质转录因子(诸如干扰素调节因子7(irf-7)和核因子κb(nf-κb))被激活。然后这些转录因子易位至细胞核并启动各种基因，例如ifn-α和其他抗病毒细胞因子基因的转录。tlr7主要在浆细胞样细胞和b细胞上表达。免疫细胞响应性的改变可能导致癌症患者的先天免疫响应降低。因此，激动剂诱导的缀合至靶向部分(诸如抗体或其片段)的tlr7和/或tlr8的激活可能代表一种用于治疗癌症的新型方法。用包含tlr7或tlr8激动剂的tc治疗代表了一种提供更高的疗效和更好的耐受性的有前途的解决方案。用于本发明中的制备tc的合适的tlr7和/或tlr8激动剂见于以下美国专利中，所述美国专利中的每一个以引用的方式并入本文：美国专利号6,825,350；美国专利号6,656,389；美国专利号6,656,398；美国专利号6,683,088；美国专利号6,756,382；美国专利号6,825,350；美国专利号6,667,312；美国专利号6,677,347；美国专利号7,598,382；美国专利号8,673,932。
[0050]
在一些实施方案中，tc包含靶向多肽，所述靶向多肽还包含氨基酸取代、添加或缺失，当与不具有取代、添加或缺失的对应野生型tc的相容性相比时，所述氨基酸取代、添加或缺失增加了tc多肽与药物防腐剂(例如间甲酚、苯酚、苯甲醇)的相容性。这种增加的相容性将能够制备在储存期间保持蛋白质的理化特性和生物活性的保存的药物配制物。
[0051]
在一些实施方案中，一个或多个工程化键是用一种或多种非天然氨基酸产生的。可通过多种方式产生分子内键，包括但不限于蛋白质中的两个氨基酸在合适的条件下发生
反应(一个或两个氨基酸可以是非天然氨基酸)；两个氨基酸(每个氨基酸可以是天然编码的或非天然编码的)在合适的条件下与接头、聚合物或其他分子等反应。
[0052]
在一些实施方案中，tc多肽中的一个或多个氨基酸取代可以是用一个或多个天然存在的或非天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，tc中的氨基酸取代可以是用天然存在的或非天然存在的氨基酸，前体条件是至少一个取代是用非天然编码氨基酸。在一些实施方案中，tc多肽中的一个或多个氨基酸取代可以是用一个或多个天然存在的氨基酸，并且另外地，至少一个取代是用非天然编码氨基酸。在一些实施方案中，tc多肽可以是抗体或抗体片段。在一些实施方案中，tc多肽可以是肿瘤靶向多肽。
[0053]
在一些实施方案中，非天然编码氨基酸包含羰基、乙酰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基团、叠氮化物基团或炔烃基团。
[0054]
在一些实施方案中，非天然编码氨基酸包含羰基。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸具有以下结构：
[0055][0056]
其中n是0-10；r1是烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基；r2是h、烷基、芳基、取代的烷基和取代的芳基；并且r3是h、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基；并且r4是h、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。
[0057]
在一些实施方案中，非天然编码氨基酸包含氨氧基。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸包含酰肼基。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸包含肼基。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸残基包含氨基脲基团。
[0058]
在一些实施方案中，非天然编码氨基酸残基包含叠氮化物基团。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸具有以下结构：
[0059][0060]
其中n是0-10；r1是烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或不存在；x是o、n、s或不存在；m是0-10；r2是h、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基；并且r3是h、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。
[0061]
在一些实施方案中，非天然编码氨基酸包含炔烃基团。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸具有以下结构：
[0062][0063]
其中n是0-10；r1是烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基；x是o、n、s或不存在；m是0-10；r2是h、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基；并且r3是h、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。
[0064]
在一些实施方案中，多肽是包含与水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸的tc。在一些实施方案中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。在一些实施方案中，tc包含非天然编
码氨基酸和一种或多种翻译后修饰、接头、聚合物或生物活性分子。
[0065]
本发明还提供了包含编码tc的靶向多肽的多核苷酸的分离的核酸，并且本发明提供了包含在严格条件下与多核苷酸杂交的多核苷酸的分离的核酸。本发明还提供了包含编码靶向多肽的多核苷酸的分离的核酸，其中所述多核苷酸包含至少一个选择密码子。对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，许多不同的多核苷酸可编码本发明的任何多肽。
[0066]
在一些实施方案中，选择密码子选自由以下组成的组：琥珀密码子、赭石密码子、乳白密码子、独特密码子、稀有密码子、五碱基密码子和四碱基密码子。
[0067]
本发明还提供了制备与水溶性聚合物连接或与一种或多种tc多肽连接以形成同二聚体或同多聚体的tc多肽的方法。在一些实施方案中，方法包括使包含非天然编码氨基酸的分离的tc多肽与包含与非天然编码氨基酸反应的部分的水溶性聚合物或接头接触。在一些实施方案中，掺入tc多肽中的非天然编码氨基酸对水溶性聚合物或接头具有反应性，而对20种常见氨基酸中的任一种不具有反应性。在一些实施方案中，掺入tc多肽中的非天然编码氨基酸对接头、聚合物或生物活性分子具有反应性，而对20种常见氨基酸中的任一种不具有反应性。
[0068]
在一些实施方案中，连接至水溶性聚合物或接头的tc多肽是通过使包含含羰基氨基酸的tc多肽与聚(乙二醇)分子或包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基团的接头反应制备的。在一些实施方案中，氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基团通过酰胺键连接至聚(乙二醇)分子或接头。在一些实施方案中，氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基团通过氨基甲酸酯键连接至聚(乙二醇)分子或接头。
[0069]
在一些实施方案中，连接至水溶性聚合物的tc多肽是通过使聚(乙二醇)分子或包含羰基的接头与包含非天然编码氨基酸的多肽反应来制备，所述非天然编码氨基酸包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基团。
[0070]
在一些实施方案中，连接至水溶性聚合物或接头的tc多肽是通过使包含含炔氨基酸的tc与包含叠氮部分的聚(乙二醇)分子反应制备的。在一些实施方案中，叠氮化物或炔烃基团通过酰胺键连接至聚(乙二醇)分子或接头。
[0071]
在一些实施方案中，连接至水溶性聚合物或接头的tc多肽是通过使包含含叠氮氨基酸的tc多肽与包含炔部分的聚(乙二醇)分子反应制备的。在一些实施方案中，叠氮化物或炔烃基团通过酰胺键连接至聚(乙二醇)分子或接头。
[0072]
在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子或接头的分子量介于约0.1kda与约100kda之间。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子或接头的分子量介于0.1kda与50kda之间。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子或接头是支化聚合物或支化接头。在一些实施方案中，聚(乙二醇)支化聚合物或支化接头的每个分支的分子量介于1kda与100kda之间，或介于1kda与50kda之间。
[0073]
在一些实施方案中，连接至tc多肽的水溶性聚合物包含聚亚烷基二醇部分。在一些实施方案中，掺入tc中的非天然编码氨基酸残基包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基团、叠氮化物基团或炔烃基团。在一些实施方案中，掺入tc多肽中的非天然编码氨基酸残基包含羰基部分并且水溶性聚合物包含氨氧基、酰肼、肼或氨基脲部分。在一些实施方案中，掺入tc多肽中的非天然编码氨基酸残基包含炔部分并且水溶性聚合物包含叠氮部分。在一些实施方案中，掺入tc多肽中的非天然编码氨基酸残基包含叠氮部分并且水溶性聚合
物包含炔部分。本发明还提供了包含有包含非天然编码氨基酸的tc多肽和药学上可接受的载剂的组合物。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸连接至水溶性聚合物。
[0074]
本发明还提供了包含多核苷酸的细胞，所述多核苷酸编码包含选择密码子的tc的靶向多肽。在一些实施方案中，细胞包含正交rna合成酶和/或正交trna，用于将非天然编码氨基酸替代至tc的靶向多肽中。
[0075]
本发明还提供了制备包含非天然编码氨基酸的tc的靶向多肽的方法。在一些实施方案中，方法包括在允许tc的靶向多肽或其变体表达的条件下培养包含编码tc的靶向多肽的一种或多种多核苷酸、正交rna合成酶和/或正交trna的细胞；从细胞和/或培养基中纯化tc多肽。
[0076]
本发明还提供了增加tc的治疗半衰期、血清半衰期或循环时间的方法。本发明还提供了调节tc免疫原性的方法。在一些实施方案中，方法包括用非天然编码氨基酸取代tc的天然存在的靶向多肽中的任一个或多个氨基酸和/或将靶向多肽连接至接头、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子。
[0077]
本发明还提供了用有效量的本发明的tc分子治疗需要此种治疗的患者的方法。在一些实施方案中，方法包括向患者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含有包含非天然编码氨基酸的tc和药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸连接至水溶性聚合物。在一些实施方案中，tc被糖基化。在一些实施方案中，tc未糖基化。
[0078]
本发明还提供了包含水溶性聚合物或通过共价键在单个氨基酸处与tc连接的接头的tc。在一些实施方案中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施方案中，共价连接至水溶性聚合物或接头的氨基酸是存在于tc的靶向多肽中的非天然编码氨基酸。
[0079]
本发明提供了包含至少一个接头、聚合物或生物活性分子的tc多肽，其中所述接头、聚合物或生物活性分子通过非天然编码氨基酸的官能团连接至多肽，所述非天然编码氨基酸以核糖体方式掺入tc的靶向多肽中。在tc缀合物中，peg或其他水溶性聚合物、另一tc、多肽或生物活性分子可通过接头直接与tc缀合。在一个实施方案中，接头足够长以允许柔性并允许形成二聚体。在一个实施方案中，接头的长度为至少3个氨基酸或18个原子，以允许形成二聚体。在一些实施方案中，多肽与接头连接以允许形成多聚体。在一些实施方案中，接头是双官能接头。在一些实施方案中，本发明的组合物和/或tc可包含多个接头。在其他实施方案中，每个接头可包括连接的一种或多种化合物。接头还可包含亚烷基、亚烯基、亚炔基、聚醚、聚酯、聚酰胺基团以及聚氨基酸、多肽、可裂解肽或氨基苯甲基氨基甲酸酯。在一些实施方案中，接头可以是相同或不同的接头。合适的接头包括例如可裂解接头和不可裂解接头。合适的可裂解接头包括例如可由细胞内蛋白酶裂解的肽接头，诸如溶酶体蛋白酶或内体蛋白酶。可裂解接头可包含缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)接头、或缬氨酸-丙氨酸(val-ala)肽、或缬氨酸-赖氨酸(val-lys)或缬氨酸-精氨酸(vla-arg)或val-cit、val-ala、val-lys或val-arg中的任一种的类似物。在一些实施方案中，接头可以是二肽接头，诸如缬氨酸-瓜氨酸或苯丙氨酸-赖氨酸接头。含缬氨酸-瓜氨酸或缬氨酸-丙氨酸的接头可含有马来酰亚胺或琥珀酰亚胺基团。含缬氨酸-瓜氨酸或缬氨酸-丙氨酸的接头可含有对氨基苯甲醇(paba)基团或对氨基苯甲基氨基甲酸酯(pabc)。其他合适的接头包括在小于5.5的ph下可水解的接头，诸如腙接头。额外合适的可裂解接头包括二硫化物接头。在一些实施方案中，可裂解接头可包括在肿瘤微环境，诸如肿瘤浸润性t细胞处裂解的接头。在一些实施
方案中，不可裂解接头包括但不限于马来酰亚氨基己酰接头。马来酰亚氨基己酰接头可包含n-马来酰亚氨基甲基环己烷-1-羧酸酯、琥珀酰亚胺基团、五氟苯基和/或一个或多个peg分子，但不限于此。在一些实施方案中，本发明的组合物、化合物或其盐中的任一种可借助于接头连接至多肽。在一些实施方案中，表3、4、5、6和7中的本文所公开的化合物或其盐中的任一种可借助于接头连接至多肽。在一些实施方案中，多肽是靶向多肽或生物靶向多肽或肿瘤靶向多肽。在一些实施方案中，靶向多肽是抗体或抗体片段。
[0080]
在一些实施方案中，tc多肽是单peg化的。本发明还提供了一种tc，其包含连接至一个或多个非天然编码氨基酸的接头、聚合物或生物活性分子，其中所述非天然编码氨基酸以核糖体方式掺入多肽中的预选位点处。
[0081]
在一些实施方案中，本发明提供了一种包含一种或多种靶向多肽的组合物，所述靶向多肽具有掺入的一种或多种非天然编码氨基酸，其中多肽中的至少一种通过与多肽的非天然氨基酸共价键合的接头连接至tlr激动剂分子。
[0082]
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，其中一种或多种靶向多肽是相同或不同的靶向多肽。在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，其中一种或多种靶向多肽与细胞表面靶标、或肿瘤细胞靶标、或癌细胞靶标结合。在另一个实施方案中，一种或多种靶向多肽是单特异性、双特异性或多特异性靶向多肽。
[0083]
在其他实施方案中，单特异性、双特异性或多特异性靶向多肽包含药物缀合物或检查点抑制剂。考虑任何合适的免疫检查点抑制剂与本发明的组合物或tc一起使用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂降低一种或多种免疫检查点蛋白的表达或活性。在另一个实施方案中，免疫检查点抑制剂减少一种或多种免疫检查点蛋白与其配体之间的相互作用。降低免疫检查点分子的表达和/或活性的抑制性核酸也可用于本发明中。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是ctla4、tigit、糖皮质激素诱导的tnfr相关蛋白(gitr)、诱导型t细胞共刺激因子(icos)、cd96、脊髓灰质炎病毒受体相关2(pvrl2)、pd-1、pd-l1、pd-l2、lag-3、b7-h4、杀伤免疫球蛋白受体(kir)、ox40、ox40-l、吲哚胺2,3-双加氧酶1(ido-1)、吲哚胺2,3-双加氧酶2(ido-2)、ceacam1、cd272、tevi3、腺苷a2a受体和vista蛋白。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是ctla4、pd-1或pd-l1的抑制剂。
[0084]
在另一个实施方案中，靶向多肽包含抗体或抗体片段。在其他实施方案中，靶向多肽是与细胞抗原结合的抗体或抗体片段。在另一个实施方案中，靶向多肽是与选自由以下组成的组的靶标结合的抗体或抗体片段：her2、her3、pd-1、pdl-1、egfr、trop2、psma、vegfr、ctla-4、epcam、muc1、muc16、c-met、gpc3、enpp3、tim-1、folr1、steap1、间皮素、5t4、cea、ca9、钙粘蛋白6、ror1、slc34a2、slc39a6、slc44a4、ly6e、dll3、epha2、gpnmb、slitrk6、cd3、cd 19、cd22、cd24、cd25、cd30、cd33、cd38、cd44、cd47、cd52、cd56、cd70、cd96、cd97、cd99、cd117、cd123、cd179、cd223和cd276。在一些实施方案中，靶向多肽包含与her2结合的抗体或抗体片段。在另一个实施方案中，靶向多肽是曲妥珠单抗(trastuzumab)。
[0085]
在另一个实施方案中，抗体或抗体片段包含igg、fab、(fab')2、fv或单链fv(scfv)。在一些实施方案中，抗体或抗体片段包含一个或多个fab、(fab')2、fv或单链fv(scfv)突变。在一些实施方案中，抗体或抗体片段包含一个或多个fc突变。在其他实施方案中，抗体或抗体片段包含一个至六个fc突变。在一些实施方案中，抗体或抗体片段包含两个或更多个fc突变。在其他实施方案中，抗体或抗体片段包含三个或更多个fc突变。在一些实
施方案中，抗体或抗体片段包含四个或更多个fc突变。在其他实施方案中，抗体或抗体片段包含五个或更多个fc突变。在其他实施方案中，抗体或抗体片段包含六个fc突变。
[0086]
在另一个实施方案中，抗体或抗体片段包含掺入重链、轻链或重链和轻链两者中的一个或多个非天然编码氨基酸。在另一个实施方案中，抗体或抗体片段包含掺入重链和轻链中的一个或多个非天然编码氨基酸。在另一个实施方案中，抗体或抗体片段包含掺入重链、轻链或重链和轻链两者中的一个或多个非天然编码氨基酸，并且还包含一个或多个fc突变。在另一个实施方案中，抗体或抗体片段包含掺入每一条重链和轻链中的一个或多个非天然编码氨基酸，抗体或抗体片段还包含一个或多个fc突变。在另一个实施方案中，抗体或抗体片段包含掺入重链、轻链或重链和轻链两者中的一个或多个非天然编码氨基酸，并且还包含至少两个fc突变。在另一个实施方案中，抗体或抗体片段包含掺入每一条重链和轻链中的一个或多个非天然编码氨基酸，抗体或抗体片段还包含至少两个fc突变。在另一个实施方案中，抗体或抗体片段包含掺入重链、轻链或重链和轻链两者中的一个或多个非天然编码氨基酸，并且还包含至少三个fc突变。在另一个实施方案中，抗体或抗体片段包含掺入每一条重链和轻链中的一个或多个非天然编码氨基酸，抗体或抗体片段还包含至少三个fc突变。在另一个实施方案中，抗体或抗体片段包含掺入重链、轻链或重链和轻链两者中的一个或多个非天然编码氨基酸，并且还包含至少四个fc突变。在另一个实施方案中，抗体或抗体片段包含掺入每一条重链和轻链中的一个或多个非天然编码氨基酸，抗体或抗体片段还包含至少四个fc突变。在另一个实施方案中，抗体或抗体片段包含掺入重链、轻链或重链和轻链两者中的一个或多个非天然编码氨基酸，并且还包含至少五个fc突变。在另一个实施方案中，抗体或抗体片段包含掺入每一条重链和轻链中的一个或多个非天然编码氨基酸，抗体或抗体片段还包含至少五个fc突变。在另一个实施方案中，抗体或抗体片段包含掺入重链、轻链或重链和轻链两者中的一个或多个非天然编码氨基酸，并且还包含至少六个fc突变。在另一个实施方案中，抗体或抗体片段包含掺入每一条重链和轻链中的一个或多个非天然编码氨基酸，抗体或抗体片段还包含至少六个fc突变。
[0087]
在另一个实施方案中，靶向多肽包含选自以下的组的一个或多个非天然编码氨基酸：对乙酰基苯丙氨酸、对硝基苯丙氨酸、对磺基苯丙氨酸、对羧基苯丙氨酸、邻硝基苯丙氨酸、间硝基苯丙氨酸、对硼酰基苯丙氨酸、邻硼酰基苯丙氨酸、间硼酰基苯丙氨酸、对氨基苯丙氨酸、邻氨基苯丙氨酸、间氨基苯丙氨酸、邻酰基苯丙氨酸、间酰基苯丙氨酸、对ome苯丙氨酸、邻ome苯丙氨酸、间ome苯丙氨酸、对磺基苯丙氨酸、邻磺基苯丙氨酸、间磺基苯丙氨酸、5-硝基his、3-硝基tyr、2-硝基tyr、硝基取代的leu、硝基取代的his、硝基取代的de、硝基取代的trp、2-硝基trp、4-硝基trp、5-硝基trp、6-硝基trp、7-硝基trp、3-氨基酪氨酸、2-氨基酪氨酸、o-磺基酪氨酸、2-磺氧基苯丙氨酸、3-磺氧基苯丙氨酸、邻羧基苯丙氨酸、间羧基苯丙氨酸、对乙酰基-l-苯丙氨酸、对炔丙基-苯丙氨酸、o-甲基-l-酪氨酸、l-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、o-4-烯丙基-l-酪氨酸、4-丙基-l-酪氨酸、三-o-乙酰基-glcnacβ-丝氨酸、l-dopa、氟化苯丙氨酸、异丙基-l-苯丙氨酸、对叠氮基-l-苯丙氨酸、对酰基-l-苯丙氨酸、对苯甲酰基-l-苯丙氨酸、l-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-l-苯丙氨酸、对炔丙基氧基-l-苯丙氨酸、4-叠氮基-l-苯丙氨酸、对叠氮基乙氧基苯丙氨酸和对叠氮甲基-苯丙氨酸。在另一个实施方案中，非天然氨基酸选自由以下组成的组：对乙酰基-苯丙氨酸、4-叠氮基-l-苯丙氨酸、对叠氮基乙氧基苯
丙氨酸或对叠氮基甲基-苯丙氨酸。在其他实施方案中，非天然编码氨基酸被位点特异性地掺入一种或多种靶向多肽中。
[0088]
在另一个实施方案中，tlr激动剂是tlr7激动剂、tlr8激动剂或tlr7/tlr8双重激动剂。在其他实施方案中，tlr激动剂是包含根据图1的式(i)或式(ii)的分子结构的tlr激动剂。在另一个实施方案中，tlr激动剂是选自根据本发明的表3、4、5、6、7的结构组的tlr激动剂中的任一种。
[0089]
在其他实施方案中，靶向多肽缀合至一种或多种接头、聚合物或生物活性分子。在一些实施方案中，靶向多肽直接或间接缀合至一种或多种接头、聚合物或生物活性分子。在一些实施方案中，一种或多种接头是可裂解或不可裂解接头。
[0090]
在一些实施方案中，一种或多种接头是0.1kda至50kda。在其他实施方案中，一种或多种接头是0.1kda至10kda。在其他实施方案中，一种或多种接头或聚合物是线性的、分支的、多聚的或树枝状的。在另一个实施方案中，一种或多种接头或聚合物是双官能或多官能接头或双官能或多官能聚合物。
[0091]
在其他实施方案中，一种或多种聚合物是水溶性聚合物。在其他实施方案中，水溶性聚合物是聚乙二醇(peg)。在一些实施方案中，peg的分子量介于0.1kda与100kda之间。在其他实施方案中，peg的分子量介于0.1kda与50kda之间。在其他实施方案中，peg的分子量介于0.1kda与40kda之间。在其他实施方案中，peg的分子量介于0.1kda与30kda之间。在其他实施方案中，peg的分子量介于0.1kda与20kda之间。在其他实施方案中，peg的分子量介于0.1kda与10kda之间。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子的分子量介于约0.1kda与约100kda之间。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子的分子量介于0.1kda与50kda之间。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子的分子量介于1kda与25kda之间、或介于2kda与22kda之间、或介于5kda与20kda之间。举例来说，聚(乙二醇)聚合物的分子量可为约5kda、或约10kda、或约20kda、或约30kda。举例来说，聚(乙二醇)聚合物的分子量可为5kda、或10kda、或20kda、或30kda。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子是支化peg。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子是支化5k peg。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子是支化10k peg。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子是支化20k peg。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子是线性peg。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子是线性5k peg。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子是线性10k peg。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子是线性20k peg。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子是线性30kpeg。在一些实施方案中，聚(乙二醇)聚合物的分子量是平均分子量。在某些实施方案中，平均分子量是数均分子量(mn)。可使用gpc或sec、sds/page分析、rp-hplc、质谱法或毛细管电泳来确定或测量平均分子量。
[0092]
在另一个实施方案中，至少一种接头、聚合物或生物活性分子连接至至少一个非天然编码氨基酸。在一些实施方案中，接头是peg。在其他实施方案中，接头是分子量介于0.1kda与50kda之间的peg。在其他实施方案中，接头是分子量介于0.1kda与40kda之间的peg。在其他实施方案中，接头是分子量介于0.1kda与30kda之间的peg。在其他实施方案中，接头是分子量介于0.1kda与20kda之间的peg。在其他实施方案中，接头是分子量介于0.1kda与10kda之间的peg。在其他实施方案中，接头是分子量介于0.1kda与5kda之间的peg。
[0093]
在另一个实施方案中，靶向多肽包含增加组合物的稳定性或溶解度的一个或多个
氨基酸取代、添加或缺失。在另一个实施方案中，靶向多肽包含增强/降低adcp或adcc活性的一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。在另一个实施方案中，靶向多肽包含增加组合物的药代动力学的一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。在其他实施方案中，组合物包含增加重组宿主细胞中或体外合成的靶向多肽的表达的一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。
[0094]
在另一个实施方案中，非天然编码氨基酸对接头、聚合物或生物活性分子具有反应性，而对多肽中的20种常见氨基酸中的任一种不具有反应性。在另一个实施方案中，非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基团、叠氮化物基团或炔烃基团。在其他实施方案中，非天然编码氨基酸包含羰基。
[0095]
在另一个实施方案中，靶向多肽连接至细胞毒性剂或免疫刺激剂。在另一个实施方案中，本发明的tc或btc连接至细胞毒性剂或免疫刺激剂。在另一个实施方案中，靶向多肽包含细胞毒性剂或免疫刺激剂。在另一个实施方案中，本发明的tc或btc包含细胞毒性剂或免疫刺激剂。
[0096]
在另一个实施方案中，本发明提供了一种tlr激动剂缀合物(tc)，其包含缀合至包含根据图1的任何结构的结构的tlr激动剂的抗her2抗体或抗体片段，其中tlr激动剂通过共价键结至掺入抗体或抗体片段中的一个或多个非天然编码氨基酸的接头缀合至抗体或抗体片段。在另一个实施方案中，tlr激动剂是tlr7激动剂、tlr8激动剂或tlr7/tlr8双重激动剂。在另一个实施方案中，tlr激动剂包含根据图1的式(i)或式(ii)的结构。在另一个实施方案中，tlr激动剂包含根据式i或式ii的结构，进一步包含接头。
[0097]
在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含掺入重链、轻链或重链和轻链两者中的一个或多个非天然编码氨基酸。在另一个实施方案中，一个或多个非天然编码氨基酸选自以下的组：对乙酰基苯丙氨酸、对硝基苯丙氨酸、对磺基苯丙氨酸、对羧基苯丙氨酸、邻硝基苯丙氨酸、间硝基苯丙氨酸、对硼酰基苯丙氨酸、邻硼酰基苯丙氨酸、间硼酰基苯丙氨酸、对氨基苯丙氨酸、邻氨基苯丙氨酸、间氨基苯丙氨酸、邻酰基苯丙氨酸、间酰基苯丙氨酸、对ome苯丙氨酸、邻ome苯丙氨酸、间ome苯丙氨酸、对磺基苯丙氨酸、邻磺基苯丙氨酸、间磺基苯丙氨酸、5-硝基his、3-硝基tyr、2-硝基tyr、硝基取代的leu、硝基取代的his、硝基取代的de、硝基取代的trp、2-硝基trp、4-硝基trp、5-硝基trp、6-硝基trp、7-硝基trp、3-氨基酪氨酸、2-氨基酪氨酸、o-磺基酪氨酸、2-磺氧基苯丙氨酸、3-磺氧基苯丙氨酸、邻羧基苯丙氨酸、间羧基苯丙氨酸、对乙酰基-l-苯丙氨酸、对炔丙基-苯丙氨酸、o-甲基-l-酪氨酸、l-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、o-4-烯丙基-l-酪氨酸、4-丙基-l-酪氨酸、三-o-乙酰基-glcnacβ-丝氨酸、l-dopa、氟化苯丙氨酸、异丙基-l-苯丙氨酸、对叠氮基-l-苯丙氨酸、对酰基-l-苯丙氨酸、对苯甲酰基-l-苯丙氨酸、l-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-l-苯丙氨酸、对炔丙基氧基-l-苯丙氨酸、4-叠氮基-l-苯丙氨酸、对叠氮基乙氧基苯丙氨酸和对叠氮甲基-苯丙氨酸。在其他实施方案中，非天然氨基酸是对乙酰基-苯丙氨酸、4-叠氮基-l-苯丙氨酸、对叠氮基甲基-苯丙氨酸或对叠氮基乙氧基苯丙氨酸。
[0098]
在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段还包含fc区中的一个或多个突变。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段还包含fc区中的两个或更多个突变。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段还包含fc区中的三个或更多个突变。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段还包含fc区中的四个或更多个突变。在另一个实施方案中，
id no:1和seq id no:5。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:1和seq id no:6。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:1和seq id no:7。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:1和seq id no:8。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:1和seq id no:9。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:1和seq id no:10。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:1和seq id no:11。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:1和seq id no:12。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:1和seq id no:13。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:1和seq id no:14。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:1和seq id no:15。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:2和seq id no:5。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:2和seq id no:6。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:2和seq id no:7。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:2和seq id no:8。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:2和seq id no:9。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:2和seq id no:10。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:2和seq id no:11。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:2和seq id no:12。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:2和seq id no:13。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:2和seq id no:14。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:2和seq id no:15。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:3和seq id no:5。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:3和seq id no:6。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:3和seq id no:7。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:3和seq id no:8。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:3和seq id no:9。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:3和seq id no:10。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:3和seq id no:11。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:3和seq id no:12。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:3和seq id no:13。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:3和seq id no:14。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:3和seq id no:15。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:4和seq id no:5。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:4和seq id no:6。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:4和seq id no:7。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:4和seq id no:8。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:4和seq id no:9。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:4和seq id no:10。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:4和seq id no:11。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:4和seq id no:12。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:4和seq id no:13。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:4和seq id no:14。在另一个实施方案中，抗her2抗体或抗体片段包含seq id no:4和seq id no:15。在
另一个实施方案中，本发明提供了一种抗her2抗体或抗体片段，其中非天然编码氨基酸被位点特异性地掺入根据kabat编号的位置114处。在另一个实施方案中，本发明提供了一种抗her2抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含根据表9a的fc突变。
[0103]
在另一个实施方案中，本发明提供了一种tlr激动剂缀合物(tc)，其包含缀合至包含根据图1的结构的tlr激动剂的抗her2抗体或抗体片段，其中tlr激动剂通过共价键结至掺入抗体或抗体片段中的一个或多个非天然编码氨基酸的接头缀合至抗体或抗体片段，所述tc还包含化学治疗剂或免疫治疗剂。在另一个实施方案中，本发明提供了一种tlr激动剂缀合物(tc)，其包含缀合至选自表3至表7的化合物中的任一种的tlr激动剂的抗her2抗体或抗体片段，其中tlr激动剂通过共价键结至掺入抗体或抗体片段中的一个或多个非天然编码氨基酸的接头缀合至抗体或抗体片段。在另一个实施方案中，本发明提供了一种tlr激动剂缀合物(tc)，其包含缀合至选自表3至表7的化合物中的每一种的tlr激动剂的抗her2抗体或抗体片段，其中tlr激动剂通过共价键结至掺入抗体或抗体片段中的一个或多个非天然编码氨基酸的接头缀合至抗体或抗体片段，所述tc还包含化学治疗剂或免疫治疗剂。
[0104]
在另一个实施方案中，本发明提供了一种tlr激动剂缀合物(tc)，其包含缀合至包含根据图1的结构的tlr激动剂的抗her2抗体或抗体片段，其中tlr激动剂通过共价键结至掺入抗体或抗体片段中的一个或多个非天然编码氨基酸的接头缀合至抗体或抗体片段，所述tc还包含药物缀合物。在其他实施方案中，药物缀合物是抗体药物缀合物。在另一个实施方案中，本发明提供了一种tlr激动剂缀合物(tc)，其包含缀合至选自表3至表7的化合物中的任一种的tlr激动剂的抗her2抗体或抗体片段，其中tlr激动剂通过共价键结至掺入抗体或抗体片段中的一个或多个非天然编码氨基酸的接头缀合至抗体或抗体片段。在另一个实施方案中，本发明提供了一种tlr激动剂缀合物(tc)，其包含缀合至选自表3至表7的化合物中的每一种的tlr激动剂的抗her2抗体或抗体片段，其中tlr激动剂通过共价键结至掺入抗体或抗体片段中的一个或多个非天然编码氨基酸的接头缀合至抗体或抗体片段，所述tc还包含药物缀合物。在其他实施方案中，药物缀合物是抗体药物缀合物。在其他实施方案中，tc还包含细胞因子或细胞毒素。
[0105]
在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗患有癌症或疾病或疾患或适应症或病症的受试者或患者的方法，所述方法包括向受试者或患者施用治疗有效量的本发明的组合物或tc。在某些实施方案中，肿瘤或癌症是her2阳性肿瘤或癌症。在某些实施方案中，肿瘤、癌症、适应症、疾病、病症或疾患是her2阳性肿瘤、癌症、适应症、疾病、病症或疾患。在某些实施方案中，肿瘤或癌症选自由以下组成的组：结肠癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌、膀胱癌、宫颈癌、胰腺癌、肾癌、食管癌、阴道癌、胃癌和白血病。
[0106]
在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗患有癌症或疾病或疾患的受试者或患者的方法，所述方法包括向受试者或患者施用治疗有效量的本发明的组合物或tc，本发明的组合物或tc还包含化学治疗剂或免疫治疗剂。在某些实施方案中，tc与至少一种化学治疗剂共同施用。化学治疗剂可选自由以下组成的组：替莫唑胺、吉西他滨、多柔比星、环磷酰胺、紫杉醇、顺铂、氟嘧啶、紫杉烷、蒽环类、拉帕替尼、卡培他滨、来曲唑、帕妥珠单抗、多西他赛、ifn-α。
[0107]
在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗患有癌症或疾病或疾患的受试者或患者的方法，所述方法包括向受试者或患者施用治疗有效量的本发明的组合物或tc，本发
明的组合物或tc还包含抗体药物缀合物、细胞毒性剂或检查点抑制剂。
[0108]
在另一个实施方案中，本发明提供了一种杀死细胞的方法，所述方法包括使细胞与本发明的tc接触。在其他实施方案中，细胞是肿瘤细胞或癌细胞。在某些实施方案中，肿瘤细胞或癌细胞是结肠癌细胞、卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、黑色素瘤细胞、肺癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、前列腺癌细胞、膀胱癌细胞、宫颈癌细胞、胰腺癌细胞、肾癌细胞、食管癌细胞、阴道癌细胞、胃癌细胞或白血病癌细胞。在某些实施方案中，肿瘤或癌症是her2阳性肿瘤或癌症。在某些实施方案中，待治疗的肿瘤、癌症、适应症、疾病、病症或疾患是her2阳性肿瘤、癌症、适应症、疾病、病症或疾患。
[0109]
本发明提供抑制或减少肿瘤或癌症生长的方法，所述方法包括使肿瘤与有效量的本发明的tc接触以刺激肿瘤附近的患者的免疫系统。本发明提供了抑制或减少肿瘤或癌症生长的方法，所述方法包括使肿瘤与有效量的peg化tc，或本发明的tc的稳定二聚体或多聚体接触。在一个实施方案中，tc是非聚乙二醇化的或单聚乙二醇化的。在一个实施方案中，tc是二聚乙二醇化。在一个实施方案中，tc具有与其连接的多于一种和/或不同的tlr激动剂分子。本发明的另一个实施方案提供了使用本发明的tc来调节对肿瘤细胞的免疫响应的方法。
[0110]
在一些实施方案中，本发明提供了使用tc治疗癌症的方法。在一些实施方案中，本发明的tc可用于治疗或预防癌症相关疾病、病症和疾患，包括与癌症直接或间接相关的疾患，例如血管生成和癌前疾患，诸如发育异常。在一些实施方案中，肿瘤是液体肿瘤或实体肿瘤。在一些实施方案中，待治疗疾患是癌症。癌症可以是但不限于乳腺癌、脑癌、胰腺癌、皮肤癌、肺癌、肝癌、胆囊癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、骨癌和血癌(白血病)癌症或与这些癌症中的任一种相关的癌症或疾病或疾患。癌是从上皮细胞开始的癌症，所述上皮细胞是覆盖身体表面、产生激素和构成腺体的细胞。借助于非限制性实例，癌包括乳腺癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、肾癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、脑癌、阴道癌、外阴癌、子宫癌、口腔癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、皮肤癌、输卵管癌、头颈癌、胃肠道间质癌、腺癌、皮肤或眼内黑色素瘤、肛门癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、尿道癌、肾盂癌、输尿管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、垂体癌、中枢神经系统(cns)肿瘤、原发性cns淋巴瘤、脑干神经胶质瘤和脊柱轴肿瘤。在一些情况下，癌症是皮肤癌，诸如基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、非黑色素瘤或光化性(日光性)角化病。在一些实施方案中，本发明还涉及一种治疗哺乳动物的急性白血病的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的本发明的tc。本发明还提供了一种抑制急性白血病母细胞增殖的方法，所述方法包括向患有急性白血病的哺乳动物施用治疗有效剂量的本发明的tc。
[0111]
在另一个实施方案中，本文公开的tc可用于调节免疫响应。免疫响应的调节可包括刺激、激活、增加、增强或上调免疫响应。免疫响应的调节可包括阻抑、抑制、预防、降低或下调免疫响应。
[0112]
在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含治疗有效量的本发明的组合物或tc和药学上可接受的载剂或赋形剂的药物组合物。
[0113]
在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的组合物在制造药剂中的用途。
[0114]
在另一个实施方案中，本发明提供了一种免疫刺激抗体缀合物(isac)，其包含根据图1中的任一式的tlr激动剂。在另一个实施方案中，本发明提供了一种免疫刺激抗体缀
合物(isac)，其包含根据表3、4、5、6、7的化合物中的任一种的tlr激动剂。在另一个实施方案中，本发明提供了peg化isac，其中tlr激动剂包含选自还包含peg屏蔽的表3、4、5、6、7化合物组的化合物。在其他实施方案中，本发明提供了isac，其中tlr激动剂包含选自表4化合物组的化合物。在另一个实施方案中，本发明提供了peg化isac，其中tlr激动剂包含选自以下的组的化合物：还包含peg屏蔽的表4化合物。
[0115]
在另一个实施方案中，本发明提供了具有图1的结构的化合物中的任一种的盐。在另一个实施方案中，本发明提供了表3、4、5、6、7的化合物中的任一种的盐。在另一个实施方案中，本发明提供了表4的化合物中的任一种的盐。在另一个实施方案中，本发明提供了根据本发明公开的组合物、化合物和tc的药物组合物或其盐。在其他实施方案中，药物组合物或盐还包含药学上可接受的赋形剂。
附图说明
[0116]
图1描绘了tlr激动剂的一般结构
[0117]
图2描绘了具有peg分子的各种tlr7激动剂的tlr7活性。
[0118]
图3a至图3b描绘了具有线性peg(图3a)和支化peg(图3b)的各种tlr7激动剂的tlr7活性。
[0119]
图4描绘了her2 isac的skbr3-rawblue共培养体外测定。
[0120]
图5描绘了fc区对her2 isac活性的影响。
[0121]
图6描绘了缀合位点对her2 isac活性的影响
[0122]
图7a至图7c示出了在raw-blue共培养测定中axc-879衍生物(图7a)、额外her2 isac(图7b)和具有分支修饰的axc-879衍生物(图7c)的体外活性。
[0123]
图8a至图8c示出了在raw-blue共培养测定中具有peg屏蔽的axc-879衍生物(图8a)(图8b)和具有peg屏蔽的其他axc-879衍生物(图8c)的体外活性比较。
[0124]
图9a至图9b示出了在raw-blue共培养测定中具有d-lys嵌段或l-lys嵌段的axc-879衍生物的体外活性比较。
[0125]
图10示出了在pbmc共培养测定中her2 mab与her2-axc879 isac之间的adcc活性的比较。
[0126]
图11示出了在pbmc共培养测定中her2 mab与her2-axc879 isac之间的hla-dr标志物对髓样细胞诱导的比较。
[0127]
图12示出了在pbmc共培养测定中her2 mab与her2-axc879 isac之间的cd86/dc-sign 双阳性细胞诱导的比较。
[0128]
图13a至图13c示出了具有前药设计的her2 isac在(图13a)her2高skbr3/pbmc共培养测定、(图13b)her2低hcc1806/pbmc共培养测定和(图13c)her2阴性mda-mb-468/pbmc共培养测定中的adcc效应。
[0129]
图14a至图14b示出了在(图14a)her2高n87/pbmc共培养测定和(图14b)her2阴性mda-mb-468/pbmc共培养测定中her2-axc879对tnf-α的细胞因子诱导。
[0130]
图15a至图15d示出了在her2高skbr3/pbmc共培养测定(图15a)和her2低hcc1806/pbmc共培养测定(图15b)中her2 isac对ifnγ的细胞因子诱导；以及在her2高skbr3/pbmc共培养测定(图15c)和her2低hcc1806/pbmc共培养测定(图15d)中her2isac对tnf-α的细胞
因子诱导。
[0131]
图16a至图16d示出了在her2高skbr3/pbmc共培养测定(图16a)、her2低hcc1806/pbmc共培养测定(图16b)、her2阴性mda-mb-468/pbmc共培养测定(图16c)和pbmc(图16d)中具有前药设计的her2 isac对ifnγ的细胞因子诱导。
[0132]
图17a至图17d示出了在her2高skbr3/pbmc共培养测定(图17a)、her2低hcc1806/pbmc共培养测定(图17b)、her2阴性mda-mb-468/pbmc共培养测定(图17c)和pbmc(图17d)中具有前药设计的her2 isac对tnf-α的细胞因子诱导。
[0133]
图18a至图18c示出了axc879与靶向不同肿瘤抗原trop-2(图18a)、psma(图18b)和cd70(图18c)的其他抗体。
[0134]
图19a至图19b示出了不同细胞系上的trop2表达水平(图19a)和不同肿瘤细胞系上的trop2-axc879表达水平(图19b)。
[0135]
图20a至图20b示出了通过raw-blue共培养测定在trop2阳性hcc1806(图20a)和trop2阴性hcc1395(图20b)细胞系中额外trop2isac的体外活性。
[0136]
图21a至图21b示出了通过pbmc共培养测定在trop2阳性skbr3(图21a)和trop2阴性hcc1395(图21b)细胞系中trop2 isac的tnf-α细胞因子诱导。
[0137]
图22a至图22b示出了与trop2阳性bxpc-3(图22a)中未缀合的trop2抗体相比，trop2-axc879显示出增强的adcc效应，并且在pbmc共培养测定中，在trop2阴性hcc1395(图22a)中显示出非特异性杀伤。
[0138]
图23示出了在c57/b6小鼠中单次给药后her2-axc879的pk概况。
[0139]
图24a至图24c示出了在mc38-hher2同源移植模型中her2-axc879的体内功效(图24a)，以及her2-axc863组(图24b)和her2-axc879组(图24c)的各个肿瘤生长曲线。
[0140]
图25示出了her2-axc879与抗pd-1抗体之间的体内功效协同效应。
[0141]
图26a至图26b示出了在c57/b6小鼠中重复给药后her2-axc879(图26a)和her2-axc863(图26b)的pk概况。
[0142]
图27示出了mc38-hher2同源移植模型中her2-axc879的剂量滴定。
[0143]
图28示出了mc38-hher2同源移植模型中不同her2 isac的体内功效比较。
[0144]
图29a至图29b示出了在isac治疗的肿瘤完全消退的小鼠和未接受治疗的小鼠中mc38-hher2肿瘤(图29a)和mc38亲代肿瘤(图29b)的再次攻击。
[0145]
图30a至图30b示出了在jimt-1异种移植模型中trop2-axc879的体内功效(图30a)和体重随时间的变化(图30b)。
具体实施方式
[0146]
本文公开了包含诸如抗体的靶向部分和一种或多种tlr激动剂的tc。tlr激动剂还可包含一种或多种接头。本发明的tc可包含与靶向部分中的非天然氨基酸连接的tlr激动剂。还包括了用于制备包含掺入靶向部分多肽中的非天然氨基酸的此类tc的方法。
[0147]
在某些实施方案中，提供了包含所描述的化合物中的任一种和药学上可接受的载剂、赋形剂或粘合剂的药物组合物。
[0148]
在其他或替代实施方案中的是用于检测患者体内多肽的存在的方法，所述方法包括施用包含至少一个含杂环的非天然氨基酸的多肽，并且相对于同源的天然存在的氨基酸
多肽，所得含杂环的非天然氨基酸多肽调节多肽的免疫原性。
[0149]
应理解，本文所描述的方法和组合物不限于本文所描述的特定方法学、方案、细胞系、构建体和试剂，并因此可变化。还应理解，本文所用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，并且不意图限制将仅由随附权利要求限定的本文所描述的方法和组合物的范围。
[0150]
如本文中和随附权利要求中所用，除非上下文另外清楚地指示，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述”包括复数个提及物。
[0151]
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本文所描述的发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管在本文所描述的发明的实践或测试中可使用与本文所描述的类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。
[0152]
本文提及的所有出版物和专利均以引用的方式整体并入本文，以用于描述和公开例如出版物中描述的构建体和方法的目的，所述构建体和方法可与本文所描述的发明结合使用。本文讨论的出版物单独提供，因为它们在本技术的提交日期之前公开。不得将本文的任何条款视为承认本文所描述的发明人因现有发明或任何其他原因而无权将此公开提前。
[0153]
术语“基于羟醛的键联”或“混合的基于羟醛的键联”是指一种羰基化合物与另一种羰基化合物的烯醇化物/烯醇的酸催化或碱催化的缩合，所述羰基化合物可以相同也可以不同，以生成β-羟基羰基化合物—羟醛。
[0154]
如本文所用，术语“亲和标记”是指可逆或不可逆地结合另一分子以修饰所述分子、破坏所述分子或与所述分子形成化合物的标记。举例来说，亲和标记包括酶和其底物，或抗体和其抗原。
[0155]
术语“烷氧基”、“烷氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)以其常规含义使用，并且是指分别通过氧原子、氨基或硫原子与分子连接的那些烷基。
[0156]
术语“烷基”自身或作为另一分子的部分，除非另外说明，否则意指直链或支链，或环状烃基，或其组合，所述烃基可为完全饱和的、单不饱和或多不饱和的并且可包括二价和多价基团、具有指定的碳原子数(即c
1-c
10
意指一个至十个碳)。饱和烃基的实例包括但不限于诸如以下的基团：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基、其同系物和异构体(例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等)。不饱和烷基为具有一个或多个双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基以及高级同系物和异构体。除非另外说明，否则术语“烷基”还意在包括本文更详细定义的那些烷基衍生物，诸如“杂烷基”、“卤代烷基”和“均烷基”。
[0157]
术语“亚烷基”自身或作为另一分子的部分意指衍生自烷烃的二价基团，例如(-ch
2-)n，其中n可以是1至约24。仅举例来说，此类基团包括但不限于具有10个或更少碳原子的基团，诸如结构-ch2ch
2-和-ch2ch2ch2ch
2-。“低级烷基”或“低级亚烷基”是较短链的烷基或亚烷基，其通常具有八个或更少个碳原子。除非另外说明，否则术语“亚烷基”还意在包括本文描述为“亚杂烷基”的那些基团。
[0158]
术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和非天然氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码的氨基酸是20种常见氨基
酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，仅举例来说，与氢、羧基、氨基和r基团结合的α-碳。此类类似物可具有修饰的r基团(举例来说，正亮氨酸)或可具有修饰的肽主链，同时仍保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸类似物的非限制性实例包括高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基硫鎓。
[0159]
氨基酸可在本文中由其名称、其通常已知的三字母符号或由iupac-iub生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。另外地，核苷酸可用其通常接受的单字母代码来表示。
[0160]“氨基末端修饰基”是指可连接至末端氨基的任何分子。举例来说，此类末端胺基可在聚合分子的末端，其中此类聚合分子包括但不限于多肽、多核苷酸和多糖。末端修饰基包括但不限于各种水溶性聚合物、肽或蛋白质。仅举例来说，末端修饰基包括聚乙二醇或血清白蛋白。末端修饰基可用于修饰聚合物分子的治疗特性，包括但不限于增加肽的血清半衰期。
[0161]
本文中的“抗体”意指由基本上由全部或部分抗体基因编码的一种或多种多肽组成的蛋白质。免疫球蛋白基因包括但不限于κ、λ、α、γ(igg1、igg2、igg3和igg4)、δ、ε和μ恒定区基因，以及大量免疫球蛋白可变区基因。本文中的抗体意在包括全长抗体和抗体片段，并且包括天然存在于任何生物中或被工程化(例如是变体)的抗体。
[0162]“抗体片段”意指除全长形式之外的任何形式的抗体。本文中的抗体片段包括作为存在于全长抗体中的更小组分的抗体，以及已经被工程化的抗体。抗体片段包括但不限于fv、fc、fab和(fab')2、单链fv(scfv)、双链抗体、三链抗体、四链抗体、双官能杂交抗体、cdr1、cdr2、cdr3、cdr的组合、可变区、框架区、恒定区、重链、轻链和可变区，以及替代支架非抗体分子、双特异性抗体等(maynard&georgiou,2000,annu.rev.biomed.eng.2:339-76；hudson,1998,curr.opin.biotechnol.9:395-402)。另一种功能亚结构是单链fv(scfv)，其由免疫球蛋白重链和轻链的可变区组成，通过肽接头共价连结(s-zhu等人,1996,cancer research,56,3055-3061)。这些小的(mr 25,000)蛋白质通常在单个多肽中保留对抗原的特异性和亲和力，并且可为更大的抗原特异性分子提供方便的构建单元。除非另外特别说明，否则使用术语“抗体(antibody/antibodies)”的声明和权利要求明确包括“抗体片段(antibody fragment/antibody fragments)”。
[0163]
如本文所用，“抗体-药物缀合物”或“adc”是指与一种或多种生物活性分子共价键结的抗体分子或其片段。生物活性分子可通过接头、聚合物或其他共价键缀合至抗体。
[0164]
如本文所用，术语“芳香族”或“芳基”是指具有至少一个具有共轭π电子系统的环并且包括碳环芳基和杂环芳基(或“杂芳基”或“杂芳香族”)的基团的闭环结构。碳环或杂环芳香族基团可含有5个至20个环原子。所述术语包括共价连接的单环或稠合环多环(即，共享相邻碳原子对)基团。芳香族基团可以是未取代或取代的。“芳香族”或“芳基”基团的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、蒽基和菲基。上述芳环和杂芳环系统中的每一个的取代基选自本文所描述的可接受的取代基组。
[0165]
为简洁起见，当与其他术语(包括但不限于芳氧基、芳硫氧基、芳烷基)组合使用
时，术语“芳香族”或“芳基”包括如上所定义的芳基环和杂芳基环。因此，术语“芳烷基”或“烷芳基”意在包括其中芳基连接至烷基(包括但不限于苯甲基、苯乙基、吡啶基甲基等)的那些基团，包括其中烷基碳原子(包括但不限于亚甲基)已被杂原子，仅举例来说，被氧原子替代的那些烷基。此类芳基的实例包括但不限于苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等。
[0166]
如本文所用，术语“亚芳基”通常指二价芳基。“亚芳基”的非限制性实例包括亚苯基、亚萘基、亚芴基、亚薁基、亚蒽基、亚菲基、亚芘基、亚联苯基和亚三联苯基。亚芳基还指双环或三环碳环，其中所述环中的一个是芳香族的并且其他环可为饱和的、部分不饱和的或芳香族的，例如二氢亚萘基、亚茚基、亚茚满基或四氢亚萘基(亚四氢萘基(tetralinylene))。在某些实施方案中，亚芳基可任选地被一个或多个取代基取代。
[0167]
如本文所用，术语“亚杂芳基”通常指含有至少一个芳环的二价单环芳基或二价多环芳基，其中至少一个芳环在环中含有一个或多个独立选自o、s和n的杂原子。亚杂芳基的每个环可含有一个或两个o原子、一个或两个s原子和/或一个或四个n原子，前体条件是每个环中的杂原子总数为四个或更少的，并且每个环含有至少一个碳原子。在某些实施方案中，亚杂芳基具有5至20个、5至15个或5至10个环原子。单环亚杂芳基的实例包括但不限于亚呋喃基、亚咪唑基、亚异噻唑基、亚异噁唑基、亚噁二唑基、亚噁二唑基、亚噁唑基、亚吡嗪基、亚吡唑基、亚哒嗪基、亚吡啶基、亚嘧啶基、亚吡咯基、亚噻二唑基、亚噻唑基、亚噻吩基、亚四唑基、亚三嗪基和亚三唑基。双环亚杂芳基的实例包括但不限于亚苯并呋喃基、亚苯并咪唑基、亚苯并异噁唑基、亚苯并吡喃基、亚苯并噻二唑基、亚苯并噻唑基、亚苯并噻吩基、亚苯并三唑基、亚苯并噁唑基、亚呋喃吡啶基、亚咪唑并吡啶基、亚咪唑并噻唑基、亚吲哚嗪基、亚吲哚基、亚吲唑基、亚异苯并呋喃基、异苯并噻吩基、亚异吲哚基、亚异喹啉基、亚异噻唑基、亚萘啶基、亚噁唑并吡啶基、亚酞嗪基、亚蝶啶基、亚嘌呤基、亚吡啶并吡啶基、亚吡咯并吡啶基、亚喹啉基、亚喹喔啉基、亚喹唑啉基、亚噻二唑并嘧啶基和亚噻吩并吡啶基。三环亚杂芳基的实例包括但不限于亚吖啶基、亚苯并吲哚基、亚咔唑基、亚二苯并呋喃基、亚咟啶基、亚菲咯啉基、亚菲啶基、亚吩吡嗪基、亚吩嗪基、亚吩噻嗪基、亚吩噁嗪基和亚氧杂蒽基。在某些实施方案中，亚杂芳基也可任选地被取代。
[0168]“双官能聚合物”，也称为“双官能接头”，是指包含能够与其他部分特异性反应以形成共价键联或非共价键联的两个官能团的聚合物。此类部分可包括但不限于天然或非天然氨基酸或含有此类天然或非天然氨基酸的肽上的侧基。可连接至双官能接头或双官能聚合物的其他部分可以是相同或不同的部分。仅举例来说，双官能接头可具有与第一肽上的基团反应的官能团和与第二肽上的基团反应的另一官能团，从而形成包括第一肽、双官能接头和第二个肽的缀合物。许多用于将各种化合物连接至肽的程序和接头分子是已知的。参见例如欧洲专利申请号188,256；美国专利号4,671,958、4,659,839、4,414,148、4,699,784；4,680,338；和4,569,789，所述文献以引用的方式整体并入本文。“多功能聚合物”也称为“多功能接头”，是指包含两个或更多个能够与其他部分反应的官能团的聚合物。此类部分可包括但不限于天然或非天然氨基酸或含有此类天然或非天然氨基酸的肽上的侧基(包括但不限于氨基酸侧基)以形成共价键联或非共价键联。双官能聚合物或多官能聚合物可以是任何所需的长度或分子量，并且可以被选择以在连接至化合物的一个或多个分子与它结合的分子或所述化合物之间提供特定所需的间距或构象。
[0169]
如本文所用，术语“生物利用度”是指物质或其活性部分从药物剂型中递送并在作用部位或在全身循环中变得可用的速率和程度。生物利用度的增加是指增加物质或其活性部分从药物剂型中递送并在作用部位或在全身循环中变得可用的速率和程度。举例来说，当与其他物质或活性部分相比时，生物利用度的增加可表示为所述物质或其活性部分在血液中的浓度增加。评估生物利用度增加的方法是本领域已知的并且可用于评估任何多肽的生物利用度。
[0170]
当在本文中使用时，术语“生物活性分子”、“生物活性部分”或“生物活性剂”意指可影响生物系统、路径、分子或与生物相关的相互作用的任何物理或生化特性的任何物质，所述生物包括但不限于病毒、细菌、噬菌体、转座子、朊病毒、昆虫、真菌、植物、动物和人。具体而言，如本文所用，生物活性分子包括但不限于旨在诊断、治愈、减轻、治疗或预防人或其他动物的疾病，或以其他方式增强人或动物的身心健康的任何物质。生物活性分子的实例包括但不限于肽、蛋白质、酶、小分子药物、硬药、软药、前药、碳水化合物、无机原子或分子、染料、脂质、核苷、放射性核素、寡核苷酸、毒素、细胞、病毒、脂质体、微粒和胶团。适用于本文所描述的方法和组合物的生物活性剂的类别包括但不限于药物、前药、放射性核素、显像剂、聚合物、抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂、抗炎剂、抗肿瘤药、心血管药、抗焦虑药、激素、生长因子、类固醇剂、微生物源性毒素等。
[0171]“调节生物活性”意指增加或降低多肽的反应性、改变多肽的选择性、增强或降低多肽的底物选择性。可通过将非天然多肽的生物活性与天然多肽的生物活性进行比较来进行修饰的生物活性的分析。
[0172]
如本文所用，术语“生物材料”是指生物源性材料，包括但不限于从生物反应器和/或由重组方法和技术获得的材料。
[0173]
如本文所用，术语“生物物理学探针”是指可检测或监测分子的结构变化的探针。此类分子包括但不限于蛋白质，并且“生物物理学探针”可用于检测或监测蛋白质与其他大分子的相互作用。生物物理学探针的实例包括但不限于自旋标记、荧光团和光活化基团。
[0174]
如本文所用，术语“生物合成地”是指利用翻译系统(细胞或非细胞)的任何方法，包括使用至少一种以下组分：多核苷酸、密码子、trna和核糖体。举例来说，非天然氨基酸可使用wo 2002/085923中所描述的方法和技术“生物合成地掺入”非天然氨基酸多肽中，所述文献以引用的方式整体并入本文。另外，在wo 2002/085923中描述了用于选择可“生物合成地掺入”非天然氨基酸多肽中的有用的非天然氨基酸的方法，所述文献以引用的方式整体并入本文。
[0175]
如本文所用，术语“生物素类似物”或也称为“生物素模拟物”是除生物素之外的任何分子，其以高亲和力与抗生物素蛋白和/或链霉抗生物素蛋白结合。
[0176]
如本文所用，术语“羰基”是指含有选自由-c(o)-、-s(o)-、-s(o)2-和-c(s)-组成的组的部分的基团，包括但不限于含有至少一个酮基、和/或至少一个醛基、和/或至少一个酯基、和/或至少一个羧酸基的基团、和/或至少一个硫酯基团的基团。此类羰基包括酮、醛、羧酸、酯和硫酯。另外，此类基团可以是直链、支链或环状分子的一部分。
[0177]
术语“羧基末端修饰基”是指可连接至末端羧基的任何分子。举例来说，此类末端羧基可在聚合分子的末端，其中此类聚合分子包括但不限于多肽、多核苷酸和多糖。末端修饰基包括但不限于各种水溶性聚合物、肽或蛋白质。仅举例来说，末端修饰基包括聚乙二醇
或血清白蛋白。末端修饰基可用于修饰聚合物分子的治疗特性，包括但不限于增加肽的血清半衰期。
[0178]
如本文所用，术语“化学可裂解基团”也称为“化学不稳定的”，是指在暴露于酸、碱、氧化剂、还原剂、化学引发剂或自由基引发剂时断裂或裂解的基团。
[0179]
如本文所用，“共折叠”是指使用至少两个分子的再折叠过程、反应或方法，所述至少两个分子彼此相互作用并导致未折叠或不正确折叠的分子转化为正确折叠的分子。仅举例来说，“共折叠”使用至少两种多肽，所述至少两种多肽彼此相互作用并导致未折叠或不正确折叠的多肽转化为天然的、正确折叠的多肽。此类多肽可含有天然氨基酸和/或至少一种非天然氨基酸。
[0180]
本文所用，“缀合物”是指直接或通过接头连接(例如共价连接)至本文所描述的化合物或化合物-接头的多肽，例如根据图1的结构中的任一种或表3至表7的结构中的任一种的化合物或盐。“靶向部分”是指相对于其他非靶分子对靶分子具有选择性亲和力的结构。本发明的靶向部分与靶分子结合。靶向部分可包括例如抗体、肽、配体、受体或其结合部分。靶生物分子可以是生物受体或细胞的其他结构，诸如肿瘤抗原。如本文所用，术语“本发明的缀合物”、“靶向部分缀合物”、“靶向缀合物”、“靶向部分-活性分子缀合物”或“tc”是指与存在于细胞或其亚单元上的缀合至生物活性分子的靶标、或其部分或其类似物(包括但不限于tlr7和/或tlr8激动剂)结合的靶向多肽或其部分、类似物或衍生物。如本文所用，术语“肿瘤靶向部分缀合物”“肿瘤靶向部分-生物活性分子缀合物”或“btc”是指与存在于肿瘤细胞或其亚单元上的缀合至生物活性分子的靶标、或其部分或其类似物(包括但不限于tlr7和/或tlr8激动剂)结合的肿瘤靶向多肽或其部分、类似物或衍生物。除非另外说明，术语“本发明的化合物”和“本发明的组合物”用作术语“本发明的缀合物”的替代。
[0181]
术语“保守修饰的变体”适用于天然和非天然氨基酸以及天然和非天然核酸序列，和其组合。关于特定核酸序列，“保守修饰的变体”是指编码相同或大致相同的天然和非天然氨基酸序列的那些天然和非天然核酸，或其中天然和非天然核酸不将天然和非天然氨基酸序列编码为大致相同的序列。举例来说，大量功能上相同的核酸由于遗传密码的简并性而对任何给定的蛋白质进行编码。例如，密码子gca、gcc、gcg和gcu均编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子指定的每个位置处，密码子可变成所描述的对应密码子中的任一个，而不改变所编码的多肽。此类核酸变异为“沉默变异”，其为一种保守修饰的变异。因此，举例来说，编码天然或非天然多肽的本文中的每个天然或非天然核酸序列也描述了天然或非天然核酸的每个可能的沉默变异。本领域的普通技术人员将认识到天然或非天然核酸中的每个密码子(除了通常为甲硫氨酸的唯一密码子的aug和通常为色氨酸的唯一密码子的tgg之外)可被修饰以获得功能上相同的分子。因此，编码天然或非天然多肽的天然或非天然核酸的每个沉默变异均暗含于每个所描述的序列中。
[0182]
至于氨基酸序列，核酸、肽、多肽或蛋白质序列中改变、添加或缺失所编码序列中的单个天然或非天然氨基酸或小百分比的天然或非天然氨基酸的个别取代、缺失或添加是“保守的修饰变体”，其中所述改变导致氨基酸缺失、氨基酸添加或天然或非天然氨基酸被化学上类似的氨基酸取代。提供功能上类似的天然氨基酸的保守取代表在本领域中是熟知的。此类保守修饰的变体为除了本文所描述的方法和组合物的多态变体、种间同系物以及等位基因以外的变体并且并不排除本文所描述的方法和组合物的多态变体、种间同系物以
及等位基因。
[0183]
提供功能上类似的氨基酸的保守取代表是本领域普通技术人员已知的。以下八组各自含有可以为彼此的保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(a)、甘氨酸(g)；2)天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)；3)天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)；4)精氨酸(r)、赖氨酸(k)；5)异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、甲硫氨酸(m)、缬氨酸(v)；6)苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)；7)丝氨酸(s)、苏氨酸(t)；以及8)半胱氨酸(c)、甲硫氨酸(m)。(参见例如creighton,proteins:structures and molecular properties(w hfreeman&co.；第2版(1993年12月)。
[0184]
除非另外说明，否则术语“环烷基”和“杂环烷基”自身或与其他术语结合分别表示“烷基”和“杂烷基”的环状型式。因此，环烷基或杂环烷基包括饱和的、部分不饱和的和完全不饱和的环键。另外，对于杂环烷基，杂原子可占据杂环连接至分子的其余部分所处的位置处。杂原子可包括但不限于氧、氮或硫。环烷基的实例包括但不限于环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括但不限于1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。另外，所述术语涵盖多环结构，包括但不限于双环和三环环结构。类似地，术语“亚杂环烷基”自身或作为另一个分子的一部分意指衍生自杂环烷基的二价基团，而术语“亚环烷基”自身或作为另一个分子的一部分意指衍生自环烷基的二价基团。
[0185]
如本文所用，术语“环糊精”是指由至少六至八个葡萄糖分子以环形式组成的环状碳水化合物。环的外部含有水溶性基团；在环的中心是一个能够容纳小分子的相对非极性的空腔。
[0186]
如本文所用，术语“细胞毒性”是指伤害细胞的化合物。
[0187]
如本文所用，“变性剂(denaturing agent/denaturant)”是指将导致聚合物可逆展开的任何化合物或材料。仅举例来说，“变性剂(denaturing agent/denaturant)”可引起蛋白质的可逆展开。变性剂(denaturing agent/denaturant)的强度将由特定变性剂(denaturing agent/denaturant)的性质和浓度决定。举例来说，变性剂(denaturing agent/denaturant)包括但不限于离液剂、洗涤剂、有机的水混溶性溶剂、磷脂或其组合。离液剂的非限制性实例包括但不限于脲、胍和硫氰酸钠。洗涤剂的非限制性实例可包括但不限于强洗涤剂(诸如十二烷基硫酸钠或聚氧乙烯醚(例如tween或triton洗涤剂))、sarkosyl、温和的非离子洗涤剂(例如毛地黄皂苷)、温和的阳离子洗涤剂(诸如n-[1-(2,3-二油氧基)-丙基-n,n,n-三甲基铵)、温和的离子洗涤剂(例如胆酸钠或脱氧胆酸钠)或两性离子洗涤剂(包括但不限于磺基甜菜碱(zwittergent)、3-(3-胆酰胺丙基)二甲氨基-1-丙烷硫酸盐(chaps)和3-(3-胆酰胺丙基)二甲氨基-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(chapso))。有机的水混溶性溶剂的非限制性实例包括但不限于可用作变性剂的乙腈、低级烷醇(尤其是c2-c4烷醇，诸如乙醇或异丙醇)或低级烷二醇(c2-c4链烷二醇，诸如乙二醇)。磷脂的非限制性实例包括但不限于天然存在的磷脂(诸如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇)或合成磷脂衍生物或变体(诸如二己酰磷脂酰胆碱或二庚酰磷脂酰胆碱)。
[0188]
如本文所用，术语“二胺”是指包含至少两个胺官能团的基团/分子，所述至少两个胺官能团包括但不限于肼基、脒基、亚胺基、1,1-二胺基、1,2-二胺基、1,3-二胺基和1,4-二胺基。另外，此类基团可以是直链、支链或环状分子的一部分。
[0189]
如本文所用，术语“可检测标记”是指可使用分析技术观察到的标记，所述分析技术包括但不限于荧光、化学发光、电子自旋共振、紫外/可见吸收光谱、质谱、核磁共振、磁共振和电化学方法。
[0190]
如本文所用，术语“二羰基”是指含有选自由-c(o)-、-s(o)-、-s(o)
2-和-c(s)-组成的组的至少两个部分的基团，包括但不限于1,2-二羰基、1,3-二羰基和1,4-二羰基，以及含有至少一个酮基、和/或至少一个醛基、和/或至少一个酯基、和/或至少一个羧酸基的基团、和/或至少一个硫酯基团的基团。此类二羰基包括二酮、酮醛、酮酸、酮酯和酮硫酯。另外，此类基团可以是直链、支链或环状分子的一部分。二羰基中的两个部分可以相同或不同，并且可包括仅举例来说，会在两个部分中的任一个处产生酯、酮、醛、硫酯或酰胺的取代基。
[0191]
如本文所用，术语“药物”是指用于预防、诊断、减轻、治疗或治愈疾病或疾患的任何物质。
[0192]
如本文所用，术语“有效量”是指所施用的剂或化合物的足够量，其将在某种程度上缓解所治疗的疾病或疾患的一种或多种症状。结果可以是疾病的体征、症状或病因减少和/或减轻，或生物系统的任何其他所需改变。举例来说，施用的剂或化合物包括但不限于天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、修饰的天然氨基酸多肽或修饰的非氨基酸多肽。可施用含有此类天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、修饰的天然氨基酸多肽或修饰的非天然氨基酸多肽的组合物以用于防治、增强和/或治疗性治疗。可使用诸如剂量递增研究的技术来确定任何个别病例中适当的“有效”量。
[0193]
术语“增强(enhance/enhancing)”是指增加或延长所需作用的效力或持续时间。举例来说，“增强”治疗剂的效果是指在效力或持续时间上增加或延长治疗剂在疾病、病症或疾患治疗期间的作用的能力。如本文所用，“增强有效量”是指足以增强治疗剂在治疗疾病、病症或疾患中的作用的量。当用于患者时，对所述用途有效的量将取决于疾病、病症或疾患的严重程度和病程、先前疗法、患者的健康状况和对药物的响应以及主治医生的诊断。
[0194]
如本文所用，术语“真核生物”是指属于真核生物系统发育域的生物，包括但不限于动物(包括但不限于哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟类等)、纤毛虫、植物(包括但不限于单子叶植物、双子叶植物和藻类)、真菌、酵母、鞭毛虫、微孢子虫和原生生物。
[0195]
如本文所用，术语“脂肪酸”是指具有约c6或更长烃侧链的羧酸。
[0196]
如本文所用，术语“荧光团”是指在激发时发射光子并因此发荧光的分子。
[0197]
如本文所用，术语“官能团”、“活性部分”、“活化基团”、“离去基团”、“反应位点”、“化学反应基”和“化学反应部分”是指发生化学反应的分子部分或单元。所述术语在化学领域中有些同义，并且在本文中用于表示执行某些功能或活性并与其他分子具有反应性的分子的部分。
[0198]
术语“卤素”包括氟、氯、碘和溴。
[0199]
如本文所用，术语“卤代酰基”是指含有卤素部分的酰基，包括但不限于-c(o)ch3、-c(o)cf3、-c(o)ch2och3等。
[0200]
如本文所用，术语“卤代烷基”是指含有卤素部分的烷基，包括但不限于-cf3和-ch2cf3等。
[0201]
如本文所用，术语“杂烷基”是指直链或支链或环状烃基或其组合，其由烷基和至
少一个选自由o、n、si和s组成的组的杂原子组成，并且其中氮和硫原子可任选地被氧化，并且氮杂原子可任选地被季铵化。杂原子o、n和s以及si可置于杂烷基的任何内部位置或烷基连接至分子的其余部分所处的位置处。实例包括但不限于-ch
2-ch
2-o-ch3、-ch
2-ch
2-nh-ch3、-ch
2-ch
2-n(ch3)-ch3、-ch
2-s-ch
2-ch3、-ch
2-ch2,-s(o)-ch3、-ch
2-ch
2-s(o)
2-ch3、-ch＝ch-o-ch3、-si(ch3)3、-ch
2-ch＝n-och3和-ch＝ch-n(ch3)-ch3。另外，至多两个杂原子可以是连续的，诸如举例来说-ch
2-nh-och3和-ch
2-o-si(ch3)3。
[0202]
术语“基于杂环的键联”或“杂环键联”是指由二羰基与二胺基反应形成的部分。所得反应产物是杂环，包括杂芳基或杂环烷基。所得杂环基团用作非天然氨基酸或非天然氨基酸多肽与另一官能团之间的化学键联。在一个实施方案中，杂环键联包括含氮杂环键联，包括仅作为实例的吡唑键联、吡咯键联、吲哚键联、苯并二氮卓键联和吡唑啉酮键联。
[0203]
类似地，术语“亚杂烷基”是指衍生自杂烷基的二价基团，例如但不限于-ch
2-ch
2-s-ch
2-ch
2-和-ch
2-s-ch
2-ch
2-nh-ch
2-。对于亚杂烷基，相同或不同的杂原子也可占据一个或两个链末端(包括但不限于亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基、氨氧基亚烷基等)。再另外，对于亚烷基和亚杂烷基连接基团，不通过连接基团的式书写的方向暗示连接基团的取向。举例来说，式-c(o)2r
’‑
表示-c(o)2r
’‑
和-r’c(o)
2-。
[0204]
如本文所用，术语“杂芳基”或“杂芳香族”是指含有至少一个选自n、o和s的杂原子的芳基；其中氮和硫原子可任选地被氧化，并且氮原子可任选地被季铵化。杂芳基可以是取代的或未取代的。杂芳基可通过杂原子连接至分子的其余部分。杂芳基的非限制性实例包括1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。
[0205]
如本文所用，术语“均烷基”是指为烃基的烷基。
[0206]
如本文所用，术语“相同的”是指相同的两个或更多个序列或子序列。另外，如本文所用，术语“基本上相同”是指两个或更多个序列当在比较窗口或指定区域上进行最大对应性比较和比对时，具有一定百分比的相同序列单元(sequential unit)，如使用比较算法或通过手动比对和视觉检查所测量的。仅举例来说，如果序列单元在指定区域上约60％相同、约65％相同、约70％相同、约75％相同、约80％相同、约85％相同、约90％相同或约95％相同，那么两个或更多个序列可以是“基本上相同的”。此类百分比用以描述两个或更多个序列的“百分比同一性”。序列的同一性可存在于长度为至少约75-100个序列单元的区域上，长度为约50个序列单元的区域上，或在未指定的情况下，存在于整个序列上。所述定义也指测试序列的互补序列。仅举例来说，当氨基酸残基相同时，两个或更多个多肽序列是相同的，而如果氨基酸残基在指定区域上约60％相同、约65％相同、约70％相同、约75％相同、约80％相同、约85％相同、约90％相同或约95％相同，那么两个或更多个多肽序列是“基本上相同的”。同一性可存在于长度为至少约75至约100个核酸的区域上，长度为约50个核酸的区域上，或在未指定的情况下，存在于多肽序列的整个序列上。另外，仅举例来说，当核酸残基相同时，两个或更多个多核苷酸序列是相同的，而如果核酸残基在指定区域上约60％相同、约65％相同、约70％相同、约75％相同、约80％相同、约85％相同、约90％相同或约95％
相同，那么两个或更多个多核苷酸序列是“基本上相同的”。同一性可存在于长度为至少约75至约100个核酸的区域上，长度为约50个核酸的区域上，或在未指定的情况下，存在于多核苷酸序列的整个序列上。
[0207]
对于序列比较，通常将一个序列用作参考序列，将其与测试序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数或可指定替代参数。然后序列比较算法基于程序参数计算出测试序列相对于参比序列的百分比序列同一性。
[0208]
如本文所用，术语“免疫原性”是指抗体对施用治疗药物的响应。可使用用于检测生物流体中的抗非天然氨基酸多肽抗体的定量和定性分析来获得对治疗性非天然氨基酸多肽的免疫原性。此类测定包括但不限于放射免疫测定(ria)、酶联免疫吸附测定(elisa)、发光免疫测定(lia)和荧光免疫测定(fia)。对治疗性非天然氨基酸多肽的免疫原性分析涉及将施用治疗性非天然氨基酸多肽后的抗体响应与施用治疗性天然氨基酸多肽后的抗体响应进行比较。
[0209]
如本文所用，术语“分离的”是指将目标组分从非目标组分中分离和去除。分离的物质可处于干燥或半干燥状态，或处于溶液状态，包括但不限于水溶液。分离的组分可处于均质状态或分离的组分可以是药物组合物的一部分，所述药物组合物包含额外的药学上可接受的载剂和/或赋形剂。可使用包括但不限于聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱的分析化学技术来确定纯度和均匀性。另外，当目标组分被分离并且是制剂中存在的主要物质时，所述组分在本文中描述为基本上纯化的。如本文所用，术语“纯化的”可指至少85％纯、至少90％纯、至少95％纯、至少99％或更高纯度的目标组分。仅举例来说，当核酸或蛋白质不含在自然状态下与之相关的细胞组分中的至少一些时，此类核酸或蛋白质是“分离的”，或核酸或蛋白质已被浓缩到高于其体内或体外生产浓度的水平。此外，举例来说，当与侧接基因并编码目标基因之外的蛋白质的开放阅读框分离时，基因被分离。
[0210]
如本文所用，术语“标记”是指掺入化合物中并易于检测到的物质，由此可检测和/或监测其物理分布。
[0211]
如本文所用，术语“键联”或“接头”是指由接头的官能团与另一分子之间的化学反应形成的键或化学部分。此类键可包括但不限于共价键和非共价键，而此类化学部分可包括但不限于酯、碳酸酯、亚胺磷酸酯、腙、缩醛、原酸酯、肽键和寡核苷酸键联。水解稳定的键联意指键联在水中基本稳定并且在适用的ph值下(包括但不限于在生理条件下持续较长时间段，甚至可能无限期)不与水反应。水解不稳定或可降解的键联意指键联在水或水溶液(包括例如血液)中是可降解的。酶促不稳定或可降解的键联意指键联可被一种或多种酶降解。仅举例来说，peg和相关聚合物可在聚合物主链中或在聚合物主链与聚合物分子的一个或多个末端官能团之间的接头基团中包括可降解的键联。此类可降解键联包括但不限于由peg羧酸或活化的peg羧酸与生物活性剂上的醇基反应形成的酯键，其中此类酯基通常在生理条件下水解以释放生物活性剂。其他可水解降解的键联包括但不限于碳酸酯键联；由胺和醛反应产生的亚胺键联；由醇与磷酸基团反应形成的磷酸酯键联；酰肼和醛的反应产物腙键联；醛和醇的反应产物缩醛键联；甲酸酯和醇的反应产物原酸酯键联；由胺基和肽的羧基，包括但不限于在诸如peg的聚合物的末端处形成的肽键联；以及由亚磷酰胺基团和寡核苷酸的5'羟基，包括但不限于在聚合物的末端处形成的寡核苷酸键联。接头包括但不限于
短的线性、支化、多臂或树枝状分子，诸如聚合物。在本发明的一些实施方案中，接头可以是分支的。在其他实施方案中，接头可以是双官能接头。在一些实施方案中，接头可以是三功能接头。许多不同的可裂解接头是本领域技术人员已知的。参见美国专利号4,618,492；4,542,225和4,625,014。从这些接头基团释放剂的机制包括例如光不稳定键的照射和酸催化的水解。美国专利号4,671,958例如包括对包含接头的免疫缀合物的描述，所述接头在体内被患者补体系统的蛋白水解酶裂解。接头的长度可根据多肽和与其连接的分子之间所需的空间关系来预先确定或选择。鉴于已报告的用于将各种放射诊断化合物、放射治疗化合物、药物、毒素和其他剂连接至抗体的大量方法，本领域技术人员将能够确定用于将给定剂或分子连接至多肽的合适方法。
[0212]
如本文所用，术语“修饰的”是指存在对天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的改变。此类改变或修饰可通过天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的合成后修饰，或通过共翻译，或通过天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的翻译后修饰获得。形式“修饰或未修饰”意指所讨论的天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽被任选地修饰，即讨论中的天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽可为修饰的或未修饰的。
[0213]
如本文所用，术语“调节的血清半衰期”指修饰的生物活性分子相对于其未修饰形式的循环半衰期的正或负变化。举例来说，修饰的生物活性分子包括但不限于天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽。举例来说，血清半衰期是通过在生物活性分子或修饰的生物活性分子施用后的不同时间点采集血样，并确定每个样品中所述分子的浓度来测量的。血清浓度与时间的相关性允许计算血清半衰期。举例来说，调节的血清半衰期可以是血清半衰期增加，这可以改进给药方案或避免毒性作用。此类血清增加可以是至少约两倍、至少约三倍、至少约五倍或至少约十倍。可进行评估多肽血清半衰期增加的方法。
[0214]
如本文所用，术语“调节的治疗半衰期”是指治疗有效量的修饰的生物活性分子的半衰期相对于其未修饰形式的正或负变化。举例来说，修饰的生物活性分子包括但不限于天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽。举例来说，治疗半衰期是通过在施用后不同时间点测量分子的药代动力学和/或药效学特性来测量的。增加的治疗半衰期可以实现特别有益的给药方案、特别有益的总剂量，或避免非所需作用。举例来说，增加的治疗半衰期可能是由于效力增加、修饰的分子与其靶标的结合增加或减少、未修饰分子的另一参数或作用机制的增加或减少或酶(例如蛋白酶)对分子的分解的增加或减少。评估任何多肽的治疗半衰期增加的方法是技术人员熟知的。
[0215]“非天然氨基酸”是指不是20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸之一的氨基酸。可与术语“非天然氨基酸”同义使用的其他术语是“非天然编码氨基酸”、“非天然氨基酸”、“非天然存在的氨基酸”以及其各种带有连字符和不带连字符版本。术语“非天然氨基酸”包括但不限于通过修饰天然编码氨基酸(包括但不限于20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸)而天然存在，但不将它们自身通过翻译复合体掺入一条不断增长的多肽链中的氨基酸。此类氨基酸的实例包括但不限于n-乙酰葡糖胺基-l-丝氨酸、n-乙酰葡糖胺基-l-苏氨酸和o-磷酸酪氨酸。另外，术语“非天然氨基酸”包括但不限于不天然存在并且
可通过合成获得或可通过修饰非天然氨基酸获得的氨基酸。在一些实施方案中，非天然氨基酸包含赖氨酸类似物，例如n6-叠氮基乙氧基-l-赖氨酸(azk)、n6-炔丙基乙氧基-l-赖氨酸(prak)、bcn-l-赖氨酸、降冰片烯赖氨酸、tco-赖氨酸、甲基四嗪赖氨酸或烯丙氧基羰基赖氨酸。在一些实施方案中，非天然氨基酸包含糖部分。此类氨基酸的实例包括n-乙酰基-l-葡糖胺基-l-丝氨酸、n-乙酰基-l-氨基半乳糖基-l-丝氨酸、n-乙酰基-l-葡糖胺基-l-苏氨酸、n-乙酰基-l-葡糖胺基-l-天冬酰胺和o-甘露糖胺基-l-丝氨酸。此类氨基酸的实例还包括氨基酸与糖之间天然存在的n-键联或o-键联被自然界中不常见的共价键(包括但不限于烯烃、肟、硫醚、酰胺等)替代的实例。此类氨基酸的实例还包括在天然存在的蛋白质中不常见的糖类，诸如2-脱氧-葡萄糖、2-脱氧半乳糖等。非天然氨基酸的具体实例包括但不限于对乙酰基-l-苯丙氨酸、对炔丙氧基苯丙氨酸、o-甲基-l-酪氨酸、l-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、o-4-烯丙基-l-酪氨酸、4-丙基-l-酪氨酸、三-o-乙酰基-glcnacβ-丝氨酸、l-dopa、氟化苯丙氨酸、异丙基-l-苯丙氨酸、对叠氮基-l-苯丙氨酸、对酰基-l-苯丙氨酸、对苯甲酰基-l-苯丙氨酸、l-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-l-苯丙氨酸、对炔丙氧基-l-苯丙氨酸、4-叠氮基-l-苯丙氨酸、对叠氮基乙氧基苯丙氨酸、对叠氮甲基-苯丙氨酸等。在一些实施方案中，非天然氨基酸选自由以下组成的组：对乙酰基-苯丙氨酸、4-叠氮基-l-苯丙氨酸、对叠氮基乙氧基苯丙氨酸或对叠氮基甲基-苯丙氨酸。
[0216]
如本文所用，术语“核酸”是指脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸和其呈单链或双链形式的聚合物。仅举例来说，此类核酸和核酸聚合物包括但不限于：(i)天然核苷酸的类似物，其具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢；(ii)寡核苷酸类似物，包括但不限于pna(肽核酸)、反义技术中使用的dna类似物(硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等)；(iii)其保守修饰的变体(包括但不限于简并密码子取代)和互补序列以及明确指示的序列。举例来说，简并密码子取代可通过产生序列来实现，其中一个或多个所选(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(batzer等人,nucleic acid res.19:5081(1991)；ohtsuka等人,j.biol.chem.260:2605-2608(1985)；以及rossolini等人,mol.cell.probes 8:91-98(1994))。
[0217]
如本文所用，术语“氧化剂”是指能够从被氧化的化合物中去除电子的化合物或材料。举例来说，氧化剂包括但不限于氧化型谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化型二硫苏糖醇、氧化型赤藓糖醇和氧气。多种氧化剂适用于本文所描述的方法和组合物。
[0218]
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指不消除化合物的生物活性或特性并且相对无毒的材料(包括但不限于盐、载剂或稀释剂)，即可向个体施用材料而不引起非所要生物效应或不以有害方式与组合物中含有的任何组分相互作用。
[0219]
如本文所用，术语“聚亚烷基二醇”或“聚(烯烃二醇)”是指直链或支链聚合聚醚多元醇。此类聚亚烷基二醇包括但不限于聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇和其衍生物。其他示例性实施方案列在例如商业供应商目录，诸如shearwater corporation的目录“polyethylene glycol and derivatives for biomedical applications”(2001)中。仅举例来说，此类聚合聚醚多元醇的平均分子量介于约0.1kda至约100kda之间。举例来说，此类聚合聚醚多元醇包括但不限于介于约100da与约100,000da之间或更大。聚合物的分子量可介于约100da与约100,000da之间，包括但不限于约100,000da、约95,000da、约90,000da、
约85,000da、约80,000da、约75,000da、约70,000da、约65,000da、约60,000da、约55,000da、约50,000da、约45,000da、约40,000da、约35,000da、约30,000da、约25,000da、约20,000da、约15,000da、约10,000da、约9,000da、约8,000da、约7,000da、约6,000da、约5,000da、约4,000da、约3,000da、约2,000da、约1,000da、约900da、约800da、约700da、约600da、约500da,400da、约300da、约200da和约100da。在一些实施方案中，聚合物的分子量介于约100da与约50,000da之间。在一些实施方案中，聚合物的分子量介于约100da与约40,000da之间。在一些实施方案中，聚合物的分子量介于约1,000da与约40,000da之间。在一些实施方案中，聚合物的分子量介于约2,000da至约50,000da之间。在一些实施方案中，聚合物的分子量介于约5,000da与约40,000da之间。在一些实施方案中，聚合物的分子量介于约10,000da与约40,000da之间。在一些实施方案中，聚(乙二醇)分子是支化聚合物。支链peg的分子量可介于约1,000da与约100,000da之间，包括但不限于约100,000da、约95,000da、约90,000da、约85,000da、约80,000da、约75,000da、约70,000da、约65,000da、约60,000da、约55,000da、约50,000da、约45,000da、约40,000da、约35,000da、约30,000da、约25,000da、约20,000da、约15,000da、约10,000da、约9,000da、约8,000da、约7,000da、约6,000da、约5,000da、约4,000da、约3,000da、约2,000da和约1,000da。在一些实施方案中，支链peg的分子量介于约1,000da与约50,000da之间。在一些实施方案中，支链peg的分子量介于约1,000da与约40,000da之间。在一些实施方案中，支链peg的分子量介于约5,000da与约40,000da之间。在一些实施方案中，支链peg的分子量介于约5,000da与约20,000da之间。在其他实施方案中，支链peg的分子量介于约2,000da至约50,000da之间。
[0220]
如本文所用，术语“聚合物”是指由重复的子单元组成的分子。此类分子包括但不限于多肽、多核苷酸或多糖或聚亚烷基二醇。
[0221]
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，以指代氨基酸残基的聚合物。也就是说，针对多肽的描述同样适用于肽的描述和蛋白质的描述，反之亦然。所述术语适用于天然发生的氨基酸聚合物，也适用于其中一个或多个氨基酸残基是非天然氨基酸的氨基酸聚合物。另外，此类“多肽”、“肽”和“蛋白质”包括任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。
[0222]
术语“翻译后修饰”是指天然或非天然氨基酸在翻译掺入多肽链后发生的任何修饰。此类修饰包括但不限于共翻译体内修饰、共翻译体外修饰(诸如在无细胞翻译系统中)、翻译后体内修饰和翻译后体外修饰。
[0223]
如本文所用，术语“前药”或“药学上可接受的前药”是指在体内或体外转化为母体药物的剂，其中所述剂不消除药物的生物活性或特性，并且相对无毒的，即可向个体施用材料而不引起非所要生物效应或不以有害方式与组合物中含有的任何组分相互作用。前药通常是药物前体，其在向受试者施用并随后被吸收后，通过一些过程(诸如通过代谢路径的转化)转化为活性或更具活性的物质。一些前药在前药上存在使其活性降低和/或赋予药物溶解度或一些其他特性的化学基团。一旦从前药中裂解和/或修饰了化学基团，就产生了活性药物。前药通过酶促或非酶促反应在体内转化为活性药物。前药可提供改良的物理化学特性，诸如更佳的溶解度、增强的递送特性，诸如特异性靶向特定细胞、组织、器官或配体，以及提高药物的治疗价值。此类前药的益处包括但不限于：(i)与母体药物相比易于施用；(ii)前药可通过口服施用来实现生物可利用，而母体药物则不然；(iii)与母体药物相比，
前药在药物组合物中的溶解度也有所提高。前药包括活性药物的药理学无活性或活性降低的衍生物。前药可设计为通过操控药物的特性，诸如生理化学、生物制药或药代动力学特性，来调节到达所需作用部位的药物或生物活性分子的量。前药的非限制性实例为非天然氨基酸多肽，其以酯(“前药”)的形式施用以促进通过细胞膜(其中水溶性不利于迁移)的传输，但一旦进入细胞内部(其中水溶性是有益的)，即接着被代谢性地水解成羧酸(活性实体)。前药可设计为可逆药物衍生物，以用作修饰剂来增强药物向位点特异性组织的转运。
[0224]
如本文所用，术语“防治有效量”是指防治性地应用于患者的含有至少一种非天然氨基酸多肽或至少一种修饰的非天然氨基酸多肽的组合物的量，所述量将在某种程度上缓解正在治疗的疾病、疾患或病症的一种或多种症状。在此类防治应用中，此类量可能取决于患者的健康状况、体重等。认为通过常规实验(包括但不限于剂量递增临床试验)确定此类防治有效量完全在本领域技术范围内。
[0225]
如本文所用，术语“受保护的”是指存在“保护基”或防止化学反应性官能团在某些反应条件下反应的部分。保护基将根据被保护的化学反应基的类型而变化。仅举例来说，(i)如果化学反应基是胺或酰肼，那么保护基可选自叔丁氧基羰基(t-boc)和9-芴基甲氧基羰基(fmoc)；(ii)如果化学反应基是硫醇，那么保护基可以是邻吡啶基二硫化物；(iii)如果化学反应基是羧酸，例如丁酸或丙酸，或羟基，那么保护基可以是苯甲基或烷基，诸如甲基、乙基或叔丁基。
[0226]
仅举例来说，阻断/保护基可选自：
[0227][0228]
另外，保护基包括但不限于包括光不稳定基团，诸如nvoc和menvoc以及本领域已知的其他保护基。其他保护基在greene and wuts,protective groups in organic synthesis,第3版,john wiley&sons,new york,ny,1999中描述，所述文献以引用的方式整体并入本文。
[0229]
术语“重组宿主细胞”也称为“宿主细胞”，是指包括外源多核苷酸的细胞，其中用于将外源多核苷酸插入细胞的方法包括但不限于直接摄取、转导、f-交配或本领域已知的
产生重组宿主细胞的其他方法。仅举例来说，此类外源多核苷酸可以是非整合载体，包括但不限于质粒，或者可以整合至宿主基因组中。
[0230]
如本文所用，术语“氧化还原活性剂”是指氧化或还原另一分子的分子，由此氧化还原活性剂被还原或氧化。氧化还原活性剂的实例包括但不限于二茂铁、醌、ru
2 /3
络合物、co
2 /3
络合物和os
2 /3
络合物。
[0231]
如本文所用，术语“还原剂”是指能够向被还原的化合物添加电子的化合物或材料。举例来说，还原剂包括但不限于二硫苏糖醇(dtt)、2-巯基乙醇、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)和还原型谷胱甘肽。仅举例来说，此类还原剂可用于将巯基保持在还原状态并还原分子内或分子间的二硫键。
[0232]
如本文所用，“再折叠”描述将不正确折叠或未折叠状态转变为天然或正确折叠构象的任何过程、反应或方法。仅举例来说，再折叠将含有二硫键的多肽从不正确折叠或未折叠状态转变为相对于二硫键天然或正确折叠的构象。此类含有二硫键的多肽可以是天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽。
[0233]
如本文所用，术语“安全性”或“安全性概况”是指可能与药物施用相对于药物施用次数相关的副作用。举例来说，据说已施用多次并且只产生轻微副作用或不产生副作用的药物具有极佳的安全性概况。用于评估任何多肽的安全性概况的方法是本领域已知的。
[0234]
如本文所用，短语“选择性杂交”或“特异性杂交”是指当特定核苷酸序列存在于复杂混合物，包括但不限于总细胞或文库dna或rna中时，分子在严格杂交条件下与所述序列结合、双链化或杂交。
[0235]
短语“严格杂交条件”是指dna、rna、pna或其他核酸模拟物或其组合的序列在低离子强度和高温条件下的杂交。举例来说，在严格条件下，探针将与其在核酸的复杂混合物(包括但不限于总细胞或文库dna或rna)中的靶子序列杂交，但不与复杂混合物中的其他序列杂交。严格条件是序列依赖性的并且在不同的环境中将是不同的。举例来说，较长的序列在较高温度下特异性杂交。严格杂交条件包括但不限于：(i)在界定的离子强度和ph下，比特定序列的热熔点(tm)低约5-10℃；(ii)在约ph7.0至约ph8.3下盐浓度为约0.01m至约1.0m，并且对于短探针(包括但不限于约10至约50个核苷酸)温度为至少约30℃，并且对于长探针(包括但不限于多于50个核苷酸)温度为至少约60℃；(iii)添加去稳定剂，包括但不限于甲酰胺；(iv)50％甲酰胺、5x ssc和1％ sds在42℃下孵育，或5x ssc、约1％ sds在65℃下孵育，并在0.2x ssc中洗涤，并且约0.1％ sds在65℃下孵育约5分钟至约120分钟。仅举例来说，选择性或特异性杂交的检测包括但不限于至少两倍背景的阳性信号。核酸杂交的详尽指南参见tijssen,laboratory techniques in biochemistry and molecular biology—hybridization with nucleic probes,“overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays”(1993)。
[0236]
如本文所用，“受试者”是指作为治疗、观察或实验的对象的动物。仅举例来说，受试者可以是但不限于哺乳动物，包括但不限于人。
[0237]
如本文所用，术语“基本上纯化的”是指可基本上或大致上不含在纯化之前通常伴随目标组分或与目标组分相互作用的其他组分的目标组分。仅举例来说，当目标组分的制剂含有少于约30％、少于约25％、少于约20％、少于约15％、少于约10％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％或少于约1％(按干重计)的污染组分时，目标组分可以是“基本
上纯化的”。因此，“基本上纯化的”目标组分可具有约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的纯度水平。仅举例来说，天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽可以从天然细胞或在重组产生的天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的情况下的宿主细胞中纯化。举例来说，当天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的制剂含有少于约30％、少于约25％、少于约20％、少于约15％、小于约10％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％或少于约1％(按干重计)的污染材料时，所述制剂可以是“基本上纯化的”。举例来说，当天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽由宿主细胞重组产生时，天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽可以细胞干重的约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％或更少存在。举例来说，当天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽由宿主细胞重组产生时，天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽可以细胞干重的约5g/l、约4g/l、约3g/l、约2g/l、约1g/l、约750mg/l、约500mg/l、约250mg/l、约100mg/l、约50mg/l、约10mg/l或约1mg/l或更少存在于培养基中。举例来说，如通过适当方法，包括但不限于sds/page分析、rp-hplc、sec和毛细管电泳所测定的，“基本上纯化的”天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽可具有约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或更高的纯度水平。
[0238]
术语“取代基”也称为“非干扰性取代基”，是指可用于替代分子上的另一基团的基团。此类基团包括但不限于卤基、c
1-c
10
烷基、c
2-c
10
烯基、c
2-c
10
炔基、c
1-c
10
烷氧基、c
5-c
12
芳烷基、c
3-c
12
环烷基、c
4-c
12
环烯基、苯基、取代的苯基、甲苯基、二甲苯基、联苯基、c
2-c
12
烷氧基烷基、c
5-c
12
烷氧基芳基、c
5-c
12
芳氧基烷基、c
7-c
12
氧芳基、c
1-c6烷基亚磺酰基、c
1-c
10
烷基磺酰基、-(ch2)
m-o-(c
1-c
10
烷基)(其中m是1至8)、芳基、取代的芳基、取代的烷氧基、氟代烷基、杂环基、取代的杂环基、硝基烷基、-no2、-cn、-nrc(o)-(c
1-c
10
烷基)、-c(o)-(c
1-c
10
烷基)、c
2-c
10
烷硫代烷基、-c(o)o-(c
1-c
10
烷基)、-oh、-so2、＝s、-cooh、-nr2、羰基、-c(o)-(c
1-c
10
烷基)-cf3、-c(o)-cf3、-c(o)nr2、-(c
1-c
10
芳基)-s-(c
6-c
10
芳基)、-c(o)-(c
6-c
10
芳基)、-(ch2)
m-o-(ch2)
m-o-(c
1-c
10
烷基)(其中每个m是1至8)、-c(o)nr2、-c(s)nr2、-so2nr2、-nrc(o)nr2、-nrc(s)nr2、其盐等。前述列表中的每个r基团包括但不限于h、烷基或取代的烷基、芳基或取代的芳基或烷芳基。在取代基团由其常见化学式从左至右书写来表示的情况下，它们同样涵盖化学上相同的因从右至左书写结构而形成的取代基，例如-ch2o-等同于
–
och
2-。
[0239]
仅举例来说，烷基和杂烷基(包括被称为亚烷基、烯基、亚杂烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基包括但不限于：-or、＝o、＝nr、＝n-or、-nr2、-sr、-卤素、-sir3、-oc(o)r、-c(o)r、-co2r、-conr2、-oc(o)nr2、-nrc(o)r、-nrc(o)nr2、-nr(o)2r、-nr-c(nr2)＝nr、-s(o)r、-s(o)2r、-s(o)2nr2、-nrso2r、-cn和-no2。前述列表中的每个r基团包括但不限于氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基(包括但不限于被1-3个卤素取代的芳基)、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳烷基。当两个r基团连接至同一氮原子时，它们可与氮原子结合形成5元、6元或7元环。举例来说，-nr2意在包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。
[0240]
具体来说，芳基和杂芳基的取代基包括但不限于-or、＝o、＝nr、＝n-or、-nr2、-sr、-卤素、-sir3、-oc(o)r、-c(o)r、-co2r、-conr2、-oc(o)nr2、-nrc(o)r、-nrc(o)nr2、-nr(o)2r、-nr-c(nr2)＝nr、-s(o)r、-s(o)2r、-s(o)2nr2、-nrso2r、-cn、-no2、-r、-n3、-ch(ph)2、氟代(c
1-c4)烷氧基和氟代(c
1-c4)烷基，数量在零至芳环系统上的开价总数的范围内；并且
其中前述列表中的每个r基团包括但不限于氢、烷基、杂烷基、芳基和杂芳基。
[0241]
如本文所用，术语“治疗有效量”是指向已患有疾病、疾患或病症的患者施用的含有至少一种非天然氨基酸多肽和/或至少一种修饰的非天然氨基酸多肽的组合物足以治愈或至少部分阻止或在某种程度上缓解所治疗疾病、病症或疾患的一种或多种症状的量。此类组合物的有效性取决于多个条件，包括但不限于疾病、病症或疾患的严重程度和病程、先前疗法、患者的健康状况和对药物的响应，以及治疗医师的诊断。仅举例来说，治疗有效量可通过常规实验，包括但不限于剂量递增临床试验来确定。
[0242]
如本文所用，术语“硫代烷氧基”是指通过氧原子与分子连接的含硫烷基。
[0243]
如本文所用，术语“毒性部分”或“毒性基团”是指可引起伤害、干扰或死亡的化合物。毒性部分包括但不限于澳瑞他汀(auristatin)、dna小沟结合剂、dna小沟烷化剂、烯二炔、lexitropsin、倍癌霉素(duocarmycin)、紫杉烷、嘌呤霉素、tlr激动剂、类美登素、长春花生物碱、afp、mmaf、mmae、aeb、aevb、澳瑞他汀e、紫杉醇、多西他赛、cc-1065、sn-38、托泊替康、吗啉代多柔比星、根瘤菌素(rhizoxin)、氰基吗啉代多柔比星、tlr激动剂-10、棘霉素、考布他汀(combretatstatin)、卡奇霉素(chalicheamicin)、美登素、dm-1、纺锤霉素、鬼臼毒素(podophyllotoxin)(例如依托泊苷、替尼泊苷等)、巴卡亭(baccatin)和其衍生物、抗微管蛋白剂、大环内酯(cryptophysin)、考布他汀、澳瑞他汀e、长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨、vp-16、喜树碱、埃博霉素a、埃博霉素b、诺考达唑(nocodazole)、秋水仙碱(colchicine)、秋水仙胺(colcimid)、雌莫司汀(estramustine)、西马多丁(cemadotin)、圆皮海绵内酯(discodermolide)、美登素、软珊瑚醇(eleutherobin)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、环磷酰胺、美法仑、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、链脲霉素(streptozocin)、氯脲霉素(chlorozotocin)、乌拉莫司汀(uracil mustard)、氮芥(chlormethine)、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷(pipobroman)、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基硫代磷胺、白消安、达卡巴嗪和替莫唑胺、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟尿嘧啶、氟尿苷、6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤、喷司他丁(pentostatin)、5-氟尿嘧啶、氨甲蝶呤、10-炔丙基-5,8-二叠氮叶酸酯、5,8-二叠氮四氢叶酸、亚叶酸、氟达拉滨磷酸酯、喷司他丁、吉西他滨、ara-c、紫杉醇、多西他赛、去氧助间霉素、丝裂霉素-c、l-天冬酰胺酶、硫唑嘌呤、布喹那、抗生素(例如蒽环类抗生素、庆大霉素、头孢噻吩、万古霉素、替拉万星(telavancin)、达托霉素、阿奇霉素、红霉素、罗红霉素、呋喃唑酮、阿莫西林、氨苄青霉素、羧苄青霉素、氟氯西林、甲氧西林、青霉素、环丙沙星、莫西沙星、氧氟沙星、多西环素、米诺环素、土霉素、四环素、链霉素、利福布汀、乙胺丁醇、利福昔明等)、抗病毒药(例如阿巴卡韦(abacavir)、阿昔洛韦(acyclovir)、安普利近(ampligen)、西多福韦、地拉韦啶(delavirdine)、地达诺新(didanosine)、依法韦仑(efavirenz)、恩替卡韦、膦乙醇(fosfonet)、更昔洛韦、伊巴他滨(ibacitabine)、imunovir、碘苷、肌苷、洛匹那韦(lopinavir)、美替沙腙(methisazone)、nexavir、奈韦拉平(nevirapine)、奥司他韦、喷昔洛韦、司他夫定(stavudine)、三氟尿苷、特鲁瓦达(truvada)、伐昔洛韦(valaciclovir)、扎那米韦等)、盐酸道诺霉素、柔红霉素、红比霉素、正定霉素(cerubidine)、伊达比星(idarubicin)、多柔比星、表柔比星和吗啉代衍生物、吩噁腙双环肽(例如放线菌素)、基础糖肽(例如博来霉素)、蒽醌苷(例如普卡霉素、光辉霉素)、蒽二酮(例如米托蒽醌)、氮丙啶并吡咯吲哚二酮(例如丝裂霉素)、大环免疫抑制剂(例如环孢素、fk-506、他克莫司、普乐可
复(prograf)、雷帕霉素等)、诺维本(navelbene)、cpt-11、阿那曲唑、来曲唑、卡培他滨(capecitabine)、雷洛萨芬(reloxafine)、环磷酰胺、异环磷酰胺、屈洛昔芬(droloxafine)、别秋水仙碱(allocolchicine)、软海绵素b、秋水仙碱、秋水仙碱衍生物、美登素、根瘤菌素、紫杉醇、紫杉醇衍生物、多西他赛、硫代秋水仙碱、三苯甲基半胱氨酸、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、顺铂、卡铂、羟基脲、n-甲基肼、表鬼臼毒素、丙卡巴肼、米托蒽醌、亚叶酸和替加氟(tegafur)。“紫杉烷”包括紫杉醇，以及任何活性紫杉烷衍生物或前药。
[0244]
如本文所用，术语“治疗(treat/treating/treatment)”包括减轻、减退或改善疾病或疾患症状、预防额外症状、改善或预防症状的潜在代谢原因、抑制疾病或疾患(例如遏制疾病或疾患的发展)、缓解疾病或疾患、引起疾病或疾患的消退、缓解由疾病或疾患引起的疾患或停止疾病或疾患的症状。术语“治疗(treat/treating/treatment)”包括但不限于防治性和/或治疗性治疗。
[0245]
如本文所用，术语“水溶性聚合物”是指可溶于水性溶剂中的任何聚合物。此类水溶性聚合物包括但不限于聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其单c
1-c
10
烷氧基或芳氧基衍生物(描述于美国专利号5,252,714中，所述专利以引用的方式并入本文)、单甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯基醚马来酸酐、n-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纤维素和纤维素衍生物(包括但不限于甲基纤维素和羧甲基纤维素)、血清白蛋白、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚亚烷基二醇和其衍生物、聚亚烷基二醇和其衍生物的共聚物、聚乙烯乙醚以及α-β-聚[(2-羟乙基)-dl-天冬酰胺等，或其混合物。仅举例来说，此类水溶性聚合物与天然氨基酸多肽或非天然多肽的偶联可导致包括但不限于以下的变化：增加的水溶性、增加或调节的血清半衰期、相对于未修饰形式的增加或调节的治疗半衰期、增加的生物利用度、调节的生物活性、延长的循环时间、调节的免疫原性、调节的物理结合特征(包括但不限于聚集和多聚体形成)、改变的受体结合、活性调节剂或其他靶向多肽结合、改变与一种或多种结合配偶体的结合以及改变靶向多肽受体二聚化或多聚化。另外，此类水溶性聚合物可能具有或可能不具有其自身的生物活性，并且可用作将靶向多肽连接至其他物质(包括但不限于一种或多种靶向多肽或一种或多种生物活性分子)的接头。
[0246]
除非另外说明，否则采用本领域技术范围内的质谱、nmr、hplc、蛋白质化学、生物化学、重组dna技术和药理学的常规方法。
[0247]
本文呈现的化合物(包括但不限于非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、修饰的非天然氨基酸多肽和用于生产前述化合物的试剂)包括同位素标记的化合物，其与在本文中呈现的各种式和结构中列举的那些化合物相同，但事实上一个或多个原子被原子质量或质量数不同于自然界通常发现的原子质量或质量数的原子替代。可掺入本发明化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、氟和氯的同位素，分别诸如2h、3h、
13
c、
14
c、
15
n、
18
o、
17
o、
35
s、
18
f、
36
cl。本文所描述的某些同位素标记的化合物，例如掺入放射性同位素(诸如3h和
14
c)的那些化合物，适用于药物和/或基质组织分布测定。此外，用同位素(诸如氘，即2h)进行的取代可提供由较大代谢稳定性产生的某些治疗优点，例如体内半衰期增加或剂量要求减少。
[0248]
本文中的一些化合物(包括但不限于非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和修饰的非天然氨基酸多肽，以及用于生产前述化合物的试剂)具有不对称碳原子并且可因此以对
映异构体或非对映异构体形式存在。通过已知的方法，例如通过色谱法和/或分步结晶，可基于非对映异构体混合物的物理化学差异将它们分离成其单独的非对映异构体。对映异构体也可如下分离：通过与适当的光学活性化合物(例如醇)反应而将对映异构体混合物转化成非对映异构体混合物、分离非对映异构体并且将单独的非对映异构体转化(例如水解)成对应的纯对映异构体。所有此类异构体，包括非对映异构体、对映异构体和其混合物，都被视为本文所描述组合物的一部分。
[0249]
在另外或其他实施方案中，本文所描述的化合物(包括但不限于非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和修饰的非天然氨基酸多肽，以及用于生产前述化合物的试剂)是以前药的形式使用。在另外或其他实施方案中，本文所描述的化合物(包括但不限于非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和修饰的非天然氨基酸多肽，以及用于生产前述化合物的试剂)在施用于需要产生代谢物的生物后被代谢，所述代谢物然后用于产生所需效果，包括所需治疗效果。在其他或另外实施方案中的是非天然氨基酸和“修饰的或未修饰的”非天然氨基酸多肽的活性代谢物。
[0250]
本文所描述的方法和配制物包括使用非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和修饰的非天然氨基酸多肽的n-氧化物、结晶形式(也称为多晶型物)或药学上可接受的盐。在某些实施方案中，非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽可作为互变异构体存在。所有互变异构体都包括在本文所呈现的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和修饰的非天然氨基酸多肽的范围内。另外，本文所描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和修饰的非天然氨基酸多肽可与药学上可接受的溶剂(诸如水、乙醇等)以非溶剂化形式以及溶剂化形式存在。本文所呈现的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和修饰的非天然氨基酸多肽的溶剂化形式也认为在本文中公开。
[0251]
本文中的一些化合物(包括但不限于非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和修饰的非天然氨基酸多肽，以及用于生产前述化合物的试剂)可以几种互变异构形式存在。所有此类互变异构形式都被认为是本文所描述的组合物的一部分。此外，例如本文中任何化合物(包括但不限于非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和修饰的非天然氨基酸多肽，以及用于生产前述化合物的试剂)的所有烯醇-酮形式被认为是本文所描述的组合物的一部分。
[0252]
本文中的一些化合物(包括但不限于非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和修饰的非天然氨基酸多肽，以及用于生产前述化合物中的任一种的试剂)是酸性的并且可与药学上可接受的阳离子形成盐。本文中的一些化合物(包括但不限于非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和修饰的非天然氨基酸多肽，以及用于生产前述化合物的试剂)可以是碱性的，并因此可与药学上可接受的阴离子形成盐。所有此类盐(包括二盐)都在本文所描述的组合物的范围内，并且所述盐可通过常规方法制备。举例来说，可通过在水性、非水性或部分水性介质中使酸性和碱性实体接触来制备盐。通过使用以下技术中的至少一种来回收盐：过滤、用非溶剂沉淀然后过滤、蒸发溶剂，或在水溶液的情况下，冻干。
[0253]
当存在于亲代非天然氨基酸多肽中的酸性质子被金属离子(例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)替代；或与有机碱配位时，可形成本文所公开的非天然氨基酸多肽的药学上可接受的盐。另外，所公开的非天然氨基酸多肽的盐形式可使用起始材料或中间物的盐来制备。可通过使本文所描述的非天然氨基酸多肽的游离碱形式与药学上可接受的无机或有机酸反应来将本文所描述的非天然氨基酸多肽制备为药学上可接受的酸加成盐(其
为一种药学上可接受的盐类型)。可选地，可通过使本文所描述的非天然氨基酸多肽的游离酸形式与药学上可接受的无机或有机碱反应来将本文所描述的非天然氨基酸多肽制备为药学上可接受的碱加成盐(其为药学上可接受的盐类型)。
[0254]
药学上可接受的盐类型包括但不限于：(1)与无机酸形成的酸加成盐，所述无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或如有机酸形成的酸加成盐，所述有机酸诸如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲基双环-[2.2.2]辛-2-烯-1-甲酸、葡庚糖酸、4,4'-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-甲酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等；(2)当存在于母体化合物中的酸性质子被金属离子(例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)取代；或与有机碱配位时形成的盐。可接受的有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、缓血酸胺、n-甲基葡糖胺等。可接受的无机碱包括氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠等。
[0255]
可使用各种方法(包括但不限于离子交换色谱、离子色谱、毛细管电泳、电感耦合等离子体、原子吸收光谱、质谱法或其任何组合)分析和鉴定非天然氨基酸多肽药学上可接受的盐的对应抗衡离子。另外，可使用实施例中描述的技术和方法测试此类非天然氨基酸多肽药学上可接受的盐的治疗活性。
[0256]
应理解，提及盐包括溶剂加成形式或其晶体形式，特别是溶剂化物或多晶型物。溶剂化物包含化学计量或者非化学计量的量的溶剂，并且可在使用药学上可接受的溶剂，诸如水、乙醇等的结晶过程期间形成。当溶剂为水时形成水合物，或当溶剂为醇时形成醇化物。多晶型物包括化合物的相同元素组成的不同晶体堆积排列。多晶型物通常具有不同的x射线衍射图、红外光谱、熔点、密度、硬度、晶体形状、光学和电学性质、稳定性和溶解度。诸如重结晶溶剂、结晶速率和储存温度的各种因素可能导致单一晶体形式占主导地位。
[0257]
非天然氨基酸多肽药学上可接受的盐、多晶型物和/或溶剂化物的筛选和表征可使用多种技术完成，所述技术包括但不限于热分析、x射线衍射、光谱学、蒸气吸附和显微术。热分析方法解决热化学降解或热物理过程，包括但不限于多晶型转变，并且此类方法用于分析多晶型之间的关系、确定重量损失、寻找玻璃化转变温度或用于赋形剂相容性研究。此类方法包括但不限于差示扫描量热法(dsc)、调制式差示扫描量热法(mdcs)、热重分析(tga)以及热重和红外分析(tg/ir)。x射线衍射方法包括但不限于单晶和粉末衍射仪以及同步辐射源。使用的各种光谱技术包括但不限于拉曼、ftir、uvis和nmr(液态和固态)。各种显微术技术包括但不限于偏振光显微术、带能量色散x射线分析(edx)的扫描电子显微术(sem)、带edx的环境扫描电子显微术(在气体或水蒸气气氛中)、红外显微术和拉曼显微术。
[0258]
尽管本文已示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员来说将显而易见的是，此类实施方案仅作为实例提供。本领域技术人员现在将想到不偏离本发明的许多变化、改变和替换。应理解，可在实践本发明时采用在本文所描述的本发明的实施方案的各种替代方案。所意图的是，以下权利要求限定本发明的范围以及由此涵盖这些权利要求和其等同物范围内的方法和结构。
[0259]
tlr激动剂接头衍生物
[0260]
在一个水平上，本文描述了用于产生和使用包含至少一种非天然氨基酸或具有羰
基、二羰基、肟基或羟胺基团的修饰的非天然氨基酸的tc或类似物的靶向多肽的工具(方法、组合物、技术)。包含非天然氨基酸的tc的此类靶向多肽可含有其他官能团，包括但不限于聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；以及其任何组合。应注意，各种前述官能度并不意味着一种官能团的成员不能归类为另一种官能团的成员。实际上，根据具体情况会有重叠。仅举例来说，水溶性聚合物在范围上与聚乙二醇的衍生物重叠，但是重叠并不完全，因此上面提到了两种官能团。
[0261]
在一方面中是用于选择和设计使用本文所描述的方法、组合物和技术进行修饰的tlr激动剂接头衍生物，以及靶向多肽的方法。可以从头或基于研究人员的兴趣设计新的tlr激动剂接头衍生物和靶向多肽，包括仅例如，作为高通量筛选过程的一部分(在这种情况下，可设计、合成、表征和/或测试许多多肽)。也可基于已知或部分表征的多肽的结构来设计新的tlr激动剂接头衍生物和靶向多肽。仅举例来说，tlr激动剂一直是科学界深入研究的主题；可基于tlr激动剂的结构设计新的化合物。选择取代和/或修饰哪些氨基酸的原则在本文中单独描述。选择采用哪种修饰也在本文中进行了描述，并且可用于满足实验者或最终用户的需要。此类需要可包括但不限于操纵多肽的治疗效果、改良多肽的安全性概况、调整多肽的药代动力学、药理学和/或药效学，诸如仅举例来说，增加水溶性、生物利用度、增加血清半衰期、增加治疗半衰期、调节免疫原性、调节生物活性或延长循环时间。另外，仅举例来说，此类修饰包括为多肽提供额外官能团、掺入抗体以及前述修饰的任何组合。
[0262]
本文还描述了具有或可以被修饰以含有肟基、羰基、二羰基或羟胺基团的tlr激动剂接头衍生物和靶向多肽。所述方面包括用于生产、纯化、表征和使用此类tlr激动剂接头衍生物和靶向多肽的方法。
[0263]
tlr激动剂接头衍生物或靶向多肽可含有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个，或十个或更多个羰基或二羰基、肟基、羟胺基团或其保护形式。tlr激动剂接头衍生物或靶向多肽可以相同或不同，例如在包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个不同的反应基的衍生物中可以存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个不同的位点。
[0264]
如本文所描述的，本公开提供了与具有式“靶向多肽-l-m”的另一个分子偶联的靶向多肽，其中l是连接基团或化学键，m是任何其他分子，包括但不限于另一个靶向多肽。在一些实施方案中，l在体内是稳定的。在一些实施方案中，l在体内是可水解的。在一些实施方案中，l在体内是亚稳态的。
[0265]
靶向多肽和m可以使用本领域技术人员已知的标准连接剂和程序通过l连接在一起。在一些方面，靶向多肽和m直接融合并且l是一个键。在其他方面，靶向多肽和m通过连接基团l融合。举例来说，在一些实施方案中，靶向多肽和m通过肽键，任选地通过肽或氨基酸间隔基连接在一起。在一些实施方案中，靶向多肽和m通过化学缀合，任选地通过连接基团(l)连接在一起。在一些实施方案中，l直接缀合至靶向多肽和m中的每一个。
[0266]
化学缀合可通过使一种化合物的亲核反应基与另一种化合物的亲电反应基反应来发生。在一些实施方案中，当l是一个键时，通过使靶向多肽上的亲核反应性部分与y上的亲电反应性部分反应，或通过使靶向多肽上的亲电反应性部分与m上的亲核反应性部分反
应，使靶向多肽缀合至m。在实施方案中，当l是将靶向多肽和m连接在一起的基团时，可以通过使靶向多肽和/或m上的亲核反应性部分与l上的亲电性反应性部分反应，或通过使靶向多肽和/或m上的亲电反应性部分与l上的亲核反应性部分反应，使靶向多肽和/或m缀合至l。亲核反应基的非限制性实例包括氨基、硫醇和羟基。亲电反应基的非限制性实例包括羧基、酰氯、酸酐、酯、琥珀酰亚胺酯、卤代烷、磺酸酯、马来酰亚氨基、卤代乙酰基和异氰酸酯。在靶向多肽和m通过羧酸与胺反应而缀合在一起的实施方案中，活化剂可用于形成羧酸的活化酯。
[0267]
羧酸的活化酯可以是例如n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、甲苯磺酸酯(tos)、甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯、碳二亚胺或六氟磷酸酯。在一些实施方案中，碳二亚胺是1,3-二环己基碳二亚胺(dcc)、1,1'-羰基二咪唑(cdi)、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)或1,3-二异丙基碳二亚胺(dicd)。在一些实施方案中，六氟磷酸酯选自由以下组成的组：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲氨基)六氟磷酸鏻(bop)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧三吡咯烷基鏻(pybop)、六氟磷酸2-(1h-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓(hatu)和六氟磷酸邻苯并三唑-n,n,n',n'-四甲基脲鎓(hbtu)。
[0268]
在一些实施方案中，靶向多肽包含能够与m或l上的亲电反应基缀合的亲核反应基(例如赖氨酸、半胱氨酸或丝氨酸侧链的氨基、硫醇基或羟基)。在一些实施方案中，靶向多肽包含能够与m或l上的亲核反应基缀合的亲电反应基(例如asp或glu侧链的羧酸酯基团)。在一些实施方案中，靶向多肽被化学修饰以包含能够直接与m或l缀合的反应基。在一些实施方案中，靶向多肽在n端或c端被修饰以包含具有亲核侧链的天然或非天然氨基酸。在示例性实施方案中，靶向多肽的n端或c端氨基酸选自由以下组成的组：赖氨酸、鸟氨酸、丝氨酸、半胱氨酸和同型半胱氨酸。举例来说，可以修饰靶向多肽的n端或c端氨基酸以包含赖氨酸残基。在一些实施方案中，靶向多肽在n端或c端氨基酸处被修饰以包含具有亲电侧链的天然或非天然氨基酸，例如asp和glu。在一些实施方案中，靶向多肽的内部氨基酸被如本文先前所描述的具有亲核侧链的天然或非天然氨基酸取代。在示例性实施方案中，被取代的靶向多肽的内部氨基酸选自由以下组成的组：赖氨酸、鸟氨酸、丝氨酸、半胱氨酸和同型半胱氨酸。举例来说，靶向多肽的内部氨基酸可以被赖氨酸残基取代。在一些实施方案中，靶向多肽的内部氨基酸被具有亲电侧链的天然或非天然氨基酸，例如asp和glu取代。
[0269]
在一些实施方案中，m包含能够直接缀合至靶向多肽或l的反应基。在一些实施方案中，m包含能够缀合至靶向多肽或l上的亲电反应基的亲核反应基(例如胺、硫醇、羟基)。在一些实施方案中，m包含能够缀合至靶向多肽或l上的亲核反应基的亲电反应基(例如羧基、羧基的活化形式、具有离去基团的化合物)。在一些实施方案中，m被化学修饰以包含能够缀合至靶向多肽或l上的亲电反应基的亲核反应基。在一些实施方案中，m被化学修饰以包含能够缀合至靶向多肽或l上的亲核反应基的亲电反应基。
[0270]
在一些实施方案中，缀合可以通过有机硅烷，例如用戊二醛处理的氨基硅烷；羰基二咪唑(cdi)活化的硅醇基团；或使用树枝状聚合物进行。多种树枝状聚合物是本领域已知的并且包括聚(酰氨基胺)(pamam)树枝状聚合物，其是通过从氨或乙二胺引发剂核心试剂开始发散法合成的；基于三-氨基乙烯-亚胺核心的pamam树枝状聚合物的子类；径向层状聚(酰氨基胺-有机硅)树枝状聚合物(pamamos)，其是由亲水性、亲核性聚酰氨基胺(pamam)内部和疏水性有机硅(os)外部组成的倒置单分子胶团；聚(丙烯亚胺)(ppi)树枝状聚合物，其
一般为以伯胺为端基的聚烷基胺，而树枝状聚合物内部由许多叔三-丙烯胺组成；聚(丙烯胺)(popam)树枝状聚合物；二氨基丁烷(dab)树枝状聚合物；两亲树枝状聚合物；胶团树枝状聚合物，其是水溶性超支化聚亚苯基的单分子胶团；聚赖氨酸树枝状聚合物；以及基于聚苯甲基醚超支化骨架的树枝状聚合物。
[0271]
在一些实施方案中，可以通过烯烃复分解进行缀合。在一些实施方案中，m和靶向多肽、m和l，或靶向多肽和l都包含能够进行复分解的烯烃或炔烃部分。在一些实施方案中，使用合适的催化剂(例如铜、钌)来加速复分解反应。进行烯烃复分解反应的合适方法在本领域中进行描述。参见例如schafmeister等人,j.am.chem.soc.122:5891-5892(2000)；walensky等人,science 305:1466-1470(2004)；以及blackwell等人,angew,chem.,int.ed.37:3281-3284(1998)。
[0272]
在一些实施方案中，可以使用点击化学进行缀合。“点击反应”范围广泛并易于执行，仅使用现成的试剂，并且对氧气和水不敏感。在一些实施方案中，点击反应是炔烃基团与叠氮基之间形成三唑基的环加成反应。在一些实施方案中，点击反应使用铜或钌催化剂。进行点击反应的合适方法在本领域中进行描述。参见例如kolb等人,drug discovery today 8:1128(2003)；kolb等人,angew.chem.int.ed.40:2004(2001)；rostovtsev等人,angew.chem.int.ed.41:2596(2002)；tomoe等人,j.org.chem.67:3057(2002)；manetsch等人,j.am.chem.soc.126:12809(2004)；lewis等人,angew.chem.int.ed.41:1053(2002)；speers,j.am.chem.soc.125:4686(2003)；chan等人.org.lett.6:2853(2004)；zhang等人,j.am.chem.soc.127:15998(2005)；以及waser等人,j.am.chem.soc.127:8294(2005)。
[0273]
通过高亲和力特异性结合配偶体的间接缀合，例如链霉抗生物素蛋白/生物素或抗生物素蛋白/生物素或凝集素/碳水化合物也被考虑在内。
[0274]
在一些实施方案中，用有机衍生剂官能化靶向多肽和/或m以包含亲核反应基或亲电反应基。所述衍生剂能够与选定的侧链或靶向多肽上的靶向氨基酸的n端或c端残基以及m上的官能团反应。靶向多肽和/或m上的反应基包括例如醛、氨基、酯、硫醇、α-卤代乙酰基、马来酰亚氨基或肼基。衍生剂包括例如马来酰亚氨基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、n-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐或本领域已知的其他剂。可选地，靶向多肽和/或m可以通过中间载剂，诸如多糖或多肽载剂间接地相互连接。多糖载剂的实例包括氨基葡聚糖。合适的多肽载剂的实例包括聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、其共聚物，以及这些氨基酸和其他氨基酸，例如丝氨酸的混合聚合物，以赋予所得负载载剂所需的溶解度特性。
[0275]
半胱氨酰残基最常见地与a-卤代乙酸酯(和对应的胺)，诸如氯乙酸或氯乙酰胺反应，以得到羧甲基或羧酰氨基甲基衍生物。半胱氨酰残基还通过与溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、磷酸氯乙酰基酯、n-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞苯甲酸、2-氯汞-4-硝基酚或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑反应来衍生。
[0276]
组氨酰残基通过与焦碳酸二乙酯在ph 5.5-7.0下反应来衍生，因为所述剂相对地对组氨酰基侧链具有特异性。对溴苯甲酰甲基溴也是可用的；反应优选在0.1m二甲胂酸钠中在ph 6.0下进行。
[0277]
赖氨酰基和氨基末端残基与琥珀酸或其他羧酸酐反应。利用这些剂的衍生具有逆
转赖氨酰残基的电荷的作用。用于衍生含α-氨基的残基的其他合适试剂包括亚氨酸酯，诸如甲基吡啶亚胺甲酯、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯代硼氢化物、三硝基苯磺酸、o-甲基异脲、2,4-戊二酮，以及转胺酶催化的与乙醛酸盐的反应。
[0278]
精氨酰残基通过与一种或若干种常规试剂反应来修饰，所述常规试剂包括苯乙二醛(phenylglyoxal)、2,3-丁二酮、1,2-环己二酮以及茚三酮。精氨酸残基的衍生需要反应在碱性条件下进行，这是因为胍官能团具有高pka。此外，这些试剂可与赖氨酸的基团以及精氨酸ε-氨基反应。
[0279]
酪氨酰残基的特定修饰可通过与芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反应来进行，尤其关注将光谱标记引入酪氨酰残基中。最常见地，使用n-乙酰基咪唑和四硝基甲烷分别形成o-乙酰基酪氨酰基物质和3-硝基衍生物。
[0280]
羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)通过与碳化二亚胺(r-n＝c＝n-r')反应进行选择性修饰，所述碳化二亚胺中r和r'是不同的烷基，诸如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳化二亚胺或1-乙基-3-(4-氮阳离子-4,4-二甲基戊基)碳化二亚胺。此外，天冬氨酰基和谷氨酰基残基可通过与铵离子反应而转化为天冬酰胺酰和谷酰胺酰残基。
[0281]
其他修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(t.e.creighton,proteins:structure and molecular properties,w.h.freeman&co.,san francisco,第79-86页(1983))，天冬酰胺或谷氨酰胺的脱酰胺作用、n端胺的乙酰化作用和/或c端羧酸基团的酰胺化或酯化作用。
[0282]
另一类型的共价修饰涉及将糖苷化学或酶促偶联至肽。糖可连接至(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基，诸如半胱氨酸的那些游离巯基，(d)游离羟基，诸如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的那些游离羟基，(e)芳香残基，诸如酪氨酸或色氨酸的那些芳香残基，或(f)谷氨酰胺的酰氨基。这些方法在wo 1987/05330和aplin和wriston,crc crit.rev.biochem.,第259-306页(1981)中描述。
[0283]
在一些实施方案中，l是一个键。在这些实施方案中，靶向多肽和m通过使靶向多肽上的亲核反应性部分与m上的亲电反应性部分反应而缀合在一起。在可选的实施方案中，靶向多肽和m通过使靶向多肽上的亲电反应性部分与m上的亲核部分反应而缀合在一起。在示例性实施方案中，l是酰胺键，其在靶向多肽上的胺(例如赖氨酸残基的ε-胺)与m上的羧基反应时形成。在可选的实施方案中，靶向多肽和/或m在缀合前用衍生剂衍生化。
[0284]
在一些实施方案中，l是连接基团。在一些实施方案中，l是双官能接头并且在缀合至靶向多肽和m之前仅包含两个反应基。在靶向多肽和m都具有亲电反应基的实施方案中，在缀合至靶向多肽和m之前，l包含两个相同的或两个不同的亲核基团(例如胺、羟基、硫醇)。在靶向多肽和m都具有亲核反应基的实施方案中，在缀合至靶向多肽和m之前，l包含两个相同或两个不同的亲电基团(例如羧基、羧基的活化形式、具有离去基团的化合物)。在靶向多肽或m中的一个具有亲核反应基并且靶向多肽或m的另一个具有亲电反应基的实施方案中，在缀合至靶向多肽和m之前，l包含一个亲核反应基和一个亲电反应基。
[0285]
l可以是具有至少两个能够与靶向多肽和m中的每一个反应的反应基(在缀合至靶向多肽和m之前)的任何分子。在一些实施方案中，l仅具有两个反应基并且是双官能的。l(在缀合至肽之前)可以由式vi表示：
[0286][0287]
其中a和b独立地是亲核或亲电反应基。在一些实施方案中，a和b均为亲核基团或均为亲电基团。在一些实施方案中，a或b中的一个是亲核基团并且a或b中的另一个是亲电基团。a和b的非限制性组合示于下表1中。
[0288]
表1：亲核基团和亲电基团的非限制性组合
[0289]
[0290]
[0291]
[0292][0293]
在一些实施方案中，a和b可包括适合于烯烃复分解反应的烯烃和/或炔烃官能团。在一些实施方案中，a和b包括适用于点击化学的部分(例如烯烃、炔烃、腈、叠氮化物)。反应基(a和b)的其他非限制性实例包括吡啶基二硫醇、芳基叠氮化物、双吖丙啶、碳二亚胺和酰肼。
[0294]
在一些实施方案中，l是疏水的。疏水接头是本领域已知的。参见例如bioconjugate techniques,g.t.hermanson(academic press,san diego,ca,1996)，其以引用的方式整体并入。本领域已知的合适的疏水连接基团包括例如8-羟基辛酸和8-巯基辛酸。在缀合至组合物的肽之前，疏水连接基团包含如本文所描述和如下所示的至少两个反应基(a和b)：
[0295][0296]
在一些实施方案中，疏水连接基团包含马来酰亚氨基或碘代乙酰基和羧酸或活化的羧酸(例如nhs酯)作为反应基。在这些实施方案中，马来酰亚氨基或碘代乙酰基可以与靶向多肽或m上的硫醇部分偶联，并且羧酸或活化的羧酸可以在使用或不使用偶联剂的情况下与靶向多肽或m上的胺偶联。可以使用本领域技术人员已知的任何偶联剂将羧酸与游离胺，例如dcc、dic、hatu、hbtu、tbtu和本文所描述的其他活化剂偶联。在具体实施方案中，亲水连接基团包含2至100个亚甲基的脂肪族链，其中a和b是羧基或其衍生物(例如琥珀酸)。在其他具体实施方案中，l是碘乙酸。
[0297][0298]
在一些实施方案中，连接基团是亲水性的，诸如聚亚烷基二醇。在缀合至组合物的肽之前，亲水连接基团包含如本文所描述和如下所示的至少两个反应基(a和b)：
[0299]
[0300]
在具体实施方案中，连接基团是聚乙二醇(peg)。在某些实施方案中，peg具有约100道尔顿至约10,000道尔顿，例如约500道尔顿至约5000道尔顿的分子量。在一些实施方案中，peg具有约10,000道尔顿至约40,000道尔顿的分子量。
[0301]
在一些实施方案中，亲水连接基团包含马来酰亚氨基或碘代乙酰基和羧酸或活化的羧酸(例如nhs酯)作为反应基。在这些实施方案中，马来酰亚氨基或碘代乙酰基可以与靶向多肽或m上的硫醇部分偶联，并且羧酸或活化的羧酸可以在使用或不使用偶联剂的情况下与靶向多肽或m上的胺偶联。可以使用本领域技术人员已知的任何适当的偶联剂将羧酸与胺，例如dcc、dic、hatu、hbtu、tbtu和本文所描述的其他活化剂偶联。在一些实施方案中，连接基团是马来酰亚氨基-聚合物(20-40kda)-cooh、碘乙酰基-聚合物(20-40kda)-cooh、马来酰亚氨基-聚合物(20-40kda)-nhs或碘乙酰基-聚合物(20-40kda)-nhs。
[0302]
在一些实施方案中，连接基团由氨基酸、二肽、三肽或多肽构成，其中氨基酸、二肽、三肽或多肽包含如本文所描述的至少两个活化基团。在一些实施方案中，连接基团(l)包含选自由以下组成的组的部分：氨基、醚、硫醚、马来酰亚氨基、二硫化物、酰胺、酯、硫酯、烯烃、环烯烃、炔烃、三唑基、氨基甲酸酯、碳酸酯、可裂解的组织蛋白酶b和腙。
[0303]
在一些实施方案中，l包含1至约60个或1至30个原子或更长、2至5个原子、2至10个原子、5至10个原子或10至20个原子长的原子链。在一些实施方案中，链原子都是碳原子。在一些实施方案中，接头主链中的链原子选自由c、o、n和s组成的组。链原子和接头可根据它们的预期溶解度(亲水性)来选择，以便提供更具可溶性的缀合物。在一些实施方案中，l提供经受在靶组织或器官或细胞中发现的酶或其他催化剂或水解条件裂解的官能团。在一些实施方案中，l的长度足够长以降低空间位阻的可能性。
[0304]
在一些实施方案中，l在生物流体，诸如血液或血液级分中是稳定的。在一些实施方案中，l在血清中稳定至少5分钟，例如当在血清中孵育5分钟时，少于25％、20％、15％、10％或5％的缀合物被裂解。在其他实施方案中，l在血清中稳定至少10、或20、或25、或30、或60、或90、或120分钟、或3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18或24小时。在这些实施方案中，l不包含能够在体内进行水解的官能团。在一些示例性实施方案中，l在血清中稳定至少约72小时。不能在体内发生显著水解的官能团的非限制性实例包括酰胺、醚和硫醚。举例来说，以下化合物在体内不发生显著水解。
[0305][0306]
在一些实施方案中，l在体内是可水解的。在这些实施方案中，l包含能够在体内进行水解的官能团。能够在体内进行水解的官能团的非限制性实例包括酯、酸酐和硫酯。举例来说，下列化合物能够在体内进行水解，因为它包含酯基：
[0307][0308]
在一些示例性实施方案中，l是不稳定的并且在37℃的血浆中在3小时内经历大量水解，在6小时内完全水解。在一些示例性实施方案中，l是不稳定的。
[0309]
在一些实施方案中，l在体内是亚稳态的。在这些实施方案中，l包含能够任选地在一段时间内在体内被化学或酶促裂解的官能团(例如酸不稳定、还原不稳定或酶不稳定的
官能团)。在这些实施方案中，l可以包含例如腙部分、二硫化物部分或组织蛋白酶可裂解部分。当l是亚稳态的，并且不打算受任何特定理论的束缚，靶向多肽-l-m缀合物在细胞外环境中是稳定的，例如在上述时间段内在血清中是稳定的，但在细胞内环境或模拟细胞内环境的条件中是不稳定的，因此它在进入细胞时被裂解。在一些实施方案中，当l是亚稳态时，l在血清中稳定至少约24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、42或48小时，例如至少约48、54、60、66或72小时，或约24-48、48-72、24-60、36-48、36-72或48-72小时。
[0310]
在另一个实施方案中，本发明的聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链：
[0311]
x—ch2ch2o
‑‑
(ch2ch2o)n‑‑
ch2ch
2-o-(ch2)
m-w-n＝n＝n，其中：
[0312]
w是包含1-10个碳原子的脂肪族或芳香族连接部分；
[0313]
n是1至约4000；x是如上文所描述的官能团；m介于1与10之间。
[0314]
本发明的含叠氮化物的聚合物衍生物可通过本领域已知的和/或本文所公开的多种方法制备。在如下所示的一种方法中，水溶性聚合物主链具有约800da至约100,000da的平均分子量的，具有与第一官能团键结的第一末端和与合适的离去基团键结的第二末端的所述聚合物主链与叠氮阴离子(其可与许多合适的抗衡离子，包括钠、钾、叔丁基铵等中的任一种配对)反应。离去基团经历亲核置换并被叠氮化物部分替代，得到所需的含叠氮化物的聚合物；
[0315]
x-聚合物-ly n
3-→
x-聚合物-l n3[0316]
如所示，适用于本发明的聚合物主链具有式x-聚合物-ly，其中聚合物是聚(乙二醇)，并且x是不与叠氮化物基团反应的官能团，y是合适的离去基团。合适的官能团的实例包括但不限于羟基、受保护的羟基、缩醛、烯基、胺、氨氧基、受保护的胺、受保护的酰肼、受保护的硫醇、羧酸、受保护的羧酸、马来酰亚胺、二硫代吡啶和乙烯基吡啶，以及酮。合适的离去基团的实例包括但不限于氯化物、溴化物、碘化物、甲磺酸酯、三氟乙基磺酸单甲氧基(tresylate)和甲苯磺酸酯。
[0317]
在制备本发明的含叠氮化物的聚合物衍生物的另一种方法中，使带有叠氮化物官能团的连接剂与具有约800da至约100,000da的平均分子量的水溶性聚合物主链接触，其中连接剂带有化学官能团，所述化学官能团将选择性地与聚合物上的化学官能团反应以形成含叠氮化物的聚合物衍生物产物，其中叠氮化物通过连接基团与聚合物主链分开。
[0318]
以下示出了示例性反应方案：
[0319]
x-聚合物-y n-接头-n＝n＝n
→
pg-x-聚合物-接头-n＝n＝n，其中：
[0320]
聚合物是聚(乙二醇)并且x是封端基团，诸如烷氧基或如上文所描述的官能团；并且y是不与叠氮化物官能团反应但会与n官能团有效并选择性地反应的官能团。
[0321]
合适的官能团的实例包括但不限于，如果n是胺，那么y是羧酸、碳酸酯或活性酯；如果n是酰肼或氨氧基部分，那么y是酮；如果n是亲核试剂，那么y是离去基团。粗产物的纯化可通过已知的方法完成，包括但不限于产物沉淀，接着如果需要进行色谱法。
[0322]
在聚合物二胺的情况下，下文示出了更具体的实例，其中一种胺被保护基部分，诸如叔丁基-boc保护，并且所得单保护的聚合物二胺与携带叠氮化物官能团的连接部分反应：
[0323]
bochn-聚合物-nh2 ho2c-(ch2)
3-n＝n＝n
[0324]
在这种情况下，胺基可以使用多种活化剂，诸如亚硫酰氯或碳二亚胺试剂和n-羟
基琥珀酰亚胺或n-羟基苯并三唑偶联至羧酸基团上，以在单胺聚合物衍生物与携带叠氮化物的接头部分之间产生酰胺键。在成功形成酰胺键后，所得的n-叔丁基-boc保护的含叠氮化物的衍生物可直接用于修饰生物活性分子，也可进一步加工以安装其他有用的官能团。例如，n-t-boc基团可以通过用强酸处理来水解，以生成ω-氨基-聚合物-叠氮化物。所得胺可用作合成手柄以安装其他有用的官能团，诸如马来酰亚胺基团、活化的二硫化物、活化的酯等，以产生有价值的异源双官能试剂。
[0325]
当需要将不同的分子连接至聚合物的每个末端时，异双官能衍生物特别有用。举例来说，ω-n-氨基-n-叠氮基聚合物将允许具有活化亲电基团的分子，诸如醛、酮、活化酯、活化碳酸酯等连接至聚合物的一个末端，并且将具有乙炔基团的分子连接至聚合物的另一端。
[0326]
在本发明的另一个实施方案中，a是具有1-10个碳原子的脂肪族接头或具有6-14个碳原子的取代的芳基环。x是不与叠氮化物基团反应的官能团，并且y是合适的离去基团。
[0327]
多个靶向多肽可通过接头多肽接合，其中接头多肽的长度任选地为6-14、7-13、8-12、7-11、9-11或9个氨基酸。其他接头包括但不限于小聚合物，诸如peg，所述小聚合物可以是多臂的，允许多个靶向多肽分子连接在一起。多个靶向多肽和修饰的靶向多肽可以通过它们的n-末端以头对头构型通过使用此类接头或通过每个多肽各自的n端之间的直接化学键结来彼此连接。举例来说，两个靶向多肽可以通过它们的n端氨基或修饰的n端氨基之间的化学键结连接来形成二聚体。此外，被设计成包含多个化学官能团以与每个靶向多肽的n端键结的连接分子可用于各自在它们各自的n-末端接合的多个靶向多肽。另外，多个靶向多肽可以通过n端氨基酸或c端氨基酸之外的氨基酸之间的键结连接。可用以形成本文所描述的靶向多肽的二聚体和多聚体的共价键的实例包括但不限于二硫键或巯基或硫醇键。另外，某些酶，诸如分选酶，可用于在靶向多肽与接头之间，包括在靶向多肽的n端形成共价键。
[0328]
接头可具有广泛范围的分子量或分子长度。更大或更小分子量的接头可用于提供靶向多肽与连接的实体之间或连接的实体与其结合配偶体(如果有的话)之间的所需空间关系或构象。具有更长或更短分子长度的接头也可用于在靶向多肽与连接的实体之间或连接的实体和其结合配偶体之间提供所需的空间或灵活性。接头可包括但不限于以下：
[0329]
[0330][0331]
在一些实施方案中，本发明提供了具有哑铃结构的水溶性双官能接头，所述哑铃结构包括：a)在聚合物主链的至少第一端上的叠氮化物、炔烃、肼、酰肼、羟胺或含羰基的部分；以及b)在聚合物主链的第二端上的至少第二官能团。第二官能团可以与第一官能团相同或不同。在一些实施方案中，第二官能团不与第一官能团反应。在一些实施方案中，本发明提供了包含支化分子结构的至少一个臂的水溶性化合物。举例来说，支化分子结构可以是树枝状的。
[0332]
在示例性实施方案中，聚合物通过接头连接至靶向多肽或修饰的靶向多肽。举例来说，接头可包含一个或两个氨基酸，所述氨基酸的一端结合聚合物—诸如白蛋白结合部分—而另一端结合多肽主链上的任何可用位置。额外示例性接头包括亲水接头，诸如包含至少5个非氢原子的化学部分，其中30％-50％的所述化学部分是n或o。可以将聚合物连接
至靶向多肽或修饰的靶向多肽的额外示例性接头在u.s.2012/0295847和wo/2012/168430中公开，所述文献中的每一个特此以引用的方式整体并入。
[0333]
任选地，多个靶向多肽或修饰的靶向多肽分子可以通过接头多肽接合，其中所述接头多肽的长度任选地是1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11、1-12个氨基酸和更长的长度，其中任选地，一种靶向多肽的n端融合至接头多肽的c端，并且接头多肽的n端融合至另一种靶向多肽的n端。wo/2013/004607中公开了可以使用的其他示例性接头多肽，所述文献特此以引用的方式整体并入。
[0334]
如本文所用，术语“亲电基团”、“亲电试剂”等是指可以接受电子对以形成共价键的原子或原子基团。本文所用的“亲电基团”包括但不限于含卤化物、含羰基和含环氧化物的化合物。常见的亲电试剂可以是卤化物，诸如硫光气、甘油二氯丙醇、邻苯二甲酰氯、琥珀酰氯、氯乙酰氯、氯琥珀酰氯等；酮，诸如氯丙酮、溴丙酮等；醛，诸如乙二醛等；异氰酸酯，诸如六亚甲基二异氰酸酯、甲苯二异氰酸酯、间亚二甲苯基二异氰酸酯、环己基甲烷-4,4-二异氰酸酯等；以及这些化合物的衍生物。
[0335]
如本文所用，术语“亲核基团”、“亲核试剂”等是指具有能够形成共价键的电子对的原子或原子基团。这种类型的基团可以是作为阴离子基团反应的可电离基团。本文所用的“亲核基团”包括但不限于羟基、伯胺、仲胺、叔胺和硫醇。
[0336]
表2提供了各种起始亲电试剂和亲核试剂，它们可以接合以产生所需的官能团。所提供的信息是说明性的，并不限制本文所描述的合成技术。
[0337]
表2：共价键联和其前体的实例
[0338]
[0339][0340]
通常，碳亲电试剂易受互补亲核试剂(包括碳亲核试剂)的攻击，其中攻击亲核试剂将电子对带到碳亲电试剂以在亲核试剂与碳亲电试剂之间形成新键。
[0341]
碳亲核试剂的非限制性实例包括但不限于烷基、烯基、芳基和炔基格氏试剂、有机锂、有机锌、烷基-锡试剂、烯基-锡试剂、芳基-锡试剂和炔基-锡试剂(有机锡烷)、烷基-硼烷试剂、烯基-硼烷试剂、芳基-硼烷试剂和炔基-硼烷试剂(有机硼烷和有机硼酸酯)；这些碳亲核试剂具有在水或极性有机溶剂中动力学稳定的优点。碳亲核试剂的其他非限制性实例包括磷叶立德、烯醇和烯醇化物试剂；这些碳亲核试剂具有相对容易从合成有机化学领域的技术人员熟知的前体产生的优点。碳亲核试剂与碳亲电试剂结合使用时，会在碳亲核试剂与碳亲电试剂之间产生新的碳-碳键。
[0342]
适合与碳亲电试剂偶联的非碳亲核试剂的非限制性实例包括但不限于伯胺和仲胺、硫醇、琉醇盐和硫醚、醇、醇盐、叠氮化物、氨基脲等。当这些非碳亲核试剂与碳亲电试剂结合使用时，通常会产生杂原子键联(c-x-c)，其中x是杂原子，包括但不限于氧、硫或氮。
[0343]
在一些情况下，用于本发明的聚合物在一端以羟基或甲氧基终止，即x是h或ch3("甲氧基peg")。可选地，聚合物可以反应基终止，从而形成双官能聚合物。典型的反应基可包括通常用于与20种常见氨基酸中发现的官能团反应的那些反应基(包括但不限于马来酰亚胺基团、活性碳酸酯(包括但不限于对硝基苯酯)、活性酯(包括但不限于n-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯酯)和醛)以及对20种常见氨基酸呈惰性但与互补官能团特异性反应的官能团(包括但不限于叠氮化物基团、炔烃基团)。应注意，在上式中由y表示的聚合物的另一端将
通过天然存在的或非天然编码氨基酸直接或间接连接至靶向多肽。例如，y可以是与多肽的胺基(包括但不限于赖氨酸或n端的ε胺)连接的酰胺、氨基甲酸酯或脲。可选地，y可以是与硫醇基(包括但不限于半胱氨酸的硫醇基)连接的马来酰亚胺键联。可选地，y可以连接至通常无法通过20种常见氨基酸获得的残基。举例来说，聚合物上的叠氮化物基团可与靶向多肽上的炔烃基团反应形成huisgen[3 2]环加成产物。可选地，聚合物上的炔烃基团可与靶向多肽中存在的叠氮化物基团反应，以形成类似的产物。在一些实施方案中，强亲核试剂(包括但不限于肼、酰肼、羟胺、氨基脲)可与靶向多肽中存在的醛基或酮基反应，以形成腙、肟或氨基脲，视情况而定，其在一些情况下可以通过适当的还原剂处理而进一步还原。可选地，强亲核试剂可通过非天然编码氨基酸掺入靶向多肽中，并用于优先与水溶性聚合物中存在的酮基或醛基反应。
[0344]
可根据实际需要使用聚合物的任何分子量，包括但不限于约100道尔顿(da)至100,000da或根据需要更高(包括但不限于有时0.1-50kda或10-40kda)。聚合物的分子量可以在广泛范围内，包括但不限于在约100da与约100,000da之间或更大。聚合物可介于约100da与约100,000da之间，包括但不限于100,000da、95,000da、90,000da、85,000da、80,000da、75,000da、70,000da、65,000da、60,000da、55,000da、50,000da、45,000da、40,000da、35,000da、30,000da、25,000da、20,000da、15,000da、10,000da、9,000da、8,000da、7,000da、6,000da、5,000da、4,000da、3,000da、2,000da、1,000da、900da、800da、700da、600da、500da、400da、300da、200da和100da。在一些实施方案中，聚合物介于约100da与约50,000da之间。也可以使用支链聚合物，包括但不限于每条链的分子量范围为1-100kda(包括但不限于1-50kda或5-20kda)的聚合物分子。支链聚合物的每条链的分子量可以是，包括但不限于介于约1,000da与约100,000da之间或更大。支链聚合物的每条链的分子量可以介于约1,000da与约100,000da之间，包括但不限于100,000da、95,000da、90,000da、85,000da、80,000da、75,000da、70,000da、65,000da、60,000da、55,000da、50,000da、45,000da、40,000da、35,000da、30,000da、25,000da、20,000da、15,000da、10,000da、9,000da、8,000da、7,000da、6,000da、5,000da、4,000da、3,000da、2,000da和1,000da。在一些实施方案中，支链聚合物的每条链的分子量介于约1,000da与约50,000da之间。在一些实施方案中，支链聚合物的每条链的分子量介于约1,000da与约40,000da之间。在一些实施方案中，支链聚合物的每条链的分子量介于约5,000da与约40,000da之间。在一些实施方案中，支链聚合物的每条链的分子量介于约5,000da与约20,000da之间。在包括但不限于shearwater polymers,inc.目录、nektar therapeutics目录中描述了广泛范围的聚合物分子，所述目录以引用的方式并入本文。
[0345]
在一些实施方案中，本发明提供了包含平均分子量为约800da至约100,000da的水溶性聚合物主链的含叠氮化物和含乙炔的聚合物衍生物。水溶性聚合物的聚合物主链可以是聚(乙二醇)。然而，应理解，包括但不限于聚(乙二醇)和其他相关聚合物(包括聚(葡聚糖)和聚丙二醇)的多种水溶性聚合物也适用于本发明的实践和使用术语peg或聚(乙二醇)意欲涵盖和包括所有此类分子。术语peg包括但不限于任何形式的聚乙二醇，包括双官能peg、多臂peg、衍生的peg、分叉peg、支化peg、悬垂peg(即具有一个或多个悬挂在聚合物主链上的官能团的peg或相关聚合物)，或其中具有可降解键联的peg。
[0346]
除了这些形式的聚合物之外，还可以制备主链中具有弱键联或可降解键联的聚合
物。举例来说，可以制备聚合物主链中具有易水解的酯键的聚合物。如下所示，这种水解导致聚合物裂解成较低分子量的片段：-聚合物-co
2-聚合物-h2o
→
聚合物-co2h ho-聚合物-[0347]
许多聚合物也适用于本发明。在一些实施方案中，具有2至约300个末端的水溶性聚合物主链在本发明中特别有用。合适的聚合物的实例包括但不限于其他聚(亚烷基二醇)，诸如聚丙二醇(“ppg”)、其共聚物(包括但不限于乙二醇和丙二醇的共聚物)、其三元共聚物，其混合物等。尽管聚合物主链的每条链的分子量可以变化，但它通常在约800da至约100,000da范围内，通常在约6,000da至约80,000da范围内。聚合物主链的每条链的分子量可以介于约100da与约100,000da之间，包括但不限于100,000da、95,000da、90,000da、85,000da、80,000da、75,000da、70,000da、65,000da、60,000da、55,000da、50,000da、45,000da、40,000da、35,000da、30,000da、25,000da、20,000da、15,000da、10,000da、9,000da、8,000da、7,000da、6,000da、5,000da、4,000da、3,000da、2,000da、1,000da、900da、800da、700da、600da、500da、400da、300da、200da和100da。在一些实施方案中，聚合物主链的每条链的分子量介于约100da与约50,000da之间。在一些实施方案中，聚合物主链的每条链的分子量介于约100da与约40,000da之间。在一些实施方案中，聚合物主链的每条链的分子量介于约1,000da与约40,000da之间。在一些实施方案中，聚合物主链的每条链的分子量介于约5,000da与约40,000da之间。在一些实施方案中，聚合物主链的每条链的分子量介于约10,000da与约40,000da之间。
[0348]
在本发明的这个实施方案的一个特征中，完整的聚合物-缀合物在水解之前在施用时被最小程度地降解，使得可裂解键的水解有效地控制活性靶向多肽释放到血流中的缓慢速率，这与靶向多肽在其释放到体循环中之前的酶促降解相反。
[0349]
适当的生理可裂解键联包括但不限于酯、碳酸酯、氨基甲酸酯、硫酸酯、磷酸酯、酰氧基烷基醚、缩醛和缩酮。此类缀合物应具有在储存和施用时稳定的生理可裂解键。例如，与聚合物连接的靶向多肽或修饰的靶向多肽应在制造最终药物组合物时、在溶解于适当的递送媒介物中时(如果使用的话)以及在施用时保持其完整性而不考虑途径。本文所公开的任何可裂解接头可与本发明的药物、有效载荷、靶向多肽或修饰的靶向多肽连接。通过可裂解接头连接的示例性实例包括但不限于：
[0350][0351]
在本发明的一些实施方案中，接头可以是与药物、有效载荷、靶向多肽或修饰的靶向多肽连接的不可裂解接头。通过不可裂解接头连接的示例性实例包括但不限于：
[0352][0353]
本发明还包括基于磷酸酯的接头，其稳定性可调，以用于在us 2017/0182181公开的药物缀合物的细胞内递送，所述专利以引用的方式并入本文。基于磷酸酯的接头包含共价连接至接头臂远端和反应性官能团的单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或四磷酸酯基团(磷酸酯基团)，所述接头臂包含从远端到近端方向的调谐元件，任选地间隔元件。基于磷酸酯的接头的磷酸酯基团能够与有效载荷缀合并且反应性官能团能够与细胞特异性靶向配体
(诸如抗体)缀合。基于磷酸酯的接头的一般结构是：磷酸酯基团-调谐元件-可选的间隔元件-功能性反应基。与有效载荷缀合的基于磷酸酯的接头具有一般结构：有效载荷-磷酸酯基团-调谐元件-可选的间隔元件-功能性反应基，并且当与靶向配体缀合时具有一般结构：有效载荷-磷酸酯基团-调谐元件-可选的间隔元件-靶向配体。这些基于磷酸酯的接头在血液中与细胞内环境(例如溶酶体区室)相比具有差异化和可调的稳定性。磷酸酯基团在细胞内环境中被裂解以释放其天然或活性形式的有效载荷的速率可能受调谐元素结构的影响，其中其他影响由磷酸酯基团的取代以及磷酸酯基团是否是单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或四磷酸酯介导。此外，这些基于磷酸酯的接头提供构建缀合物，诸如抗体-药物缀合物的能力，其中与使用不是本文所公开的基于磷酸酯的接头的接头将相同有效载荷与抗体或靶向配体缀合的缀合物相比，所述缀合物形成聚集体的倾向降低。
[0354]
tlr激动剂接头衍生物的结构和合成：亲电基团和亲核基团
[0355]
具有含羟胺(也称为氨氧基)基团的接头的tlr激动剂衍生物允许与各种亲电基团(包括但不限于与peg或其他水溶性聚合物)反应以形成缀合物。与肼、酰肼和氨基脲一样，氨氧基的增强的亲核性使其能够有效并选择性地与含有羰基或二羰基的各种分子(包括但不限于酮、醛或具有类似化学反应性的其他官能团)进行反应。参见例如shao,j.和tam,j.,j.am.chem.soc.117:3893-3899(1995)；h.hang和c.bertozzi,acc.chem.res.34(9):727-736(2001)。然而，与肼基反应的结果是对应的腙，而肟通常由氨氧基与含羰基或二羰基的基团，诸如酮、醛或具有类似化学反应性的其他官能团反应产生。在一些实施方案中，具有包含叠氮化物、炔烃或环炔烃的接头的tlr激动剂衍生物允许通过环加成反应(例如1,3-偶极环加成、叠氮-炔烃huisgen环加成等)连接分子。(在美国专利好7,807,619中描述，其在相对于反应的程度上以引用的方式并入本文)。
[0356]
因此，在本文所描述的某些实施方案中的是具有接头的tlr激动剂衍生物，所述接头包含羟胺、醛、受保护的醛、酮、受保护的酮、硫酯、酯、二羰基、肼、脒、亚胺、二胺、酮-胺、酮-炔和烯二酮羟胺基团、类羟胺基团(其具有与羟胺基团相似的反应性并且在结构上与羟胺基团相似)、掩蔽的羟胺基团(其可容易地转化为羟胺基团)或受保护的羟胺基团(脱保护时其具有与羟胺基团相似的反应性)。在一些实施方案中，具有接头的tlr激动剂衍生物包括叠氮化物、炔烃或环炔烃。
[0357]
此类tlr激动剂接头衍生物或靶向多肽可以呈盐的形式，或可以掺入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中，并且任选地进行翻译后修饰。
[0358]
在某些实施方案中，式(i)至式(vii)的化合物在温和酸性条件下在水溶液中稳定至少1个月。在某些实施方案中，式(i)至式(vii)的化合物在温和酸性条件下稳定至少2周。在某些实施方案中，式(i)至式(vii)的化合物在温和酸性条件下稳定至少5天。在某些实施方案中，此类酸性条件为ph 2至8。
[0359]
本文所提供和描述的方法和组合物包括包含非天然氨基酸的多肽，所述非天然氨基酸具有至少一个羰基或二羰基、肟基、羟胺基或其受保护的或掩蔽形式。将至少一个反应基引入tlr激动剂接头衍生物或靶向多肽中可以允许应用涉及特定化学反应，包括但不限于与一种或多种靶向多肽反应，而不与常见的氨基酸反应的缀合化学。一旦掺入，tc侧链的靶向多肽也可以通过利用本文所描述的或适用于tlr激动剂接头衍生物或靶向多肽中存在的特定官能团或取代基的化学方法进行修饰。
[0360]
本文所描述的tlr激动剂接头衍生物和靶向多肽方法以及组合物提供了具有多种官能团、取代基或部分的物质与其他物质(包括但不限于聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；以及其任何组合)的缀合物。
[0361]
在某些实施方案中，包括式(i)至式(vii)的化合物的本文所描述的tlr激动剂接头衍生物、靶向多肽、tc、接头和试剂在温和酸性条件(包括但不包括限于ph 2至8)下在水溶液中稳定。在其他实施方案中，此类化合物在温和酸性条件下稳定至少一个月。在其他实施方案中，此类化合物在温和酸性条件下稳定至少2周。在其他实施方案中，此类化合物在温和酸性条件下稳定至少5天。
[0362]
在本文所描述的组合物、方法、技术和策略的另一方面中的是用于研究或使用前述“修饰或未修饰的”非天然氨基酸靶向多肽中的任一种的方法。仅举例来说，所述方面包括将受益于包含“修饰或未修饰的”非天然氨基酸多肽或蛋白质的靶向多肽的治疗、诊断、基于测定的、工业、化妆品、植物生物学、环境、能源生产、消费品和/或军事用途。
[0363]
本发明提供了包含至少一种非天然氨基酸的tc分子。在本发明的某些实施方案中，具有至少一种非天然氨基酸的tc包括至少一个翻译后修饰。在一个实施方案中，至少一个翻译后修饰包含将包含第二反应基的分子(包括但不限于标记、染料、接头、另一种tc多肽、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交联剂、放射性核素、细胞毒性化合物、药物、亲和标记、光亲和标记、活性化合物、树脂、第二蛋白质或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、多核苷酸、dna、rna、反义多核苷酸、糖类、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米颗粒、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射性部分、新型官能团、与其他分子共价或非共价相互作用的基团、光笼部分、光化辐射可激发部分、光致异构部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、掺入重原子的部分、化学可裂解基团、光可裂解基团、伸长的侧链、碳连接的糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、毒性部分、同位素标记的部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、嵌入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子、量子点、纳米发射体、放射性核苷酸、放射性发射体、中子俘获剂或上述或任何其他所需化合物或物质的任何组合)利用本领域普通技术人员已知的适用于特定反应基的化学方法连接至包含第一反应基的至少一种非天然氨基酸。举例来说，第一反应基是炔基部分(包括但不限于非天然氨基酸中的对炔丙基氧基苯丙氨酸，其中炔丙基有时也称为乙炔基团)，并且第二反应基是叠氮基部分并使用[3 2]环加成化学方法。在另一个实例中，第一反应基是叠氮基部分(包括但不限于非天然氨基酸中的对-叠氮基-l-苯丙氨酸或如本说明书中有时所称的paz)并且第二反应基是炔基部分。在本发明的修饰的tc的某些实施方案中，使用包含至少一个翻译后修饰的至少一种非天然氨基酸(包括但不限于含有酮基官能团的非天然氨基酸)，其中至少一个翻译后修饰包含糖部分。在某些实施方案中，翻译后修饰是在真核细胞或非真核细胞中体内进行的。接头、聚合物、水溶性聚合物或其他分子可将分子连接至多肽。在另一个实施方案中，连接至tc的接头足够长以允许形成二聚体。所述分子也可以直接连接至多肽。
[0364]
在某些实施方案中，tc蛋白包括由一种宿主细胞在体内进行的至少一个翻译后修饰，其中翻译后修饰通常不由另一种宿主细胞类型进行。在某些实施方案中，蛋白质包括由真核细胞在体内进行的至少一个翻译后修饰，其中翻译后修饰通常不是由非真核细胞进行的。翻译后修饰的实例包括但不限于糖基化、乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸酯
加成、磷酸化、糖脂键联修饰等。
[0365]
在一些实施方案中，tc包含一种或多种非天然编码氨基酸，用于多肽的糖基化、乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸酯加成、磷酸化或糖脂键联修饰。在一些实施方案中，tc包含一种或多种非天然编码氨基酸用于多肽的糖基化。在一些实施方案中，tc包含一种或多种天然编码氨基酸，用于多肽的糖基化、乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸酯加成、磷酸化或糖脂键联修饰。在一些实施方案中，tc包含一种或多种天然编码氨基酸用于多肽的糖基化。
[0366]
在一些实施方案中，tc包含增强多肽糖基化的一个或多个非天然编码氨基酸添加和/或取代。在一些实施方案中，tc包含增强多肽糖基化的一个或多个缺失。在一些实施方案中，tc包含增强多肽中不同氨基酸处的糖基化的一个或多个非天然编码氨基酸添加和/或取代。在一些实施方案中，tc包含增强多肽中不同氨基酸处的糖基化的一个或多个缺失。在一些实施方案中，tc包含其增强多肽中非天然编码氨基酸处的糖基化的一个或多个非天然编码氨基酸添加和/或取代。在一些实施方案中，tc包含增强多肽中天然编码氨基酸的糖基化的一个或多个非天然编码氨基酸添加和/或取代。在一些实施方案中，tc包含增强多肽中不同氨基酸处的糖基化的一个或多个天然编码氨基酸添加和/或取代。在一些实施方案中，tc包含增强多肽中天然编码氨基酸的糖基化的一个或多个非天然编码氨基酸添加和/或取代。在一些实施方案中，tc包含其增强多肽中非天然编码氨基酸处的糖基化的一个或多个非天然编码氨基酸添加和/或取代。
[0367]
在一个实施方案中，翻译后修饰包括将寡糖(包括但不限于，其中寡糖包含(glcnac-man)
2-man-glcnac-glcnac等)通过glcnac-天冬酰胺键联连接至天冬酰胺。在另一个实施方案中，翻译后修饰包括将寡糖(包括但不限于gal-galnac、gal-glcnac等)通过galnac-丝氨酸、galnac-苏氨酸、glcnac-丝氨酸或glcnac-苏氨酸键联连接至丝氨酸或苏氨酸。在某些实施方案中，本发明的蛋白质或多肽可包含分泌或定位序列、表位标签、flag标签、多组氨酸标签、gst融合物等。分泌信号序列的实例包括但不限于原核分泌信号序列、真核分泌信号序列、针对细菌表达5'-优化的真核分泌信号序列、新型分泌信号序列、果胶酸酯裂解酶分泌信号序列、omp a分泌信号序列和噬菌体分泌信号序列。分泌信号序列的实例包括但不限于stii(原核生物)、fd giii和m13(噬菌体)、bg12(酵母)和源自转座子的信号序列bla。可修饰任何此类序列以提供多肽的所需结果，包括但不限于，用不同的信号序列取代一个信号序列，用不同的前导序列取代前导序列等。
[0368]
目标蛋白质或多肽可含有至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、或十种或更多种非天然氨基酸。非天然氨基酸可以相同或不同，例如在包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种不同的非天然氨基酸的蛋白质中可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个不同的位点。在某些实施方案中，天然存在型式的蛋白质中存在的至少一个但少于全部的特定氨基酸被非天然氨基酸取代。
[0369]
本发明提供了基于包含至少一种非天然编码氨基酸的tc的方法和组合物。将至少一种非天然编码氨基酸引入tc可以允许应用涉及特定化学反应，包括但不限于与一种或多种非天然编码氨基酸反应，而不与常见的20种氨基酸反应的缀合化学。在一些实施方案中，包含非天然编码氨基酸的tc通过非天然编码氨基酸的侧链连接至水溶性聚合物，诸如聚乙二醇(peg)或接头。本发明提供了一种用peg衍生物或tlr接头衍生物选择性修饰蛋白质的
高效方法，所述方法涉及选择性掺入非遗传编码的氨基酸，包括但不限于含有官能团或取代基的未在20种天然掺入的氨基酸中发现的那些氨基酸，包括但不限于酮、叠氮化物或乙炔部分，这些氨基酸响应于选择密码子而进入蛋白质并且随后用具有适当反应性的peg衍生物修饰这些氨基酸。一旦掺入，氨基酸侧链然后可通过利用本领域普通技术人员已知的适合于非天然编码氨基酸中存在的特定官能团或取代基的化学方法来修饰。各种各样的已知化学方法适用于本发明以将水溶性聚合物掺入蛋白质中。此类方法包括但不限于分别与包括但不限于乙炔或叠氮化物衍生物发生huisgen[3 2]环加成反应(参见例如padwa,a.,comprehensive organic synthesis,第4卷,(1991)编.trost,b.m.,pergamon,oxford,第1069-1109页；以及huisgen,r.,1,3-dipolar cycloaddition chemistry,(1984)编.padwa,a.,wiley,new york,第1-176页)。
[0370]
因为huisgen[3 2]环加成法涉及环加成而非亲核取代反应，所以可以极高的选择性修饰蛋白质。通过向反应混合物中添加催化量的cu(i)盐，可以在室温下在具有极佳区域选择性(1,4》1,5)的水性条件下进行反应。参见例如tornoe,等人,(2002)j.org.chem.67:3057-3064；和rostovtsev,等人,(2002)angew.chem.int.ed.41:2596-2599；以及wo 03/101972。可以通过[3 2]环加成添加至本发明的蛋白质中的分子实际上包括具有合适的官能团或取代基，包括但不限于叠氮基或乙炔衍生物的任何分子。可以将这些分子添加至具有乙炔基，分别包括但不限于对炔丙基氧基苯丙氨酸或叠氮基(包括但不限于对叠氮基苯丙氨酸)的非天然氨基酸。
[0371]
由huisgen[3 2]环加成产生的五元环在还原环境中通常是不可逆的，并且在水性环境中长时间抗水解是稳定的。因此，可以在苛刻的水性条件下用本发明的活性peg衍生物或tlr-接头衍生物修饰多种物质的物理和化学性质。更重要的是，由于叠氮化物和乙炔部分是彼此特异的(例如不与20种常见的基因编码氨基酸中的任一种发生反应)，因此可以在一个或多个特定位点以极高的选择性修饰蛋白质。
[0372]
本发明还提供了peg衍生物或tlr-接头衍生物的水溶性和水解稳定的衍生物以及具有一个或多个乙炔或叠氮化物部分的相关亲水聚合物。含有乙炔部分的peg聚合物衍生物对于与响应于选择密码子而选择性引入蛋白质中的叠氮化物部分偶联具有高度选择性。类似地，含有叠氮化物部分的peg聚合物衍生物对于与响应于选择密码子而选择性引入蛋白质中的乙炔部分偶联具有高度选择性。更具体地，叠氮化物部分包括但不限于烷基叠氮化物、芳基叠氮化物和这些叠氮化物的衍生物。烷基叠氮化物和芳基叠氮化物的衍生物可包括其他取代基，只要保持乙炔特异性反应性即可。乙炔部分包括烷基和芳基乙炔以及各自的衍生物。烷基和芳基乙炔的衍生物可包括其他取代基，只要保持叠氮化物特异性反应性即可。
[0373]
本发明提供了具有多种官能团、取代基或部分的物质与其他物质的缀合物，所述其他物质包括但不限于标签；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；放射性核素；细胞毒性化合物；药物；亲和标签；光亲和标签；活性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；dna；rna；反义多核苷酸；糖类；水溶性树枝状聚合物；环糊精；抑制性核糖核酸；生物材料；纳米颗粒；自旋标签；荧光团，含金属部分；放射性部分；新型官能团；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼部分；光化辐射可激发部分；光致异构部分；生物素；生物素的
衍生物；生物素类似物；掺入重原子的部分；化学可裂解基团；光可裂解基团；伸长的侧链；碳连接的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；嵌入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标签；小分子；量子点；纳米发射器；放射性核苷酸；放射性发射体；中子俘获剂；或上述的任何组合，或任何其他所需的化合物或物质。本发明还包括具有叠氮化物或乙炔部分的物质与具有对应的乙炔或叠氮化物部分的peg聚合物衍生物的缀合物。举例来说，含有叠氮化物部分的peg聚合物可以在含有带有乙炔官能团的非遗传编码氨基酸的蛋白质中的位置处与生物活性分子偶联。peg与生物活性分子偶联的键联包括但不限于huisgen[3 2]环加成产物。
[0374]
peg可用于修饰生物材料的表面，这在本领域已得到充分证实(参见例如美国专利6,610,281；mehvar,r,j.pharm sci.,3(1):125-136(2000)，所述文献以引用的方式并入本文)。本发明还包括生物材料，其包含具有一个或多个反应性叠氮化物或乙炔位点的表面和通过huisgen[3 2]环加成键偶联至所述表面的一种或多种本发明的含叠氮化物或含乙炔聚合物。生物材料和其他物质也可以通过除叠氮化物键联或乙炔键联之外的键联，诸如通过包含羧酸、胺、醇或硫醇部分的键联，与叠氮化物或乙炔活化的聚合物衍生物偶联，以留下叠氮化物或乙炔部分可用于后续反应。
[0375]
本发明包括一种合成本发明的含叠氮化物和含乙炔的聚合物的方法。在含叠氮化物的peg衍生物的情况下，叠氮化物可以直接键结至聚合物的碳原子上。可选地，含叠氮化物的peg衍生物可通过将在一个末端具有叠氮化物部分的连接剂连接至常规活化的聚合物上来制备，使得所得聚合物在其末端处具有叠氮化物部分。在含乙炔的peg衍生物的情况下，乙炔可以直接键结至聚合物的碳原子上。可选地，含乙炔的peg衍生物可通过将在一个末端具有乙炔部分的连接剂连接至常规活化的聚合物上来制备，使得所得聚合物在其末端处具有乙炔部分。
[0376]
更具体地，在含叠氮化物的peg衍生物的情况下，具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物经历反应以产生在其上更具反应性的部分，诸如甲磺酸酯、三氟乙基磺酸单甲氧基、甲苯磺酸酯或卤素离去基团的取代的聚合物。含有磺酰卤、卤素原子和其他离去基团的peg衍生物或tlr-接头衍生物的制备和使用是本领域普通技术人员已知的。所得取代的聚合物然后经历反应以取代聚合物末端处的叠氮化物部分的更具反应性部分。可选地，具有至少一个活性亲核或亲电部分的水溶性聚合物与在一个末端具有叠氮化物的连接剂发生反应，从而在peg聚合物与连接剂之间形成共价键，并且叠氮化物部分位于聚合物的末端。亲核和亲电部分，包括胺、硫醇、酰肼、肼、醇、羧酸酯、醛、酮、硫酯等，是普通技术人员已知的。
[0377]
更具体地，在含乙炔的peg衍生物的情况下，具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物经历反应以从含有乙炔部分的前体置换卤素或其他活化的离去基团。可选地，具有至少一个活性亲核或亲电部分的水溶性聚合物与在一个末端具有乙炔的连接剂发生反应，从而在peg聚合物与连接剂之间形成共价键，并且乙炔部分位于聚合物的末端。卤素部分、活化的离去基团、亲核和亲电部分在有机合成的背景下的使用以及peg衍生物或tlr-接头衍生物的制备和使用已为本领域的从业者所熟知。
[0378]
本发明还提供了选择性修饰蛋白质的方法，在修饰后的蛋白质中添加其他物质，
包括但不限于水溶性聚合物，诸如peg和peg衍生物或tlr-接头衍生物、接头或含有叠氮化物或乙炔部分的其他tc多肽。含叠氮化物和乙炔的peg衍生物或tlr-接头衍生物可用于修饰表面和分子的特性，其中生物相容性、稳定性、溶解度和缺乏免疫原性是重要的，同时提供了比本领域先前已知的更具选择性的将peg衍生物或tlr接头衍生物附着至蛋白质上的方法。
[0379]
用于本发明的一般重组核酸方法
[0380]
在本发明的许多实施方案中，编码目标tc的靶向多肽的核酸将被分离、克隆并且经常使用重组方法改变。此类实施方案用于，包括但不限于，用于蛋白质表达或在变体、衍生物、表达盒或衍生自tc的靶向多肽的其他序列的产生期间。在一些实施方案中，编码本发明多肽的序列可操作地连接至异源启动子。
[0381]
可以在亲代多肽的氨基酸序列的基础上合成编码包含非天然编码氨基酸的tc的靶向多肽的核苷酸序列，然后改变核苷酸序列以实现引入(即掺入或取代)或去除(即缺失或取代)相关氨基酸残基。可根据常规方法通过定点诱变方便地修饰核苷酸序列。可选地，可以通过化学合成，包括但不限于通过使用寡核苷酸合成仪制备核苷酸序列，其中寡核苷酸是基于所需多肽的氨基酸序列设计的，并且优选地选择在产生重组多肽的宿主细胞中有利的那些密码子。举例来说，可通过pcr、连接或连接链反应合成和组装编码所需多肽部分的若干种小寡核苷酸。参见例如barany,等人,proc.natl.acad.sci.88:189-193(1991)；美国专利6,521,427，所述文献以引用的方式并入本文。
[0382]
本发明利用了重组遗传学领域的常规技术。公开了在本发明中使用的一般方法的基础文章包括sambrook等人,molecular cloning,alaboratory manual(第3版2001)；kriegler,gene transfer and expression:a laboratory manual(1990)；以及current protocols in molecular biology(ausubel等人,编,1994)。
[0383]
本发明还涉及用于通过正交trna/rs对体内掺入非天然氨基酸的真核宿主细胞、非真核宿主细胞和生物。宿主细胞用本发明的多核苷酸或包括本发明的多核苷酸的构建体，包括但不限于本发明的载体(其可以是例如克隆载体或表达载体)进行遗传工程化(包括但不限于转化、转导或转染)。
[0384]
将靶核酸引入细胞中的几种众所周知的方法是可用的，所述方法中的任一种都可用于本发明。这些方法包括：接受者细胞与含有dna的细菌原生质体的融合、电穿孔、射弹轰击和病毒载体感染(下文进一步讨论)等。细菌细胞可用于扩增含有本发明的dna构建体的质粒的数量。细菌生长至对数生长期，并且细菌内的质粒可以通过本领域已知的多种方法分离(参见例如sambrook)。另外，用于从细菌中纯化质粒的试剂盒是可商购获得的(参见例如easyprep
tm
、flexiprep
tm
，均来自pharmacia biotech；strataclean
tm
，来自stratagene；以及qiaprep
tm
，来自qiagen)。然后进一步操纵分离和纯化的质粒以产生其他质粒，用于转染细胞或掺入相关载体以感染生物。典型的载体含有可用于调控特定靶核酸的表达的转录和翻译终止子、转录和翻译启动序列以及启动子。载体任选地包含通用表达盒，其含有至少一个独立的终止子序列、允许盒在真核生物或原核生物或两者中复制的序列(包括但不限于穿梭载体)以及用于原核和真核系统的选择标志物。载体适合于在原核生物、真核生物或两者中复制和整合。参见gillam&smith,gene 8:81(1979)；roberts等人,nature,328:731(1987)；schneider,e.,等人,protein expr.purif.6(1):10-14(1995)；ausubel,
sambrook,berger(所有同上)。可用于克隆的细菌和噬菌体目录由例如atcc提供，例如细菌和噬菌体(1992)gherna等人(编)的由atcc出版的atcc目录。用于测序、克隆和分子生物学其他方面的其他基本程序以及基本的理论考虑也在watson等人(1992)recombinant dna second edition scientific american books,ny中找到。另外，大致上任何核酸(以及几乎任何标记的核酸，无论是标准的还是非标准的)都可以定制或从各种商业来源订购标准，诸如midland certified reagent company(midland,tx，可在万维网上访问mcrc.com)、the great american gene company(ramona,ca，可在万维网上访问genco.com)、expressgen inc.(chicago,il，可在万维网上访问expressgen.com)、operon technologies inc.(alameda,ca)和许多其他公司。
[0385]
选择密码子
[0386]
本发明的选择密码子扩增了蛋白质生物合成机制的遗传密码子框架。举例来说，选择密码子包括但不限于独特的三碱基密码子、无义密码子(诸如终止密码子，包括但不限于琥珀密码子(uag)、赭石密码子或乳白密码子(uga))、非自然密码子、四碱基或更多碱基密码子、稀有密码子等。对于本领域的普通技术人员来说显而易见的是，可以在编码tc的至少一部分的单个多核苷酸中引入所需基因或多核苷酸的选择密码子的数量范围很广，包括但不限于一个或多个、两个或更多个、三个或更多、4、5、6、7、8、9、10个或更多个。
[0387]
在一个实施方案中，所述方法涉及使用选择密码子，所述选择密码子是用于在体内掺入一种或多种非天然氨基酸的终止密码子。举例来说，产生识别终止密码子，包括但不限于uag的o-trna，并通过具有所需非天然氨基酸的o-rs氨酰化。这种o-trna不被天然宿主的氨酰基-trna合成酶识别。常规的定点诱变可用于在目标多肽的目标位点处引入终止密码子，包括但不限于tag。参见例如sayers,j.r.,等人(1988),5
’‑3’
exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis.nucleic acids res,16:791-802。当o-rs、o-trna和编码目标多肽的核酸在体内结合时，非天然氨基酸响应于uag密码子被掺入以在指定位置处产生含有非天然氨基酸的多肽。
[0388]
可以在不显著扰动真核宿主细胞的情况下在体内掺入非天然氨基酸。举例来说，因为uag密码子的抑制效率取决于o-trna(包括但不限于琥珀抑制子trna)与真核释放因子(包括但不限于erf)(其与终止密码子结合并启动生长肽从核糖体中的释放)之间的竞争，抑制效率可以通过(包括但不限于)增加o-trna和/或抑制子trna的表达水平来调节。
[0389]
非天然氨基酸也可以用稀有密码子编码。举例来说，当体外蛋白质合成反应中的精氨酸浓度降低时，稀有精氨酸密码子agg已被证明可有效地通过丙氨酸酰化的合成trna插入ala。参见例如ma等人,biochemistry,32:7939(1993)。在这种情况下，合成trna与天然存在的trnaarg竞争，trnaarg大肠埃希氏菌中作为次要物种存在。有些生物不使用所有的三联体密码子。藤黄微球菌(micrococcus luteus)中未分配的密码子aga已用于在体外转录/翻译提取物中插入氨基酸。参见例如kowal和oliver,nucl.acid.res.,25:4685(1997)。可以生成本发明的组分以在体内使用这些稀有密码子。
[0390]
选择密码子还包含扩展密码子，包括但不限于四或更多碱基密码子，诸如四、五、六或更多碱基密码子。四碱基密码子的实例包括但不限于agga、cuag、uaga、cccu等。五碱基密码子的实例包括但不限于aggac、ccccu、cccuc、cuaga、cuacu、uaggc等。本发明的一个特点包括使用基于移码抑制的扩展密码子。四或更多碱基密码子可以将包括但不限于一种或
多种非天然氨基酸插入同一蛋白质中。举例来说，在突变的o-trna存在的情况下，包括但不限于具有反密码子环(例如具有至少8-10nt反密码子环)的特殊移码抑制trna，四或更多碱基密码子被读作单一氨基酸。在其他实施方案中，反密码子环可以解码，包括但不限于至少一个四碱基密码子、至少一个五碱基密码子或至少一个六碱基密码子或更多碱基密码子。由于存在256个可能的四碱基密码子，可以使用四碱基或更多碱基密码子在同一细胞中编码多种非天然氨基酸。参见anderson等人,(2002)exploring the limits of codon and anticodon size,chemistry and biology,9:237-244；magliery,(2001)expanding the genetic code:selection of efficient suppressors of four-base codons and identification of“shifty”four-base codons with a library approach in escherichia coli,j.mol.biol.307:755-769。
[0391]
举例来说，四碱基密码子已被用于使用体外生物合成方法将非天然氨基酸掺入蛋白质中。参见例如ma等人,(1993)biochemistry,32:7939；和hohsaka等人,(1999)j.am.chem.soc.,121:34。cggg和aggu用于在体外同时将2-萘基丙氨酸和赖氨酸的nbd衍生物与两个化学酰化移码抑制子trna掺入链霉抗生物素蛋白中。参见例如hohsaka等人,(1999)j.am.chem.soc.,121:12194。在一项体内研究中，moore等人检查了具有ncua反密码子的trnaleu衍生物遏制uagn密码子(n可以是u、a、g或c)的能力，并且发现四联体uaga可以被具有ucua反密码子的trnaleu以13％至26％的效率解码，前在在0或-1框中几乎没有解码。参见moore等人,(2000)j.mol.biol.,298:195。在一个实施方案中，本发明可以使用基于稀有密码子或无义密码子的扩展密码子，这可以减少其他非所要位点的错义连读和移码遏制。
[0392]
对于给定的系统，选择密码子还可以包括天然三碱基密码子中的一个，其中内源系统不使用(或很少使用)天然碱基密码子。举例来说，这包括缺少识别天然三碱基密码子的trna的系统，和/或三碱基密码子是稀有密码子的系统。
[0393]
选择密码子任选地包括非天然碱基对。这些非天然碱基对进一步扩展了现有的遗传字母表。一个额外的碱基对将三联体密码子的数量从64个增加至125个。第三个碱基对的特性包括稳定的选择性碱基配对、通过聚合酶以高保真度有效地酶促掺入dna，以及在合成新生非天然碱基对后有效的持续引物延伸。可适用于方法和组合物的非天然碱基对的描述包括例如hirao等人,(2002)an unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein,nature biotechnology,20:177-182。也参见wu,y.等人,(2002)j.am.chem.soc.124:14626-14630。其他相关出版物如下所列。
[0394]
对于体内使用，非天然核苷是膜可渗透的并且被磷酸化以形成对应的三磷酸。另外，增加的遗传信息是稳定的，并且不会被细胞酶破坏。benner和其他人的先前努力利用了不同于典型watson-crick对的氢键结模式，其中最值得注意的实例是iso-c:iso-g对。参见例如switzer等人,(1989)j.am.chem.soc.,111:8322；和piccirilli等人,(1990)nature,343:33；kool,(2000)curr.opin.chem.biol.,4:602。这些碱基通常在某种程度上与天然碱基错配并且不能被酶促复制。kool和其同事证明，碱基之间的疏水堆积相互作用可以替代氢键结以驱动碱基对的形成。参见kool,(2000)curr.opin.chem.biol.,4:602；以及guckian和kool,(1998)angew.chem.int.ed.engl.,36,2825。为了开发满足上述所有要求的非天然碱基对，schultz、romesberg和其同事系统地合成并研究了一系列非天然疏水碱
基。发现pics:pics自我对比天然碱基对更稳定，并且可以通过大肠埃希氏菌dna聚合酶i(kf)的klenow片段有效地掺入dna。参见例如mcminn等人,(1999)j.am.chem.soc.,121:11585-6；以及ogawa等人,(2000)j.am.chem.soc.,122:3274。可以通过kf以足以满足生物功能的效率和选择性合成3mn:3mn自我对。参见例如ogawa等人,(2000)j.am.chem.soc.,122:8803。然而，这两个碱基都充当链终止子以进行进一步复制。最近演化出一种突变的dna聚合酶，其可用于复制pics自我对。另外，可以复制7ai自我对。参见例如tae等人,(2001)j.am.chem.soc.,123:7439。还开发了一种新型金属碱基对dipic:py，其在结合cu(ii)时形成稳定的对。参见meggers等人,(2000)j.am.chem.soc.,122:10714。因为扩展密码子和非天然密码子与天然密码子本质上是正交的，所以本发明的方法可以利用所述特性为它们生成正交trna。
[0395]
翻译旁路系统也可用于将非天然氨基酸掺入所需多肽中。在翻译旁路系统中，一个大序列被掺入一个基因中，但不被翻译成蛋白质。序列含有可充当诱导核糖体跳过序列并恢复插入下游翻译的提示的结构。
[0396]
编码目标蛋白质，诸如tc的靶向多肽的核酸分子可容易地突变以在多肽的任何所需位置引入半胱氨酸。半胱氨酸广泛用于将反应性分子、水溶性聚合物、蛋白质或多种其他分子引入目标蛋白质。适用于将半胱氨酸掺入多肽的所需位置的方法是本领域普通技术人员已知的，诸如美国专利号6,608,183(所述专利以引用的方式并入本文)中所描述的那些方法以及标准诱变技术。
[0397]
iii.非天然编码氨基酸
[0398]
非常广泛的非天然编码氨基酸适用于本发明。可以将任何数量的非天然编码氨基酸引入tc。一般而言，引入的非天然编码氨基酸对20种常见的基因编码氨基酸(即丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)基本上是化学惰性的。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸包括侧链官能团，其与20种常见氨基酸中未发现的官能团(包括但不限于叠氮基、酮基、醛基和氨氧基)有效并选择性地反应以形成稳定的缀合物。举例来说，包括含有叠氮基官能团的非天然编码氨基酸的tc的靶向多肽可以与聚合物(包括但不限于聚(乙二醇)或可选地，第二多肽或含有炔烃部分的接头)反应以形成稳定的缀合物，这是由于叠氮化物与炔烃官能团的选择性反应形成huisgen[3 2]环加成产物。
[0399]
α-氨基酸的一般结构如下所示(式i)：
[0400][0401]
非天然编码的氨基酸通常是具有上式的任何结构，其中r基团是二十种天然氨基酸中使用的取代基之外的任何取代基，并且可适用于本发明。因为本发明的非天然编码氨基酸通常仅在侧链结构上不同于天然氨基酸，所以非天然编码氨基酸与其他氨基酸(包括但不限于天然或非天然编码的)以与它们在天然存在的多肽中形成的方式相同的方式形成酰胺键。然而，非天然编码氨基酸具有将它们与天然氨基酸区分开来的侧链基团。举例来
说，r任选地包括烷基-、芳基-、酰基-、酮基-、叠氮基-、羟基-、肼、氰基-、卤基-、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醇、硒基-、磺酰基-、硼酸、硼酸酯、二氧磷基、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺、氨基等或其任何组合。可适用于本发明的其他非天然存在的目标氨基酸包括但不限于包含光活化交联剂的氨基酸、自旋标记的氨基酸、荧光氨基酸、金属结合氨基酸、含金属氨基酸、放射性氨基酸、具有新型官能团的氨基酸、与其他分子共价或非共价相互作用的氨基酸、光笼和/或光致异构氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化氨基酸(诸如糖取代的丝氨酸)、其他碳水化合物修饰的氨基酸、含酮基氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、化学可裂解和/或光可裂解氨基酸、与天然氨基酸相比具有延长侧链的氨基酸(包括但不限于聚醚或长链碳氢化合物，包括但不限于大于约5个或大于约10个碳)、碳连接的含糖氨基酸、氧化还原活性氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸以及包含一个或多个毒性部分的氨基酸。
[0402]
可适用于本发明并且可用于与水溶性聚合物反应的示例性非天然编码氨基酸包括但不限于具有羰基、氨氧基、肼、酰肼、氨基脲、叠氮化物和炔烃反应基的那些氨基酸。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸包含糖部分。此类氨基酸的实例包括n-乙酰基-l-葡糖胺基-l-丝氨酸、n-乙酰基-l-氨基半乳糖基-l-丝氨酸、n-乙酰基-l-葡糖胺基-l-苏氨酸、n-乙酰基-l-葡糖胺基-l-天冬酰胺和o-甘露糖胺基-l-丝氨酸。此类氨基酸的实例还包括氨基酸与糖之间天然存在的n-键联或o-键联被自然界中不常见的共价键(包括但不限于烯烃、肟、硫醚、酰胺等)替代的实例。此类氨基酸的实例还包括在天然存在的蛋白质中不常见的糖类，诸如2-脱氧-葡萄糖、2-脱氧半乳糖等。
[0403]
本文提供的许多非天然编码氨基酸是可商购获得的，例如从sigma-aldrich(st.louis,mo,usa)、novabiochem(a division of emd biosciences,darmstadt,germany)或peptech(burlington,ma,usa)商购获得。不可商购获得的那些氨基酸任选地如本文所提供的或使用本领域普通技术人员已知的标准方法合成。对于有机合成技术，参见例如fessendon和fessendon的organic chemistry,(1982,第二版,willard grant press,boston mass.)；march的advanced organic chemistry(第三版,1985,wiley and sons,new york)；以及carey和sundberg的advanced organic chemistry(第三版,部分a和部分b,1990,plenum press,new york)。还参见美国专利号7,045,337和7,083,970，所述专利以引用的方式并入本文。除了含有新侧链的非天然氨基酸外，可适用于本发明的非天然氨基酸还任选地包含修饰的主链结构，包括但不限于如式ii和式iii的结构所示：
[0404][0405]
其中z通常包含oh、nh2、sh、nh-r'或s-r'；可以相同或不同的x和y通常包含s或o，并且任选地相同或不同的r和r'通常选自与上述具有式i的非天然氨基酸以及氢的r基团相同的成分列表。举例来说，本发明的非天然氨基酸任选地包含如式ii和式iii所示的氨基或羧基中的取代。这种类型的非天然氨基酸包括但不限于α-羟基酸、α-硫代酸、α-氨基硫代羧酸酯，包括但不限于具有对应于常见的二十种天然氨基酸或非天然侧链的侧链。另外，α-碳
上的取代任选地包括但不限于l、d或α-α-二取代的氨基酸，诸如d-谷氨酸、d-丙氨酸、d-甲基-o-酪氨酸、氨基丁酸等。其他结构替代物包括环状氨基酸，诸如脯氨酸类似物以及3、4、6、7、8和9元环脯氨酸类似物，β和γ氨基酸，诸如取代的β-丙氨酸和γ-氨基丁酸。
[0406]
许多非天然氨基酸是基于天然氨基酸，诸如酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等，并且适用于本发明。酪氨酸类似物包括但不限于对位取代的酪氨酸、邻位取代的酪氨酸和间位取代的酪氨酸，其中取代的酪氨酸包含但不限于酮基(包括但不限于乙酰基)、苯甲酰基、氨基、肼、羟胺、硫醇基、羧基、异丙基、甲基、c
6-c
20
直链或支链烃、饱和或不饱和烃、o-甲基、聚醚基、硝基、炔基等。另外，还考虑了多取代的芳基环。适用于本发明的谷氨酰胺类似物包括但不限于α-羟基衍生物、γ-取代的衍生物、环状衍生物和酰胺取代的谷氨酰胺衍生物。可适用于本发明的示例性苯丙氨酸类似物包括但不限于对位取代的苯丙氨酸、邻位取代的苯丙氨酸和间位取代的苯丙氨酸，其中取代基包含但不限于羟基、甲氧基、甲基、烯丙基、醛基、叠氮基、碘基、溴基、酮基(包括但不限于乙酰基)、苯甲酰基、炔基等。可适用于本发明的非天然氨基酸的具体实例包括但不限于对乙酰基-l-苯丙氨酸、o-甲基-l-酪氨酸、l-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、o-4-烯丙基-l-酪氨酸、4-丙基-l-酪氨酸、三-o-乙酰基-glcnacβ-丝氨酸、l-dopa、氟化苯丙氨酸、异丙基-l-苯丙氨酸、对叠氮基-l-苯丙氨酸、对酰基-l-苯丙氨酸、对苯甲酰基-l-苯丙氨酸、l-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-l-苯丙氨酸、异丙基-l-苯丙氨酸和对炔丙氧基-苯丙氨酸等。可适用于本发明的多种非天然氨基酸的结构的实例在例如标题为“in vivo incorporation of unnatural amino acids”的wo 2002/085923中提供。对于额外甲硫氨酸类似物也参见kiick等人,(2002)incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the staudinger ligation,pnas 99:19-24，所述文献以引用的方式并入本文。标题为“compositions containing,methods involving,and uses of non-natural amino acids and polypeptides”的国际申请号pct/us06/47822(其以引用的方式并入本文)描述了芳香族胺部分(包括但不限于对氨基-苯丙氨酸)的还原烷化和还原胺化。
[0407]
在本发明的另一个实施方案中，具有一种或多种非天然编码氨基酸的tc多肽被共价修饰。与生物系统的多种功能正交的选择性化学反应被认为是化学生物学中的重要工具。作为合成化学领域的相对新成员，这些生物正交反应激发了化合物文库合成、蛋白质工程化、功能蛋白质组学和细胞表面化学重塑的新策略。叠氮化物作为一种独特的生物缀合化学处理剂发挥了重要作用。staudinger连接已与膦一起用于标记代谢引入细胞糖缀合物的叠氮糖。staudinger连接可以在活体动物体内进行，而不会造成生理伤害；然而，staudinger反应并非没有责任。必需的膦易受空气氧化的影响，并且已证明它们在提高水溶性和提高反应速率方面的优化具有综合挑战性。
[0408]
叠氮化物基团具有另一种生物正交反应模式：huisgen描述的与炔烃的[3 2]环加成反应。在其经典形式中，由于合理的反应速率需要升高的温度(或压力)，所述反应在生物系统中的适用性有限。sharpless和同事克服了这一障碍，开发了一种铜(i)催化版本，称为“点击化学”，它可以在生理温度和功能丰富的生物环境中容易地进行。这一发现使从复杂组织裂解物中选择性修饰病毒颗粒、核酸和蛋白质成为可能。不幸的是，强制性铜催化剂对细菌和哺乳动物细胞具有毒性，因此排除了细胞必须保持活力的应用。据报告，在环境温度
下会发生由吸电子取代基活化的炔烃的无催化剂huisgen环加成反应。然而，这些化合物会与生物亲核试剂发生michael反应。
[0409]
在一个实施方案中，提供了包括非天然氨基酸(诸如对-(炔丙基氧基)-苯丙氨酸)的tc的靶向多肽的组合物。还提供了包含对-(炔丙基氧基)-苯丙氨酸和包括但不限于蛋白质和/或细胞的各种组合物。在一方面，包含对-(炔丙基氧基)-苯丙氨酸非天然氨基酸的组合物还包含正交trna。非天然氨基酸可以与正交trna键结(包括但不限于共价键结)，包括但不限于通过氨基-酰基键与正交trna共价键结、与正交trna的末端核糖糖的3'oh或2'oh共价键结等。
[0410]
通过可以掺入蛋白质中的非天然氨基酸的化学部分提供了蛋白质的多种优点和操作。举例来说，酮基官能团的独特反应性允许在体外和体内用许多含肼或含羟胺的试剂中的任一种选择性修饰蛋白质。举例来说，重原子非天然氨基酸可用于定相x射线结构数据。使用非天然氨基酸的位点特异性引入重原子也提供了选择重原子位置的选择性和灵活性。举例来说，光反应性非天然氨基酸(包括但不限于具有二苯甲酮和芳基叠氮化物(包括但不限于苯基叠氮化物)侧链的氨基酸)允许蛋白质在体内和体外进行有效的光交联。光反应性非天然氨基酸的实例包括但不限于对-叠氮基-苯丙氨酸和对-苯甲酰基-苯丙氨酸。然后可以通过激发提供时间控制的光反应性基团，随意交联具有光反应性非天然氨基酸的蛋白质。在一个实例中，非天然氨基的甲基可以被同位素标记的包括但不限于甲基取代，作为局部结构和动力学的探针，包括但不限于使用核磁共振和振动光谱。举例来说，炔基或叠氮基官能团允许通过[3 2]环加成反应用分子选择性修饰蛋白质。
[0411]
在氨基末端掺入多肽中的非天然氨基酸可以由r基团和通常存在于α-氨基酸中的不同于nh2基团的第2反应基构成，r基团是除二十种天然氨基酸中使用的取代基之外的任何取代基。类似的非天然氨基酸可以在c端结合有不同于通常存在于α-氨基酸中的cooh基团的第2反应基。
[0412]
可选择或设计本发明的非天然氨基酸以提供在二十种天然氨基酸中不可用的额外特征。举例而言，可任选地设计或选择非天然氨基酸以修饰例如将其掺入其中的蛋白质的生物学特性。举例而言，可以通过将非天然氨基酸包括到蛋白质中来任选地修饰以下特性：毒性、生物分布、溶解度、稳定性(例如热、水解、氧化、对酶促降解的抗性等)、容易纯化和加工、结构特性、光谱特性、化学和/或光化学特性、催化活性、氧化还原电位、半衰期、与其他分子反应(例如共价或非共价)的能力等。
[0413]
在一些实施方案中，本发明提供了通过肟键与水溶性聚合物，例如peg连接的tc。许多类型的非天然编码氨基酸都适合形成肟键。这些非天然编码氨基酸包括但不限于含有羰基、二羰基或羟胺基团的非天然编码氨基酸。此类氨基酸在美国专利公开号2006/0194256、2006/0217532和2006/0217289以及标题为“compositions containing,methods involving,and uses of non-natural amino acids and polypeptides”的wo 2006/069246中描述，所述文献均以引用的方式整体并入本文。非天然编码氨基酸也在美国专利号7,083,970和美国专利号7,045,337中描述，所述专利均以引用的方式整体并入本文。
[0414]
本发明的一些实施方案利用在一个或多个位置处被对乙酰基苯丙氨酸氨基酸取代的tc多肽。对乙酰基-( /-)-苯丙氨酸和间乙酰基-( /-)-苯丙氨酸的合成在zhang,z.等人,biochemistry 42:6735-6746(2003)中描述，所述文献以引用的方式并入。其他含羰基
或二羰基的氨基酸可由本领域普通技术人员类似地制备。此外，本文中包括的非天然氨基酸的非限制性示例性合成在美国专利号7,083,970中有所介绍，所述专利以引用的方式整体并入本文。
[0415]
具有亲电反应基的氨基酸允许进行多种反应以通过亲核加成反应等连接分子。此类亲电反应基包括羰基(包括酮基和二羰基)、类羰基(其具有与羰基(包括酮基和二羰基)类似的反应性且结构类似于羰基)、掩蔽的羰基(其可以容易地转化为羰基(包括酮基和二羰基))或受保护的羰基(其在脱保护时具有与羰基(包括酮基和二羰基)类似的反应性)。此类氨基酸包括具有式(iv)结构的氨基酸：
[0416][0417]
其中：
[0418]
a是任选的，并且当存在时，是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；
[0419]
b是任选的，并且当存在时，是选自由以下组成的组的接头：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-o-、-o-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-s-、-s-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-s(o)
k-(其中k是1、2或3)、-s(o)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-c(o)-、-c(o)-(亚烷基或取代亚烷基)-、-c(s)-、-c(s)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-n(r’)-、-nr
’‑
(亚烷基或取代的亚烷基)-、-c(o)n(r’)-、-con(r’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-csn(r’)-、-csn(r’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-n(r’)co-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-n(r’)c(o)o-、-s(o)kn(r’)-、-n(r’)c(o)n(r’)-、-n(r’)c(s)n(r’)-、-n(r’)s(o)kn(r’)-、-n(r’)-n＝、-c(r’)＝n-、-c(r’)＝n-n(r’)-、-c(r’)＝n-n＝、-c(r’)
2-n＝n-和-c(r’)
2-n(r’)-n(r’)-，其中每个r'独立地为h、烷基或取代的烷基；
[0420]
j是j是
[0421]
r是h、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
[0422]
每个r”独立地为h、烷基、取代的烷基或保护基，或当存在一个以上的r”基团时，两个r”任选地形成杂环烷基；
[0423]
r1是任选的，并且当存在时，是h、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
[0424]
r2是任选的，并且当存在时，是oh、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
[0425]
r3和r4各自独立地为h、卤素、低级烷基或取代的低级烷基，或r3和r4或两个r3基团任选地形成环烷基或杂环烷基；
[0426]
或-a-b-j-r基团一起形成双环或三环环烷基或杂环烷基，其包含至少一个羰基(包括二羰基)、受保护的羰基(包括受保护的二羰基)或掩蔽的羰基(包括掩蔽的二羰基)；
[0427]
或-j-r基团一起形成单环或双环环烷基或杂环烷基，其包含至少一个羰基(包括二羰基)、受保护的羰基(包括受保护的二羰基)或掩蔽的羰基(包括掩蔽的二羰基)；
[0428]
条件是当a是亚苯基并且每个r3是h时，b存在；并且当a是-(ch2)4‑‑
并且每个r3是h时，b不是-nhc(o)(ch2ch2)-；并且当a和b不存在并且每个r3是h时，r不是甲基。
[0429]
另外，包括具有式(v)结构的氨基酸：
[0430][0431]
其中：
[0432]
a是任选的，并且当存在时，是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；
[0433]
b是任选的，并且当存在时，是选自由以下组成的组的接头：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-o-、-o-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-s-、-s-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-s(o)
k-(其中k是1、2或3)、-s(o)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-c(o)-、-c(o)-(亚烷基或取代亚烷基)-、-c(s)-、-c(s)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-n(r’)-、-nr
’‑
(亚烷基或取代的亚烷基)-、-c(o)n(r’)-、-con(r’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-csn(r’)-、-csn(r’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-n(r’)co-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-n(r’)c(o)o-、-s(o)kn(r’)-、-n(r’)c(o)n(r’)-、-n(r’)c(s)n(r’)-、-n(r’)s(o)kn(r’)-、-n(r’)-n＝、-c(r’)＝n-、-c(r’)＝n-n(r’)-、-c(r’)＝n-n＝、-c(r’)
2-n＝n-和-c(r’)
2-n(r’)-n(r’)-，其中每个r'独立地为h、烷基或取代的烷基；
[0434]
r是h、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
[0435]
r1是任选的，并且当存在时，是h、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
[0436]
r2是任选的，并且当存在时，是oh、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
[0437]
条件是当a是亚苯基时，b存在；并且当a是-(ch2)
4-时，b不是-nhc(o)(ch2ch2)-；并且当a和b不存在时，r不是甲基。
[0438]
另外，包括具有式(vi)结构的氨基酸：
[0439][0440]
其中：
[0441]
b是选自由以下组成的组的接头：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-o-、-o-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-s-、-s-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-s(o)
k-(其中k是1、2或3)、-s(o)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-c(o)-、-c(o)-(亚烷基或取代亚烷基)-、-c(s)-、-c(s)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-n(r’)-、-nr
’‑
(亚烷基或取代的亚烷基)-、-c(o)n(r’)-、-con(r’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-csn(r’)-、-csn(r’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-n(r’)co-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-n(r’)c(o)o-、-s(o)kn(r’)-、-n(r’)c(o)n(r’)-、-n(r’)c(s)n(r’)-、-n(r’)s(o)kn(r’)-、-n(r’)-n＝、-c(r’)＝n-、-c(r’)＝n-n(r’)-、-c(r’)＝n-n＝、-c(r’)
2-n＝n-和-c(r’)
2-n(r’)-n(r’)-，其中每个r'独立地为h、烷基或取代的烷基；
[0442]
r是h、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
[0443]
r1是任选的，并且当存在时，是h、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
[0444]
r2是任选的，并且当存在时，是oh、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
[0445]
每个ra独立地选自由以下组成的组：h、卤素、烷基、取代的烷基、-n(r’)2、-c(o)kr’(其中k是1、2或3)、-c(o)n(r’)2、-or’和-s(o)kr’，其中每个r'独立地为h、烷基或取代的烷基。
[0446]
另外，包括以下氨基酸：
[0447][0447]
其中此类化合物任选地为氨基保护基、羧基保护基或其盐。另外，可将以下非天然氨基酸中的任一种掺入非天然氨基酸多肽中。
[0448]
另外，包括具有式(vii)结构的以下氨基酸：
[0449][0450]
其中
[0451]
b是任选的，并且当存在时，是选自由以下组成的组的接头：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-o-、-o-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-s-、-s-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-s(o)
k-(其中k是1、2或3)、-s(o)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-c(o)-、-c(o)-(亚烷基或取代亚烷基)-、-c(s)-、-c(s)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-n(r’)-、-nr
’‑
(亚烷基或取代的亚烷基)-、-c(o)n(r’)-、-con(r’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-csn(r’)-、-csn(r’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-n(r’)co-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-n(r’)c(o)o-、-s(o)kn(r’)-、-n(r’)c(o)n(r’)-、-n(r’)c(s)n(r’)-、-n(r’)s(o)kn(r’)-、-n(r’)-n＝、-c(r’)＝n-、-c(r’)＝n-n(r’)-、-c(r’)＝n-n＝、-c(r’)
2-n＝n-和-c(r’)
2-n(r’)-n(r’)-，其中每个r'独立地为h、烷基或取代的烷基；
[0452]
r是h、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
[0453]
r1是任选的，并且当存在时，是h、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
[0454]
r2是任选的，并且当存在时，是oh、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
[0455]
每个ra独立地选自由以下组成的组：h、卤素、烷基、取代的烷基、-n(r’)2、-c(o)kr’(其中k是1、2或3)、-c(o)n(r’)2、-or’和-s(o)kr’，其中每个r'独立地为h、烷基或取代的烷基；并且n是0至8，
[0456]
条件是当a是-(ch2)
4-时，b不是-nhc(o)(ch2ch2)-。
[0457]
另外，包括以下氨基酸：
[0458]
其中此类化合物任选地是氨基保护基、任选地是羧基保护基、任选地是氨基保护基和羧基保护基，或其盐。另外，可将这些非天然氨基酸和以下非天然氨基酸中的任一种掺入非天然氨基酸多肽中。
[0459]
另外，包括具有式(viii)结构的以下氨基酸：
[0460][0461]
其中a是任选的，并且当存在时，是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；
[0462]
b是任选的，并且当存在时，是选自由以下组成的组的接头：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-o-、-o-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-s-、-s-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-s(o)
k-(其中k是1、2或3)、-s(o)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-c(o)-、-c(o)-(亚烷基或取代亚烷基)-、-c(s)-、-c(s)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-n(r’)-、-nr
’‑
(亚烷基或取代的亚烷基)-、-c(o)n(r’)-、-con(r’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-csn(r’)-、-csn(r’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-n(r’)co-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-n(r’)c(o)o-、-s(o)kn(r’)-、-n(r’)c(o)n(r’)-、-n(r’)c(s)n(r’)-、-n(r’)s(o)kn(r’)-、-n(r’)-n＝、-c(r’)＝n-、-c(r’)＝n-n(r’)-、-c(r’)＝n-n＝、-c(r’)
2-n＝n-和-c(r’)
2-n(r’)-n(r’)-，其中每个r'独立地为h、烷基或取代的烷基；
[0463]
r1是任选的，并且当存在时，是h、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
[0464]
r2是任选的，并且当存在时，是oh、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸。
[0465]
另外，包括具有式(ix)结构的以下氨基酸：
[0466][0467]
b是任选的，并且当存在时，是选自由以下组成的组的接头：低级亚烷基、取代的低
级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-o-、-o-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-s-、-s-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-s(o)
k-(其中k是1、2或3)、-s(o)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-c(o)-、-c(o)-(亚烷基或取代亚烷基)-、-c(s)-、-c(s)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-n(r’)-、-nr
’‑
(亚烷基或取代的亚烷基)-、-c(o)n(r’)-、-con(r’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-csn(r’)-、-csn(r’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-n(r’)co-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-n(r’)c(o)o-、-s(o)kn(r’)-、-n(r’)c(o)n(r’)-、-n(r’)c(s)n(r’)-、-n(r’)s(o)kn(r’)-、-n(r’)-n＝、-c(r’)＝n-、-c(r’)＝n-n(r’)-、-c(r’)＝n-n＝、-c(r’)
2-n＝n-和-c(r’)
2-n(r’)-n(r’)-，其中每个r'独立地为h、烷基或取代的烷基；
[0468]
r是h、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
[0469]
r1是任选的，并且当存在时，是h、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
[0470]
r2是任选的，并且当存在时，是oh、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
[0471]
其中每个ra独立地选自由以下组成的组：h、卤素、烷基、取代的烷基、-n(r’)2、-c(o)kr’(其中k是1、2或3)、-c(o)n(r’)2、-or’和-s(o)kr’，其中每个r'独立地为h、烷基或取代的烷基。
[0472]
另外，包括以下氨基酸：
[0473][0473]
其中此类化合物任选地是氨基保护基、任选地是羧基保护基、任选地是氨基保护基和羧基保护基，或其盐。另外，可将这些非天然氨基酸和以下非天然氨基酸中的任一种掺入非天然氨基酸多肽中。
[0474]
另外，包括具有式(x)结构的以下氨基酸：
[0475][0476]
其中b是任选的，并且当存在时，是选自由以下组成的组的接头：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-o-、-o-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-s-、-s-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-s(o)
k-(其中k是1、2或3)、-s(o)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-c(o)-、-c(o)-(亚烷基或取代亚烷基)-、-c(s)-、-c(s)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-n(r’)-、-nr
’‑
(亚烷基或取代的亚烷基)-、-c(o)
n(r’)-、-con(r’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-csn(r’)-、-csn(r’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-n(r’)co-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-n(r’)c(o)o-、-s(o)kn(r’)-、-n(r’)c(o)n(r’)-、-n(r’)c(s)n(r’)-、-n(r’)s(o)kn(r’)-、-n(r’)-n＝、-c(r’)＝n-、-c(r’)＝n-n(r’)-、-c(r’)＝n-n＝、-c(r’)
2-n＝n-和-c(r’)
2-n(r’)-n(r’)-，其中每个r'独立地为h、烷基或取代的烷基；
[0477]
r是h、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
[0478]
r1是任选的，并且当存在时，是h、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
[0479]
r2是任选的，并且当存在时，是oh、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
[0480]
每个ra独立地选自由以下组成的组：h、卤素、烷基、取代的烷基、-n(r’)2、-c(o)kr’(其中k是1、2或3)、-c(o)n(r’)2、-or’和-s(o)kr’，其中每个r'独立地为h、烷基或取代的烷基；并且n是0至8。
[0481]
另外，包括以下氨基酸：
[0482][0482]
其中此类化合物任选地是氨基保护基、任选地是羧基保护基、任选地是氨基保护基和羧基保护基，或其盐。另外，可将这些非天然氨基酸和以下非天然氨基酸中的任一种掺入非天然氨基酸多肽中。
[0483]
除单羰基结构外，本文所描述的非天然氨基酸可包括诸如二羰基、类二羰基、掩蔽的二羰基和受保护的二羰基的基团。
[0484]
举例来说，包括具有式(xi)结构的以下氨基酸：
[0485][0486]
其中a是任选的，并且当存在时，是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；
[0487]
b是任选的，并且当存在时，是选自由以下组成的组的接头：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-o-、-o-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-s-、-s-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-s(o)
k-(其中k是1、2或
3)、-s(o)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-c(o)-、-c(o)-(亚烷基或取代亚烷基)-、-c(s)-、-c(s)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-n(r’)-、-nr
’‑
(亚烷基或取代的亚烷基)-、-c(o)n(r’)-、-con(r’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-csn(r’)-、-csn(r’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-n(r’)co-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-n(r’)c(o)o-、-s(o)kn(r’)-、-n(r’)c(o)n(r’)-、-n(r’)c(s)n(r’)-、-n(r’)s(o)kn(r’)-、-n(r’)-n＝、-c(r’)＝n-、-c(r’)＝n-n(r’)-、-c(r’)＝n-n＝、-c(r’)
2-n＝n-和-c(r’)
2-n(r’)-n(r’)-，其中每个r'独立地为h、烷基或取代的烷基；
[0488]
r是h、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
[0489]
r1是任选的，并且当存在时，是h、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
[0490]
r2是任选的，并且当存在时，是oh、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸。
[0491]
另外，包括具有式(xii)结构的以下氨基酸：
[0492][0493]
b是任选的，并且当存在时，是选自由以下组成的组的接头：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-o-、-o-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-s-、-s-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-s(o)
k-(其中k是1、2或3)、-s(o)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-c(o)-、-c(o)-(亚烷基或取代亚烷基)-、-c(s)-、-c(s)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-n(r’)-、-nr
’‑
(亚烷基或取代的亚烷基)-、-c(o)n(r’)-、-con(r’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-csn(r’)-、-csn(r’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-n(r’)co-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-n(r’)c(o)o-、-s(o)kn(r’)-、-n(r’)c(o)n(r’)-、-n(r’)c(s)n(r’)-、-n(r’)s(o)kn(r’)-、-n(r’)-n＝、-c(r’)＝n-、-c(r’)＝n-n(r’)-、-c(r’)＝n-n＝、-c(r’)
2-n＝n-和-c(r’)
2-n(r’)-n(r’)-，其中每个r'独立地为h、烷基或取代的烷基；
[0494]
r是h、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
[0495]
r1是任选的，并且当存在时，是h、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
[0496]
r2是任选的，并且当存在时，是oh、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
[0497]
其中每个ra独立地选自由以下组成的组：h、卤素、烷基、取代的烷基、-n(r’)2、-c(o)kr’(其中k是1、2或3)、-c(o)n(r’)2、-or’和-s(o)kr’，其中每个r'独立地为h、烷基或取代的烷基。
[0498]
另外，包括以下氨基酸：
[0499]
其中此类化合物任选地是氨基保护基、任选地是羧基保护基、任选地是氨基保护基和羧基保护基，或其盐。另外，可将这些非天然氨基酸和以下非天然氨基酸中的任一种掺入非天然氨基酸多肽中。
[0500]
另外，包括具有式(xiii)结构的以下氨基酸：
[0501][0502]
其中b是任选的，并且当存在时，是选自由以下组成的组的接头：低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、低级亚杂烷基、取代的低级亚杂烷基、-o-、-o-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-s-、-s-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-s(o)
k-(其中k是1、2或3)、-s(o)k(亚烷基或取代的亚烷基)-、-c(o)-、-c(o)-(亚烷基或取代亚烷基)-、-c(s)-、-c(s)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-n(r’)-、-nr
’‑
(亚烷基或取代的亚烷基)-、-c(o)n(r’)-、-con(r’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-csn(r’)-、-csn(r’)-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-n(r’)co-(亚烷基或取代的亚烷基)-、-n(r’)c(o)o-、-s(o)kn(r’)-、-n(r’)c(o)n(r’)-、-n(r’)c(s)n(r’)-、-n(r’)s(o)kn(r’)-、-n(r’)-n＝、-c(r’)＝n-、-c(r’)＝n-n(r’)-、-c(r’)＝n-n＝、-c(r’)
2-n＝n-和-c(r’)
2-n(r’)-n(r’)-，其中每个r'独立地为h、烷基或取代的烷基；
[0503]
r是h、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
[0504]
r1是任选的，并且当存在时，是h、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
[0505]
r2是任选的，并且当存在时，是oh、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
[0506]
每个ra独立地选自由以下组成的组：h、卤素、烷基、取代的烷基、-n(r’)2、-c(o)kr’(其中k是1、2或3)、-c(o)n(r’)2、-or’和-s(o)kr’，其中每个r'独立地为h、烷基或取代的烷基；并且n是0至8。
[0507]
另外，包括以下氨基酸：
[0508][0508]
其中此类化合物任选地是氨基保护基、任选地是羧基保护基、任选地是氨基保护基和羧基保护基，或其盐。另外，可将这些非天然氨基酸和以下非天然氨基酸中的任一种掺入非天然氨基酸多肽中。
[0509]
另外，包括具有式(xiv)结构的以下氨基酸：
[0510][0511]
其中：
[0512]
a是任选的，并且当存在时，是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；
[0513]
r是h、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
[0514]
r1是任选的，并且当存在时，是h、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
[0515]
r2是任选的，并且当存在时，是oh、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
[0516]
x1是c、s或s(o)；并且l是亚烷基、取代的亚烷基、n(r')(亚烷基)或n(r')(取代的亚烷基)，其中r'是h、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基。
[0517]
另外，包括具有式(xiv-a)结构的以下氨基酸：
[0518][0519]
其中：
[0520]
a是任选的，并且当存在时，是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；
[0521]
r是h、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
[0522]
r1是任选的，并且当存在时，是h、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
[0523]
r2是任选的，并且当存在时，是oh、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
[0524]
l是亚烷基、取代的亚烷基、n(r')(亚烷基)或n(r')(取代的亚烷基)，其中r'是h、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基。
[0525]
另外，包括具有式(xiv-b)结构的以下氨基酸：
[0526][0527]
其中：
[0528]
a是任选的，并且当存在时，是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；
[0529]
r是h、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
[0530]
r1是任选的，并且当存在时，是h、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
[0531]
r2是任选的，并且当存在时，是oh、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
[0532]
l是亚烷基、取代的亚烷基、n(r')(亚烷基)或n(r')(取代的亚烷基)，其中r'是h、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基。
[0533]
另外，包括具有式(xv)结构的以下氨基酸：
[0534][0535]
其中：
[0536]
a是任选的，并且当存在时，是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；
[0537]
r是h、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
[0538]
r1是任选的，并且当存在时，是h、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
[0539]
r2是任选的，并且当存在时，是oh、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
[0540]
x1是c、s或s(o)，并且n是0、1、2、3、4或5；并且每个cr8r9基团上的每个r8和r9独立地选自由以下组成的组：h、烷氧基、烷基胺、卤素、烷基、芳基，或任何r8和r9可以一起形成＝o或环烷基，或邻近r8基团的任何基团可以一起形成环烷基。
[0541]
另外，包括具有式(xv-a)结构的以下氨基酸：
[0542][0543]
其中：
[0544]
a是任选的，并且当存在时，是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；
[0545]
r是h、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
[0546]
r1是任选的，并且当存在时，是h、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
[0547]
r2是任选的，并且当存在时，是oh、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
[0548]
n是0、1、2、3、4或5；并且每个cr8r9基团上的每个r8和r9独立地选自由以下组成的组：h、烷氧基、烷基胺、卤素、烷基、芳基，或任何r8和r9可以一起形成＝o或环烷基，或邻近r8基团的任何基团可以一起形成环烷基。
[0549]
另外，包括具有式(xv-b)结构的以下氨基酸：
[0550][0551]
其中：
[0552]
a是任选的，并且当存在时，是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；
[0553]
r是h、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
[0554]
r1是任选的，并且当存在时，是h、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
[0555]
r2是任选的，并且当存在时，是oh、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
[0556]
n是0、1、2、3、4或5；并且每个cr8r9基团上的每个r8和r9独立地选自由以下组成的组：h、烷氧基、烷基胺、卤素、烷基、芳基，或任何r8和r9可以一起形成＝o或环烷基，或邻近r8基团的任何基团可以一起形成环烷基。
[0557]
另外，包括具有式(xvi)结构的以下氨基酸：
[0558][0559]
其中：
[0560]
a是任选的，并且当存在时，是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；
[0561]
r是h、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
[0562]
r1是任选的，并且当存在时，是h、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
[0563]
r2是任选的，并且当存在时，是oh、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
[0564]
x1是c、s或s(o)；并且l是亚烷基、取代的亚烷基、n(r')(亚烷基)或n(r')(取代的亚烷基)，其中r'是h、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基。
[0565]
另外，包括具有式(xvi-a)结构的以下氨基酸：
[0566][0567]
其中：
[0568]
a是任选的，并且当存在时，是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；
[0569]
r是h、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
[0570]
r1是任选的，并且当存在时，是h、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
[0571]
r2是任选的，并且当存在时，是oh、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
[0572]
l是亚烷基、取代的亚烷基、n(r')(亚烷基)或n(r')(取代的亚烷基)，其中r'是h、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基。
[0573]
另外，包括具有式(xvi-b)结构的以下氨基酸：
[0574][0575]
其中：
[0576]
a是任选的，并且当存在时，是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；
[0577]
r是h、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
[0578]
r1是任选的，并且当存在时，是h、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
[0579]
r2是任选的，并且当存在时，是oh、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
[0580]
l是亚烷基、取代的亚烷基、n(r')(亚烷基)或n(r')(取代的亚烷基)，其中r'是h、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基。
[0581]
另外，包括具有式(xvii)结构的氨基酸：
[0582][0583]
其中：
[0584]
a是任选的，并且当存在时，是低级亚烷基、取代的低级亚烷基、低级亚环烷基、取代的低级亚环烷基、低级亚烯基、取代的低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、取代的亚杂烷基、低级亚杂环烷基、取代的低级亚杂环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基、取代的亚杂芳基、亚烷芳基、取代的亚烷芳基、亚芳烷基或取代的亚芳烷基；
[0585]
m是-c(r3)-、、、其中(a)表示与a基团键结，(b)表示与各自的羰基键结，r3和r4独立地选自h、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基，或r3和r4或两个r3基团或两个r4基团任选地形成环烷基或杂环烷基；
[0586]
r是h、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
[0587]
t3是一个键、c(r)(r)、o或s，并且r是h、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
[0588]
r1是任选的，并且当存在时，是h、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
[0589]
r2是任选的，并且当存在时，是oh、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸。
[0590]
另外，包括具有式(xviii)结构的氨基酸：
[0591][0592]
其中：
[0593]
m是-c(r3)-、、其中(a)表示与a基团键结，(b)表示与各自的羰基键结，r3和r4独立地选自h、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基，或r3和r4或两个r3基团或两个r4基团任选地形成环烷基或杂环烷基；
[0594]
r是h、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
[0595]
t3是一个键、c(r)(r)、o或s，并且r是h、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；
[0596]
r1是任选的，并且当存在时，是h、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
[0597]
r2是任选的，并且当存在时，是oh、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
[0598]
每个ra独立地选自由以下组成的组：h、卤素、烷基、取代的烷基、-n(r’)2、-c(o)kr’(其中k是1、2或3)、-c(o)n(r’)2、-or’和-s(o)kr’，其中每个r'独立地为h、烷基或取代的烷基。
[0599]
另外，包括具有式(xix)结构的氨基酸：
[0600][0601]
其中：
[0602]
r是h、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基；并且
[0603]
t3是o或s。
[0604]
另外，包括具有式(xx)结构的氨基酸：
[0605][0606]
其中：
[0607]
r是h、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基。
[0608]
另外，包括具有式(xxi)结构的以下氨基酸：
[0609][0610]
在一些实施方案中，包含非天然氨基酸的多肽被化学修饰以产生反应性羰基或二羰基官能团。例如，可从具有相邻氨基和羟基的官能团产生可用于缀合反应的醛官能团。当生物活性分子是多肽时，例如，n端丝氨酸或苏氨酸(通常可能存在或可能通过化学或酶促消化暴露)可用于在使用高碘酸盐的温和氧化裂解条件下产生醛官能团。参见例如gaertner等人,bioconjug.chem.3:262-268(1992)；geoghegan,k.&stroh,j,bioconjug.chem.3:138-146(1992)；gaertner等人,j.biol.chem.269:7224-7230(1994)。然而，本领域已知的方法仅限于肽或蛋白质的n端处的氨基酸。
[0611]
在本发明中，带有相邻羟基和氨基的非天然氨基酸可作为“掩蔽的”醛官能团掺入多肽中。举例来说，5-羟基赖氨酸带有一个与ε胺相邻的羟基。用于产生醛的反应条件通常涉及在温和条件下添加摩尔过量的偏高碘酸钠以避免在多肽内的其他位点处氧化。氧化反应的ph值通常为约7.0。典型的反应涉及向多肽的缓冲溶液中添加约1.5摩尔过量的偏高碘酸钠，接着在黑暗中孵育约10分钟。参见例如美国专利号6,423,685。
[0612]
羰基或二羰基官能团可以在温和条件下在水溶液中选择性地与含羟胺试剂反应以形成在生理条件下稳定的对应肟键。参见例如jencks,w.p.,j.am.chem.soc.81,475-481(1959)；shao,j.和tam,j.p.,j.am.chem.soc.117:3893-3899(1995)。此外，羰基或二羰基的独特反应性允许在其他氨基酸侧链存在的情况下进行选择性修饰。参见例如cornish,v.w.,等人,j.am.chem.soc.118:8150-8151(1996)；geoghegan,k.f.&stroh,j.g,bioconjug.chem.3:138-146(1992)；mahal,l.k.,等人,science 276:1125-1128(1997)。
[0613]
a.羰基反应基
[0614]
具有羰基反应基的氨基酸允许通过亲核加成反应或醛醇缩合反应等多种反应来连接分子(包括但不限于peg或其他水溶性分子)。
[0615]
示例性含羰基氨基酸可表示如下：
[0616]
[0617]
其中n是0-10；r1是烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基；r2是h、烷基、芳基、取代的烷基和取代的芳基；并且r3是h、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基；并且r4是h、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。在一些实施方案中，n是1，r1是苯基并且r2是简单烷基(即甲基、乙基或丙基)，并且酮部分位于相对于烷基侧链的对位位置。在一些实施方案中，n是1，r1是苯基并且r2是简单烷基(即甲基、乙基或丙基)，并且酮部分位于相对于烷基侧链的间位位置。
[0618]
对乙酰基-( /-)-苯丙氨酸和间乙酰基-( /-)-苯丙氨酸的合成在zhang,z.等人,biochemistry 42:6735-6746(2003)中描述，所述文献以引用的方式并入本文。其他含羰基的氨基酸可由本领域普通技术人员类似地制备。
[0619]
在一些实施方案中，包含非天然编码氨基酸的多肽被化学修饰以产生反应性羰基官能团。例如，可从具有相邻氨基和羟基的官能团产生可用于缀合反应的醛官能团。当生物活性分子是多肽时，例如，n端丝氨酸或苏氨酸(通常可能存在或可能通过化学或酶促消化暴露)可用于在使用高碘酸盐的温和氧化裂解条件下产生醛官能团。参见例如gaertner,等人,bioconjug.chem.3:262-268(1992)；geoghegan,k.&stroh,j.,bioconjug.chem.3:138-146(1992)；gaertner等人,j.biol.chem.269:7224-7230(1994)。然而，本领域已知的方法仅限于肽或蛋白质的n端处的氨基酸。
[0620]
在本发明中，带有相邻羟基和氨基的非天然编码氨基酸可作为“掩蔽的”醛官能团掺入多肽中。举例来说，5-羟基赖氨酸带有一个与ε胺相邻的羟基。用于产生醛的反应条件通常涉及在温和条件下添加摩尔过量的偏高碘酸钠以避免在多肽内的其他位点处氧化。氧化反应的ph值通常为约7.0。典型的反应涉及向多肽的缓冲溶液中添加约1.5摩尔过量的偏高碘酸钠，接着在黑暗中孵育约10分钟。参见例如美国专利号6,423,685，其以引用的方式并入本文。
[0621]
羰基官能团可以选择性地与含肼、酰肼、羟胺或氨基脲的试剂在温和条件下在水溶液中反应以分别形成在生理条件下稳定的对应的腙、肟或氨基脲键联。参见例如jencks,w.p.,j.am.chem.soc.81,475-481(1959)；shao,j.和tam,j.p.,j.am.chem.soc.117:3893-3899(1995)。此外，羰基的独特反应性允许在其他氨基酸侧链存在的情况下进行选择性修饰。参见例如cornish,v.w.,等人,j.am.chem.soc.118:8150-8151(1996)；geoghegan,k.f.&stroh,j.g.,bioconjug.chem.3:138-146(1992)；mahal,l.k.,等人,science 276:1125-1128(1997)。
[0622]
b.肼、酰肼或氨基脲反应基
[0623]
含有亲核基团(诸如肼、酰肼或氨基脲)的非天然编码氨基酸允许与各种亲电基团(包括但不限于与peg或其他水溶性聚合物)反应以形成缀合物。
[0624]
示例性的含肼、酰肼或氨基脲的氨基酸可表示如下：
[0625][0626]
其中n是0-10；r1是烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基或不存在；x是o、n或s或不存在；r2是h、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基；并且r3是h、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。
[0627]
在一些实施方案中，n是4，r1不存在，并且x是n。在一些实施方案中，n是2，r1不存
在，并且x不存在。在一些实施方案中，n是1，r1是苯基，x是o，并且氧原子位于芳环上的脂肪族基团的对位。
[0628]
含酰肼、肼和氨基脲的氨基酸可从商业来源获得。例如，l-谷氨酸-γ-酰肼可从sigma chemical(st.louis,mo)获得。本领域普通技术人员可以制备不可商购获得的其他氨基酸。参见例如美国专利号6,281,211，所述专利以引用的方式并入本文。
[0629]
含有带有酰肼、肼或氨基脲官能团的非天然编码氨基酸的多肽可以有效并选择性地与含有醛或具有类似化学反应性的其他官能团的多种分子反应。参见例如shao,j.和tam,j.,j.am.chem.soc.117:3893-3899(1995)。与20种常见氨基酸(包括但不限于丝氨酸或苏氨酸的羟基或赖氨酸和n端的氨基)上存在的亲核基团相比，酰肼、肼和氨基脲官能团的独特反应性使它们对醛、酮和其他亲电基团明显更具反应性。
[0630]
c.含氨氧基的氨基酸
[0631]
含有氨氧基(也称为羟胺)基团的非天然编码氨基酸允许与多种亲电子基团(包括但不限于与peg或其他水溶性聚合物)反应以形成缀合物。与肼、酰肼和氨基脲一样，氨氧基的增强的亲核性使其能够有效并选择性地与含有醛或具有类似化学反应性的其他官能团的各种分子进行反应。参见例如shao,j.和tam,j.,j.am.chem.soc.117:3893-3899(1995)；h.hang和c.bertozzi,acc.chem.res.34:727-736(2001)。然而，与肼基反应的结果是对应的腙，而肟通常由氨氧基与含羰基的基团，诸如酮反应产生。
[0632]
含有氨氧基的示例性氨基酸可表示如下：
[0633][0634]
其中n是0-10；r1是烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基或不存在；x是o、n、s或不存在；m是0-10；y＝c(o)或不存在；r2是h、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基；并且r3是h、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。在一些实施方案中，n是1，r1是苯基，x是o，m是1并且y存在。在一些实施方案中，n是2，r1和x不存在，m为0并且y不存在。
[0635]
含氨氧基的氨基酸可以由容易获得的氨基酸前体(高丝氨酸、丝氨酸和苏氨酸)制备。参见例如m.carrasco和r.brown,j.org.chem.68:8853-8858(2003)。某些含氨氧基的氨基酸，诸如l-2-氨基-4-(氨氧基)丁酸已从天然来源中分离出来(rosenthal,g.,life sci.60:1635-1641(1997))。其他含氨氧基的氨基酸可由本领域普通技术人员制备。
[0636]
d.叠氮化物和炔烃反应基
[0637]
叠氮化物和炔烃官能团的独特反应性使它们对于多肽和其他生物分子的选择性修饰极其有用。有机叠氮化物，特别是脂肪族叠氮化物和炔烃通常对常见的反应化学条件稳定。特别是，叠氮化物和炔烃官能团对天然存在的多肽中发现的20种常见氨基酸的侧链(即r基团)呈惰性。然而，当靠得很近时，叠氮化物和炔烃基团的“弹簧加载”性质就会显现出来，并且所述基团通过huisgen[3 2]环加成反应选择性并有效地反应，生成对应的三唑。参见例如chin j.,等人,science 301:964-7(2003)；wang,q.,等人,j.am.chem.soc.125,3192-3193(2003)；chin,j.w.,等人,j.am.chem.soc.124:9026-9027(2002)。
[0638]
因为huisgen环加成反应涉及选择性环加成反应(参见例如padwa,a.,comprehensive organic synthesis,第4卷,(trost,b.m.编,1991),第1069-1109页；
huisgen,r.1,3-dlpolar cycloaddition chemistry,(padwa,a.,编1984),第1-176页)而非亲核取代，掺入带有含叠氮化物和炔烃侧链的非天然编码氨基酸允许生成的多肽在非天然编码氨基酸的位置处进行选择性修饰。涉及含叠氮化物或含炔烃的tc的环加成反应可以在室温下在水性条件下通过在还原剂存在下添加cu(ii)(包括但不限于呈催化量的cuso4的形式)以催化量原位将cu(ii)还原为cu(i)来进行。参见例如wang,q.,等人,j.am.chem.soc.125,3192-3193(2003)；tornoe,c.w.,等人,j.org.chem.67:3057-3064(2002)；rostovtsev,等人,angew.chem.int.ed.41:2596-2599(2002)。示例性还原剂包括但不限于抗坏血酸盐、金属铜、奎宁、氢醌、维生素k、谷胱甘肽、半胱氨酸fe
2
、co
2
和施加的电位。
[0639]
在一些情况下，当叠氮化物与炔烃之间的huisgen[3 2]环加成反应合乎需要时，tc包含有包含炔烃部分的非天然编码氨基酸并且待连接至氨基酸的水溶性聚合物包含叠氮化物部分。可选地，也可以进行相反的反应(即，与氨基酸上的叠氮化物部分和存在于水溶性聚合物上的炔烃部分)。
[0640]
氮化物官能团也可以选择性地与含有芳基酯的水溶性聚合物反应并用芳基膦部分适当地官能化以产生酰胺键。芳基膦基团原位还原叠氮化物，并且然后所得胺与邻近的酯键有效地反应，以生成对应的酰胺。参见例如e.saxon和c.bertozzi,science 287,2007-2010(2000)。含叠氮化物的氨基酸可以是烷基叠氮化物(包括但不限于2-氨基-6-叠氮基-1-己酸)或芳基叠氮化物(对叠氮基-苯丙氨酸)。
[0641]
含有芳基酯和膦部分的示例性水溶性聚合物可表示如下：
[0642][0643]
其中x可以是o、n、s或不存在，ph是苯基，w是水溶性聚合物，并且r可以是h、烷基、芳基、取代的烷基和取代的芳基。示例性r基团包括但不限于-ch2、-c(ch3)3、-or’、-nr’r”、-sr’、-卤素、-c(o)r’、-conr’r”、-s(o)2r’、-s(o)2nr’r”、-cn和-no2。r’、r”、r
’”
和r
””
各自独立地指氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基(包括但不限于被1-3个卤素取代的芳基)、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳烷基。当本发明的化合物包括多于一个r基团时，当存在多于一个这些基团时，例如每个r基团被独立地选择为每个r'、r”、r”'和r
””
基团。当r'和r”连接至同一氮原子时，它们可与氮原子结合形成5元、6元或7元环。举例来说，-nr’r”意在包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。由取代基的以上讨论，本领域技术人员将理解，术语“烷基”意在包括有包括键结至除了氢基团之外的基团的碳原子的基团，诸如卤代烷基(例如-cf3和-ch2cf3)和酰基(包括但不限于-c(o)ch3、-c(o)cf3、-c(o)ch2och3等)。
[0644]
叠氮化物官能团也可以选择性地与含有硫酯的水溶性聚合物反应并用芳基膦部分适当地官能化以产生酰胺键。芳基膦基团原位还原叠氮化物，并且然后所得胺与硫酯键有效地反应，以生成对应的酰胺。含有硫酯和膦部分的示例性水溶性聚合物可表示如下：
[0645][0646]
其中n是1-10；x可以是o、n、s或不存在，ph是苯基，并且w是水溶性聚合物。
[0647]
示例性含炔烃氨基酸可表示如下：
[0648][0649]
其中n是0-10；r1是烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基或不存在；x是o、n、s或不存在；m是0-10；r2是h、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基；并且r3是h、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。在一些实施方案中，n是1，r1是苯基，x不存在，m是0并且乙炔部分位于相对于烷基侧链的对位位置。在一些实施方案中，n是1，r1是苯基，x是o，m是1并且炔丙氧基位于相对于烷基侧链(即o-炔丙基-酪氨酸)的对位位置。在一些实施方案中，n是1，r1和x不存在，并且m是0(即炔丙基甘氨酸)。
[0650]
含炔烃氨基酸是可商购获得的。举例来说，炔丙基甘氨酸可从peptech(burlington,ma)商购获得。可选地，可根据标准方法制备含炔烃氨基酸。例如，可以合成对炔丙氧基苯丙氨酸，例如如deiters,a.,等人,j.am.chem.soc.125:11782-11783(2003)中所描述的，并且可以合成4-炔基-l-苯丙氨酸，如在kayser,b.,等人,tetrahedron 53(7):2475-2484(1997)中所描述的。其他含炔烃氨基酸可由本领域普通技术人员制备。
[0651]
示例性含叠氮化物的氨基酸可表示如下：
[0652][0653]
其中n是0-10；r1是烷基、芳基、取代的烷基、取代的芳基或不存在；x是o、n、s或不存在；m是0-10；r2是h、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基；并且r3是h、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。在一些实施方案中，n是1，r1是苯基，x不存在，m是0并且叠氮化物部分位于烷基侧链的对位。在一些实施方案中，n是0-4并且r1和x不存在，并且m＝0。在一些实施方案中，n是1，r1是苯基，x是o，m是2并且-叠氮基乙氧基部分位于相对于烷基侧链的对位位置。
[0654]
含叠氮化物的氨基酸可从商业来源获得。例如，4-叠氮基苯丙氨酸可从chem-impex international,inc.(wood dale,il)获得。对于那些不可商购获得的含叠氮化物的氨基酸，可以使用本领域普通技术人员已知的标准方法相对容易地制备叠氮化物基团，包括但不限于通过置换合适的离去基团(包括但不限于不限于卤化物、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯)或通过打开适当保护的内酯。参见例如advanced organic chemistry by march(第三版,1985,wiley and sons,new york)。
[0655]
e.氨基硫醇反应基
[0656]
β-取代的氨基硫醇官能团的独特反应性使它们非常适用于通过形成噻唑烷选择性修饰多肽和含有醛基的其他生物分子。参见例如j.shao和j.tam,j.am.chem.soc.1995,117(14)3893-3899。在一些实施方案中，β-取代的氨基硫醇氨基酸可掺入tc多肽中，并且然后与包含醛官能团的水溶性聚合物反应。在一些实施方案中，水溶性聚合物、药物缀合物或其他有效载荷可通过形成噻唑烷与包含β-取代的氨基硫醇氨基酸的tc的靶向多肽偶联。
[0657]
f.额外反应基
[0658]
以下专利申请中描述了可掺入本发明的tc多肽中的额外反应基和非天然编码氨基酸，包括但不限于对氨基-苯丙氨酸，所述专利申请均以引用的方式整体并入本文：美国
专利公开号2006/0194256、美国专利公开号2006/0217532、美国专利公开号2006/0217289、美国临时专利号60/755,338；美国临时专利号60/755,711；美国临时专利号60/755,018；国际专利申请号pct/us06/49397；wo 2006/069246；美国临时专利号60/743,041；美国临时专利号60/743,040；国际专利申请号pct/us06/47822；美国临时专利号60/882,819；美国临时专利号60/882,500；以及美国临时专利号60/870,594。这些申请还讨论了可能存在于peg或其他聚合物上的反应基，包括但不限于用于缀合的羟胺(氨氧基)基团。
[0659]
tc多肽中非天然氨基酸的位置
[0660]
本文所描述的方法和组合物包括将一种或多种非天然氨基酸掺入靶向多肽中以制备本发明的tc。一种或多种非天然氨基酸可掺入不破坏靶向多肽的活性的一个或多个特定位置。这可以通过进行“保守”取代来实现，包括但不限于用非天然或天然疏水氨基酸取代疏水氨基酸、用非天然或天然大体积氨基酸取代大体积氨基酸、用天然或非天然的亲水氨基酸取代亲水氨基酸和/或将非天然氨基酸插入不需要活性的位置。
[0661]
可采用多种生物化学和结构方法来选择用于在tc的靶向多肽内用非天然氨基酸取代的所需位点。在一些实施方案中，非天然氨基酸连接于tlr激动剂衍生物的c端。在其他实施方案中，非天然氨基酸连接于tlr激动剂衍生物的n端。tc的靶向多肽的任何位置均适合选择以掺入非天然氨基酸，并且选择可基于合理设计或出于任何或无特定期望的目的通过随机选择。所需位点的选择可基于产生具有任何所需特性或活性的非天然氨基酸多肽(其可被进一步修饰或保持未修饰)，包括但不限于受体结合调节剂、受体活性调节剂、与结合剂配偶体结合的调节剂、结合配偶体活性调节剂、结合配偶体构象调节剂、二聚体或多聚体形成、与天然分子相比活性或性质无变化，或操纵多肽的任何物理或化学性质，诸如溶解度、聚集或稳定性。可选地，被鉴定为对生物活性至关重要的位点也可能是用非天然氨基酸取代的良好候选物，同样取决于为多肽寻求的所需活性。另一种选择是简单地用非天然氨基酸在多肽链上的每个位置进行连续取代，并观察对多肽活性的影响。用于选择用非天然氨基酸取代到任何多肽中的位置的任何手段、技术或方法适用于本文所描述的方法、技术和组合物。
[0662]
还可以检查含有缺失的天然存在的多肽突变体的结构和活性以确定可能耐受非天然氨基酸取代的蛋白质区域。一旦消除了可能不耐受非天然氨基酸取代的残基，就可以使用包括但不限于相关多肽的三维结构和任何相关配体或结合蛋白的方法来检查在每个剩余位置处所提议的取代的影响。许多多肽的x射线晶体学和nmr结构可在蛋白质数据库(pdb，www.rcsb.org)中获得，这是一个含有蛋白质和核酸大分子的三维结构数据的中央数据库，可用于识别可被非天然氨基酸取代的氨基酸位置。另外，如果三维结构数据不可用，那么可以制作模型来研究多肽的二级和三级结构。因此，可以容易地获得可以被非天然氨基酸取代的氨基酸位置的身份。
[0663]
掺入非天然氨基酸的示例性位点包括但不限于被排除在潜在受体结合区之外的位点，或用于与结合蛋白或配体结合的区域可能完全或部分暴露于溶剂，与附近残基具有最小或没有氢键相互作用，可能最少暴露于附近的反应性残基，和/或可能位于高度灵活的区域，如特定多肽与其相关受体、配体或结合蛋白的三维晶体结构所预测的那样。
[0664]
可以用多种非天然氨基酸取代或掺入多肽中的给定位置。举例来说，可以基于对多肽与其相关配体、受体和/或结合蛋白的三维晶体结构的检查对保守取代的偏好来选择
特定的非天然氨基酸以用于掺入。
[0665]
在一个实施方案中，本文所描述的方法包括将非天然氨基酸掺入tc的靶向多肽中，其中tc的靶向多肽包含第一反应基；并使tc的靶向多肽与包含第二反应基的分子(包括但不限于第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；以及其任何组合)接触。在某些实施方案中，第一反应基是羟胺部分并且第二反应基是羰基或二羰基部分，由此形成肟键。在某些实施方案中，第一反应基是羰基或二羰基部分并且第二反应基是羟胺部分，由此形成肟键。在某些实施方案中，第一反应基是羰基或二羰基部分并且第二反应基是肟部分，由此发生肟交换反应。在某些实施方案中，第一反应基是肟部分并且第二反应基是羰基或二羰基部分，由此发生肟交换反应。
[0666]
在一些情况下，掺入非天然氨基酸的tc的靶向多肽将与多肽内的其他添加、取代或缺失组合以影响其他化学、物理、药理学和/或生物学特质。在一些情况下，其他添加、取代或缺失可增加多肽的稳定性(包括但不限于对蛋白水解降解的抗性)或增加多肽对其合适的受体、配体和/或结合蛋白的亲和力。在一些情况下，其他添加、取代或缺失可增加多肽的溶解度(包括但不限于当在大肠埃希氏菌或其他宿主细胞中表达时)。在一些实施方案中，除了用于掺入非天然氨基酸的另一个位点之外，还选择用天然编码或非天然氨基酸取代的位点，目的是增加多肽在大肠埃希氏菌或其他重组宿主细胞中表达后的溶解度。在一些实施方案中，多肽包含另一种添加、取代或缺失，其调节对相关配体、结合蛋白和/或受体的亲和力、调节(包括但不限于，增加或减少)受体二聚化、稳定受体二聚体、调节循环半衰期、调节释放或生物利用度、促进纯化，或改善或改变特定的施用途径。类似地，非天然氨基酸多肽可包含改进多肽的检测(包括但不限于gfp)、纯化、通过组织或细胞膜转运、前药释放或活化、大小减小或其他特质的化学或酶裂解序列、蛋白酶裂解序列、反应基、抗体结合域(包括但不限于flag或聚his)或其他基于亲和力的序列(包括但不限于限于flag、聚his、gst等)或连接分子(包括但不限于生物素)。
[0667]
抗her2抗体作为靶向部分的范例
[0668]
本文所描述的方法、组合物、策略和技术不限于特定类型、类别或家族的靶向部分多肽或蛋白质。事实上，几乎任何靶向部分多肽都可以被设计或修饰以包括含有本文所描述的tc的靶向多肽的至少一种“修饰的或未修饰的”非天然氨基酸。仅举例来说，靶向部分多肽可以与选自由以下组成的组的治疗性蛋白同源：α-1抗胰蛋白酶、血管抑制素、抗溶血因子、抗体、抗体片段、单克隆抗体(例如贝伐珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、英夫利昔单抗、阿达木单抗、巴利昔单抗、达利珠单抗、奥马珠单抗、优特克单抗(ustekinumab)、依那西普(etanercept)、吉妥珠单抗、阿仑单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、帕利珠单抗和阿昔单抗)、载脂蛋白、脱辅基蛋白(apoprotein)、心钠素(atrial natriuretic factor)、心房利钠尿多肽(atrial natriuretic polypeptide)、心房肽(atrial peptide)、c-x-c趋化因子、t39765、nap-2、ena-78、gro-a、gro-b、gro-c、ip-10、gcp-2、nap-4、sdf-1、pf4、mig、降钙素、c-kit配体、cc趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白-iβ、rantes、1309、r83915、r91733、hcc1、t58847、d31065、t64262、cd40、cd40配体、c-kit配体、胶原蛋白、集落刺激因子(csf)、补体因子5a、补体抑制剂、补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞激活肽-78、mip-16、mcp-1、表皮生长因子(egf)、上皮中性粒细胞激活肽、促红细
胞生成素(epo)、去角质毒素、因子ix、因子vii、因子viii、因子x、成纤维细胞生长因子(fgf)、纤维蛋白原、纤连蛋白、四螺旋束蛋白、g-csf、glp-1、gm-csf、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、生长因子受体、生长激素释放因子、刺猬蛋白、血红蛋白、肝细胞生长因子(hgf)、水蛭素、人生长激素(hgh)、人血清白蛋白、icam-1、icam-1受体、lfa-1、lfa-1受体、胰岛素、类胰岛素生长因子(igf)、igf-i、igf-ii、干扰素(ifn)、ifn-α、ifn-β、ifn-γ、白细胞介素(il)、il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、角质细胞生长因子(kgf)、乳铁蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经秩蛋白(neurturin)、中性粒细胞抑制因子(nif)、制瘤素m、成骨蛋白、致癌基因产物、paracitonin、甲状旁腺激素(pth)、pd-ecgf、pdgf、肽激素、多效蛋白(pleiotropin)、蛋白a、蛋白g、致热性外毒素a、致热性外毒素b、致热性外毒素c、肽yy(pyy)、松弛素、肾素、scf、小生物合成蛋白、可溶性补体受体i、可溶性i-cam 1、可溶性白细胞介素受体、可溶性tnf受体、生长调节素、生长抑素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、sea、seb、sec1、sec2、sec3、sed、see、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合征毒素、胸腺素α1、组织型纤溶酶原活化剂、肿瘤生长因子(tgf)、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(tnfr)、vla-4蛋白、vcam-1蛋白、血管内皮生长因子(vegf)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、myb、rel、雌激素受体、孕激素受体、睾酮受体、醛固酮受体、ldl受体和皮质酮。
[0669]
在一个实施方案中的是一种治疗过表达her-2的实体肿瘤的方法，所述实体肿瘤选自由以下组成的组：乳腺癌、小细胞肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、膀胱癌、头颈癌、前列腺癌、胃癌癌、宫颈癌、子宫癌、食管癌和结肠癌。在另一个实施方案中，实体肿瘤是乳腺癌。在另一个实施方案中，实体肿瘤是卵巢癌。
[0670]
因此，提供曲妥珠单抗的以下描述仅用于说明目的并且仅作为实例，而不是作为本文所描述的方法、组合物、策略和技术的范围的限制。此外，在本技术中提及曲妥珠单抗旨在使用通用术语作为任何抗体的实例。因此，应理解，本文关于曲妥珠单抗描述的修饰和化学可同样应用于任何抗体或单克隆抗体，包括本文具体列出的那些抗体。
[0671]
曲妥珠单抗是与her2/neu受体的细胞外区段的域iv结合的人源化单克隆抗体。her2基因(也称为her2/neu和erbb2基因)在20％-30％的早期乳腺癌中被扩增，使其过表达。此外，在癌症中，her2可能在无有丝分裂原到达并与任何受体结合的情况下发送信号，使其过度活跃。
[0672]
her2延伸穿过细胞膜并将信号从细胞外携带到细胞内。在健康人体内，称为有丝分裂原的信号传导化合物到达细胞膜，并与her受体家族的其他成员的外部结合。然后那些结合的受体与her2连接(二聚化)，激活her2。然后her2向细胞内部发送信号。信号通过不同的生化路径。所述路径包括pi3k/akt路径和mapk路径。这些信号促进细胞的血管侵袭、存活和生长(血管生成)。
[0673]
用曲妥珠单抗处理的细胞在细胞周期的g1期经历停滞，因此增殖减少。有人提出，曲妥珠单抗通过下调her2/neu导致受体二聚化破坏和通过下游pi3k级联的信号传导来诱导其某些作用。然后p27kip1不被磷酸化，并且能够进入细胞核并抑制cdk2活性，导致细胞周期停滞。此外，曲妥珠单抗通过诱导抗血管生成因子和阻遏促血管生成因子来阻遏血管生成。据信，在癌症中观察到的不受调控的生长的贡献可能是由于her2/neu的蛋白水解裂
解导致细胞外域的释放。曲妥珠单抗已显示可抑制乳腺癌细胞中的her2/neu胞外域裂解。
[0674]
在非真核生物和真核生物中的表达
[0675]
为了获得克隆的tc多核苷酸的高水平表达，通常将编码本发明tc多肽的靶向多肽的多核苷酸亚克隆到表达载体中，所述表达载体含有用于直接转录的强启动子、转录/翻译终止子，并且如果是编码蛋白质的核酸，则含有用于翻译起始的核糖体结合位点。合适的细菌启动子是本领域普通技术人员已知的并且在例如sambrook等人和ausubel等人中描述。
[0676]
用于表达本发明的tc多肽的细菌表达系统可用于，包括但不限于大肠埃希氏菌、芽孢杆菌属某种(bacillus sp.)、荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)和沙门氏菌属(salmonella)(palva等人,gene 22:229-235(1983)；mosbach等人,nature 302:543-545(1983))。用于此类表达系统的试剂盒是可商购获得的。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统是本领域普通技术人员已知的并且也是可商购获得的。在使用正交trna和氨酰基trna合成酶(如上所述)来表达本发明的tc多肽的情况下，基于它们使用正交组分的能力来选择用于表达的宿主细胞。示例性宿主细胞包括革兰氏阳性菌(包括但不限于短芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或链霉菌属)和革兰氏阴性菌(大肠埃希氏菌、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌)，以及酵母和其他真核细胞。可以如本文所描述的使用包含o-trna/o-rs对的细胞。
[0677]
本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供合成包含大量有用量的非天然氨基酸的蛋白质的能力。在一方面，组合物任选地包括但不限于至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克，至少1毫克、至少10毫克、至少100毫克、至少一克或更多的包含非天然氨基酸的蛋白质，或通过体内蛋白质生产方法可以达到的量(详情见本文提供了重组蛋白的生产和纯化)。在另一方面，蛋白质任选地以在包括但不限于细胞裂解物、缓冲液、药物缓冲液或其他液体悬浮液(包括但不限于体积为包括但不限于约1nl至约100l或更多)中的包括但不限于以下的浓度存在于组合物中：每升至少10微克蛋白质、每升至少50微克蛋白质、每升至少75微克蛋白质，每升至少100微克蛋白质，每升至少200微克蛋白质，每升至少250微克蛋白质，每升至少500微克蛋白质、每升至少1毫克蛋白质或每升至少10毫克蛋白质或更多。在真核细胞中大量生产(包括但不限于比其他方法(包括但不限于体外翻译)通常可能生产的更多)包括至少一种非天然氨基酸的蛋白质是本发明的一个特点。
[0678]
编码tc多肽的靶向多肽的核苷酸序列可以包括或可以不包括编码信号肽的序列。当多肽要从表达它的细胞中分泌时，信号肽即存在。这种信号肽可以是任何序列。信号肽可以是原核的或真核的。coloma,m(1992)j.imm.methods 152:89 104描述了一种用于哺乳动物细胞的信号肽(鼠类igκ轻链信号肽)。其他信号肽包括但不限于来自酿酒酵母的α因子信号肽(美国专利号4,870,008，其以引用的方式并入本文)、小鼠唾液淀粉酶的信号肽(o.hagenbuchle等人,nature 289,1981,第643-646页)、修饰的羧肽酶信号肽(l.a.valls等人,cell 48,1987,第887-897页)、酵母bar1信号肽(wo 87/02670，其以引用的方式并入本文)和酵母天冬氨酸蛋白酶3(yap3)信号肽(参见m.egel-mitani等人,yeast 6,1990,第127-137页)。
[0679]
合适的哺乳动物宿主细胞的实例是本领域普通技术人员已知的。此类宿主细胞可
以是中国仓鼠卵巢(cho)细胞(例如cho-k1；atcc ccl-61)、绿猴细胞(cos)(例如cos 1(atcc crl-1650)、cos 7(atcc crl-1651))；小鼠细胞(例如ns/o)、幼仓鼠肾(bhk)细胞系(例如atcc crl-1632或atcc ccl-10)和人细胞(例如hek 293(atcc crl-1573))以及组织培养物中的植物细胞。这些细胞系和其他细胞系可从公共保藏机构，诸如rockville,md的美国典型培养物保藏中心(american type culture collection)获得。为了提供改进的tc多肽糖基化，哺乳动物宿主细胞可以被修饰以表达唾液酸转移酶，例如1,6-唾液酸转移酶，例如如美国专利号5,047,335中所描述的，所述专利以引用的方式并入本文。
[0680]
将外源dna引入哺乳动物宿主细胞中的方法包括但不限于磷酸钙介导的转染、电穿孔、deae-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、病毒载体以及life technologies ltd,paisley,uk描述的使用lipofectamin 2000和roche diagnostics corporation,indianapolis,usa描述的使用fugene 6的转染方法。这些方法在本领域中是众所周知的并且由ausbel等人(编),1996,current protocols in molecular biology,john wiley&sons,new york,usa描述。哺乳动物细胞的培养可以根据已建立的方法，例如如(animal cell biotechnology,methods and protocols,由nigel jenkins编,1999,human press inc.totowa,n.j.,usa and harrison mass,and rae if,general techniques of cell culture,cambridge university press 1997)中所公开的方法进行。
[0681]
i.大肠埃希氏菌、假单胞菌属物种和其他原核生物细菌表达技术是本领域普通技术人员已知的。多种载体可用于细菌宿主。载体可以是单拷贝或低或高的多拷贝载体。载体可用于克隆和/或表达。鉴于有关载体的大量文献、许多载体的商业可用性，甚至描述载体和其限制图谱和特征的手册，这里不需要进行广泛的讨论。众所周知，载体通常包括允许选择的标志物，这些标志物可以提供细胞毒性剂抗性、原营养或免疫力。通常存在多个标志物，它们提供不同的特性。
[0682]
细菌启动子是能够结合细菌rna聚合酶并启动编码序列(例如结构基因)下游(3')转录为mrna的任何dna序列。启动子将具有通常位于接近编码序列的5'末端的转录起始区。所述转录起始区通常包括rna聚合酶结合位点和转录起始位点。细菌启动子也可能具有称为操作子的第二域，它可能与rna合成开始的相邻rna聚合酶结合位点重叠。操作子允许负调控(诱导型)转录，因为基因阻遏蛋白可结合操作子，从而抑制特定基因的转录。在不存在负调控元件(诸如操作子)的情况下，可能发生组成型表达。另外，正调控可通过基因活化蛋白结合序列实现，如果存在，所述序列通常位于rna聚合酶结合序列的近端(5')。基因活化蛋白的一个实例是分解代谢活化蛋白(cap)，它有助于启动大肠埃希氏菌(escherichia coli/e.coli)中lac操纵子的转录(参见raibaud等人,annu.rev.genet.(1984)18:173)。因此，受调控的表达可以是正的或负的，从而增强或减少转录。
[0683]
术语“细菌宿主”或“细菌宿主细胞”是指可以或已经用作重组载体或其他转移dna的接受体的细菌。所述术语包括已被转染的原始细菌宿主细胞的后代。应理解，由于意外或故意突变，单个亲代细胞的后代并不一定与原始亲代在形态或基因组或全dna补体方面完全相同。诸如在存在编码tc多肽的核苷酸序列的情况下，与亲代足够相似以通过相关特性表征的亲代细胞的后代包括在所述定义所指的后代中。
[0684]
用于表达tc多肽的合适宿主细菌的选择是本领域普通技术人员已知的。在选择用于表达的细菌宿主时，合适的宿主可包括显示尤其具有良好包涵体形成能力、低蛋白水解
活性和整体稳健性的那些宿主。细菌宿主通常可从多种来源，包括但不限于加利福尼亚大学(berkeley,ca)生物物理学和医学物理学系细菌遗传库中心；和美国典型培养物保藏中心(“atcc”)(manassas,va)获得。工业/制药发酵通常使用源自k菌株的细菌(例如w3110)或源自b菌株的细菌(例如bl21)。这些菌株特别有用，因为它们的生长参数众所周知并且稳健。另外，这些菌株是非致病性的，出于安全性和环境原因，这在商业上很重要。合适的大肠埃希氏菌宿主的其他实例包括但不限于bl21、dh10b或其衍生物的菌株。在本发明方法的另一个实施方案中，大肠埃希氏菌宿主是蛋白酶阴性菌株，包括但不限于omp-和lon-。宿主细胞菌株可以是一种假单胞菌，包括但不限于荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌。荧光假单胞菌生物变种1，命名为菌株mb101，已知可用于重组生产并可用于治疗性蛋白质生产过程。假单胞菌表达系统的实例包括可从the dow chemical company作为宿主菌株获得的系统(midland,mi，可在www.dow.com上获得)。
[0685]
一旦建立了重组宿主细胞菌株(即，已经将表达构建体引入宿主细胞并且分离具有适当表达构建体的宿主细胞)，即在适合生产tc多肽的条件下培养重组宿主细胞菌株。正如本领域技术人员显而易见的，重组宿主细胞菌株的培养方法将取决于所用表达构建体的性质和宿主细胞的特性。重组宿主菌株通常使用本领域普通技术人员已知的方法进行培养。重组宿主细胞通常在液体培养基中培养，所述液体培养基含有可同化的碳源、氮源和无机盐，并且任选地含有维生素、氨基酸、生长因子和本领域普通技术人员已知的其他蛋白质培养补充剂。用于宿主细胞培养的液体培养基可任选地含有抗生素或抗真菌剂以防止不需要的微生物和/或化合物(包括但不限于抗生素)的生长，以选择含有表达载体的宿主细胞。
[0686]
重组宿主细胞可以分批或连续形式培养，其中细胞收获(在tc多肽在细胞内积聚的情况下)或以分批或连续形式收获培养物上清液。对于原核宿主细胞的生产，优选分批培养和细胞收获。
[0687]
本发明的tc多肽通常在重组系统中表达后进行纯化。可通过本领域已知的多种方法从宿主细胞或培养基中纯化tc多肽。细菌宿主细胞中产生的tc多肽可能难溶或不溶(以包涵体的形式)。在本发明的一个实施方案中，使用本文所公开的方法以及本领域已知的方法，可容易地在选择的tc多肽中进行氨基酸取代以增加重组产生的蛋白质的溶解度。在不溶性蛋白质的情况下，可通过离心从宿主细胞裂解物中收集蛋白质，并且接着可以进一步将细胞均质化。在难溶性蛋白质的情况下，可添加包括但不限于聚乙烯亚胺(pei)的化合物以诱导部分可溶性蛋白质的沉淀。然后可通过离心方便地收集沉淀的蛋白质。可使用本领域普通技术人员已知的多种方法破坏或均质化重组宿主细胞以从细胞内释放包涵体。可使用熟知的技术，包括但不限于酶促细胞破坏、超声处理、杜恩斯均质化或高压释放破坏进行宿主细胞破坏或均质化。在本发明方法的一个实施方案中，高压释放技术用于破坏大肠埃希氏菌宿主细胞以释放tc多肽的包涵体。当处理tc多肽的包涵体时，将重复的均质化时间降至最低，以最大限度地提高包涵体的产量，而不会因诸如增溶、机械剪切或蛋白水解的因素而造成损失，这可能是有利的。
[0688]
然后可使用本领域已知的若干种合适的增溶剂中的任一种来溶解不溶性或沉淀的tc多肽。tc多肽可用脲或盐酸胍溶解。应最小化溶解的tc多肽的体积，以便可使用易于管理的批量生产大批量生产。这个因素在大规模商业环境中可能是重要的，在这种环境中，重组宿主可能以数千升的体积分批生长。另外，在大规模商业环境中生产tc多肽时，特别是用
于人类药物用途时，应尽可能避免使用可能损坏机器和容器或蛋白质产品本身的刺激性化学品。在本发明的方法中已经证明，较温和的变性剂脲可用于代替较苛刻的变性剂盐酸胍来溶解tc多肽包涵体。脲的使用显著降低了在tc多肽的制造和纯化过程中使用的不锈钢设备损坏的风险，同时有效地溶解了tc多肽包涵体。
[0689]
在tc蛋白的可溶性靶向多肽的情况下，tc的靶向多肽可分泌到周质空间或培养基中。另外，可溶性tc可能存在于宿主细胞的细胞质中。在进行纯化步骤之前可能需要浓缩可溶性tc。本领域普通技术人员已知的标准技术可用于从例如细胞裂解物或培养基中浓缩可溶性靶向多肽。另外，本领域普通技术人员已知的标准技术可用于破坏宿主细胞并从宿主细胞的细胞质或周质空间释放可溶性tc。
[0690]
一般来说，偶尔需要变性和减少表达的多肽，并且然后使多肽重新折叠成优选的构象。举例来说，可将胍、脲、dtt、dte和/或伴侣蛋白添加至目标翻译产物中。还原、变性和复性蛋白质的方法是本领域普通技术人员已知的(参见上述参考文献和debinski等人(1993)j.biol.chem.,268:14065-14070；kreitman和pastan(1993)bioconjug.chem.,4:581-585；以及buchner等人,(1992)anal.biochem.,205:263-270)。例如，debinski等人描述了胍-dte中包涵体蛋白的变性和还原。蛋白质可在含有(包括但不限于)氧化谷胱甘肽和l-精氨酸的氧化还原缓冲液中重新折叠。重新折叠试剂可以流动或以其他方式移动以与一种或多种多肽或其他表达产物接触，反之亦然。
[0691]
在tc多肽的原核生产的情况下，由此产生的tc多肽可能被错误折叠并因此缺乏或具有降低的生物活性。蛋白质的生物活性可通过“重新折叠”来恢复。一般来说，错误折叠的tc多肽通过使用例如一种或多种离液剂(例如脲和/或胍)和能够还原二硫键(例如二硫苏糖醇、dtt或2-巯基乙醇、2-me)的还原剂来溶解(其中tc多肽也是不溶的)、展开和还原多肽链而被重新折叠。在中等浓度的离液剂下，然后添加氧化剂(例如氧气、胱氨酸或胱胺)，这允许重新形成二硫键。可使用本领域已知的标准方法，诸如美国专利号4,511,502、4,511,503和4,512,922中描述的那些方法重新折叠tc多肽，所述专利以引用的方式并入本文。tc多肽也可以与其他蛋白质共折叠以形成异二聚体或异多聚体。
[0692]
重新折叠后，可进一步纯化tc的靶向多肽。tc的纯化可使用本领域普通技术人员已知的多种技术，包括疏水相互作用色谱、尺寸排阻色谱、离子交换色谱、反相高效液相色谱、亲和色谱等或其任何组合来完成。额外的纯化还可能包括纯化蛋白质的干燥或沉淀步骤。
[0693]
纯化后，tc的靶向多肽可交换到不同的缓冲液中和/或通过本领域已知的多种方法中的任一种，包括但不限于渗滤和透析来浓缩。作为单一纯化蛋白质提供的tc可能会发生聚集和沉淀。
[0694]
tc的纯化的靶向多肽可以是至少90％纯的(如通过反相高效液相色谱、rp-hplc或十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、sds-page测量的)或至少95％纯的、或至少96％纯的、或至少97％纯的、或至少98％纯的、或至少99％或更高纯的。不管tc的靶向多肽纯度的确切纯度数值如何，tc的靶向多肽的纯度足以用作药物产品或用于进一步加工，诸如与水溶性聚合物(诸如peg)缀合。
[0695]
某些tc分子可以在不存在其他活性成分或蛋白质(赋形剂、载剂和稳定剂、血清白蛋白等除外)的情况下用作治疗剂，或它们可以与另一种蛋白质或聚合物复合。
[0696]
先前已表明，通过将化学氨酰化抑制trna添加至用含有所需琥珀无义突变的基因编程的蛋白质合成反应中，可在体外将非天然氨基酸位点特异性掺入蛋白质中。使用这些方法，可使用对特定氨基酸具有营养缺陷型的菌株，将许多常见的二十种氨基酸替换为结构相似的同系物，例如用氟苯丙氨酸替换苯丙氨酸。参见例如noren,c.j.,anthony-cahill,griffith,m.c.,schultz,p.g.a general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins,science,244:182-188(1989)；m.w.nowak,等人.,science 268:439-42(1995)；bain,j.d.,glabe,c.g.,dix,t.a.,chamberlin,a.r.,diala,e.s.biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide,j.am chem soc,111:8013-8014(1989)；n.budisa等人,faseb j.13:41-51(1999)；ellman,j.a.,mendel,d.,anthony-cahill,s.,noren,c.j.,schultz,p.g.biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins,methods in enz.,第202卷,301-336(1992)；以及mendel,d.,cornish,v.w.&schultz,p.g.site-directed mutagenesis with an expanded genetic code,annu rev biophys.biomol struct.24,435-62(1995)。
[0697]
举例来说，制备识别终止密码子uag并用非天然氨基酸化学氨酰化的抑制trna。常规定点诱变用于在蛋白质基因中的目标位点处引入终止密码子tag。参见例如sayers,j.r.,schmidt,w.eckstein,f.5'-3'exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis,nucleic acids res,16(3):791-802(1988)。当酰化抑制trna和突变基因在体外转录/翻译系统中组合时，非天然氨基酸响应于uag密码子而被掺入，从而在指定位置处产生含有所述氨基酸的蛋白质。使用[3h]-phe的实验和使用α-羟基酸的实验表明，只有所需的氨基酸被掺入由uag密码子指定的位置，并且所述氨基酸未掺入蛋白质中的任何其他位点。参见例如noren,等人，同上；kobayashi等人,(2003)nature structural biology 10(6):425-432；以及ellman,j.a.,mendel,d.,schultz,p.g.site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins,science,255(5041):197-200(1992)。
[0698]
可通过任何方法或技术，包括但不限于化学或酶促氨酰化，用所需氨基酸来氨酰化trna。
[0699]
氨酰化可通过氨酰基trna合成酶或通过其他酶分子，包括但不限于核酶来完成。术语“核酶”可与“催化rna”互换。cech和同事(cech,1987,science,236:1532-1539；mccorkle等人,1987,concepts biochem.64:221-226)证明了存在可充当催化剂(核酶)的天然存在的rna。然而，尽管这些天然rna催化剂仅显示作用于核糖核酸底物以进行裂解和剪接，但核酶人工进化的最新发展已将催化作用扩展到各种化学反应。研究已鉴定出可在其自身(2')3'-末端催化氨酰基-rna键的rna分子(illangakekare等人,1995science 267:643-647)，以及可将氨基酸从一个rna分子转移到另一个rna的rna分子(lohse等人,1996,nature 381:442-444)。
[0700]
美国专利申请公开2003/0228593(以引用的方式并入本文)描述了构建核酶的方法及其在具有天然编码和非天然编码氨基酸的trna氨酰化中的用途。可以氨酰化trna的底物固定形式的酶分子(包括但不限于核酶)可实现氨酰化产物的有效亲和纯化。合适的底物的实例包括琼脂糖、琼脂糖凝胶和磁珠。chemistry and biology 2003,10:1077-1084和美
国专利申请公开2003/0228593中描述了用于氨酰化的底物固定形式的核酶的生产和用途，所述文献以引用的方式并入本文。
[0701]
化学氨酰化方法包括但不限于由hecht和同事(hecht,s.m.acc.chem.res.1992,25,545；heckler,t.g.；roesser,j.r；xu,c.；chang,p.；hecht,s.m.biochemistry 1988,27,7254；hecht,s.m.；alford,b.l.；kuroda,y.；kitano,s.j.biol.chem.1978,253,4517)和schultz、chamberlin、dougherty等人(cornish,v.w.；mendel,d.；schultz,p.g.angew.chem.int.ed.engl.1995,34,621；robertson,s.a.；ellman,j.a.；schultz,p.g.j.am.chem.soc.1991,113,2722；noren,c.j.；anthony-cahill,s.j；griffith,m.c.；schultz,p.g.science 1989,244,182；bain,j.d.；glabe,c.g.；dix,t.a.；chamberlin,a.r.j.am.chem.soc.1989,111,8013；bain,j.d.等人nature 1992,356,537；gallivan,j.p.；lester,h.a.；dougherty,d.a.chem.biol.1997,4,740；turcatti,等人j.biol.chem.1996,271,19991；nowak,m.w.等人science,1995,268,439；saks,m.e.等人j.biol.chem.1996,271,23169；hohsaka,t.等人j.am.chem.soc.1999,121,34)介绍的那些方法，以避免在氨酰化中使用合成酶，所述文献以引用的方式并入本文。此类方法或其他化学氨酰化方法可用于氨酰化trna分子。
[0702]
用于产生催化性rna的方法可包括产生单独的随机核酶序列池，对这些池进行定向进化，针对所需的氨酰化活性筛选这些池，以及选择表现出所需氨酰化活性的那些核酶的序列。
[0703]
也可以使用重构的翻译系统。纯化翻译因子的混合物也已成功地用于将mrna翻译成蛋白质，以及裂解物或补充有纯化翻译因子(诸如起始因子-1(if-1)、if-2、if-3(α或β)、延伸因子t(ef-tu)或终止因子)的裂解物的组合。无细胞系统也可以是偶联的转录/翻译系统，其中将dna引入系统，转录到mrna并翻译mrna，如current protocols in molecular biology(f.m.ausubel等人编,wiley interscience,1993)中所描述的，所述文献特此以引用的方式具体并入。在真核转录系统中转录的rna可能呈异核rna(hnrna)或5'-末端帽(7-甲基鸟苷)和3'-末端聚a尾成熟mrna的形式，这在某些翻译系统中可能是一个优势。举例来说，带帽的mrna在网织红细胞裂解物系统中被高效翻译。
[0704]
与tc多肽偶联的大分子聚合物
[0705]
可使用本文所描述的组合物、方法、技术和策略对本文所描述的非天然氨基酸多肽进行各种修饰。这些修饰包括将其他官能团掺入多肽的非天然氨基酸组分，所述官能团包括但不限于标签；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；放射性核素；细胞毒性化合物；药物；亲和标签；光亲和标签；活性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；dna；rna；反义多核苷酸；糖类；水溶性树枝状聚合物；环糊精；抑制性核糖核酸；生物材料；纳米颗粒；自旋标签；荧光团，含金属部分；放射性部分；新型官能团；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼部分；光化辐射可激发部分；光致异构部分；生物素；生物素的衍生物；生物素类似物；掺入重原子的部分；化学可裂解基团；光可裂解基团；伸长的侧链；碳连接的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；嵌入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标签；小分子；量子点；纳米发射器；放射性核苷酸；放射性发射体；中子俘获剂；
或上述的任何组合，或任何其他所需的化合物或物质。作为本文所描述的组合物、方法、技术和策略的说明性、非限制性实例，以下描述将着重于将大分子聚合物添加至非天然氨基酸多肽，同时应理解其中所描述的组合物、方法、技术和策略也适用于(在必要时进行适当的修改，并且本领域技术人员可以利用此处的公开内容进行修改)添加其他官能团，包括但不限于上文列出的那些官能团。
[0706]
多种大分子聚合物和其他分子可与本发明的tc多肽连接，以调节tc多肽的生物学特性，和/或为tc分子提供新的生物学特性。这些大分子聚合物可通过天然编码氨基酸、非天然编码氨基酸、或天然或非天然氨基酸的任何功能取代基、或添加至天然非天然氨基酸的任何取代基或官能团连接至tc多肽。聚合物的分子量可以在广泛范围内，包括但不限于介于约100da与约100,000da之间或更大。聚合物的分子量可以介于约100da与约100,000da之间，包括但不限于100,000da、95,000da、90,000da、85,000da、80,000da、75,000da、70,000da、65,000da、60,000da、55,000da、50,000da、45,000da、40,000da、35,000da、30,000da、25,000da、20,000da、15,000da、10,000da、9,000da、8,000da、7,000da、6,000da、5,000da、4,000da、3,000da、2,000da、1,000da、900da、800da、700da、600da、500da、400da、300da、200da和100da。在一些实施方案中，聚合物的分子量介于约100da与约50,000da之间。在一些实施方案中，聚合物的分子量介于约100da与约40,000da之间。在一些实施方案中，聚合物的分子量介于约1,000da与约40,000da之间。在一些实施方案中，聚合物的分子量介于约5,000da与约40,000da之间。在一些实施方案中，聚合物的分子量介于约10,000da与约40,000da之间。
[0707]
本发明提供了多聚蛋白缀合物的基本上均质的制剂。如本文所用，“基本上均质的”意指观察到多聚蛋白缀合物分子大于总蛋白质的一半。多聚蛋白缀合物具有生物活性，并且本文提供的本发明的“基本上均质的”peg化tc多肽制剂是足够均质以显示均质制剂的优点，例如在批次间药代动力学的可预测性方面易于临床应用的那些制剂。
[0708]
还可以选择制备多聚蛋白缀合物分子的混合物，并且本文提供的优点是可以选择混合物中包括的单多聚蛋白缀合物的比例。因此，如果需要，可制备具有不同数量的连接的聚合物部分(即，二聚、三聚、四聚等)的各种蛋白质的混合物，并且将所述缀合物与使用本发明的方法制备的单多聚蛋白缀合物组合并具有预定比例的单多聚蛋白缀合物的混合物。
[0709]
所选聚合物可以是水溶性的，使得其所连接的蛋白质不会在诸如生理环境的水性环境中沉淀。所述聚合物可以是分支或无分支的。对于最终产物制剂的治疗用途来说，聚合物将是药学上可接受的。
[0710]
聚合物的实例包括但不限于聚烷基醚和其烷氧基封端的类似物(例如聚氧乙烯二醇、聚氧乙烯/丙二醇和其甲氧基或乙氧基封端的类似物，尤其是聚氧乙烯二醇，后者也称为聚乙二醇或peg)；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯烷基醚；聚噁唑啉、聚烷基噁唑啉和聚羟烷基噁唑啉；聚丙烯酰胺、聚烷基丙烯酰胺和聚羟烷基丙烯酰胺(例如聚羟丙基甲基丙烯酰胺和其衍生物)；聚丙烯酸羟烷基酯；聚唾液酸和其类似物；亲水肽序列；多糖和其衍生物，包括葡聚糖和葡聚糖衍生物，例如羧甲基葡聚糖、硫酸葡聚糖、氨基葡聚糖；纤维素和其衍生物，例如羧甲基纤维素、羟烷基纤维素；壳多糖和其衍生物，例如壳聚糖、琥珀酰壳聚糖、羧甲基壳多糖、羧甲基壳聚糖；透明质酸和其衍生物；淀粉；海藻酸；硫酸软骨素；白蛋白；支链淀粉和羧甲基支链淀粉；聚氨基酸和其衍生物，例如聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚天冬氨酸、聚天冬酰
胺；马来酸酐共聚物，诸如：苯乙烯马来酸酐共聚物、二乙烯乙基醚马来酸酐共聚物；聚乙烯醇；其共聚物；其三元共聚物；其混合物；以及前述的衍生物。
[0711]
聚乙二醇分子与蛋白质分子的比例会变化，它们在反应混合物中的浓度也会变化。一般来说，最佳比率(就反应效率而言，因为存在最少过量的未反应蛋白质或聚合物)可由所选聚乙二醇的分子量和可用反应基的数量决定。关于分子量，通常聚合物的分子量越高，可连接至蛋白质的聚合物分子的数量就越少。类似地，在最佳化这些参数时应考虑聚合物的支化。通常，分子量越高(或支链越多)，聚合物:蛋白质的比就越高。
[0712]
如本文所用，并且当考虑peg:tc多肽缀合物时，术语“治疗有效量”是指给患者带来所需益处的量。所述量因人而异，并且取决于多种因素，包括患者的整体身体状况和待治疗疾患的根本原因。用于疗法的tc多肽的量提供可接受的变化率并将所需的响应维持在有益水平。本领域的普通技术人员可使用公开可用的材料和程序容易地确定本发明组合物的治疗有效量。
[0713]
水溶性聚合物可以是任何结构形式，包括但不限于线性、叉状或支化。通常，水溶性聚合物是聚(亚烷基二醇)，诸如聚乙二醇(peg)，但也可以使用其他水溶性聚合物。举例来说，peg用于描述本发明的某些实施方案。
[0714]
聚乙二醇是熟知的水溶性聚合物，其可商购获得或可根据本领域普通技术人员已知的方法(sandler和karo,polymer synthesis,academic press,new york,第3卷,第138-161页)通过乙二醇的开环聚合来制备。术语“peg”广泛用于涵盖任何聚乙二醇分子，而不考虑大小或peg末端的修饰，并且可以表示为通过下式连接至tc多肽：
[0715]
xo-(ch2ch2o)
n-ch2ch
2-y
[0716]
其中n为2至10,000并且x是h或末端修饰，包括但不限于c
1-4
烷基、保护基或末端官能团。
[0717]
在一些情况下，用于本发明的peg在一端以羟基或甲氧基终止，即x是h或ch3("甲氧基peg")。可选地，peg可以反应基终止，从而形成双官能聚合物。典型的反应基可包括通常用于与20种常见氨基酸中发现的官能团反应的那些反应基(包括但不限于马来酰亚胺基团、活性碳酸酯(包括但不限于对硝基苯酯)、活性酯(包括但不限于n-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯酯)和醛)以及对20种常见氨基酸呈惰性但与非天然编码氨基酸中存在的互补官能团特异性反应的官能团(包括但不限于叠氮化物基团、炔烃基团)。应注意，在上式中由y表示的peg的另一端将通过天然存在的或非天然编码氨基酸直接或间接连接至tc多肽。例如，y可以是与多肽的胺基(包括但不限于赖氨酸或n端的ε胺)连接的酰胺、氨基甲酸酯或脲。可选地，y可以是与硫醇基(包括但不限于半胱氨酸的硫醇基)连接的马来酰亚胺键联。可选地，y可以连接至通常无法通过20种常见氨基酸获得的残基。举例来说，peg上的叠氮化物基团可与tc多肽上的炔烃基团反应形成huisgen[3 2]环加成产物。可选地，peg上的炔烃基团可与非天然编码氨基酸中存在的叠氮化物基团反应，以形成类似的产物。在一些实施方案中，强亲核试剂(包括但不限于肼、酰肼、羟胺、氨基脲)可与非天然编码氨基酸中存在的醛基或酮基反应，以形成腙、肟或氨基脲，视情况而定，其在一些情况下可以通过适当的还原剂处理而进一步还原。可选地，强亲核试剂可通过非天然编码氨基酸掺入tc多肽中，并用于优先与水溶性聚合物中存在的酮基或醛基反应。
[0718]
可根据实际需要使用peg的任何分子量，包括但不限于约100道尔顿(da)至100,
000da或根据需要更高(包括但不限于有时0.1-50kda或10-40kda)。peg的分子量可以在广泛范围内，包括但不限于在约100da与约100,000da之间或更大。peg可介于约100da与约100,000da之间，包括但不限于100,000da、95,000da、90,000da、85,000da、80,000da、75,000da、70,000da、65,000da、60,000da、55,000da、50,000da、45,000da、40,000da、35,000da、30,000da、25,000da、20,000da、15,000da、10,000da、9,000da、8,000da、7,000da、6,000da、5,000da、4,000da、3,000da、2,000da、1,000da、900da、800da、700da、600da、500da、400da、300da、200da和100da。在一些实施方案中，peg介于约100da与约50,000da之间。在一些实施方案中，peg介于约100da与约40,000da之间。在一些实施方案中，peg介于约1,000da与约40,000da之间。在一些实施方案中，peg介于约5,000da与约40,000da之间。在一些实施方案中，peg介于约10,000da与约40,000da之间。也可以使用支链peg，包括但不限于每条链的分子量范围为1-100kda(包括但不限于1-50kda或5-20kda)的peg分子。支链peg的每条链的分子量可以是，包括但不限于介于约1,000da与约100,000da之间或更大。支链peg的每条链的分子量可以介于约1,000da与约100,000da之间，包括但不限于100,000da、95,000da、90,000da、85,000da、80,000da、75,000da、70,000da、65,000da、60,000da、55,000da、50,000da、45,000da、40,000da、35,000da、30,000da、25,000da、20,000da、15,000da、10,000da、9,000da、8,000da、7,000da、6,000da、5,000da、4,000da、3,000da、2,000da和1,000da。在一些实施方案中，支链peg的每条链的分子量介于约1,000da与约50,000da之间。在一些实施方案中，支链peg的每条链的分子量介于约1,000da与约40,000da之间。在一些实施方案中，支链peg的每条链的分子量介于约5,000da与约40,000da之间。在一些实施方案中，支链peg的每条链的分子量介于约5,000da与约20,000da之间。在包括但不限于shearwater polymers,inc.目录、nektar therapeutics目录中描述了广泛范围的peg分子，所述目录以引用的方式并入本文。
[0719]
通常，peg分子的至少一个末端可用于与非天然编码氨基酸反应。举例来说，携带用于与氨基酸侧链反应的炔烃和叠氮化物部分的peg衍生物或tlr接头衍生物可用于将peg连接至如本文所描述的非天然编码氨基酸。如果非天然编码氨基酸包含叠氮化物，那么peg通常含有炔烃部分以影响[3 2]环加成产物的形成或含有膦基团的活化peg物质(即酯、碳酸酯)以影响酰胺键的形成。可选地，如果非天然编码的氨基酸包含炔烃，那么peg通常含有叠氮化物部分以影响[3 2]huisgen环加成产物的形成。如果非天然编码氨基酸包含羰基，那么peg通常包含强效亲核试剂(包括但不限于酰肼、肼、羟胺或氨基脲官能团)以分别影响对应腙、肟和缩氨基脲键联。在其他备选方案中，可使用上述反应基的反向定向，即非天然编码氨基酸中的叠氮化物部分可与含有炔烃的peg衍生物反应。
[0720]
在一些实施方案中，具有peg衍生物的tc多肽含有与非天然编码氨基酸侧链上存在的化学官能团反应的化学官能团。
[0721]
在一些实施方案中，本发明提供了包含平均分子量为约800da至约100,000da的水溶性聚合物主链的含叠氮化物和含乙炔的聚合物衍生物。水溶性聚合物的聚合物主链可以是聚(乙二醇)。然而，应理解，包括但不限于聚(乙二醇)和其他相关聚合物(包括聚(葡聚糖)和聚丙二醇)的多种水溶性聚合物也适用于本发明的实践和使用术语peg或聚(乙二醇)意欲涵盖和包括所有此类分子。术语peg包括但不限于任何形式的聚乙二醇，包括双官能peg、多臂peg、衍生的peg、分叉peg、支化peg、悬垂peg(即具有一个或多个悬挂在聚合物主
链上的官能团的peg或相关聚合物)，或其中具有可降解键联的peg。
[0722]
聚乙二醇通常是透明、无色、无味、易溶于水、对热稳定、对许多化学剂呈惰性、不水解或变质，并且通常无毒的。聚(乙二醇)被认为具有生物相容性，也就是说peg能够与活组织或生物共存而不会造成伤害。更具体地，peg基本上是非免疫原性的，也就是说peg不倾向于在体内产生免疫响应。当连接到在体内具有某些所需功能的分子(诸如生物活性剂)时，peg倾向于掩蔽所述剂并可以减少或消除任何免疫响应，从而使生物可以耐受所述剂的存在。peg缀合物往往不会产生显著的免疫响应或引起凝血或其他不良影响。具有式
‑‑
ch2ch2o
‑‑
(ch2ch2o)n‑‑
ch2ch2‑‑
的peg适用于本发明中，其中n是约3至约4000，通常约20至约2000。具有约800da至约100,000da的分子量的peg在本发明的一些实施方案中特别用作聚合物主链。peg的分子量可以在广泛范围内，包括但不限于在约100da与约100,000da之间或更大。peg的分子量可以介于约100da与约100,000da之间，包括但不限于100,000da、95,000da、90,000da、85,000da、80,000da、75,000da、70,000da、65,000da、60,000da、55,000da、50,000da、45,000da、40,000da、35,000da、30,000da、25,000da、20,000da、15,000da、10,000da、9,000da、8,000da、7,000da、6,000da、5,000da、4,000da、3,000da、2,000da、1,000da、900da、800da、700da、600da、500da、400da、300da、200da和100da。在一些实施方案中，peg的分子量介于约100da与约50,000da之间。在一些实施方案中，peg的分子量介于约100da与约40,000da之间。在一些实施方案中，peg的分子量介于约1,000da与约40,000da之间。在一些实施方案中，peg的分子量介于约5,000da与约40,000da之间。在一些实施方案中，peg的分子量介于约10,000da与约40,000da之间。
[0723]
聚合物主链可以是线性的或分支的。支化聚合物主链在本领域中通常是已知的。通常，支化聚合物具有中央支化核部分和连接至中央支化核的多个线性聚合物链。peg通常以支化形式使用，可通过将环氧乙烷加成至各种多元醇(诸如甘油、甘油寡聚物、季戊四醇和山梨糖醇)中来制备。中央支化部分也可以衍生自若干种氨基酸，诸如赖氨酸。支化聚(乙二醇)可以一般形式表示为r(-peg-oh)m，其中r衍生自核部分，诸如甘油、甘油寡聚物或季戊四醇，并且m表示臂数。多臂peg分子，诸如美国专利号5,932,462；5,643,575；5,229,490；4,289,872；美国专利申请2003/0143596；wo 96/21469；以及wo93/21259中所描述的那些分子也可以用作聚合物主链，所述文献中的每一个以引用的方式整体并入本文。
[0724]
支化peg也可以是叉状peg的形式，由peg(
‑‑
ychz2)n表示，其中y是连接基团，并且z是通过界定长度的原子链连接至ch的活化末端基团.还有另一种支化形式，悬垂的peg具有沿着peg主链而不是在peg链末端的反应基，诸如羧基。
[0725]
除了这些形式的peg之外，还可以制备主链中具有弱或可降解键联的聚合物。举例来说，可以制备聚合物主链中具有易水解的酯键的peg。如下所示，这种水解导致聚合物裂解成较低分子量的片段：
[0726]-peg-co
2-peg- h2o
→
peg-co2h ho-peg-[0727]
本领域的普通技术人员理解术语聚(乙二醇)或peg表示或包括本领域已知的所有形式，包括但不限于本文所公开的那些形式。
[0728]
许多其他聚合物也适用于本发明。在一些实施方案中，具有2至约300个末端的水溶性聚合物主链在本发明中特别有用。合适的聚合物的实例包括但不限于其他聚(亚烷基二醇)，诸如聚丙二醇(“ppg”)、其共聚物(包括但不限于乙二醇和丙二醇的共聚物)、其三元
共聚物，其混合物等。尽管聚合物主链的每条链的分子量可以变化，但它通常在约800da至约100,000da范围内，通常在约6,000da至约80,000da范围内。聚合物主链的每条链的分子量可以介于约100da与约100,000da之间，包括但不限于100,000da、95,000da、90,000da、85,000da、80,000da、75,000da、70,000da、65,000da、60,000da、55,000da、50,000da、45,000da、40,000da、35,000da、30,000da、25,000da、20,000da、15,000da、10,000da、9,000da、8,000da、7,000da、6,000da、5,000da、4,000da、3,000da、2,000da、1,000da、900da、800da、700da、600da、500da、400da、300da、200da和100da。在一些实施方案中，聚合物主链的每条链的分子量介于约100da与约50,000da之间。在一些实施方案中，聚合物主链的每条链的分子量介于约100da与约40,000da之间。在一些实施方案中，聚合物主链的每条链的分子量介于约1,000da与约40,000da之间。在一些实施方案中，聚合物主链的每条链的分子量介于约5,000da与约40,000da之间。在一些实施方案中，聚合物主链的每条链的分子量介于约10,000da与约40,000da之间。
[0729]
本领域的普通技术人员将认识到，基本上水溶性主链的上述列表绝不是详尽的，而仅仅是说明性的，并且具有上述品质的所有聚合材料都被认为适用于本发明。
[0730]
在本发明的一些实施方案中，聚合物衍生物是“多官能的”，意指聚合物主链具有至少两个末端，并且可能多达约300个末端，被官能团官能化或活化。多官能聚合物衍生物包括但不限于具有两个末端的线性聚合物，每个末端键结至可能相同或不同的官能团。
[0731]
术语“受保护的”是指存在保护基或防止化学反应性官能团在某些反应条件下反应的部分。保护基将根据被保护的化学反应基的类型而变化。举例来说，如果化学反应基是胺或酰肼，那么保护基可以选自叔丁氧基羰基(t-boc)和9-芴基甲氧基羰基(fmoc)。如果化学反应基是硫醇，那么保护基可以是邻吡啶基二硫化物。如果化学反应基是羧酸，诸如丁酸或丙酸，或羟基，那么保护基可以是苯甲基或烷基，诸如甲基、乙基或叔丁基。本发明中也可以使用本领域中已知的其他保护基。
[0732]
文献中末端官能团的具体实例包括但不限于n-琥珀酰亚胺基碳酸酯(参见例如美国专利号5,281,698、5,468,478)、胺(参见例如buckmann等人makromol.chem.182:1379(1981)、zalipsky等人eur.polym.j.19:1177(1983))、酰肼(参见例如andresz等人makromol.chem.179:301(1978))、琥珀酰亚胺基丙酸酯和琥珀酰亚胺基丁酸酯(参见例如olson等人，poly(ethylene glycol)chemistry&biological applications,第170-181页,harris&zalipsky编,acs,washington,d.c.,1997；也参见美国专利no.5,672,662)、琥珀酰亚胺琥珀酸酯(参见例如abuchowski等人cancer biochem.biophys.7:175(1984)和joppich等人makromol.chem.180:1381(1979)、琥珀酰亚胺酯(参见例如美国专利号4,670,417)、苯并三唑碳酸酯(参见例如美国专利号5,650,234)、缩水甘油醚(参见例如pitha等人eur.j biochem.94:11(1979)、elling等人,biotech.appl.biochem.13:354(1991)、氧基羰基咪唑(参见例如beauchamp,等人,anal.biochem.131:25(1983)、tondelli等人j.controlled release 1:251(1985))、对硝基苯碳酸酯(参见例如veronese等人,appl.biochem.biotech.,11:141(1985)；以及sartore等人,appl.biochem.biotech.,27:45(1991))、醛(参见例如harris等人j.polym.sci.chem.ed.22:341(1984)、美国专利号5,824,784、美国专利号5,252,714)、马来酰亚胺(参见例如goodson等人biotechnology(ny)8:343(1990)、romani等人，chemistry of peptides and proteins 2:29(1984))和kogan,
40kda。
[0739]
在一些实施方案中，叠氮化物末端peg衍生物将具有以下结构：
[0740]
ro-(ch2ch2o)
n-o-(ch2)
m-n3[0741]
其中r是简单的烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2-10并且n是100-1,000(即，平均分子量在5-40kda之间)。
[0742]
在另一个实施方案中，叠氮化物末端peg衍生物将具有以下结构：
[0743]
ro-(ch2ch2o)
n-o-(ch2)
m-nh-c(o)-(ch2)
p-n3[0744]
其中r是简单的烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2-10，p是2-10并且n是100-1,000(即，平均分子量在5-40kda之间)。
[0745]
在本发明的另一个实施方案中，包含含炔烃氨基酸的tc的靶向多肽用含有末端叠氮化物部分的支化peg衍生物修饰，其中支化peg的每条链的分子量范围为10-40kda并且可为5-20kda。例如，在一些实施方案中，叠氮化物末端peg衍生物将具有以下结构：
[0746]
[ro-(ch2ch2o)
n-o-(ch2)
2-nh-c(o)]2ch(ch2)
m-x-(ch2)
p
n3[0747]
其中r是简单的烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2-10，p是2-10并且n是100-1,000，并且x任选地为o、n、s或羰基(c＝o)，在每种情况下都可以存在或不存在。
[0748]
含炔烃的peg衍生物或tlr接头衍生物
[0749]
在本发明的另一个实施方案中，tc的靶向多肽用含有炔烃部分的peg衍生物修饰，所述炔烃部分将与存在于非天然编码氨基酸侧链上的叠氮化物部分反应。
[0750]
在一些实施方案中，炔烃末端peg衍生物将具有以下结构：
[0751]
ro-(ch2ch2o)
n-o-(ch2)mc≡ch
[0752]
其中r是简单的烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2-10并且n是100-1,000(即，平均分子量在5-40kda之间)。
[0753]
在本发明的另一个实施方案中，包含含炔烃的非天然编码氨基酸的tc的靶向多肽是用peg衍生物修饰，所述peg衍生物含有通过酰胺键与peg主链连接的末端叠氮化物或末端炔烃部分。
[0754]
在一些实施方案中，炔烃末端peg衍生物将具有以下结构：
[0755]
ro-(ch2ch2o
)n-o-(ch2)
m-nh-c(o)-(ch2)
p-c≡ch
[0756]
其中r是简单的烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2-10，p是2-10并且n是100-1,000。
[0757]
在本发明的另一个实施方案中，包含含叠氮化物氨基酸的tc的靶向多肽用含有末端炔烃部分的支化peg衍生物修饰，其中支化peg的每条链的分子量范围为10-40kda并且可为5-20kda。例如，在一些实施方案中，炔烃末端peg衍生物将具有以下结构：
[0758]
[ro-(ch2ch2o)
n-o-(ch2)
2-nh-c(o)]2ch(ch2)
m-x-(ch2)
p
c≡ch
[0759]
其中r是简单的烷基(甲基、乙基、丙基等)，m是2-10，p是2-10并且n是100-1,000，并且x任选地为o、n、s或羰基(c＝o)，或不存在。
[0760]
含膦的peg衍生物或tlr接头衍生物
[0761]
在本发明的另一个实施方案中，tc的靶向多肽用peg衍生物修饰，所述peg衍生物含有活化的官能团(包括但不限于酯、碳酸酯)，进一步包含将与存在于非天然编码氨基酸侧链上的叠氮化物部分反应的芳基膦基团。一般来说，peg衍生物或tlr接头衍生物的平均分子量范围为1-100kda，在一些实施方案中，为10-40kda。
[0762]
在一些实施方案中，peg衍生物将具有以下结构：
[0763][0764]
其中n是1-10；x可以是o、n、s或不存在，ph是苯基，并且w是水溶性聚合物。
[0765]
在一些实施方案中，peg衍生物将具有以下结构：
[0766][0767]
其中x可以是o、n、s或不存在，ph是苯基，w是水溶性聚合物，并且r可以是h、烷基、芳基、取代的烷基和取代的芳基。示例性r基团包括但不限于-ch2、-c(ch3)3、-or’、-nr’r”、-sr’、-卤素、-c(o)r’、-conr’r”、-s(o)2r’、-s(o)2nr’r”、-cn和-no2。r’、r”、r
’”
和r
””
各自独立地指氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基(包括但不限于被1-3个卤素取代的芳基)、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳烷基。当本发明的化合物包括多于一个r基团时，当存在多于一个这些基团时，例如每个r基团被独立地选择为每个r'、r”、r”'和r
””
基团。当r'和r”连接至同一氮原子时，它们可与氮原子结合形成5元、6元或7元环。举例来说，-nr’r”意在包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。由取代基的以上讨论，本领域技术人员将理解，术语“烷基”意在包括有包括键结至除了氢基团之外的基团的碳原子的基团，诸如卤代烷基(例如-cf3和-ch2cf3)和酰基(包括但不限于-c(o)ch3、-c(o)cf3、-c(o)ch2och3等)。
[0768]
其他peg衍生物或tlr接头衍生物和一般缀合技术
[0769]
可以与tc多肽连接的其他示例性peg分子以及peg化方法包括但不限于在以下中描述的那些：例如美国专利公开号2004/0001838；2002/0052009；2003/0162949；2004/0013637；2003/0228274；2003/0220447；2003/0158333；2003/0143596；2003/0114647；2003/0105275；2003/0105224；2003/0023023；2002/0156047；2002/0099133；2002/0086939；2002/0082345；2002/0072573；2002/0052430；2002/0040076；2002/0037949；2002/0002250；2001/0056171；2001/0044526；2001/0021763；美国专利号6,646,110；5,824,778；5,476,653；5,219,564；5,629,384；5,736,625；4,902,502；5,281,698；5,122,614；5,473,034；5,516,673；5,382,657；6,552,167；6,610,281；6,515,100；6,461,603；6,436,386；6,214,966；5,990,237；5,900,461；5,739,208；5,672,662；5,446,090；5,808,096；5,612,460；5,324,844；5,252,714；6,420,339；6,201,072；6,451,346；6,306,821；5,559,213；5,747,646；5,834,594；5,849,860；5,980,948；6,004,573；6,129,912；wo 97/32607、ep 229,108、ep 402,378、wo 92/16555、wo 94/04193、wo 94/14758、wo 94/17039、wo 94/18247、wo 94/28024、wo 95/00162、wo 95/11924、wo 95/13090、wo 95/33490、wo 96/00080、wo 97/18832、wo 98/41562、wo 98/48837、wo 99/32134、wo 99/32139、wo 99/32140、wo 96/40791、wo 98/32466、wo 95/06058、ep 439 508、wo 97/03106、wo 96/21469、wo 95/13312、ep 921 131、wo 98/05363、ep 809 996、wo 96/41813、wo 96/07670、ep 605 963、ep 510 356、ep 400 472、ep 183 503和ep 154 316，所述文献都以引用的方式并入本文。本文所描述的peg分子中的任一种可以任何形式使用，包括但不限于单链、支链、多臂链、单官能、双官能、多官能或其任何组合。
[0770]
包括但不限于羟胺(氨氧基)peg衍生物或tlr-接头衍生物的额外聚合物和peg衍生物或tlr-接头衍生物在全部以引用的方式整体并入本文的以下专利申请中描述：美国专利公开号2006/0194256、美国专利公开号2006/0217532、美国专利公开号2006/0217289、美国临时专利号60/755,338；美国临时专利号60/755,711；美国临时专利号60/755,018；国际专利申请号pct/us06/49397；wo 2006/069246；美国临时专利号60/743,041；美国临时专利号60/743,040；国际专利申请号pct/us06/47822；美国临时专利号60/882,819；美国临时专利号60/882,500；以及美国临时专利号60/870,594。
[0771]
tc多肽的糖基化
[0772]
糖基化可显著影响多肽，诸如tc多肽的物理特性(例如溶解度)并且在蛋白质稳定性、分泌和亚细胞定位中也可能是重要的。糖基化多肽还可以表现出增强的稳定性或可以改良一种或多种药代动力学特性，诸如半衰期。另外，溶解度改良可例如使得能够产生比包含非糖基化多肽的配制物更适用于药物施用的配制物。
[0773]
本发明包括掺入携带糖残基的一种或多种非天然编码氨基酸的tc多肽。糖残基可以是天然的(包括但不限于n-乙酰葡糖胺)或非天然的(包括但不限于3-氟半乳糖)。糖可以通过n-连接的或o-连接的糖苷键联(包括但不限于n-乙酰半乳糖-l-丝氨酸)或非天然键联(包括但不限于肟或对应的c-连接的或s-连接的糖苷)。
[0774]
可以体内或体外将糖(包括但不限于糖基)部分添加至tc多肽。在本发明的一些实施方案中，包含含羰基的非天然编码氨基酸的tc的靶向多肽是用氨氧基衍生的糖修饰以产生通过肟键联连接的对应糖基化多肽。一旦连接到非天然编码的氨基酸，糖可以通过用糖基转移酶和其他酶处理以产生键结至tc多肽的寡糖来进一步精制。参见例如h.liu,等人j.am.chem.soc.125:1702-1703(2003)。
[0775]
在本发明的一些实施方案中，包含含羰基的非天然编码氨基酸的tc多肽是直接用作为氨氧基衍生物制备的具有界定结构的聚糖修饰。本领域普通技术人员将认识到，其他官能团，包括叠氮化物、炔烃、酰肼、肼和氨基脲，可用于将糖连接至非天然编码氨基酸。
[0776]
在本发明的一些实施方案中，然后可以通过包括但不限于分别与包括但不限于炔基或叠氮化物衍生物的huisgen[3 2]环加成反应修饰包含含叠氮化物或炔基的非天然编码氨基酸的tc的靶向多肽。这种方法允许以极高的选择性修饰蛋白质。
[0777]
tc二聚体和多聚体
[0778]
本发明还提供了tc和tc类似物组合，诸如同源二聚体、异源二聚体、同源多聚体或异源多聚体(即，三聚体、四聚体等)，其中含有一种或多种非天然编码氨基酸的tc键结至另一种tc或不是tc的任何另一种多肽，要么直接键结至多肽主链或通过接头。由于与单体相比分子量增加，相对于单体tc，tc二聚体或多聚体缀合物可能表现出新的或合乎需要的特性，包括但不限于不同的药理学、药代动力学、药效学、调节的治疗半衰期或调节的血浆半衰期。在一些实施方案中，本发明的tc二聚体将调节tc受体的信号转导。在其他实施方案中，本发明的tc二聚体或多聚体将充当tc受体拮抗剂、激动剂或调节剂。
[0779]
在一些实施方案中，存在于含有二聚体或多聚体的tc中的一个或多个tc分子包含与水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸。
[0780]
在一些实施方案中，包括但不限于通过asn-lys酰胺键或cys-cys二硫键直接连接至tc多肽。在一些实施方案中，tc多肽和/或连接的非tc分子将包含不同的非天然编码氨基
酸以促进二聚化，包括但不限于第一tc多肽的一种非天然编码氨基酸中的炔烃和第二个分子的第二种非天然编码氨基酸中的叠氮化物通过huisgen[3 2]环加成来缀合。可选地，tc和/或包含含酮非天然编码氨基酸的连接的非tc分子可与包含含羟胺非天然编码氨基酸的第二多肽缀合，并且多肽通过形成对应的肟来反应。
[0781]
可选地，两个tc多肽和/或连接的非肽tc分子通过接头连接。任何异源或同源双官能接头可用于连接两个分子，和/或连接的非肽tc分子，所述非肽tc分子可具有相同或不同的一级序列。在一些情况下，用于将tc和/或连接的非肽tc分子连接在一起的接头可以是双官能peg试剂。接头可具有广泛范围的分子量或分子长度。更大或更小分子量的接头可用于提供tc与连接的实体之间或tc与其受体之间或连接的实体与其结合配偶体(如果有的话)之间的所需空间关系或构象。具有更长或更短分子长度的接头也可用于在tc与连接的实体之间或连接的实体和其结合配偶体(如果有的话)之间提供所需的空间或灵活性。
[0782]
在一些实施方案中，本发明提供了具有哑铃结构的水溶性双官能接头，所述哑铃结构包括：a)在聚合物主链的至少第一端上的叠氮化物、炔烃、肼、酰肼、羟胺或含羰基的部分；以及b)在聚合物主链的第二端上的至少第二官能团。第二官能团可以与第一官能团相同或不同。在一些实施方案中，第二官能团不与第一官能团反应。在一些实施方案中，本发明提供了包含支化分子结构的至少一个臂的水溶性化合物。举例来说，支化分子结构可以是树枝状的。
[0783]
在一些实施方案中，本发明提供了通过与具有以下结构的水溶性活化聚合物反应形成的包含一种或多种tc多肽的多聚体：r-(ch2ch2o)
n-o-(ch2)
m-x，其中n是约5至3,000，m是2-10，x可以是叠氮化物、炔烃、肼、酰肼、氨氧基、羟胺、乙酰基或含羰基部分，并且r是可以与x相同或不同的封端基团、官能团或离去基团。r可以是例如选自由以下组成的组的官能团：羟基、受保护的羟基、烷氧基、n-羟基琥珀酰亚胺酯、1-苯并三唑酯、n-羟基琥珀酰亚胺碳酸酯、1-苯并三唑碳酸酯、缩醛、醛、醛水合物、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、受保护的胺、酰肼、受保护的酰肼、受保护的硫醇、羧酸、受保护的羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和三氟乙基磺酸单甲氧基、烯烃和酮。
[0784]
tc多肽活性和tc多肽对her2靶标的亲和力的测量
[0785]
tc多肽活性可以使用标准的或已知的体外或体内测定来确定。可以通过本领域已知的合适方法分析tc的生物活性。此类测定包括但不限于tc反应基因的活化、受体结合测定、抗病毒活性测定、细胞病变效应抑制测定、抗增殖测定、免疫调节测定和监测mhc分子诱导的测定。
[0786]
可以分析tc多肽活化tc敏感信号转导路径的能力。一个实例是干扰素刺激响应元件(isre)测定。组成型表达tc受体的细胞用isre-荧光素酶载体(pisre-luc，clontech)瞬时转染。转染后，用tc的靶向多肽处理细胞。测试了多种蛋白质浓度，例如0.0001-10ng/ml，以生成剂量-响应曲线。如果tc多肽结合并活化tc受体，那么所得信号转导级联会诱导荧光素酶表达。可以通过多种方式测量发光，例如通过使用topcount
tm
或fusion
tm
酶标仪和steady-glor萤光素酶检测系统(promega)。
[0787]
可以分析tc多肽与tc受体结合的能力。对于包含非天然氨基酸的非peg化或peg化的tc多肽，可以使用biacore
tm
生物传感器(pharmacia)测量tc对其受体的亲和力。合适的结
合测定包括但不限于biacore测定(pearce等人biochemistry 38:81-89(1999))和alphascreen
tm
测定(perkinelmer)。
[0788]
无论使用哪种方法来产生tc多肽，都对tc多肽进行生物活性测定。一般来说，生物活性测试应提供对所需结果的分析，诸如生物活性的增加或减少(与修饰的tc相比)、不同的生物活性(与修饰的tc相比)、受体或结合配偶体亲和力分析、tc本身或其受体的构象或结构变化(与修饰的tc相比)、或血清半衰期分析。
[0789]
效力、体内功能半衰期和药代动力学参数的测量
[0790]
本发明的一个重要方面是延长的生物半衰期，其通过在多肽与水溶性聚合物部分缀合或不缀合的情况下构建tc获得。施用后tc血清浓度降低的速率可能使得评估对用缀合和未缀合tc多肽和其变体治疗的生物学响应变得重要。本发明的缀合和未缀合tc多肽和其变体在通过例如皮下施用或静脉内施用后也可以具有延长的血清半衰期，使得有可能通过例如elisa方法或通过初级筛选测定法进行测量。可以使用来自商业来源的elisa或ria试剂盒，诸如invitrogen(carlsbad,ca)。如本文所描述的进行体内生物半衰期的测量。
[0791]
包含非天然编码氨基酸的tc的靶向多肽的效力和功能性体内半衰期可以根据本领域普通技术人员已知的方案来确定。
[0792]
可以在正常sprague-dawley雄性大鼠(每个治疗组n＝5只动物)中评估包含非天然编码氨基酸的tc多肽的药代动力学参数。动物将接受单剂量25ug/只大鼠iv或50ug/只大鼠sc，并且将根据预定的时间进程采集大约5-7个血样，通常涵盖约6小时的未缀合至水溶性聚合物的包含非天然编码氨基酸的tc多肽，以及约4天的包含非天然编码氨基酸缀合至水溶性聚合物的tc多肽。不具有非天然编码氨基酸的tc的药代动力学数据可以直接与包含非天然编码氨基酸的tc多肽获得的数据进行比较。
[0793]
施用和药物组合物
[0794]
本发明的多肽或蛋白质(包括但不限于tc、合成酶、包含一种或多种非天然氨基酸的蛋白质等)任选地用于治疗用途，包括但不限于与合适的药物载剂进行组合。此类组合物例如包含治疗有效量的化合物和药学上可接受的载剂或赋形剂。此类载剂或赋形剂包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇和/或其组合。制备适合施用模式的配制物。一般来说，施用蛋白质的方法是本领域普通技术人员已知的并且可以应用于施用本发明的多肽。组合物可以呈水溶性形式，诸如以药学上可接受的盐形式存在，这意味着包括酸加成盐和碱加成盐。
[0795]
包含一种或多种本发明的多肽的治疗组合物任选地根据本领域的普通技术人员已知的方法在一种或多种合适的体外和/或体内疾病动物模型中进行测试，以确认功效、组织代谢和估算剂量。具体而言，剂量最初可以通过活性、稳定性或本文非天然与天然氨基酸同系物的其他合适量度，即在相关测定中确定(包括但不限于，修饰为包括一种或多种非天然氨基酸的tc的靶向多肽与天然氨基酸tc多肽的比较，以及修饰为包括一种或多种非天然氨基酸的tc的靶向多肽与当前可用的tc治疗的比较)。
[0796]
施用是通过通常用于将分子引入以最终与血液或组织细胞接触的任何途径来达成。本发明的非天然氨基酸多肽是以任何合适的方式施用，任选地与一种或多种药学上可接受的载体一起施用。可以获得在本发明的情形中向患者施用此类多肽的合适方法，并且尽管可以使用多于一种途径来施用特定组合物，但是特定途径通常可以提供比另一种途径
更直接和更有效的作用和反应。
[0797]
药学上可接受的载剂部分地通过所施用的特定组合物以及通过用来施用组合物的特定方法来确定。因此，存在本发明的药物组合物的广泛多种合适配制物。
[0798]
本发明的tc多肽可以通过适合蛋白质或肽的任何常规途径施用，包括但不限于肠胃外，例如注射，包括但不限于皮下或静脉内或任何其他形式的注射或输注。多肽组合物可通过包括但不限于以下的多种途径来施用：口服、静脉内、腹膜内、肌内、透皮、皮下、局部、舌下或直肠方式。包含修饰或未修饰的非天然氨基酸多肽的组合物也可以通过脂质体施用。此类施用途径和适当配制物一般是本领域的技术人员已知的。tc多肽可以单独使用或与其他合适的组分，诸如药物载剂组合使用。tc多肽可以与其他剂或治疗剂组合使用。
[0799]
单独或与其他合适的组分组合的包含非天然氨基酸的tc多肽也可以制成气溶胶配制物(即，它们可以被“雾化”)以通过吸入施用。气溶胶配制物可被置于加压可接受的推进剂，诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等中。
[0800]
适用于肠胃外，诸如通过关节内(在关节中)、静脉内、肌内、皮内、腹膜内以及皮下途径施用的配制物包括水性和非水性的等渗无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使配制物与所预期的接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性的无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。tc的配制物可以单位剂量或多剂量密封容器(诸如安瓿和小瓶)形式呈现。
[0801]
肠胃外施用和静脉内施用是优选的施用方法。特别是，已经用于天然氨基酸同系物治疗剂的施用途径(包括但不限于通常用于epo、gh、g-csf、gm-csf、ifn(例如tc)、白细胞介素、抗体、fgf和/或任何其他药物递送的蛋白质)连同目前使用的配制物为本发明的多肽提供了优选的施用途径和配制物。
[0802]
在本发明的上下文中，向患者施用的剂量足以随着时间或其他适当的活动在患者中产生有益的治疗响应，这取决于应用。通过特定载体或配制物的功效，和所采用非天然氨基酸多肽的活性、稳定性或血清半衰期，和患者的疾患，以及待治疗患者的体重或表面积，确定这种剂量。还通过在特定患者中施用特定载体、配制物等所伴有的任何不利副作用的存在、性质和程度，确定这种剂量的大小。
[0803]
在确定在治疗或防治疾病(包括但不限于中性粒细胞减少症、再生障碍性贫血、周期性中性粒细胞减少症、特发性中性粒细胞减少症、chdiak-higashi综合征、系统性红斑狼疮(sle)、白血病、骨髓增生异常综合征和骨髓纤维化等)中所施用的载体或配制物的有效量中，医生评估循环血浆水平、配制物毒性和疾病进展。
[0804]
例如向70千克患者施用的剂量通常在相当于目前使用的治疗性蛋白剂量的范围内，并根据相关组合物的改变的活性或血清半衰期进行调整。本发明的载体或药物配制物可以通过任何已知的常规疗法，包括抗体施用、疫苗施用、细胞毒性剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物、生物响应调节剂等的施用来补充治疗条件。
[0805]
对于施用，以由相关配制物的ld-50或ed-50，和/或不同浓度的非天然氨基酸多肽观察到的任何副作用，包括但不限于应用于患者的体重和整体健康确定的速率施用本发明的配制物。施用可以通过单次剂量或分开剂量来完成。
[0806]
如果接受配制物输注的患者出现发烧、发冷或肌肉疼痛，那么他/她接受适当剂量的阿司匹林、布洛芬、对乙酰氨基酚或其他疼痛/发烧控制药物。对输注有诸如发烧、肌肉疼
痛和发冷的反应的患者在未来输注前30分钟使用阿司匹林、对乙酰氨基酚或(包括但不限于)苯海拉明进行预先给药。度冷丁用于治疗对退热药和抗组胺药反应不快的更严重的发冷和肌肉疼痛。根据反应的严重程度减慢或停止细胞输注。
[0807]
可以将本发明的tc的靶向多肽的人形式直接施用于哺乳动物受试者。通过任何通常用于将tc多肽引入受试者的途径进行施用。根据本发明的实施方案的tc多肽组合物包括适用于口服、直肠、局部、吸入(包括但不限于通过气雾剂)、口腔(包括但不限于舌下)、阴道、肠胃外(包括但不限于皮下、肌内、皮内、关节内、胸膜内、腹膜内、脑内、动脉内或静脉内)、局部(即皮肤和粘膜表面，包括气道表面)、肺部、眼内、鼻内和透皮施用的那些组合物，尽管在任何给定情况下最合适的途径将取决于所治疗疾患的性质和严重程度。施用可为局部或全身性的。化合物的配制物可以单位剂量或多剂量密封容器(诸如安瓿和小瓶)的形式呈现。本发明的tc多肽可以单位剂量可注射形式(包括但不限于溶液、悬浮液或乳液)与药学上可接受的载剂的混合物形式来制备。本发明的tc多肽也可以通过连续输注(使用，包括但不限于微型泵，诸如渗透泵)、单次推注或缓释储库配制物来施用。
[0808]
适用于施用的配制物包括水性和非水性溶液、等渗无菌溶液(所述溶液可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使配制物等渗的溶质)，以及水性和非水性无菌悬浮液(所述悬浮液可包括助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂)。溶液和悬浮液可由先前所描述的种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
[0809]
冷冻干燥是一种通常用于呈现蛋白质的技术；所述冷冻干燥用于从目标蛋白质配制物中去除水。冷冻干燥或冻干是一种待干燥物质首先冷冻并且然后通过在真空环境中升华而去除冰或冷冻溶剂所用的方法。赋形剂可包括在预冻干配制物中以增强冷冻干燥过程期间的稳定性和/或改良冻干产品在储存时的稳定性。pikal,m.biopharm.3(9)26-30(1990)和arakawa等人pharm.res.8(3):285-291(1991)。
[0810]
药物的喷雾干燥也是本领域普通技术人员已知的。例如参见broadhead,j.等人,"the spray drying of pharmaceuticals,"drug dev.ind.pharm,18(11&12),1169-1206(1992)。除了小分子药物外，还对多种生物材料进行了喷雾干燥，并且这些材料包括酶、血清、血浆、微生物和酵母。喷雾干燥是一种有用的技术，因为它可以一步工艺将液体药物制剂转化为精细、无尘或结块的粉末。基本技术包括以下四个步骤：a)将进料溶液雾化成喷雾；b)喷气接触；c)干燥喷雾；和d)将干燥产品与干燥空气分离。美国专利号6,235,710和6,001,800(其以引用的方式并入本文)描述了通过喷雾干燥制备重组促红细胞生成素。
[0811]
本发明的药物组合物和配制物可包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。药学上可接受的载剂部分地通过所施用的特定组合物以及通过用来施用组合物的特定方法来确定。因此，存在本发明的药物组合物(包括任选的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂)的广泛多种的合适的配制物(参见例如remington’s pharmaceutical sciences,第17版.1985)。
[0812]
合适的载剂包括但不限于含有琥珀酸盐、磷酸盐、硼酸盐、hepes、柠檬酸盐、组氨酸、咪唑、乙酸盐、碳酸氢盐和其他有机酸的缓冲液；抗氧化剂，包括但不限于抗坏血酸；低分子量多肽，包括但不限于少于约10个残基的那些多肽；蛋白质，包括但不限于血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，包括但不限于甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、组氨酸或组氨酸衍生物、甲硫氨酸、谷氨酸或赖氨
酸；单糖、双糖和其他碳水化合物，包括但不限于海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，包括但不限于edta和依地酸二钠；二价金属离子，包括但不限于锌、钴或铜；糖醇，包括但不限于甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，包括但不限于钠和氯化钠；填充剂，诸如微晶纤维素、乳糖、玉米和其他淀粉类；粘合剂；甜味剂和其他调味剂；着色剂；和/或非离子表面活性剂，包括但不限于tween
tm
(包括但不限于tween 80(聚山梨醇酯80)和tween 20(聚山梨醇酯20)、pluronics
tm
和其他普朗尼克酸，包括但不限于普朗尼克酸f68(泊洛沙姆188)，或peg。合适的表面活性剂包括例如但不限于基于聚(环氧乙烷-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)，即(peo-ppo-peo)或聚(环氧丙烷-聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)，即(ppo-peo-ppo)的聚醚，或其组合。peo-ppo-peo和ppo-peo-ppo可以以商品名pluronics
tm
、r-pluronics
tm
、tetronics
tm
和r-tetronics
tm
(basf wyandotte corp.,wyandotte,mich.)商购获得，并在以引用的方式整体并入本文的美国专利号4,820,352中进一步描述。其他乙烯/聚丙烯嵌段聚合物可能是合适的表面活性剂。表面活性剂或表面活性剂的组合可用于稳定peg化的tc以抵抗一种或多种压力，包括但不限于由搅动引起的压力。上述表面活性剂中的一些可能称为“膨胀剂”。一些也可能称为“张力调节剂”。抗菌防腐剂也可应用于产品稳定性和抗菌效果；合适的防腐剂包括但不限于苯甲醇、苯扎氯铵、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯/丙酯、甲酚和苯酚，或其组合。美国专利号7,144,574(其以引用的方式并入本文)描述了可能适用于本发明的药物组合物和制备剂以及其他递送制剂的额外材料。
[0813]
本发明的tc多肽(包括与水溶性聚合物，诸如peg连接的那些多肽)也可以通过缓释系统或作为缓释系统的一部分施用。缓释组合物包括但不限于成形制品形式的半透性聚合物基质，包括但不限于薄膜或微胶囊。缓释基质包括来自生物相容性材料，诸如聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(langer等人,j.biomed.mater.res.,15:267-277(1981)；langer,chem.tech.,12:98-105(1982)、乙烯乙酸乙烯酯(langer等人，同上)或聚-d-(-)-3-羟基丁酸(ep 133,988)、聚丙交酯(聚乳酸)(美国专利号3,773,919；ep 58,481)、聚乙交酯(乙醇酸的聚合物)、聚丙交酯共聚-乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)聚酐、l-谷氨酸和γ-乙基-l-谷氨酸的共聚物(sidman等人,biopolymers,22,547-556(1983)、聚(原)酯、多肽、透明质酸、胶原蛋白、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(诸如苯丙氨酸)、酪氨酸、异亮氨酸、多核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。缓释组合物还包括脂质体包裹的化合物。含有所述化合物的脂质体通过本身已知的方法制备：de 3,218,121；eppstein等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,82:3688-3692(1985)；hwang等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,77:4030-4034(1980)；ep 52,322；ep 36,676；美国专利号4,619,794；ep 143,949；美国专利号5,021,234；日本专利申请83-118008；美国专利号4,485,045和4,544,545；以及ep 102,324。引用的所有参考文献和专利均以引用的方式并入本文。
[0814]
脂质体包裹的tc多肽可以通过例如de 3,218,121；eppstein等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,82:3688-3692(1985)；hwang等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,77:4030-4034(1980)；ep 52,322；ep 36,676；美国专利号4,619,794；ep 143,949；美国专利号5,021,234；日本专利申请83-118008；美国专利号4,485,045和4,544,545；以及ep 102,324中所描述的方法制备。脂质体的组成和大小是众所周知的或能够由本领域普通技术人员根据经验容易地确定。脂质体的一些实例在例如park jw,等人,proc.natl.acad.sci.usa 92:1327-1331(1995)；lasic d和papahadjopoulos d
(编):medical applications of liposomes(1998)；drummond dc,等人,liposomal drug delivery systems for cancer therapy,teicher b(编):cancer drug discovery and development(2002)；park jw,等人,clin.cancer res.8:1172-1181(2002)；nielsen ub,等人,biochim.biophys.acta 1591(1-3):109-118(2002)；mamot c,等人,cancer res.63:3154-3161(2003)中描述。引用的所有参考文献和专利均以引用的方式并入本文。
[0815]
在本发明的上下文中，施用至患者的剂量应足以随着时间的推移在受试者中产生有益的响应。通常，每剂肠胃外施用的本发明的tc多肽的总药学有效量在患者体重的约0.01μg/kg/天至约100μg/kg或约0.05mg/kg至约1mg/kg范围内，尽管这取决于治疗的判断。在所述实施方案的具体方面中，缀合物可以大于4μ/kg/天至约20μg/kg/天的范围内的剂量施用。在又其他方面中，缀合物可以大于4μg/kg/天至约9μg/kg/天的范围内的剂量施用。在又其他方面中，缀合物可以大于4μg/kg/天至约12.5μg/kg/天的范围内的剂量施用。在一个具体方面中，缀合物可以以或低于最大耐受剂量而没有过度毒性的剂量施用。此外，缀合物可以每周至少施用两次或者缀合物可以每周至少施用三次、每周至少四次、每周至少五次、每周至少六次或每周七次。在一个具体方面中，当多余一次施用缀合物时，缀合物可以每次以大于4μg/kg/天的剂量施用。特别地，可以在两周或更长时间的时段内施用缀合物。在某些方面中，与参考样品(即未与本发明的缀合物接触的细胞样品)相比，表达白细胞介素-10受体的细胞的生长可被抑制至少50％、至少65％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。在所述实施方案的一个具体方面中，缀合物可以约5.3μg/kg/天的剂量、或以约7.1μg/kg/天的剂量、或以约9.4μg/kg/天的剂量、或以约12.5μg/kg/天的剂量施用。给药频率也取决于治疗的判断，并且可以比批准用于人的市售tc多肽产品更频繁或更不频繁。通常，本发明的tc的靶向多肽、peg化的tc多肽、缀合的tc多肽或peg化的缀合的tc多肽可以通过上述施用途径中的任一种施用。
[0816]
本发明的tc的治疗用途
[0817]
本发明的tc可用于治疗广泛范围的病症。本发明还包括治疗处于对tc、cd8 t细胞刺激和/或tc配制物有响应处于癌症风险下、正在患有癌症和/或已经患有癌症的哺乳动物的方法。tc的施用可能会产生短期影响，即对观察到的若干个临床参数的直接有益影响，并且这可能在施用后12或24小时内发生，另一方面，也可能产生长期影响，有益地减缓肿瘤生长的进展、缩小肿瘤大小以及/或增加循环cd8 t细胞水平，并且本发明的tc可以通过本领域技术人员已知的任何方式施用，并且可以通过输注，例如通过动脉、腹膜内或静脉内注射和/或输注足以获得所需药理作用的剂量有利地施用。
[0818]
tc剂量的范围可以是每次治疗每公斤体重的10-200mg，或40-80mg tc多肽。举例来说，施用的tc的剂量可以是约20-100mg tc多肽/kg体重，作为推注和/或输注给予临床上必要的时间段，例如持续从几分钟到几小时范围内的时段，例如长达24小时。如有必要，tc施用可重复一次或数次。tc的施用可以与其他药剂，诸如化学治疗剂的施用组合。此外，本发明涉及一种用于防治和/或治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的tc。
[0819]
tc的平均量可以变化并且尤其应该基于合格医生的推荐和处方。tc的确切量是一个偏好问题，受诸如所治疗疾患的确切类型、所治疗患者的疾患以及组合物中的其他成分的因素的影响。本发明还提供了治疗有效量的另一种活性剂的施用。待给予的量可由本领域普通技术人员基于tc疗法容易地确定。
[0820]
实施例
[0821]
提供以下实施例以说明，而非限制要求保护的发明。
[0822]
实施例1:用于合成tlr激动剂的一般方法
[0823]
本实施例提供了用于合成本发明的tlr激动剂的一般方法。
[0824]
所有可商购获得的无水溶剂均未经进一步纯化即使用，并在氮气气氛下储存。tlc在merck硅胶60f254板上使用uv光和/或用kmno4水溶液染色进行可视化。使用实验程序中详述的条件在来自teledyne isco的combiflash rf上进行色谱纯化。使用phenomenex gemini-nx c18 5μm 50
×
4.6mm柱在shimadzu系统上进行分析型hplc，所述柱用乙腈于含0.05％ tfa的水中的线性梯度以1ml/min洗脱。(流动相a：水中的0.05％三氟乙酸；流动相b：90％乙腈(acn)水溶液中的0.05％三氟乙酸)或waters beh 1.7μm v2.1x50 mm柱。分析方法1：1min内0％ b、11min内0-50％ b、0.5min内50-100％b、1.5min内100％ b、1min内100-0％ b、0％ b持续2min；方法2：1min内10-20％ b、11min内20-70％ b、0.5min内70-100％ b、100％ b持续1.5min、1min内100-10％ b、10％ b持续2min；方法3：1min内0-40％ b、11min内40-90％ b、0.5min内90-100％ b、100％ b持续1.5min、1min内100-10％ b、10％ b持续2min；方法4：0.3min内5％ b、0.3min至1.5min内5％至100％ b、1.5min至1.8min内100％ b，0min至1.8min内流速为0.8ml/min至1.1ml/min。
[0825]
使用gemini-nx c18 5μm 100
×
30mm、150
×
30mm或250
×
50mm柱(这取决于规模)在shimadzu系统上进行制备型hplc。在shimadzu lcms-2020系统上记录质谱(ms)，并使用shimadzu labsolutions软件处理数据。agilent 1260infinity二元lc耦合6230accurate-mass tofms系统用于hr-esi-tof分析。nmr光谱数据是在500mhz bruker nmr光谱仪上收集的。化学位移(δ)以ppm为单位报告，并参考氘溶剂信号。耦合常数(j)以赫兹(hz)为单位报告。自旋多重性描述为：s(单峰)、br(宽峰)、d(双峰)、dd(双二重峰)、t(三重峰)、q(四重峰)或m(多重峰)。合并单体抗体，以0.22μm过滤，并储存在≤65℃下直至进一步使用。
[0826]
实施例中使用的缩写包括：-cdi：1,1'-羰基二咪唑，diea：n,n-二异丙基乙胺，dcm：二氯甲烷，diad：偶氮二甲酸二异丙酯，dmf：二甲基甲酰胺，dmtmmt：4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓四氟硼酸盐，etoac：乙酸乙酯，meoh：甲醇，tfa：三氟乙酸。
[0827]
实施例2:包含以下结构-核1的tlr激动剂的合成：
[0828][0829]
在一些实施方案中，x是ch或n；
[0830]
r2是c1至c
12
亚烷基、含氮亚烷基、芳香环或-c(＝nh)nh-或其组合；
[0831]
r3是-h、c1至c
12
烷基、含氮烷基、芳香环或-c(＝nh)nh2或其组合；
[0832]
或r2和r3连接以形成c4至c8亚环烷基；
[0833]
r4是c1至c
12
烷基、c1至c
12
取代的烷基、c4至c8环烷基、c4至c8取代的环烷基、芳香环、
取代的芳香环、芳香杂环、取代的芳香杂环、-onh2末端c1至c
12
烷基或其组合；或r4不存在；
[0834]
z1是c1至c6亚烷基、c3至c8亚环烷基或c3至c8含氮杂环，或其组合；并且
[0835]
r5是c1至c
12
烷基、c1至c
12
取代的烷基、含氧c1至c
12
烷基、c4至c8环烷基、c4至c8取代的环烷基或其组合。
[0836]
具有核1结构的tlr激动剂如以下方案中所公开合成。
[0837][0838]
2-(2-(3-硝基喹啉-4-基氨基)乙氧基)乙基氨基甲酸叔丁酯(1)：将4-氯-3-硝基喹啉(1750mg，8.39mmol)溶解于dcm(30ml)中，并用游离胺(1800mg，8.55mmol)处理，接着用tea(2.29ml，17.3mmol)处理。将反应物在室温下保持18h，然后用h2o(20ml)、盐水(10ml)洗涤，经mgso4干燥并真空浓缩。获得呈黄色固体的目标化合物(1)(3130mg，99％)，ms m/z 399(m na)
。
[0839]
2-(2-(3-氨基喹啉-4-基氨基)乙氧基)乙基氨基甲酸叔丁酯(2)：将硝基化合物(1)(3.12g，8.29mmol)溶解于thf(100ml)和水(80ml)中。以一份添加锌(13.55g，207.2mmol)，接着添加nh4cl(13.3g，248.6mmol)。将悬浮液在室温下剧烈搅拌1h(hplc)。过滤后，用thf(20ml
×
2)洗涤饼。向滤液中添加nacl直至水相饱和。收集液相并分离thf层。将水层用thf/ea(50ml/50ml)萃取。将有机层合并，经mgso4干燥，并浓缩，以获得用于下一步的残余物(2)(3.1g，》100％)。ms m/z 347(m h)
。
[0840]
2-(2-(2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)乙氧基)乙基氨基甲酸叔丁酯(3)：将胺化合物(2)(3.1g，粗品，《8.95mmol)和原戊酸三乙酯(3.1ml，13.5mmol)悬浮于甲苯(200ml)中并加热至110℃。然后添加吡啶hcl(55mg，0.48mmol)。将反应物加热4h。将混合物在室温下保持48h。倾析液体，并将剩余的固体/残余物与甲苯(20ml
×
2)一起搅动，与液体合并并浓缩。将残余物溶解于dcm中并通过柱色谱(dcm中的甲醇，0-10-20％，80g柱)纯化以获得目标化合物(3)(1.05g，从硝基化合物1的2-步骤30％)。ms m/z 413(m h)
。
[0841]
1-(2-(2-(叔丁氧基羰基氨基)乙氧基)乙基)-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉5-氧化物(4)：将化合物3(1.05g，2.54mmol)溶解于dcm(20ml)中并用mcpba(750mg，2.83mmol)处理。将反应物在室温下保持4h。将混合物用nahco3饱和溶液(15ml
×
3)洗涤，干燥并浓缩，以获得用于下一步的粗糖浆(4)(900mg，83％)。ms m/z 429(m h)
。
[0842]
2-(2-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)乙氧基)乙基氨基甲酸叔丁酯(5)：在压力管中，将化合物4(900mg，2.18mmol)溶解于二氯乙烷(25ml)中并用浓氢氧化铵(28％，1ml)处理并且将温度升至80℃。冷却后，在5min内向该混合物中缓慢添加甲苯磺酰氯(470mg，2.46mmol)。添加浓氢氧化铵(0.5ml)并密封管。将管在80℃下加热4h。冷却后，将混合物用dcm(60ml)稀释，用水(40ml)洗涤，干燥并通过硅胶柱色谱纯化，以得到目标化合物(5)(750mg，80％)。ms m/z 428(m h)
。
[0843]
1-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺(a)：在室温下，化合物5(750mg，1.75mmol)用etoh(20ml)中的1.25m hcl处理17h。接下来，将反应物真空干燥，并将残余物重悬于etoh/et2o(1/10；20ml)中并过滤。收集固体，以获得目标化合物(a)(600mg，85％)。hplc(方法1)：5.8min，ms m/z 328(m h)
。
[0844][0845]
4-(2-(2-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)乙氧基)乙基氨基甲酰基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(6)：将化合物a的hcl盐(100mg，0.25mmol)溶解于dcm(10ml)中并用tea(68μl，0 511mmol)处理。向悬浮液中添加4-(氯羰基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(75mg，0.286mmol)。将反应物在室温下保持17h并用dcm/meoh(4ml/1ml)稀释，然后溶液用盐水洗涤。有机相通过硅胶柱色谱纯化，以得到纯产物6(130mg，0.24mmol，96％)。ms m/z 540(m h)
。
[0846]
n-(2-(2-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)乙氧基)乙基)哌嗪-1-甲酰胺(7)：在室温下，化合物(6)(10mg，0.018mmol)用hcl/etoh(约1.5m，1ml)处理1h，然后在60℃下处理1h并真空干燥。将残余物用二乙醚洗涤并干燥，以得到目标化合物(7)(9mg，0.018mmol，定量)。ms m/z 440(m h)
。
[0847][0848]
n-(2-(2-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)乙氧基)乙基)吗啉-4-甲酰胺(8)：使用与针对6所描述的类似程序，通过使化合物a与吗啉-4-羰基氯反应来制备化合物7，以获得目标化合物7(7mg，42％)。ms m/z 441(m h)。
[0849][0850]
4-(2-(2-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)乙氧基)乙基氨基甲酰基)哌嗪-1-甲酸4-((r)-2-((r)-2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苯甲酯(9)：将化合物7(22mg，0.02mmol)溶解于dcm(1ml)中并用dipea(3.5μl，0.02mmol)处理，接着用2-(叔丁氧基羰基氨氧基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(3.3mg，
0.011mmol)处理。将反应物在室温下保持17h。向混合物中添加tfa(0.3ml)，并搅拌15min。真空干燥后，将残余物通过制备型hplc纯化，以得到化合物9(15mg，22％来自7)。ms m/z 918(m h)
。
[0851][0852]
2-丁基-1-(2-(2-(哌嗪-1-甲酰氨基)乙氧基)乙基)-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-基氨基甲酸4-((r)-2-((r)-2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苯甲酯(10))：将化合物6(65mg，0.097mmol)溶解于dmf(2ml)中并用dipea(34μl，0.194mmol)处理，接着用fmoc-vc-pab-pnp(94mg，0.116mmol)处理。将反应物在室温下保持1h，并添加水(10ml)。收集固体，用水(2ml)洗涤并干燥。将黄色固体溶解于dmf(2ml)中并在室温下用二乙胺(100μl，0.97mmol)处理30min。反应混合物通过制备型lc纯化，以得到中间物val-cit-pab-oco-(化合物6)。将该中间物(11mg，0.01mmol)溶解于dcm(1ml)中并用dipea(3.5μl，0.02mmol)处理，接着用2-(叔丁氧基羰基氨氧基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(3.3mg，0.011mmol)处理。将反应物在室温下保持17h。添加tfa(0.3ml)，并搅拌混合物15min。真空干燥后，残余物通过制备型hplc纯化，以得到化合物10(15mg，16％来自化合物6)。ms m/z 918(m h)
。
[0853][0854]
1-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-基氨基甲酸4-((r)-2-((r)-2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苯甲酯(11)：使用5作为起始材料，以与针对10所描述的类似程序制备化合物11，以得到目标化合物11(22mg，21％来自5)。ms m/z 806(m h)
。
[0855][0856]
2-丁基-1-(2-(2-(哌嗪-1-甲酰氨基)乙氧基)乙基)-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-基氨基甲酸4-((r)-2-((r)-2-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)丙酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苯甲酯(12)：使用5，3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯作为起始材料，以与针对10所描述的类似程序制备化合物12，以获得目标化合物12(未用tfa处理)(15mg，17％来自5)。ms m/z 984(m h)
。
[0857][0858]
己二酸-双-(n-(2-(2-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)乙氧基)乙基)哌嗪-1-甲酰胺(13)：在23℃下，向化合物7(8mg，0.018mmol)和己二酸(2mg，0.07mmol)于dmf(1ml)中的溶液中添加edc(3mg，0.016mmol)、hobt(1mg，0.018mmol)和diea(4μl，0.23mmol)。24h后，混合物通过制备型lc纯化并干燥，以获得化合物13(5mg，0.004mmol，23％)。ms m/z 1217(m h)
。
[0859][0860]
4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基氨基甲酸叔丁酯(14)：使用boc-l,4-丁二胺和原丙酸三乙酯作为起始材料，以与针对5所描述的类似的程序制备化合物14，以获得目标化合物14(420mg，1.095mmol，14.5％来自起始材料)。ms m/z 384(m h)
。
[0861]
1-(4-氨丁基)-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺-2hcl(b)：在23℃下，将化合物14(400mg，1.043mmol)添加至dcm(0.5ml)和二噁烷中的4m hcl(10ml，40mmol)。1h后，lcms显示反应完成。真空去除溶剂并在高真空泵下干燥6h，以获得呈淡黄色固体的化合物b(400mg，1.129mmol，99％)。ms m/z 284(m h)
。
[0862][0863]
2-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁氨基)乙酸叔丁酯(15)：在23℃下，向化合物b(31mg，0.109mmol)于dcm(5ml)中的溶液中添加溴乙酸叔丁酯(15μl，0.102mmol)，接着添加tea(88μl，0.681mmol)。24h后，混合物通过制备型lc纯化，以获得呈黄色固体的化合物15(4mg，0.006mmol，6％)。ms m/z 398(m h)
。
[0864][0865]
5-氨基-n-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)吡啶酰胺(16)：在23℃下，向化合物b(25mg，0.071mmol)和5-氨基吡啶-2-甲酸(10mg，0.072mmol)于dmf(1ml)中的溶液中添加hatu(20mg，0.083mmol)和diea(50μl，0.287mmol)。1h后，混合物通过制备型lc纯化并干燥，以获得呈白色固体的化合物16(21mg，0.033mmol，46％)。ms m/z 404(m h)
。
[0866][0867]
n-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-5,6,7-三甲氧基-1h-吲哚-2-甲酰胺(17)a：使用化合物b和5,6,7-三甲氧基-1h-吲哚-2-甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物17，以获得目标化合物17(13mg，0.017mmol，44％)。ms m/z517(m h)
。
[0868][0869]
5-氨基-n-(2-(2-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)乙氧基)乙基)吡啶酰胺(18)：使用化合物a和5-氨基吡啶-2-甲酸作为起始材料，并且以与针对16所描述的类似程序制备化合物18，以获得目标化合物18(24mg，0.036mmol，82％)ms m/z 448(m h)
。
[0870][0871]
3-(4-(n-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)氨磺酰基)苯基)丙酸甲酯(19)：在23℃下，向化合物b(14mg，0.035mmol)和5-氨基吡啶-2-甲酸(6mg，0.043mmol)于dmf(1ml)中的溶液中添加diea(40μl，0.230mmol)。30min后，混合物通过制备型lc纯化并干燥，以获得呈浅黄色固体的化合物19(15mg，0.020mmol，58％)。ms m/z 510(m h)
。
[0872][0873]
1-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-3-(3-(吡咯烷-1-基甲基)苯甲基)脲(20)：在23℃下，向(3-(吡咯烷-1-基甲基)苯基)甲胺(19mg，0.100mmol)和氯甲酸硝基苯酯(21mg，0.104mmol)于dmf(1ml)中的溶液中添加diea(34μl，0.195mmol)。10min后，lcms显示硝基苯酚活化完成。向该混合物中添加化合物b。2h后，混合物通过制备型lc纯化并干燥，以获得呈白色固体的化合物20(3mg，0.006mmol，6％)。
[0874][0875]
n-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)吡嗪-2-甲酰胺(21)：使用化合物b和吡嗪甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似程序制备化合物28，以获得目标化合物21(11mg，0.013mmol，23％)。ms m/z 390(m h)
。
[0876][0877]
2-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)乙基氨基甲酸叔丁酯(22)：使用4-氯-3-硝基喹啉、2-氨乙基氨基甲酸叔丁酯和原戊酸三乙酯作为起始材料，以与针对化合物5所描述的类似的程序制备化合物22，以获得目标化合物22(140mg，0.365mmol，33％)。ms m/z 384(m h)
。
[0878]
1-(4-氨丁基)-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺-3,hcl(c)：使用化合物22作为起始材料，以与针对a所描述的类似的程序制备化合物c，以获得目标化合物c(60mg，0.169mmol，定量)ms m/z 284(m h)
。
[0879][0880]
n-(2-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)乙基)吡嗪-2-甲酰胺(23)：使用化合物c和吡嗪甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物23，以获得目标化合物23(8mg，0.09mmol，29％)。ms m/z 390(m h)
。
[0881][0882]
1-(2-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)乙氨基)-5-胍基-1-氧代戊-2-基氨基甲酸(s)-叔丁酯(24)：使用化合物c和boc-arg-oh作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物24，以获得目标化合物24(75mg，0.098mmol，79％)。ms m/z 540(m h)
。
[0883]
(s)-2-氨基-n-(2-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)乙基)-5-胍基戊酰胺,3hcl(25)：在23℃下，向化合物24(60mg，0.111mmol)中添加二噁烷中的4m hcl(1ml，4mmol)。2h后，真空干燥反应物。将残余物在高真空泵下干燥，以获得呈白色固体的化合物25(64mg，0.110mmol，定量)。
[0884][0885]
1-(2-(2-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)乙氧基)乙氨基)-5-胍基-1-氧代戊-2-基氨基甲酸(s)-叔丁酯(26)：使用化合物a和boc-arg-oh作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物26，以获得目标化合物26(20mg，0.019mmol，59％)。ms m/z584(m h)
。
[0886]
(s)-2-氨基-n-(2-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)乙基)-5-胍基戊酰胺(27)：使用化合物26作为起始材料，以与针对25所描述的类似的程序制备化合物27，以获得目标化合物27(14mg，0.016mmol，定量)。ms m/z 484(m h)
。
[0887][0888]
n-(2-(2-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)乙氧基)乙基)吡嗪-2-甲酰胺(28)：使用化合物a和吡嗪甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物28，以获得目标化合物28(1.3mg，0.001mmol，4％)。ms m/z 434(m h)
。
[0889][0890]
1-(2-(2-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)乙氧基)乙基)胍(29)：在80℃下，向化合物a(15mg，0.038mmol)和甲脒基硫代甲酯双(硫酸酯)(25mg，0.090mmol)于dmf(1ml)和水(1ml)中的溶液中添加tea(50μl，0.358mmol)。18h后，将混合物通过制备型lc纯化，以获得化合物29(12mg，0.017mmol，45％)。ms m/z 370(m h)
。
[0891][0892]
1-(2-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)乙基)胍(30)：使用化合物c作为起始材料，以与针对29所描述的类似的程序制备化合物30，以获得目标化合物30(10mg，0.013mmol，29％)。ms m/z434(m h)
。
[0893][0894]
1-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)胍(31)：使用化合物b作为起始材料，以与针对29所描述的类似的程序制备化合物31，以获得目标化合物31(8mg，0.010mmol，29％)。ms m/z 326(m h)
。
[0895][0896]
(s)-2-乙酰氨基-n-(2-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)乙基)-5-胍基戊酰胺(32)：使用化合物c和乙酰基-精氨酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物32，以获得目标化合物32(18mg，0.025mmol，69％)。ms m/z 482(m h)
。
[0897][0898]
(s)-2-乙酰氨基-n-(2-(2-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)乙氧基)乙基)-5-胍基戊酰胺(33)：使用化合物a和乙酰基-精氨酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物33，以获得目标化合物33(4mg，0.019mmol，67％)。ms m/z 526(m h)
。
[0899][0900]
(s)-2-乙酰氨基-n-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-5-胍基戊酰胺(34)：使用化合物b和乙酰基-精氨酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物34，以获得目标化合物34(5mg，0.007mmol，30％)。ms m/z 482(m h)
。
[0901][0902]
n-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)苯甲酰胺(35)：使用化合物b和苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物35，以获得目标化合物35(8mg，0.013mmol，53％)。ms m/z 388(m h)
。
[0903][0904]
4-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基氨基甲酰基)苯乙基氨基甲酸叔丁酯(36)：使用化合物b和4-((2-boc-氨基)乙基)苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物36，以获得目标化合物36(25mg，0.033mmol，38％)。ms m/z 531(m h)
。
[0905][0906]
n-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-4-胍基丁酰胺(37)：使用化合物b和4-胍基丁酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物37，以获得目标化合物37(10mg，0.016mmol，45％)。ms m/z 411(m h)
。
[0907][0908]
n-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-2,3,5,6-四氟苯甲酰胺(38)：使用化合物b和2,3,5,6-四氟苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物38，以获得目标化合物38(7mg，0.010mmol，36％)。ms m/z 460(m h)
。
[0909][0910]
4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基氨基甲酸叔丁酯(39)：使用4-氯-3-硝基喹啉、4-氨丁基氨基甲酸叔丁酯和原戊酸三乙酯作为起始材料，以与针对化合物5所描述的类似的程序制备化合物39，以获得目标化合物39(177mg，0.430mmol，20％来自起始材料)。ms m/z 412(m h)
。
[0911]
1-(4-氨丁基)-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺-3,hcl(d)：使用化合物39作为起始材料，以与针对a所描述的类似的程序制备化合物d，以获得目标化合物d(180mg，0.431mmol，定量)。ms m/z 312(m h)
。
[0912][0913]
n-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-4-碘苯甲酰胺(40)：使用化合物b和4-碘苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物40，以获得目标化合物40(15mg，0.020mmol，72％)。ms m/z 514(m h)
。
[0914][0915]
n-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-4-(2-胍基乙基)苯甲酰胺(41)：使用化合物b和4-(2-胍基乙基)苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物41，以获得目标化合物41(7mg，0.009mmol，29％)ms m/z 473(m h)
。
[0916][0917]
n-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)苯甲酰胺(42)：使用化合物d和苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物42，以获得目标化合物42(6mg，0.012mmol，38％)。ms m/z 416(m h)
。
[0918][0919]
4-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基氨基甲酰基)苯乙基氨基甲酸叔丁酯(43)：使用化合物d和4-((2-boc-氨基)乙基)苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物43，以获得目标化合物43(9mg，0.010mmol，38％)。ms m/z 559(m h)
。
[0920][0921]
4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基氨基甲酸叔丁酯(44)：使
用4-氯-3-硝基-l,5-萘啶、4-氨丁基氨基甲酸叔丁酯和原戊酸三乙酯作为起始材料，以与针对5所描述的类似的程序制备化合物44，以获得目标化合物44(120mg，0.159mmol，5.3％来自起始材料)。ms m/z 413(m h)
。
[0922]
1-(4-氨丁基)-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c][1,5]萘啶-4-胺,4hcl(e)：使用化合物44作为起始材料，以与针对a所描述的类似的程序制备化合物e，以获得目标化合物e(145mg，0.296mmol，定量)。ms m/z313(m h)
[0923][0924]
n-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)吡嗪-2-甲酰胺(45)：使用化合物d和吡嗪甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物45，以获得目标化合物45(4mg，0.004mmol，14％)ms m/z 418(m h)
。
[0925][0926]
4-氨基-n-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-3-甲氧基苯甲酰胺(46)：使用化合物b和4-氨基-3-甲氧基苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物46，以获得目标化合物46(12.1mg，0.014mmol，58％)。ms m/z 433(m h)
。
[0927][0928]
4-氨基-n-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)苯甲酰胺(47)：使用化合物b和4-氨基苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物47，以获得目标化合物47(6mg，0.007mmol，30％)。ms m/z 403(m h)
。
[0929][0930]
4-氨基-n-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)苯甲酰胺(48)：使用化合物d和4-氨基苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化
合物48，以获得目标化合物48(0.4mg，0.0005mmol，2％)。ms m/z 431(m h)
。
[0931][0932]
4-氨基-n-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-3-甲氧基苯甲酰胺(49)：使用化合物d和4-氨基-3-甲氧基苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物49，以获得目标化合物49(4.2mg，0.005mmol，21％)。ms m/z 461(m h)
。
[0933][0934]
2-乙酰基-n-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)苯甲酰胺(50)：使用化合物d和2-乙酰基苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物50，以获得目标化合物50(7.6mg，0.01mmol，43％)。ms m/z 458(m h)
。
[0935][0936]
n-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-4-(2-氨乙基)苯甲酰胺-4hcl(51)：使用化合物43作为起始材料，以与针对a所描述的类似的程序制备化合物51，以获得目标化合物51(10mg，0.017mmol，定量)。ms m/z 459(m h)
[0937][0938]
n-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c][1,5]萘啶-1-基)丁基)苯甲酰胺苯甲酰胺(52)：使用化合物e和苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物52，以获得目标化合物52(1.5mg，0.002mmol，8％)，ms m/z 417(m h)
。
[0939][0940]
4-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c][1,5]萘啶-1-基)丁基氨基甲酰基)苯乙基氨基甲酸叔丁酯(53)：使用化合物e和4-((2-boc-氨基)乙基)苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物53，以获得目标化合物53(3.8mg，0.004mmol，16％)，ms m/z560(m h)
。
[0941][0942]
n-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c][1,5]萘啶-1-基)丁基)吡嗪-2-甲酰胺(54)：使用化合物d和吡嗪甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物54，以获得目标化合物54(3mg，0.004mmol，20％)，ms m/z 419(m h)
。
[0943][0944]
n-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c][1,5]萘啶-1-基)丁基)-4-胍基丁酰胺(55)：使用化合物e和4-胍基甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物55，以获得目标化合物55(2mg，0.003mmol，12％)。ms m/z 440(m h)
。
[0945][0946]
n-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c][1,5]萘啶-1-基)丁基)-4-(2-氨乙基)苯甲酰胺,4tfa(56)：在23℃下，向化合物53(3.6mg，0.006mmol)中添加dcm(0.5ml)和tfa(1ml)。20min后，将反应物真空干燥，然后在高真空泵下干燥过夜，以获得目标化合物56(7mg，0.008mmol，定量)。ms m/z 460(m h)
。
[0947][0948]
2-乙酰基-n-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c][1,5]萘啶-1-基)丁基)苯甲酰胺(57)：使用化合物e和2-乙酰基苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物57，以获得目标化合物57(5.2mg，0.006mmol，27％)。ms m/z 459(m h)
。
[0949][0950]
4-氨基-n-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c][l,5]萘啶-1-基)丁基)-3-甲氧基苯甲酰胺(58)：使用化合物e和4-氨基-3-甲氧基苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物58，以获得目标化合物58((4.3mg，0.04mmol，20％)ms m/z 462(m h)
。
[0951][0952]
4-氨基-n-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)苯甲酰胺(59)：使用化合物e和4-氨基苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物59，以获得目标化合物59(1.6mg，0.002mmol，8％)ms m/z 432(m h)
。
[0953][0954]
n-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-4-(二甲氨基)苯甲酰胺(60)：使用化合物b和4-二甲氨基苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物60，以获得目标化合物60(1mg，0.001mmol，6％)。ms m/z 431(m h)
。
[0955][0956]
(e)-n-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-3-(4-(二甲氨基)苯基)丙烯酰胺(61)：使用化合物b和4-二甲氨基肉桂酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物61，以获得目标化合物61(2mg，0.003mmol，11％)，ms m/z 457(m h)
。
[0957][0958]
n-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-4-(二甲氨基)苯甲酰胺(62)：使用化合物d和4-二甲氨基苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物62，以获得目标化合物62(3.5mg，0.004mmol，20％)，ms m/z 459(m h)
。
[0959][0960]
(e)-n-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-3-(4-(二甲氨基)苯基)丙烯酰胺(63)：使用化合物d和4-二甲氨基肉桂酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物63，以获得目标化合物63(4.5mg，0.005mmol，25％)。ms m/z 485(m h)
[0961][0962]
n-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c][1,5]萘啶-1-基)丁基)-4-(二甲氨基)苯甲酰胺(64)：使用化合物e和4-二甲氨基苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物64，以获得目标化合物64(0.5mg，0.001mmol，7％)，ms m/z 460(m h)
。
[0963][0964]
(e)-n-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c][1,5]萘啶-1-基)丁基)-3-(4-(二甲氨基)苯基)丙烯酰胺(65)：使用化合物e和4-二甲氨基肉桂酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物65，以获得目标化合物65(0.5mg，0.001mmol，7％)。ms m/z 486(m h)
。
[0965][0966]
(e)-n-(2-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)乙基)-3-(4-(二甲氨基)苯基)丙烯酰胺(66)：使用化合物c和4-二甲氨基肉桂酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物66，以获得目标化合物66(3mg，0.004mmol，16％)。ms m/z 457(m h)
。
[0967][0968]
4-(2-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)乙基氨基甲酰基)苯乙基氨基甲酸叔丁酯(67)：使用化合物c和4-(2-(叔丁氧基羰基氨基)乙基)苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物67，以获得目标化合物67(1.5mg，0.002mmol，11％)。ms m/z 457(m h)
。
[0969]
n-(2-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)乙基)-4-(2-氨乙基)苯甲酰胺(68)：使用化合物67作为起始材料，以与针对56所描述的类似的程序制备化合物68，以获得目标化合物68(2.9mg，0.003mmol，定量)。ms m/z 431(m h)
。
[0970][0971]
1-(4-氨丁基)-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺(f)：使用4-氯-3-硝基-1,5-萘啶、4-氨丁基氨基甲酸叔丁酯和原乙酸三乙酯作为起始材料，以与针对a所描述的类似的程序制备化合物f，以获得目标化合物f(130mg，0.316mmol，9％来自起始材料)。ms m/z 270
(m h)
。
[0972][0973]
n-(4-(4-氨基-2-甲基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)苯甲酰胺(69)：使用化合物f和苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物69，以获得目标化合物69(6.5mg，0.008mmol，42％)。ms m/z 374(m h)
。
[0974][0975]
n-(4-(4-氨基-2-甲基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-4-(二甲氨基)苯甲酰胺(70)：使用化合物f和4-二甲氨基苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物70，以获得目标化合物70(6.5mg，0.009mmol，39％)。ms m/z 417(m h)
。
[0976][0977]
n-(4-(4-氨基-2-甲基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-4-(吡咯烷-1-基)苯甲酰胺(71)：使用化合物f和4-(1-吡咯烷基苯甲酸)作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物71，以获得目标化合物71(3.1mg，0.004mmol，18％)，ms m/z 443(m h)
。
[0978][0979]
n-(4-(4-氨基-2-甲基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-4-(二乙氨基)苯甲酰胺(72)：使用化合物f和4-(二乙氨基)苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物72，以获得目标化合物72(6.4mg，0.008mmol，41％)，ms m/z 445(m h)
。
[0980]
[0981]
3,4-二氨基-n-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)苯甲酰胺(73)：使用化合物b和3,4-二氨基苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物73，以获得目标化合物73(1.1mg，0.001mmol，4％)。ms m/z 418(m h)
。
[0982][0983]
n-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-4-(吡咯烷-1-基)苯甲酰胺(74)：使用化合物b和4-(吡咯烷-1-基)苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物74，以获得目标化合物74(4.5mg，0.005mmol，19％)。ms m/z 457(m h)
。
[0984][0985]
n-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-4-(甲氨基)苯甲酰胺(75)：使用化合物b和4-甲氨基苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物75，以获得目标化合物75(7.6mg，0.009mmol，33％)。ms m/z 417(m h)
。
[0986][0987]
4-氨基-n-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-3-氟苯甲酰胺(76)：使用化合物b和3-氟-4-氨基苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物76，以获得目标化合物76(7mg，0.008mmol，31％)。ms m/z 421(m h)
。
[0988][0989]
n-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-4-(二甲氨基)-3,5-二氟苯甲酰胺(77)：使用化合物b和4-(二甲氨基)-3,5-二氟苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物77，以获得目标化合物77(9.5mg，0.010mmol，41％)。ms m/z 467(m h)
。
[0990][0991]
n-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-4-(二甲氨基)-3-氟苯甲酰胺(78)：使用化合物b和4-(二甲氨基)-3-氟苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物78，以获得目标化合物78(12mg，0.013mmol，49％)。ms m/z 449(m h)
。
[0992][0993]
n-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-4-(二甲氨基)-3-硝基苯甲酰胺(79)：使用化合物b和4-(二甲氨基)-3-硝基苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物79，以获得目标化合物79(11mg，0.012mmol，50％)。ms m/z 476(m h)
。
[0994][0995]
n-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-4-(二乙氨基)苯甲酰胺(80)：使用化合物b和4-(二乙氨基)苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物80，以获得目标化合物80(10mg，0.011mmol，42％)。ms m/z 459(m h)
。
[0996][0997]
n-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-2-(二甲氨基)苯甲酰胺(81)：使用化合物b和2-(二乙氨基)苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物81，以获得目标化合物81(12.2mg，0.014mmol，57％)。ms m/z 431(m h)
。
[0998][0999]
4-氨基-n-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-3,5-二氟苯甲酰胺(82)：使用化合物b和4-氨基-3,5-二氟苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物82，以获得目标化合物82(10.2mg，0.011mmol，49％)。ms m/z 439(m h)
。
[1000][1001]
n-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-4-(二甲氨基)-3-氟苯甲酰胺(83)：使用化合物d和4-(二甲氨基)-3-氟苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物83，以获得目标化合物83(9mg，0.011mmol，50％)。ms m/z 477(m h)
。
[1002][1003]
n-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-4-(二甲氨基)-3,5-二氟苯甲酰胺(84)：使用化合物d和4-(二甲氨基)-3,5-二氟苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物84，以获得目标化合物84(7mg，0.008mmol，38％)。ms m/z 495(m h)
。
[1004][1005]
n-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-4-(二甲氨基)-3-硝
基苯甲酰胺(85)：使用化合物d和4-(二甲氨基)-3-硝基苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物85，以获得目标化合物85(10mg，0.012mmol，54％)。ms m/z 504(m h)
。
[1006][1007]
n-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-4-(吡咯烷-1-基)苯甲酰胺(86)：使用化合物d和4-(1-吡咯烷基氨基)苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物86，以获得目标化合物86(2mg，0.002mmol，11％)。ms m/z 485(m h)
。
[1008][1009]
4-氨基-n-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-3-氟苯甲酰胺(87)：使用化合物d和4-氨基-3-氟-苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物87，以获得目标化合物87(6mg，0.008mmol，20％)。ms m/z 449(m h)
。
[1010][1011]
4-氨基-n-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-3,5-二氟苯甲酰胺(88)：使用化合物d和4-氨基-3,5-二氟-苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物88，以获得目标化合物88(6mg，0.007mmol，34％)，ms m/z 467(m h)
。
[1012][1013]
n-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-4-(二甲氨基)苯甲酰胺(89)：使用化合物b和4-氨基-3,5-二氟苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类
似的程序制备化合物89，以获得目标化合物89(10mg，0.011mmol，27％)，ms m/z 431(m h)
。
[1014][1015]
5-氨基-n-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)吡嗪-2-甲酰胺(90)：使用化合物b和5-氨基吡嗪-2-甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物90，以获得目标化合物90(8mg，0.009mmol，37％)。ms m/z 405(m h)
。
[1016][1017]
4-(3-氨基喹啉-4-基氨基)丁基氨基甲酸叔丁酯(91)：使用4-氯-3-硝基喹啉和4-氨丁基氨基甲酸叔丁酯，以与针对2所描述的类似的程序制备化合物91，以获得目标化合物91(5050mg，15.284mmol，97％来自起始材料)。ms m/z 331(m h)
。
[1018]
4-(2-(乙氧基甲基)-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基氨基甲酸丁基氨基甲酸叔丁酯(92)：在23℃下，向4-(3-氨基喹啉-4-基氨基)丁基氨基甲酸叔丁酯(1070mg，3.238mmol)于无水thf(12ml)中的溶液中添加三乙胺(885μl，8.746mmol)和2-乙氧基乙酰氯(500mg，4.078mmol)。20h后，真空去除溶剂。将残余物溶解于dcm(50ml)中，用饱和碳酸氢钠(50ml)和盐水(50ml)洗涤，并且经mgso4干燥，以获得呈粗品的中间物(4-(3-(2-乙氧基乙酰氨基)喹啉-4-基氨基)丁基氨基甲酸叔丁酯)。将该粗品溶解于meoh(5ml)中，接着在密封管中添加氧化钙(0.5g)。将反应混合物在120℃下加热2.5h。在通过过滤去除cao后，真空去除溶剂，并且将残余物通过制备型lc纯化，以获得化合物92(346mg，0.868mmol，27％)，ms m/z 399(m h)
。
[1019]
1-(4-氨丁基)-2-(乙氧基甲基)-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺,3hcl(g)：使用化合物92，以与针对a所描述的类似的程序制备化合物g，以获得目标化合物g(5270mg，0.595mmol，4％来自起始材料)。ms m/z 312(m h)
。
[1020][1021]
3-氨基-n-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)苯甲酰胺(93)：使用化合物d和3-氨基苯甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物93，以获得目标化合物93(5mg，0.006mmol，19％)ms m/z 431(m h)
。
[1022][1023]
3-氨基-n-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-4-氟苯甲酰胺(94)：在23℃下，向d(10mg，0.024mmol)和3-氨基-4-氟-苯甲酸(4mg，0.026mmol)于dmf(1ml)中的溶液中添加4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基-吗啉鎓四氟硼酸盐(dmtmmt；7mg，0.029mmol)和diea(30μl，0.172mmol)。10min后，混合物通过制备型lc纯化，以获得目标化合物94(5mg，0.006mmol，21％)ms m/z 449(m h)
。
[1024][1025]
3-氨基-n-(4-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-4-氟苯甲酰胺(95)：使用化合物g和3-氨基-4-氟-苯甲酸作为起始材料，以与针对94所描述的类似的程序制备化合物95，以获得目标化合物95(6mg，0.007mmol，26％)。ms m/z 451(m h)
。
[1026][1027]
3-氨基-n-(4-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-4-氟苯甲酰胺(96)：使用化合物g和3-氨基苯甲酸作为起始材料，以与针对94所描述的类似的程序制备化合物96，以获得目标化合物96(5mg，0.006mmol，19％)。ms m/z 433(m h)
。
[1028][1029]
3-氨基-n-(4-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)苯
甲酰胺(97)：使用化合物g和4-氨基-3-甲氧基苯甲酸作为起始材料，以与针对94所描述的类似的程序制备化合物97，以获得目标化合物97(5mg，0.005mmol，23％)。ms m/z 463(m h)
。
[1030][1031]
5-氨基-n-(2-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)乙基)吡嗪-2-甲酰胺(98)：使用化合物c和5-氨基-吡嗪-2-甲酸作为起始材料，以与针对16所描述的类似的程序制备化合物98，以获得目标化合物98(2.13mg，0.002mmol，11％)。ms m/z 405(m h)
。
[1032][1033]
4-氨基-n-(4-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-3-氟苯甲酰胺(99)：使用化合物g和3-氟-4-氨基苯甲酸作为起始材料，以与针对94所描述的类似的程序制备化合物99，以获得目标化合物99(7.37mg，0.008mmol，37％)。ms m/z 451(m h)
。
[1034][1035]
4-氨基-n-(4-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-3,5-二氟苯甲酰胺(100)：使用化合物g和4-氨基-3,5-二氟苯甲酸作为起始材料，以与针对94所描述的类似的程序制备化合物100，以获得目标化合物100(9.7mg，0.011mmol，51％)，ms m/z 469(m h)
。
[1036][1037]
甲基-4-氨基-3,5-二氟苯甲酸酯(101)：向4-氨基-3,5-二氟苯甲酸(2087mg，12.055mmol)于乙腈(15ml)中的溶液中添加亚硫酰氯(12ml)，并且然后加热至80℃。1h后，真空去除溶剂。向混合物中添加甲苯(10ml)，接着真空蒸发。将残余物溶解于无水meoh(5ml)中。0.5h后，真空去除溶剂。将残余物溶解于dcm(20ml)中，用饱和碳酸氢钠(50ml)和盐水(50ml)洗涤，接着在mgso4中干燥并过滤。真空去除溶剂，以获得化合物101(1730mg，9.244mmol，77％)，ms m/z 188(m h)
。
[1038]
1-(1h-咪唑-1-基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基氨基甲酸(s)-叔丁酯(102)：在室温下，向boc-cit-oh(1150mg，4.177mmol)于dmf(5ml)中的溶液中添加cdi(880mg,，5.427mmol)，并且然后加热至60℃。2h后，向该混合物中添加cdi(220mg，1.357mmol)。将反应物在60℃下搅拌1h。3h后，将反应物真空干燥。将残余物用etoac(50ml)稀释，并用水(50ml)、饱和碳酸氢钠(20ml)和盐水(20ml)洗涤。将有机层经mgso4干燥，接着过滤，并且真空去除溶剂，以获得化合物102(1465mg，4.503mmol，粗品)，ms m/z 326(m h)
。
[1039]
(s)-4-(2-(叔丁氧基羰基氨基)-5-脲基戊酰氨基)-3,5-二氟苯甲酸(103)：在23℃下，向化合物103(188mg，0.578mmol)和化合物102(108mg，0.577mmol)于thf(2ml)中的溶液中添加60％ nah(70mg，1.826mmol)。20h后，添加1ml水，并且搅拌混合物10min。真空去除溶剂，并且将残余物通过制备型lc纯化，以获得化合物103(17mg，0.049mmol，9％)，ms m/z 345(m h)
。
[1040]
1-(4-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基氨基甲酰基)-2,6-二氟苯氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基氨基甲酸(s)-叔丁酯(104)：在23℃下，向化合物d(20mg，0.044mmol)和化合物103(17mg，0.040mmol)于dmf(1ml)中的溶液中添加hatu(16mg,0.042mmol)和diea(60μl，0.344mmol)。20min后，将混合物通过制备型lc纯化，以获得化合物104(23mg，0.022mmol，55％)。ms m/z724(m h)
。
[1041]
(s)-n-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-4-(2-氨基-5-脲基戊酰氨基)-3,5-二氟苯甲酰胺(105)：在23℃下，向化合物104(23mg，0.022mmol)于dcm(1ml)中的溶液中添加tfa(1ml)。15min后，真空去除溶剂。向残余物中添加10ml甲苯并再次蒸发。将残余物在高真空泵上干燥，以获得化合物105(24mg，0.022mmol，定量)。ms m/z 624
(m h)
。
[1042]
n-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-4-((s)-2-((s)-2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)-3,5-二氟苯甲酰胺(106)：在23℃下，向fmoc-aoa-val-oh(11mg，0.027mmol)和化合物105(24mg，0.022mmol)于dmf(1ml)中的溶液中添加hatu(9mg，0.037mmol)和diea(40μl，0.023mmol)。10min后，向该混合物中添加哌啶(50μl，5％)。5min后，将混合物通过制备型lc纯化，以获得化合物106(9mg，0.007mmol，27％)，ms m/z 796(m h)
。
[1043][1044]
1-(1h-咪唑-1-基)-1-氧代丙-2-基氨基甲酸(s)-叔丁酯(107)：使用boc-丙氨酸，以与针对102所描述的类似的程序制备化合物107，以获得目标化合物107(730mg，3.051mmol，75％粗品)。ms m/z 326(m h)
。
[1045]
(s)-4-(2-(叔丁氧基羰基氨基)-5-脲基戊酰氨基)-3,5-二氟苯甲酸(108)：使用107，以与针对103所描述的类似的程序制备化合物108，以获得目标化合物108(17mg，0.049mmol，9％)。ms m/z 431(m h)
。
[1046]
(s)-n-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-4-(2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)丙酰氨基)-3,5-二氟苯甲酰胺(109)：使用108和化合物d，以与针对106所描述的类似的程序制备化合物109，以获得目标化合物109(9mg，0.007mmol，31％来自108)。ms m/z 796(m h)
。
[1047][1048]
2-(3-(2-(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基氧基)乙氧基)丙酰氨基)-3-甲基丁酸(s)-叔丁酯(110)：在23℃下，向3-(2-(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基氧基)乙氧基)丙酸(295mg，1.056mmol)和val-otbu-hcl(225mg，1.078mmol)于dcm(5ml)中的溶液中添加dmtmmt(304mg，1.260mmol)和diea(460μl，2.641mmol)。1.5h后，溶液用etoac(100ml)稀释并用1n hcl(100ml)、饱和碳酸氢钠(100ml)和盐水(50ml)洗涤。将有机层经mgso4干燥，过滤，并真空去除溶剂。将残余物通过快速色谱纯化，以获得化合物110(379mg，0.872mmol，83％)。ms m/z 435(m h)
。
[1049]
(s)-2-(3-(2-(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基氧基)乙氧基)丙酰氨基)-3-甲基丁酸(111)：在23℃下，向化合物110(379mg，0.872mmol)的溶液中添加二噁烷中的4m hcl(5ml，20mmol)。20h后，真空去除溶剂并使用高真空泵干燥，以获得化合物111(320mg，0.846mmol，
97％)。ms m/z 379(m h)
。
[1050]
n-(4-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-4-((s)-2-((s)-2-(3-(2-(氨氧基)乙氧基)丙酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)-3,5-二氟苯甲酰胺(112)：在23℃下，向化合物111(3mg，0.007mmol)和化合物105(5mg，0.005mmol)于dmf(1ml)中的溶液中添加dmtmmt(3mg，0.012mmol)和diea(20μl，0.115mmol)。1.5h后，向该混合物中添加水合肼(2μl，0.506mmol)。5min后，将混合物通过制备型lc纯化，以获得化合物112(2mg，0.002mmol，21％)。ms m/z 855(m h)
。
[1051][1052]
(s)-n-(4-((n-(2-(4-氨基-2-丁基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)乙基)甲脒基氨基甲酰氧基)甲基)苯基)-2-((s)-2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰胺(113)：使用化合物30作为起始材料，以与针对106所描述的类似的程序制备化合物113，以获得目标化合物113(2mg，0.001mmol，2％来自化合物30)。ms m/z 805(m h)
。
[1053]
表3-tlr激动剂-核1化合物
[1054]
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[1058]
[1059]
[1060]
[1061]
[1062]
[1063]
[1064]
[1065]
[1066]
[1067][1068]
实施例3：包含以下代表性结构的tlr激动剂的合成-式(i)和式(ii)(图1)的核5：
[1069][1070]
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体或互变异构体，其中
[1071]
a是ch或n；
[1072]
x是o-r1、nh-r1、s-r1或h；
[1073]
yy是-onh2、-n3、-oh、马来酰亚胺、-cooh或-c(＝o)ch2y1，其中y1是卤化物；
[1074]
l1和l2中的每一个独立地为(ch2)m、(ch2)mc(＝o)、(ch2)
m-nh(ch2)n、(ch2)
m-c(＝o)nh(ch2)n、(ch2)
m-oc(＝o)-nh-(ch2)n、(ch2)
m-nhc(＝o)-nh-(ch2)n、(ch2)
m-nh、(ch2)
m-nhc(＝o)、(ch2)
m-nhc(＝o)-(ch2)
n-nhc(＝o)-(ch2)
p
、c(＝o)-(ch2)n、c
3-c8杂环或不存在；其中m、n和p中的每一个独立地为0至12的整数；
[1075]
r1是h、c
1-c
12
烷基、取代的c
1-c
12
烷基、含氧c
1-c
12
烷基、c
3-c8杂环烷基、取代的c
3-c8杂环烷基、c
3-c8环烷基、取代的c
3-c8环烷基、-n3末端取代的c
1-c
12
烷基、(ch2)
q-(och2ch2)
r-ome，其中q和r中的每一个独立地为0至12的整数；
[1076]
r2是c
1-c6亚烷基、c
1-c
12
取代的亚烷基、c
3-c8亚环烷基、c
3-c8取代的亚环烷基、亚芳基、取代的c
6-c
10
亚芳基、包含1-3个杂原子的5-12元亚杂芳基、包含1-3个杂原子的取代的5-12元亚杂芳基或(och2ch2)
ss
，或其组合，或r2不存在；其中ss是1至12的整数，其中每个杂原子独立地为n、o或s；
[1077]
r3是氨基酸的侧链、c
1-c6亚烷基、c
1-c6取代的亚烷基、c
3-c8亚环烷基、c
3-c8亚杂环烷基、取代的c
3-c8亚环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、包含1-3个杂原子的5-12元亚杂芳基、包含1-3个杂原子的取代的5-12元亚杂芳基、含有氨基的c
1-c
12
亚烷基、含有羰基的c
1-c
12
亚烷基、含氧c
1-c
12
亚烷基、-n3末端c
1-c6亚烷基、-cch末端c
1-c6亚烷基、-sh末端c
1-c6亚烷
基、-oh末端c
1-c6亚烷基、含氮c
1-c6亚烷基、-opo3h2末端c
1-c6亚烷基、-opo3h2末端亚芳基、葡糖苷酸末端c
1-c6亚烷基、-n3末端亚芳基、乙炔末端亚芳基、胺末端亚芳基、(ch2)s、(ch2)
s-c(＝o)、(ch2)
s-nh(ch2)
t
、(ch2)
s-c(＝o)nh(ch2)
t
、(ch2)
s-oc(＝o)-nh-(ch2)
t
、(ch2)
s-nhc(＝o)-nh-(ch2)
t
或其组合；或r3不存在；其中每个s和t独立地为0至6的整数；
[1078]
r4是h、c
3-c8环烷基、c
3-c8杂环烷基、c
3-c8取代的杂环烷基、芳基、取代的芳基、(ch2)
u-(och2ch2)
v-ome、二/三支链(ch2)
u-(och2ch2)
v-ome或其组合；或r4不存在；其中每个u和v独立地为1至48的整数
[1079][1080]
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体或互变异构体，其中a是ch或n；
[1081]
x是o-r1、nh-r1、s-r1或h；
[1082]
yy是h、-onh2、-n3、-oh、马来酰亚胺、-cooh或-c(＝o)ch2y1，其中y1是卤化物；
[1083]
l1和l2中的每一个独立地为(ch2)m、(ch2)mc(＝o)、(ch2)
m-nh(ch2)n、(ch2)
m-c(＝o)nh(ch2)n、(ch2)
m-oc(＝o)-nh-(ch2)n、(ch2)
m-nhc(＝o)-nh-(ch2)n、(ch2)
m-nh、(ch2)
m-nhc(＝o)、(ch2)
m-nhc(＝o)-(ch2)
n-nhc(＝o)-(ch2)
p
、c(＝o)-(ch2)n、亚芳基、取代的亚芳基、包含1-3个杂原子的5-12元亚杂芳基、包含1-3个杂原子的取代的5-12元亚杂芳基、包含1-3个杂原子的c
3-c8杂环或不存在；其中m、n和p中的每一个独立地为0至6的整数，其中每个杂原子独立地为n、o或s；
[1084]
l3是c(＝o)、-ch(r5)-、-(aa)
i-或亚芳基，或其组合，或l3不存在；其中每个aa独立地为氨基酸，其中i是1至6的整数；
[1085]
r5是nh-l4-y2或ch
2-l4-y2，其中y2是h或不存在；
[1086]
l4是c(＝o)、c(＝o)o-、-oc(＝o)-、-c(ch2o)
3-、-c(ch2ch2o)
3-、-(aa)
j-、亚芳基、取代的亚芳基、c
3-c8亚环烷基、c
3-c8取代的亚环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、包含1-3个杂原子的5-12元亚杂芳基、包含1-3个杂原子的取代的5-12元亚杂芳基、包含1-3个杂原子的5-12元亚杂环烷基、包含1-3个杂原子的取代的5-12元亚杂环烷基、c
1-c
12
亚烷基、-o-、-nh-、-s-、取代的c
1-c
12
亚烷基、-(ch2)
s-(och2ch2)
t-(ch2)
u-、(ch2)
s-(och2ch2)
t-ome、-n3、-sh、-oh、-nh2、-opo3h2、葡糖苷酸、乙炔或其组合，或l4不存在；其中每个aa独立地为氨基酸，其中j是1至6的整数，其中s和u中的每一个独立地为0至12的整数，其中t独立地为0至48的整数，其中每个杂原子独立地为n、o或s；
[1087]
r1是h、c
1-c
12
烷基、取代的c
1-c
12
烷基、含氧c
1-c
12
烷基、c
3-c8杂环烷基、取代的c
3-c8杂环烷基、c
3-c8环烷基、取代的c
3-c8环烷基、-n3末端取代的c
1-c
12
烷基、(ch2)
q-(och2ch2)
r-ome；其中q和r中的每一个独立地为0至12的整数；
[1088]
r2是c
1-c6亚烷基、c
1-c
12
取代的亚烷基、c
3-c8亚环烷基、c
3-c8取代的亚环烷基、亚芳基、取代的亚芳基、包含1-3个杂原子的5-12元亚杂芳基、包含1-3个杂原子的取代的5-12元亚杂芳基、包含1-3个杂原子的5-12元亚杂环烷基、包含1-3个杂原子的取代的5-12元亚杂环烷基或(och2ch2)r，或其组合，或r2不存在；其中r是1至12的整数，其中每个杂原子独立地为n、o或s；
[1089]
r3是h或-c(＝o)r6、-c(＝o)or6；
[1090]
r6是c
1-c
12
烷基、取代的烷基、取代的芳基、ch
3-(ch2)
s-(och2ch2)
t-(ch2)
u-，其中s、t和u中的每一个独立地为0至12的整数。
[1091]
具有核5结构的tlr激动剂如以下方案中所公开合成。
[1092][1093]
4-((2,6-二氯-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基氨基甲酸叔丁酯、4-((2,6-二氯-7h-嘌呤-7-基)甲基)苯甲基氨基甲酸叔丁酯(114)：在23℃下，向4-(羟甲基)苯甲基氨基甲酸叔丁酯(1280mg，5.394mmol)和2,6-二氯嘌呤(1050mg，5.556mmol)于thf(10ml)中的溶液中添加pph3(1560mg，5.948mmol)。30min后，在0℃下历时5min添加diad(1600μl，8.126mmol)。将混合物在50℃下搅拌。2h后，真空去除溶剂。将残余混合物用etoac(100ml)稀释并使用半饱和碳酸氢钠(100ml)和盐水(20ml)洗涤。将有机层经mgso4干燥并过滤。真空去除溶剂。将残余物通过快速色谱纯化，以获得化合物114(2268mg，《5.555mmol，具有pph3的粗混合物)。ms m/z 409(m h)
。
[1094]
4-((6-氨基-2-氯-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基氨基甲酸叔丁酯(115)：将化合物114(pph3的粗混合物，2268mg，《5.555mmol)置于配备有搅拌棒的耐压玻璃容器中。向该容器中添加meoh中的7nnh3(12ml，84mmol)。将管密封并在120℃下加热。1h后，真空去除溶剂，并将残余物溶解于dcm(100ml)中。通过过滤去除沉淀物。将液体通过快速色谱纯化，以获得化合物115(1043mg，2.682mmol，50％来自2,6-二氯嘌呤)。ms m/z 400(m h)
。
[1095]
4-((6-氨基-2-丁氧基-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基氨基甲酸叔丁酯(116)：在23℃和干燥氮气下，将化合物115(1043mg，2.682mmol)溶解于20％正丁醇钠(5ml，10.4mmol)中，并且将温度升至110℃。1.5h后，向混合物中添加1ml水，接着添加boc酸酐(170mg，0.779mmol)。5min后，真空去除溶剂。将残余物溶解于dcm(30ml)中，用半饱和碳酸氢钠(50ml)和盐水(50ml)洗涤，经mgso4干燥并过滤。真空去除有机溶剂。残余物通过快速色谱纯化，以获得化合物116(560mg，1.313mmol，49％)。ms m/z 427(m h)
。
[1096]
4-((6-氨基-8-溴-2-丁氧基-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基氨基甲酸叔丁酯(117)：在23℃下，向化合物116(560mg，1.313mmol)于dcm(10ml)中的溶液中添加溴(135μl，0.507mmol)。10min后，真空干燥反应物。将残余物溶解于dcm(50ml)中，用半饱和碳酸氢钠(50ml)和盐水(50ml)洗涤，经mgso4干燥并过滤。真空去除溶剂。残余物通过快速色谱纯化，以获得呈hbr盐的化合物117(440mg，0.871mmol，66％)，ms m/z 506(m h)
。
[1097]
6-氨基-9-(4-(氨甲基)苯甲基)-2-丁氧基-7h-嘌呤-8(9h)-酮(118)：将化合物117(240mg，0.410mmol)溶解于37％浓hcl溶液(10ml)中并回流。4.5h后，真空去除溶剂。向残余物中添加水(10ml)和meoh(4ml)，通过添加28％的nh3溶液(9ml)将其中和。真空去除溶剂。将残余物通过制备型lc纯化，以获得化合物118(11mg，0.019mmol，5％)。ms m/z 343(m
h)
。
[1098]
n-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)苯甲基)-2-(氨氧基)乙酰胺(119)：在23℃下，向化合物118(5mg，0.007mmol)和2-(叔丁氧基羰基氨氧基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(3mg，0.010mmol)于dmf(1ml)中的溶液中添加diea(5μl，0.057mmol)。10min后，真空去除溶剂。在23℃下，向残余物中添加dcm(1ml)和tfa(1ml)。10min后，将混合物通过制备型lc纯化，以获得化合物119(3.6mg，0.005mmol，65％)。ms m/z 416(m h)
。
[1099][1100]
n-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)苯甲基)-3-(2-(氨氧基)乙氧基)丙酰胺(120)：在23℃下，向118(5mg，0.007mmol)和3-(2-(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基氧基)乙氧基)丙酸(3mg，0.011mmol)于dmf(1ml)中的溶液中添加dmtmmt(3mg，0.012mmol)和diea(8μl，0.046mmol)。15min后，向混合物中添加水合肼(3μl，0.06mmol)。20min后，将混合物通过制备型lc纯化，以获得化合物120(3.5mg，0.004mmol，59％)。ms m/z 474(m h)
。
[1101][1102]
2,6-二氯-9-(四氢-2h-吡喃-2-基)-9h-嘌呤(121)：向2,6-二氯嘌呤(2950mg，15.608mmol)于乙酸乙酯(100ml)中的磁力搅拌溶液中添加苯磺酸(30mg，0.19mmol)，并且在干燥氮气下将混合物加热至50℃。在50℃下历时1h向搅拌混合物中添加3,4-二氢-2h-吡喃(2200μl，26.153mmol)。将温度降至23℃。1h后，将混合物用半饱和nahco3(50ml)和盐水(50ml)洗涤，经mgso4干燥并过滤。真空去除有机溶剂，将残余物在高真空泵中干燥，以获得化合物121(4170mg，15.269mmol，98％)，ms m/z 274(m h)
。
[1103]
2-氯-9-(四氢-2h-吡喃-2-基)-9h-嘌呤-6-胺(122)：将化合物121(4170mg，15.269mmol)置于配备有搅拌棒的耐压玻璃容器中。向该容器中添加meoh中的7n nh3(12.84mmol)。将管密封并在110℃下加热。3.5h后，将混合物冷却至室温并使其静置过夜。将沉淀过滤并用meoh(5ml)洗涤。将固体在高真空泵上干燥，以获得化合物122(3450mg，13.6mmol，89％)。ms m/z 254(m h)
。
[1104]
2-氯-9-(四氢-2h-吡喃-2-基)-9h-嘌呤-6-胺(123)：将化合物122(1746mg，6.882mmol)置于配备有搅拌棒的耐压玻璃容器中。向该容器中添加正丁胺(7ml，70.86mmol)和diea(2.3ml，13.25mmol)。将管密封并在150℃下加热。5h后，将混合物冷却至室温并且真空去除溶剂。将残余物溶解于dcm(100ml)中，用水(30ml)和盐水(50ml)洗涤，经
mgso4干燥并过滤。真空去除有机溶剂。将残余物(中间物)溶解于meoh(10ml)和tfa(2ml)中，并在23℃下搅拌过夜。18h后，真空去除溶剂。向残余物中添加etoac(10ml)和己烷(50ml)以沉淀。通过过滤收集沉淀并在真空泵中干燥，以获得呈2tfa盐的化合物123(1640mg，3.777mmol，55％)。ms m/z 207(m h)
。
[1105]
n2-丁基-9-((6-氯吡啶-3-基)甲基)-9h-嘌呤-2,6-二胺(124)：向化合物123(1640mg，3.777mmol)和2-氯-5-(氯甲基)吡啶(900mg，5.556mmol)于dmf(5ml)中的溶液中添加k2co3(2600mg，18.813mmol)，并将混合物在50℃和氮气下搅拌。24h后，向混合物中添加冰水(100ml)，并分离沉淀。将沉淀溶解于dcm(100ml)中，用盐水(50ml)洗涤，经mgso4干燥并过滤。真空去除有机溶剂。将残余物通过使用1％至10％ meoh/dcm梯度的快速色谱(硅胶)纯化，以获得化合物124(1020mg，3.074mmol，81％)。ms m/z 332(m h)
。
[1106]
6-氨基-2-(丁氨基)-9-((6-氯吡啶-3-基)甲基)-7h-嘌呤-8(9h)-酮(125)：在23℃下，向化合物124(1020mg，3.074mmol)于dcm(10ml)中的溶液中添加溴(250μl，0.939mmol)。1.5h后，真空去除溶剂。将残余物在高真空泵上干燥。将8-溴-n2-丁基-9-((6-氯吡啶-3-基)甲基)-9h-嘌呤-2,6-二胺,hbr(1500mg，《3.074mmol)的粗中间物溶解于37％的浓hcl溶液(15ml)中，并将溶液回流。8h后，真空去除溶剂。向残余物中添加水(10ml)和meoh(4ml)，并且然后通过添加28％ nh3溶液(5ml)来中和。沉淀的固体通过离心机(5min，4000rpm)分离，并用meoh(2ml)和水(10ml)洗涤。干燥沉淀，以获得化合物125(1100mg，2.421mmol，79％)。ms m/z 348(m h)
。
[1107]
6-氨基-9-((6-(4-(2-氨乙基)哌嗪-1-基)吡啶-3-基)甲基)-2-(丁氨基)-7h-嘌呤-8(9h)-酮(126)：将化合物125(30mg，0.086mmol)和2-(哌嗪-1-基)乙基氨基甲酸叔丁酯(26mg，0.113mmol)的混合物在140℃下加热。20h后，将混合物冷却至23℃。向残余物中添加dcm(0.5ml)和tfa(0.5ml)。30min后。真空去除溶剂，并且将残余物通过制备型lc纯化，以获得呈tfa盐的化合物126(9mg，0.010mmol，12％)。ms m/z 441(m h)
。
[1108]
n-(2-(4-(5-((6-氨基-2-(丁氨基)-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)吡啶-2-基)哌嗪-1-基)乙基)-2-(氨氧基)乙酰胺(127)：在23℃下，向化合物126(9mg，0.010mmol)和2-(叔丁氧基羰基氨氧基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(2.5mg，0.011mmol)于dmf(1ml)中的溶液中添加diea(10μl，0.060mmol)。15min后，真空去除溶剂。向残余物中添加dcm(1ml)和tfa(1ml)。5min后，真空去除溶剂。将残余物通过制备型lc纯化，以获得呈tfa盐的化合物127(8mg，0.008mmol，82％)。ms m/z 514(m h)
。
[1109][1110]
6-氨基-9-((6-(2-((2-氨乙基)(甲基)氨基)乙氨基)吡啶-3-基)甲基)-2-(丁氨基)-7h-嘌呤-8(9h)-酮(128)：将化合物125(30mg，0.086mmol)和2,2'二氨基-n-甲基二乙胺(100μl，0.853mmol)的混合物在130℃下加热。20h后，将混合物冷却至23℃，并通过制备型lc纯化，以获得化合物128(40mg，0.045mmol，52％)。ms m/z 423(m h)
。
[1111]
n-(2-((2-(5-((6-氨基-2-(丁氨基)-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)吡啶-2-基氨基)乙基)(甲基)氨基)乙基)-2-(氨氧基)乙酰胺(129)：使用化合物128作为起始材料，
以与针对127所描述的类似的程序制备化合物129，以获得目标化合物129(13mg，0.012mmol，54％)。ms m/z502(m h)
。
[1112][1113]
nh2o-peg3-pr-(6-氨基-9-((6-(2-((2-氨乙基)(甲基)氨基)乙氨基)吡啶-3-基)甲基)-2-(丁氨基)-7h-嘌呤-8(9h)-酮)乙酰胺(130)：在23℃下，向化合物128(20mg，0.023mmol)和phth-peg4-osu(10mg，0.022mmol)于dmf(1ml)中的溶液中添加diea(50μl，0.287mmol)。5min后，在23℃下，向混合物中添加水合肼(10μl)。5min后，混合物通过制备型lc纯化，以获得化合物130(20mg，0.016mmol，70％)。ms m/z 692(m h)
。
[1114][1115]
6-氨基-2-(丁氨基)-9-((6-(2-((2-羟乙基)(甲基)氨基)乙氧基)吡啶-3-基)甲基)-7h-嘌呤-8(9h)-酮(131)：在23℃下，向化合物125(124mg，0.215mmol)于dmf(4ml)中的溶液中添加n-甲基二乙醇胺(200μl，1.007mmol)和60％ nah(350mg，8.750mmol)。将混合物在60℃和干燥氮气下搅拌。3h后，将1n hcl(4ml)添加至混合物中并通过制备型lc纯化，以获得化合物131(75mg，0.085mmol，39％)。ms m/z 431(m h)
。
[1116][1117]
2-丁氧基-9h-嘌呤-6-胺(132)：在23℃和干燥氮气下，将化合物122(690mg，2.720mmol)溶解于20％正丁醇钠(8ml，16.71mmol)中。添加后，将温度升至100℃。20h后，真空去除溶剂。将残余物溶解于dcm(30ml)中，用半饱和碳酸氢钠(50ml)和盐水(50ml)洗涤，经mgso4干燥并过滤。真空去除有机溶剂。将meoh(5ml)和tfa(1ml)添加至残余物中并在23℃下搅拌。18h后，真空去除溶剂。将残余物溶解于dcm(30ml)中，用碳酸氢钠(50ml)和盐水(50ml)洗涤，经mgso4干燥并过滤。真空去除有机溶剂，以获得粗制的2-丁氧基-9h-嘌呤-6-胺(1300mg，2.987，定量)。ms m/z 208(m h)
。
[1118]
n2-丁基-9-((6-氯吡啶-3-基)甲基)-9h-嘌呤-2,6-二胺(133)：使用化合物132作为起始材料，以与针对124所描述的类似的程序制备化合物133，以获得目标化合物133(468mg，1.406mmol，47％)。ms m/z333(m h)
。
[1119]
n-(2-(4-(5-((6-氨基-2-丁氧基-9h-嘌呤-9-基)甲基)吡啶-2-基)哌嗪-1-基)乙基)-2-(氨氧基)乙酰胺(134)：使用化合物133作为起始材料，以与针对127所描述的类似的程序制备化合物134，以获得目标化合物134(12mg，0.012mmol，10％来自化合物133)。ms m/z 514(m h)
。
[1120][1121]
6-氨基-2-丁氧基-9-((6-氯吡啶-3-基)甲基)-7h-嘌呤-8(9h)-酮(135)：在23℃下，向化合物133(124mg，0.373mmol)于dcm(10ml)中的溶液中添加溴(30μl，0.113mmol)。2h后，真空干燥反应物。将8-溴-2-丁氧基-9-((6-氯吡啶-3-基)甲基)-9h-嘌呤-6-胺,hbr(150mg，《0.373mmol，粗品)的粗残余物溶解于3n hcl溶液(15ml)中并回流。20h后，真空去除溶剂。将混合物通过制备型lc纯化，以获得化合物135(47mg，0.110mmol，29％)。ms m/z 349(m h)
。
[1122]
6-氨基-9-((6-(4-(2-氨乙基)哌啶-1-基)吡啶-3-基)甲基)-2-丁氧基-7h-嘌呤-8(9h)-酮(136)：将化合物135(46mg，0.132mmol)和4-(2-boc-氨乙基)-哌啶(120mg，0.526mmol)混合，并将混合物在140℃下搅拌。25h后，冷却至23℃后，向混合物中添加dcm(1ml)和tfa(1ml)。10min后，真空去除有机溶剂。将混合物通过制备型lc纯化，以获得化合物136(11mg，0.014mmol，11％)。ms m/z 441(m h)
。
[1123]
n-(2-(1-(5-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)吡啶-2-基)哌啶-4-基)乙基)-3-(2-(氨氧基)乙氧基)丙酰胺(137)：使用化合物136和3-(2-(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基氧基)乙氧基)丙酸作为起始材料，以与针对130所描述的类似的程序制备化合物137，以获得目标化合物137(9mg，0.010mmol，70％)，ms m/z 572(m h)
。
[1124][1125]
9-(4-(2-氨乙基)苯甲基)-2-丁氧基-9h-嘌呤-6-胺(138)：在23℃和干燥氮气下，将化合物122(3330mg，13.126mmol)溶解于20％正丁醇钠(25ml)中，并将温度升至100℃。1.5h后，真空去除溶剂。将残余物溶解于dcm(30ml)中，用半饱和碳酸氢钠(50ml)和盐水(50ml)洗涤，经mgso4干燥并过滤。真空去除有机溶剂。将残余物通过使用1％至4％的meoh/dcm梯度的快速色谱纯化，以获得化合物138(2687mg，9.224mmol，70％)。ms m/z 292(m h)
。
[1126]
8-溴-2-丁氧基-9-(四氢-2h-吡喃-2-基)-9h-嘌呤-6-胺(139)：在23℃下，向化合物138(2687mg，9224mmol)于dcm(50ml)中的溶液中添加n-溴代琥珀酰亚胺(2000mg，11069mmol)。1h后，将饱和硫代硫酸钠(20ml)添加至混合物中。将材料用dcm(20ml)萃取。将
有机层用饱和碳酸氢钠(50ml)和盐水(50ml)洗涤，经mgso4干燥并过滤。真空去除有机溶剂。将残余物通过使用20％至70％的etoac/己烷梯度的快速色谱纯化，以获得化合物139(2517mg，6.799mmol，74％)。ms m/z 371(m h)
。
[1127]
2-丁氧基-8-甲氧基-9h-嘌呤-6-胺(140)：在23℃和干燥氮气下，将化合物139(2517mg，6.799mmol)溶解于25％甲醇钠(20ml，42mmol)中。添加后，将温度升至70℃。2.5h后，将混合物真空浓缩，溶解于etoac(100ml)中，用水(100ml)和盐水(100ml)洗涤，经mgso4干燥并过滤。收集有机层并真空蒸发。向残余物中添加meoh(10ml)和tfa(3ml)。添加tfa 48h后，真空去除溶剂。将混合物通过制备型lc纯化，以获得化合物140(708mg，2.984，44％)。ms m/z 238(m h)
。
[1128]
(4-((6-氨基-2-(丁氨基)-8-甲氧基-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯基)甲醇(141)：向化合物140,tfa盐(25mg，0.054mmol)于dmf(2ml)中的溶液中添加碳酸钾(20mg，0.524mmol)和(4-羟甲基)苯甲基氯(11mg，0.070mmol)，并在50℃下搅拌。2h后，浓缩溶剂。向残余物中添加水，并且然后将混合物用dcm(50ml)萃取。将有机层用水(10ml)和盐水(20ml)洗涤，接着经mgso4干燥并过滤。真空去除溶剂。将混合物通过制备型lc纯化，以获得呈tfa盐的化合物141(29mg，0.042mmol，77％)。ms m/z 357(m h)
。
[1129]
6-氨基-2-丁氧基-9-(4-(氯甲基)苯甲基)-7h-嘌呤-8(9h)-酮(142)：向化合物141(607mg，1.037mmol)中添加二氯甲烷(10ml)。向所得悬浮液中添加亚硫酰氯(1000μl)并将混合物在50℃下搅拌3小时。将甲苯(30ml)添加至混合物中并蒸发溶剂。向残余物中再次添加甲苯(100ml)，蒸除溶剂并在减压下干燥，以获得化合物142(402mg，1.111mmol，定量)。ms m/z 362(m h)
。
[1130]
2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基氨基甲酸叔丁酯(143)：向化合物142(166mg，0.384mmol)和4-(2-boc-氨乙基)-哌啶(180mg，0.788mmol)于dmf(2ml)中的溶液中添加diea(1000μl，5.741mmol)并将温度升至80℃。3.5h后，真空去除溶剂。将混合物通过制备型lc纯化，以获得化合物143(205mg，0.229mmol，29％)。ms m/z 554(m h)
。
[1131]
6-氨基-9-(4-((4-(2-氨乙基)哌啶-1-基)甲基)苯甲基)-2-丁氧基-7h-嘌呤-8(9h)-酮(144)：将化合物143(41mg，0.052mmol)溶解于dcm(2ml)和tfa(1ml)中。5min后，真空去除溶剂。向残余物中添加甲苯(5ml)并真空蒸发。将残余物在高真空泵上干燥，以获得呈tfa盐的化合物144(41mg，0.052mmol，定量)。ms m/z 454(m h)
。
[1132]
n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2-(氨氧基)乙酰胺(145)：使用化合物144作为起始材料，以与针对127所描述的类似的程序制备化合物145，以获得目标化合物145(15mg，0.015mmol，87％)。ms m/z 527(m h)
。
[1133][1134]
n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)苯甲基)哌
啶-4-基)乙基)-3-(2-(氨氧基)乙氧基)丙烯酰胺(146)：使用化合物144作为起始材料，以与针对137所描述的类似的程序制备化合物146，以获得目标化合物146(16mg，0.015mmol，87％)。ms m/z 585(m h)
。
[1135][1136]
2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基氨基甲酸叔丁酯(147)：使用化合物142和6-氨己基氨基甲酸叔丁酯作为起始材料，以与针对143所描述的类似的程序制备化合物147，以获得目标化合物147(23mg，0.026mmol，14％)。ms m/z 542(m h)
。
[1137]
6-氨基-9-(4-((6-氨己基氨基)甲基)苯甲基)-2-丁氧基-7h-嘌呤-8(9h)-酮(148)：使用化合物147作为起始材料，以与针对144所描述的类似的程序制备化合物148，以获得目标化合物148(24mg，0.027mmol，定量)。ms m/z 442(m h)
。
[1138]
n-(6-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)苯甲基氨基)己基)-2-(氨氧基)乙酰胺(149)：使用化合物148作为起始材料，以与针对127所描述的类似的程序制备化合物149，以获得目标化合物149(7mg，0.008mmol，31％)。ms m/z 515(m h)
。
[1139][1140]
n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-3-(2-(氨氧基)乙氧基)丙酰胺(150)：在23℃下，向化合物144(14mg，0.018mmol)和n-boc-n,2-二甲基-丙氨酸(5.5mg，0.020mmol)于dmf(1ml)中的溶液中添加dmtmmt(5mg，0.021mmol)和diea(20μl，0.115mmol)。30min后，将混合物通过制备型lc纯化，以获得化合物150(7mg，0.007mmol，37％)。ms m/z653(m h)
。
[1141]
n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2-甲基-2-(甲氨基)丙烯酰胺(151)：使用化合物150作为起始材料，以与针对144所描述的类似的程序制备化合物151，以获得目标化合物151(5.5mg，0.005mmol，定量)。ms m/z 553(m h)
。
[1142][1143]
n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)新戊酰胺(152)：在23℃下，向化合物144(14mg，0.018mmol)和三甲基乙酰氯(2.8μl，0.022mmol)于dmf(1ml)中的溶液中添加diea(20μl，0.115mmol)。1h后，将混合物通过制备型lc纯化，以获得化合物152(7mg，0.008mmol，36％)。ms m/z538(m h)
。
[1144][1145]
n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)乙酰胺(153)：在23℃下，向化合物144(20mg，0.022mmol)和乙酸酐(2.1μl，0.021mmol)于dmf(1ml)中的溶液中添加diea(20μl，0.115mmol)。1h后，将混合物通过制备型lc纯化，以获得化合物153(8mg，0.010mmol，43％)。ms m/z 496(m h)
。
[1146][1147]
4-氨基-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-3,5-二氟苯甲酰胺(154)：使用化合物144和4-氨基-3,5-二氟苯甲酸作为起始材料，以与针对150所描述的类似的程序制备化合物154，以获得目标化合物154(8mg，0.008mmol，38％)。ms m/z 609(m h)
。
[1148][1149]
n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)异丁酰胺(155)：使用化合物144和异丁酸作为起始材料，以与针对150所描述的类似的程序制备化合物155，以获得化合物155(6mg，0.007mmol，32％)。ms m/z 524(m h)
。
[1150][1151]
1,7-双(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙氨基)-1,7-二氧代庚-4-基氨基甲酸叔丁酯(156)：使用化合物144和4-(n-boc-氨基)-1,6-庚二酸作为起始材料，以与针对150所描述的类似的程序制备化合物156，以获得目标化合物156(15mg，0.009mmol，34％)。ms m/z 1147(m h)
。
[1152]
4-氨基-n1,n7-双(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)庚二酰胺(157)：使用化合物156作为起始材料，以与针对144所描述的类似的程序制备化合物157，以获得目标化合物157(15mg，0.01mmol，定量)。ms m/z 1047(m h)
。
[1153]
n1,n7-双(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-4-(2-(氨氧基)乙酰氨基)庚二酰胺(158)：使用化合物157和2-(叔丁氧基羰基氨氧基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯作为起始材料，以与针对145所描述的类似的程序制备化合物158，以获得目标化合物158(5mg，0.003mmol，34％)。ms m/z 1120(m h)
。
[1154][1155]
(s)-2-氨基-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)丙酰胺(173)：在23℃下，向化合物144(20mg，0.022mmol)和n-boc-丙氨酸(5mg，0.026mmol)于dmf(1ml)中的溶液中添加dmtmmt(6mg，0.025mmol)和diea(20μl，0.115mmol)。10min后，真空去除溶剂。向残余物中添加dcm(1ml)和tfa(1ml)。10min后，真空去除溶剂，并且残余物通过制备型lc纯化，以获得化合物173(8mg，0.009mmol，42％)。ms m/z525(m h)
。
[1156][1157]
(s)-2-氨基-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-5-胍基戊酰胺(174)：使用化合物144和n-boc-精氨酸作为起始
材料，以与针对173所描述的类似的程序制备化合物174，以获得目标化合物174(10mg，0.011mmol，48％)。ms m/z 610(m h)
。
[1158][1159]
4-(2-(异丁氨基)乙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(175)：在23℃下，将4-(2-氨乙基)-1-boc-哌啶(520mg，2.278mmol)和异丁醛(230μl，3.190mmol)溶解于甲醇(10ml)中。2h后，向该混合物中添加硼氢化钠(142mg，3.754mmol)。10min后，真空去除溶剂。将残余物溶解于dcm(100ml)中，用饱和nahco3(50ml)和盐水(50ml)洗涤，经mgso4干燥并过滤。真空去除溶剂。将残余物通过制备型lc纯化，以获得呈透明无色固体的化合物175(499mg，1.755mmol，55％)。ms m/z285(m h)
。
[1160]
4-(2-(3-(2-(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基氧基)乙氧基)-n-异丁基丙酰氨基)乙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(176)：在23℃下，向化合物175(80mg，0.201mmol)和phth-peg1-cooh(56mg，0.201mmol)于etoac(10ml)中的溶液中添加cmpi(62mg，0.243mmol)和diea(70μl，0.402mmol)。3h后，通过过滤去除沉淀，并且将滤液用快速色谱纯化，以获得呈白色固体的化合物176(65mg，0.119mmol，59％)。ms m/z 546(m h)
。
[1161]
3-(2-(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基氧基)乙氧基)-n-异丁基-n-(2-(哌啶-4-基)乙基)丙酰胺(177)：使用化合物176作为起始材料，以与针对144所描述的类似的程序制备化合物177，以获得目标化合物177(66mg，0.118mmol，定量)。ms m/z 446(m h)
。
[1162]
n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-3-(2-(氨氧基)乙氧基)-n-异丁基丙酰胺(178)：使用化合物177和化合物142作为起始材料，以与针对143所描述的类似的程序，接着用针对130所描述的水合肼(10μl)处理来制备化合物178，以获得化合物178(19mg，0.019mmol，7％)。ms m/z 641(m h)
。
[1163][1164]
6-氨基-2-丁氧基-9-(4-(哌啶-1-基甲基)苯甲基)-7h-嘌呤-8(9h)-酮(179)：使用化合物142和哌啶作为起始材料，以与针对143所描述的类似的程序制备化合物179，以获得化合物179(31mg，0.041mmol，54％)。ms m/z 411(m h)
。
[1165][1166]
4-氨基-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-3-甲氧基苯甲酰胺(180)：使用化合物144和4-氨基-3-甲氧基苯甲酸作为起始材料，以与针对150所描述的类似的程序制备化合物180，以获得目标化合物180(8mg，0.008mmol，39％)。ms m/z 603(m h)
。
[1167][1168]
(s)-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)丙烯酰胺(181)：使用化合物173和2-(叔丁氧基羰基氨氧基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯作为起始材料，以与针对127所描述的类似的程序制备化合物181，以获得目标化合物181(5mg，0.005mmol，58％)。ms m/z 598(m h)
。
[1169][1170]
(s)-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-5-胍基戊酰胺(182)：使用化合物174和2-(叔丁氧基羰基氨氧基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯作为起始材料，以与针对127所描述的类似的程序制备化合物182，以获得目标化合物182(5mg，0.004mmol，42％)。ms m/z 683(m h)
。
[1171][1172]
9-(4-(4,4'-联哌啶-1-基甲基)苯甲基)-6-氨基-2-丁氧基-7h-嘌呤-8(9h)-酮(183)：使用化合物142和4,4'-联哌啶作为起始材料，以与针对143所描述的类似的程序制备化合物183，以获得化合物183(13mg，0.016mmol，7％)。ms m/z 494(m h)
。
[1173][1174]
6-氨基-9-(4-((1'-(2-(氨氧基)乙酰基)-4,4'-联哌啶-1-基)甲基)苯甲基)-2-丁氧基-7h-嘌呤-8(9h)-酮(184)：使用化合物183和2-(叔丁氧基羰基氨氧基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯作为起始材料，以与针对127所描述的类似的程序制备化合物184，以获得目标化合物184(5mg，0.005mmol，18％)。ms m/z 567(m h)
。
[1175][1176]
3-氨基-n-(2-(1-(4-((4-氨基-6-丁氧基-2-氧代-2,3-二氢-1h-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)苯甲酰胺(185)：使用化合物144和3-氨基苯甲酸作为起始材料，以与针对150所描述的类似的程序制备化合物185，以获得目标化合物185(8mg，0.009mmol，53％)。ms m/z 572(m h)
。
[1177][1178]
n-(2-(1-(4-((4-氨基-6-丁氧基-2-氧代-2,3-二氢-1h-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-4-(2-氨乙基)苯甲酰胺(186)：使用化合物144和4-(2-boc-氨基)乙基苯甲酸作为起始材料，以与针对173所描述的类似的程序制备化合物186，以获得目标化合物186(9mg，0.010mmol，58％)。ms m/z 600(m h)
。
[1179][1180]
4-氨基-n-(2-(1-(4-((4-氨基-6-丁氧基-2-氧代-2,3-二氢-1h-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)苯甲酰胺苯甲酰胺(187)：使用化合物144和4-氨基苯甲酸作为起始材料，以与针对150所描述的类似的程序制备化合物187，以获得目标化合物187(8mg，0.009mmol，53％)。ms m/z 572(m h)
。
[1181]
[1182]
3-氨基-n-(2-(1-(4-((4-氨基-6-丁氧基-2-氧代-2,3-二氢-1h-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-4-氟苯甲酰胺(188)：使用化合物144和3-氨基-4-氟苯甲酸作为起始材料，以与针对150所描述的类似的程序制备化合物188，以获得目标化合物188(11mg，0.011mmol，64％)。ms m/z 590(m h)
。
[1183][1184]
n-(2-(1-(4-((4-氨基-6-丁氧基-2-氧代-2,3-二氢-1h-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-4-(2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)乙基)苯甲酰胺(189)：使用化合物186和2-(叔丁氧基羰基氨氧基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯作为起始材料，以与针对127所描述的类似的程序制备化合物189，以获得目标化合物189(11mg，0.010mmol，94％)，ms m/z 673(m h)
。
[1185][1186]
6-氨基-9-(4-((4-(4-氨苯基)哌啶-1-基)甲基)苯甲基)-2-丁氧基-7h-嘌呤-8(9h)-酮(190)：使用化合物142和4-(4-氨苯基)-哌啶作为起始材料，以与针对143所描述的类似的程序制备化合物190，以获得化合物190(3mg，0.004mmol，5％)。ms m/z 502(m h)
。
[1187][1188]
6-氨基-9-(4-((1'-(3-(2-(氨氧基)乙氧基)丙酰基)-4,4
’-联哌啶-1-基)甲基)苯甲基)-2-丁氧基-7h-嘌呤-8(9h)-酮(191)：使用化合物183作为起始材料，以与针对137所描述的类似的程序制备化合物191，以获得目标化合物191(13mg，0.012mmol，48％)。ms m/z 625(m h)
。
[1189][1190]
n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-4-羟基苯甲酰胺(213)：使用化合物144和4-羟基苯甲酸作为起始材料，以与针对150所描述的类似的程序制备化合物213，以获得目标化合物213(10mg，0.011mmol，66％)。ms m/z 573(m h)
。
[1191][1192]
n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-3-(4-羟苯基)丙酰胺(214)：使用化合物144和3-(4-羟苯基)丙酸作为起始材料，以与针对150所描述的类似的程序制备化合物214，以获得目标化合物214(9mg，0.010mmol，58％)。ms m/z 602(m h)
。
[1193][1194]
boc-lys(boc-氨氧基乙酰基)-oh(215)；在23℃下，向dmf(5ml)中的2-(叔丁氧基羰基氨氧基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(399mg，1.384mmol)和boc-lys-oh(335mg，1.360mmol)中添加diea(750μl，4.306mmol)。2h后，真空去除溶剂。将残余物溶解于etoac(50ml)中，并用1n hcl(50ml)和盐水(20ml)洗涤。将有机层经mgso4干燥，接着过滤。真空去除溶剂。将残余物通过快速色谱纯化，以获得呈白色固体的化合物215(480mg，1.144mmol，83％)。ms m/z 420(m h)
。
[1195]
(s)-2-氨基-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-6-(2-(氨氧基)乙酰氨基)己酰胺(216)：使用化合物144和化合物215作为起始材料，以与针对173所描述的类似的程序制备化合物216，以获得目标化合物216(6mg，0.006mmol，37％)。ms m/z 655(m h)
。
[1196][1197]
(s)-n-(5-氨基-6-(1
’‑
(4-((4-氨基-6-丁氧基-2-氧代-2,3-二氢-1h-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)甲基)苯甲基)-4,4
’‑
联哌啶-1-基)-6-氧代己基)-2-(氨氧基)乙酰胺(217)：使用化合物183和化合物215作为起始材料，以与针对173所描述的类似的程序制备化合物217，以获得目标化合物217(6mg，0.006mmol，37％)。ms m/z 696(m h)
。
[1198][1199]
5-氨基-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)烟酰胺(218)：使用化合物144和5-氨基烟酸作为起始材料，以与针对150所描述的类似的程序制备化合物218，以获得目标化合物218(1mg，0.001mmol，7％)。ms m/z574(m h)
。
[1200][1201]
5-氨基-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)吡嗪-2-甲酰胺(219)：使用化合物144和5-氨基-吡嗪-甲酸作为起始材料，以与针对150所描述的类似的程序制备化合物219，以获得目标化合物219(10mg，0.11mmol，66％)。ms m/z 575(m h)
。
[1202][1203]
6-氨基-2-丁氧基-9-(4-((1'-(4-羟基苯甲酰基)-[4,4'-联哌啶]-1-基)甲基)苯甲基)-7,9-二氢-8h-嘌呤-8-酮(220)：使用化合物183和4-羟基苯甲酸作为起始材料，以与针对150所描述的类似的程序制备化合物220，以获得目标化合物220(10mg，0.011mmol，69％)。ms m/z 614(m h)
。
[1204][1205]
(s)-2-氨基-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-3-(4-氨苯基)丙酰胺(221)：使用化合物144和boc-l-4-氨基苯丙氨酸作为起始材料，以与针对173所描述的类似的程序制备化合物221，以获得目标化合物221(15mg，0.014mmol，85％)。ms m/z 616(m h)
。
[1206][1207]
6-氨基-9-(4-((1'-(5-氨基吡嗪-2-羰基)-4,4'-联哌啶-1-基)甲基)苯甲基)-2-丁氧基-7h-嘌呤-8(9h)-酮(222)：使用化合物183和5-氨基-吡嗪甲酸作为起始材料，以与针对150所描述的类似的程序制备化合物222，以获得目标化合物222(11mg，0.012mmol，73％)。ms m/z615(m h)
。
[1208][1209]
(s)-2-氨基-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙烯酰胺(223)：使用化合物144和boc-l-4-叠氮基甲基苯丙氨酸作为起始材料，以与针对173所描述的类似的程序制备化合物223，以获得目标化合物223(11mg，0.010mmol，90％)。ms m/z 656(m h)
。
[1210][1211]
(s)-2-氨基-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-6-叠氮基己酰胺(224)：使用化合物144和boc-l-叠氮基赖氨酸作为起始材料，以与针对173所描述的类似的程序制备化合物224，以获得目标化合物224(12mg，0.011mmol，93％)。ms m/z 608(m h)
。
[1212][1213]
4-(2-(叔丁氧基羰基氨基)丙酰氨基)苯甲酸(s)-甲酯(225)：在0℃下，向boc-ala-oh(625mg，3.303mmol)于dmf(5ml)中的溶液中添加edci(960mg，5.008mmol)和hobt(450mg，3.330mmol)。30min后，在23℃下，向该混合物中添加甲基-4-氨基苯甲酸酯(500mg，3.307mmol)和dmap(410mg，3.356mmol)。20h后，通过旋转蒸发将溶剂减少至约1ml并用50ml etoac稀释。将溶液用1n hcl(50ml)、饱和碳酸氢钠(50ml)和盐水(50ml)洗涤，经mgso4干燥并过滤。真空去除有机溶剂。将残余物通过快速色谱纯化，以获得呈白色固体的化合物225(180mg，0.558mmol，17％)。ms m/z 323(m h)
。
[1214]
4-(2-氨基丙酰氨基)苯甲酸(s)-甲酯(226)：在23℃下，向化合物225(180mg，0.558mmol)于dcm(1ml)中的溶液中添加tfa(1ml)。20min后，真空去除溶剂。向残余物中添加甲苯(5ml)并真空再蒸发。将残余物在高真空泵中干燥过夜，以获得呈棕色tfa盐的化合物226(200mg，《0.595mmol，定量)。ms m/z 223(m h)
。
[1215]
4-((s)-2-((s)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苯甲酸甲酯(227)：在23℃下，向化合物226(200mg，0.595mmol)和boc-val-oh(130mg，0.598mmol)于dcm(10ml)中的溶液中添加dmtmmt(170mg，0.705mmol)和diea(350μl，2.009mmol)。15min后，真空去除溶剂，并将残余物溶解于etoac(50ml)中，用1n hcl(50ml)、饱和碳酸氢钠(50ml)和盐水(20ml)洗涤。将有机层经mgso4干燥并过滤。通过旋蒸去除溶剂。将残余物通过快速色谱纯化，以获得呈白色固体的化合物227(202mg，0.479mmol，81％)。ms m/z 422(m h)
。
[1216]
4-((s)-2-((s)-2-(叔丁氧羰基氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苯甲酸(228)：在23℃下，向化合物227(202mg，0.479mmol)于meoh(10ml)和水(1ml)中的溶液中添加lioh(24mg，1.002mmol)。24h后，真空去除溶剂，并将残余物溶解于etoac(50ml)中，用1n hcl(50ml)和盐水(20ml)洗涤。将有机层经mgso4干燥并过滤。通过旋蒸去除溶剂。将残余物通过快速色谱纯化，以获得呈白色固体的化合物228(96mg，0.236mmol，49％)。ms m/z 408(m
h)
。
[1217]
n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-4-((s)-2-((s)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苯甲酰胺(229)：使用化合物144和化合物228作为起始材料，以与针对173所描述的类似的程序制备化合物229，以获得目标化合物229(14mg，0.012mmol，97％)。ms m/z 743(m h)
。
[1218]
n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-4-((s)-2-((s)-2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苯甲酰胺(230)：在23℃下，向化合物229(14mg，0.012mmol)和2-(叔丁氧基羰基氨氧基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(4mg，0.014mmol)于dmf(1ml)中的溶液中添加diea(30μl，0.172mmol)。10min后，真空去除溶剂，并向残余物中添加dcm(1ml)和tfa(1ml)。10min后，真空去除溶剂。将残余物通过制备型lc纯化，以获得目标化合物230(11mg，0.009mmol，74％)。ms m/z 816(m h)
。
[1219][1220]
5-氨基-6-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙氨基)-6-氧代己基氨基甲酸(s)-(9h-芴-9-基)甲酯(231)：使用化合物144和boc-lys(fmoc)-oh作为起始材料，以与针对173所描述的类似的程序制备化合物231，以获得目标化合物231(85mg，00.074mmol，67％)。ms m/z 804(m h)
。
[1221]
((s)-1-(((s)-1-(((s)-6-氨基-1-((2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)氨基)-1-氧代己-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯(232)：在23℃下，向化合物231(24mg，0.019mmol)和boc-val-ala-oh(6mg，0.021mmol)于dmf(1ml)中的溶液中添加dmtmmt(7mg，0.029mmol)和diea(30μl，0.172mmol)。10min后，向混合物添加哌啶(100μl)。10min后，将混合物通过制备型lc纯化，以获得呈浅棕色固体的化合物232(24mg，0.018mmol，96％)。
[1222]
(s)-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2-((s)-2-((s)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基丙酰氨基)-6-(2-(氨氧基)乙酰氨基)己酰胺(233)：使用化合物232和2-(叔丁氧基羰基氨氧基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯作为起始材料，以与针对230所描述的类似的程序制备化合物233，以获得目标化合物233(22mg，0.016mmol，79％)。ms m/z 825(m h)
。
[1223][1224]
(s)-6-氨基-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2-peg24-酰氨基己酰胺(234)：在23℃下，向化合物231(11mg，0.0109mmol)和peg24-nhs(12mg，0.010mmol)于dmf(1ml)中的溶液中添加diea(12μl，0.069mmol)。20min后，向混合物中添加哌啶(50μl)。10min后，混合物通过制备型lc纯化，以获得呈透明固体的化合物234(18mg，0.008mmol，96％)。ms m/z 1682(m-h)
。
[1225]
(s)-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-6-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-2-peg24-酰氨基己酰胺(235)：使用化合物234和2-(叔丁氧基羰基氨氧基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯作为起始材料，以与针对230所描述的类似的程序制备化合物235，以获得目标化合物235(13mg，0.006mmol，66％)。ms m/z 1753(m-h)
。
[1226][1227]
(s)-1-((s)-1-((s)-6-氨基-1-(2-(1-(4-((4-氨基-6-丁氧基-2-氧代-2,3-二氢-1h-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙氨基)-1-氧代己-2-基氨基)-1-氧代丙-2-基氨基)-3-甲基-1氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯(236)：使用化合物231和boc-val-ala-pabc-pnp作为起始材料，以与针对232所描述的类似的程序制备化合物236，以获得目标化合物236(18mg，0.012mmol，71％)。ms m/z 1001(m h)
。
[1228]
((s)-17-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)-1-(9h-芴-9-基)-3,7,14-三氧代-2,5-二氧杂-4,8,15-三氮杂十七烷-13-基)氨基甲酸4-((s)-2-((s)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苯甲酯(237)：使用化合物236和2-(((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基氨氧基)乙酸作为起始材料，以与针对173所描述的类似的程序制备化合物237，以获得目标化合物237(19mg，0.012mmol，93％)。ms m/z 1197(m h)
。
[1229]
((s)-1-((2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)氨基)-6-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-1-氧代己-2-基)氨基甲酸4-((s)-2-((s)-3-甲基-2-peg24-酰氨基丁酰氨基)丙酰氨基)苯甲酯(238)：使用化合物237和peg24-nhs作为起始材料，以与针对234所描述的类似的程序制备化合物238，以获得目标化合物238(8mg，0.003mmol，27％)ms m/z 1037(m 2h)
。
[1230][1231]
((s)-1-((2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)氨基)-6-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-1-氧代己-2-基)氨基甲酸4-((s)-2-((s)-2-乙酰氨基-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苯甲酯(239)：使用化合物237和乙酸酐作为起始材料，以与针对234所描述的类似的程序制备化合物239，以获得目标化合物239(6mg，0.004mmol，71％)ms m/z 1016(m h)
。
[1232][1233]
(s)-2-氨基-n-(2-(1-(4-((4-氨基-6-丁氧基-2-氧代-2,3-二氢-1h-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-3-叠氮基丙酰胺(240)：使用化合物144和boc-l-叠氮基丙氨酸作为起始材料，以与针对173所描述的类似的程序制备化合物240，以获得目标化合物240(10mg，0.010mmol，89％)。ms m/z 566(m h)
。
[1234][1235]
(s)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-(4-((4-((叔丁氧基羰基氨氧基)甲基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)甲基)苯基)丙酸(241)：在23℃下，向boc-l-叠氮基甲基-苯丙氨酸(120mg，0.375mmol)和丙-2-炔基氧基氨基甲酸叔丁酯(70mg，0.409mmol)于dcm(1ml)中的溶液中添加cubr(55mg，0.383mmol)。2小时后，将混合物通过制备型lc纯化，以获得呈白色固体的化合物241(9mg，0.018mmol，5％)。ms m/z 492(m h)
。
[1236]
(s)-2-氨基-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-3-(4-((4-((氨氧基)甲基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)甲基)苯基)丙酰胺(242)：在23℃下，向化合物144(8mg，0.009mmol)和化合物241(9mg，0.018mmol，粗品)于dmf(1ml)中的溶液中添加dmtmmt(5mg，0.021mmol)和diea(12μl，0.069mmol)。10min后，真空去除溶剂，并向残余物中添加dcm(1ml)和tfa(1ml)。10min后，
lcms显示脱保护反应完成。将混合物通过制备型lc纯化，以获得化合物242(6mg，0.004mmol，71％)，ms m/z 725(m-h)
。
[1237][1238]
(s)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-(4-((1,3-二氧代异吲哚啉-2-基氧基)甲基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)丙酸(243)：使用boc-l-叠氮基-ala-oh和2-丙-2-炔氧基异吲哚啉-1,3-二酮作为起始材料，以与针对242所描述的类似的程序制备化合物243，以获得目标化合物243(130mg，0.238mmol，84％)。ms m/z 432(m h)
。
[1239]
(s)-2-氨基-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-3-(4-((氨氧基)甲基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)丙酰胺(244)：在23℃下，向化合物144(10mg，0.011mmol)和化合物243(7mg，0.013mmol)于dmf(1ml)中的溶液中添加dmtmmt(5mg，0.021mmol)和diea(12μl，0.069mmol)。10min后，真空去除溶剂，并向残余物中添加dcm(1ml)和tfa(1ml)。15min后，真空去除溶剂，并向残余物中添加dcm(1ml)和水合肼(0.1ml)。2h后，真空去除溶剂，并且将残余物通过制备型lc纯化，以获得呈无色透明固体的化合物244(10mg，0.010mmol，89％)。ms m/z 637(m h)
。
[1240][1241]
(s)-2-氨基-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-3-羟基丙酰胺(245)：使用boc-l-ser-oh和化合物144作为起始材料，以与针对242所描述的类似的程序制备化合物245，以获得目标化合物245(7mg，0.007mmol，64％)。ms m/z 541(m h)
。
[1242][1243]
(s)-2-氨基-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-3-(4-羟苯基)丙酰胺(246)：使用boc-l-tyr-oh和化合物144作为起始材料，以与针对242所描述的类似的程序制备化合物246，以获得目标化合物246(8mg，0.007mmol，68％)。ms m/z 617(m h)
。
[1244][1245]
(s)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-6-(4-((1,3-二氧代异吲哚啉-2-基氧基)甲基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)己酸(247)：使用boc-l-叠氮基-lys-oh和2-丙-2-炔氧基异吲哚啉-1,3-二酮作为起始材料，以与针对241所描述的类似的程序制备化合物247，以获得目标化合物247(57mg，0.097mmol，53％)。ms m/z 474(m h)
。
[1246]
(s)-2-氨基-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-6-(4-((氨氧基)甲基)-1h-1,2,3-三唑-1-基)己酰胺(248)：使用化合物144和化合物247作为起始材料，以与针对244所描述的类似的程序制备化合物248，以获得目标化合物248(10mg，0.010mmol，89％)。ms m/z 679(m h)
。
[1247][1248]
(s)-(2-((5-氨基-6-((2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)氨基)-6-氧代己基)氨基)-2-氧代乙氧基)氨基甲酸叔丁酯(249)：在50℃下，向2-(((叔丁氧基羰基)氨基)氧基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(380mg，1.318mmol)和fmoc-l-lys-oh(444mg，1.205mmol)于dmf(5ml)中的溶液中添加diea(660μl，3.789mmol)。1h后，真空去除溶剂，将残余物溶解于etoac(50ml)中并用1n hcl(50ml)和盐水(20ml)洗涤。将有机层经mgso4干燥，然后过滤。真空去除溶剂。将残余物通过使用meoh/dcm梯度(0-10％)的快速色谱纯化，以获得化合物249(466mg，0.860mmol，65％)。ms m/z 542(m h)
。
[1249]
(s)-(2-((5-氨基-6-((2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)氨基)-6-氧代己基)氨基)-2-氧代乙氧基)氨基甲酸叔丁酯(250)：在23℃下，向化合物144(180mg，0.198mmol)和化合物249(105mg，0.194mmol)于dmf(2ml)中的溶液中添加dmtmmt(68mg，0.282mmol)和diea(200μl，1.148mmol)。10min后，向混合物中添加哌啶(100μl)。20min后，lcms显示脱保护反应完成。将混合物通过制备型lc纯化，以获得目标化合物250(160mg，0.146mmol，74％)。ms m/z 755(m h)
。
[1250]
(s)-n1-(1-((2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲
基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)氨基)-6-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-1-氧代己-2-基)-n5-(peg48)-戊二酰胺(251)：在23℃下，向化合物250(10mg，0.009mmol)和peg48-nhco-(ch2)3-tfp酯(22mg，0.009mmol)于dmf(0.5ml)中的溶液中添加diea(12μl，0.069mmol)。10min后，真空去除溶剂。向残余物中添加dcm(1ml)和tfa(1ml)。10min后，lcms显示脱保护反应完成。真空去除溶剂。将残余物通过制备型lc纯化，以获得目标化合物251(19mg，0.006mmol，62％)。ms m/z 1449(m 2h)
。
[1251][1252]
(s)-2-peg8-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-6-(2-(氨氧基)乙酰氨基)己酰胺(252)：使用化合物250和mpeg8-nhs作为起始材料，以与针对251所描述的类似的程序制备化合物252，以获得目标化合物252(9mg，0.006mmol，66％)。ms m/z 1050(m h)
。
[1253][1254]
(s)-n1-(1-((2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)氨基)-6-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-1-氧代己-2-基)-n5-mpeg4-(peg4)3-戊二酰胺(253)：使用化合物250和mpeg4-(m-peg4)3-nhs作为起始材料，以与针对251所描述的类似的程序制备化合物253，以获得目标化合物253(20mg，0.008mmol，93％)。ms m/z 952(m 2h)
。
[1255][1256]
(s)-2-peg4-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)
甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-6-(2-(氨氧基)乙酰氨基)己酰胺(254)：使用化合物250和mpeg4-nhs作为起始材料，以与针对251所描述的类似的程序制备化合物254，以获得目标化合物254(9mg，0.007mmol，74％)。ms m/z 873(m 2h)
。
[1257][1258]
(s)-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-6-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-2-peg12-酰氨基己酰胺(255)：使用化合物250和mpeg12-nhs作为起始材料，以与针对251所描述的类似的程序制备化合物255，以获得目标化合物255(12mg，0.007mmol，78％)。ms m/z 1224(m-h)
。
[1259][1260]
(s)-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-6-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-2-peg37-酰氨基己酰胺(256)：使用化合物250和mpeg37-nhs作为起始材料，以与针对251所描述的类似的程序制备化合物256，以获得目标化合物256(21mg，0.008mmol，83％)。ms m/z 1164(m 2h)
。
[1261][1262]
(s)-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-6-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-2-(4-苯基丁酰氨基)己酰胺(257)：使用化合物250和4-苯基丁酸作为起始材料，以与针对251所描述的类似的程序制备化合物257，以获得目标化合物257(11mg，0.009mmol，96％)。ms m/z 801(m h)
。
[1263][1264]
(s)-n-(1-(2-(1-(4-((4-氨基-6-丁氧基-2-氧代-2,3-二氢-1h-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙氨基)-6-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-1-氧代己-2-基)油酰胺(258)：使用化合物250和油酰氯作为起始材料，以与针对251所描述的类似的程序制备化合物258，以获得目标化合物258(11mg，0.008mmol，88％)。ms m/z 920(m h)
。
[1265][1266]
(s)-n-(1-((2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)氨基)-6-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-1-氧代己-2-基)辛酰胺(259)：使用化合物250和辛酸作为起始材料，以与针对242所描述的类似的程序制备化合物259，以获得目标化合物259(10mg，0.008mmol，89％)。ms m/z 781(m h)
。
[1267][1268]
(s)-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-6-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-2-dpeg4-(m-dpeg8)3-酰氨基己酰胺(260)：使用化合物250和dpeg4-(m-dpeg8)3-nhs作为起始材料，以与针对251所描述的类似的程序制备化合物260，以获得目标化合物260(21mg，0.007mmol，80％)。ms m/z 1217(m 2h)
。
[1269][1270]
(s)-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-6-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-2-dpeg4-(m-dpeg12)3-酰氨基己酰胺(261)：使用化合物250和dpeg4-(m-dpeg12)3-nhs作为起始材料，以与针对261所描述的类似的程序制备化合物261，以获得目标化合物261(25mg，0.007mmol，80％)。ms m/z 988(m 3h)
。
[1271][1272]
(s)-(5-氨基-6-((2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)氨基)-6-氧代己基)氨基甲酸(9h-芴-9-基)甲酯(262)：使用化合物144和boc-l-lys(fmoc)-oh作为起始材料，以与针对242所描述的类似的程序制备化合物262，以获得目标化合物262(85mg，00.074mmol，67％)。ms m/z 804(m h)
。
[1273]
(s)-6-氨基-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)己酰胺(263)：在23℃下，向化合物263(15mg，0.015mmol)和fmoc-氨氧基乙酸酯(3mg，0.023mmol)于dmf(2ml)中的溶液中添加dmtmmt(5mg，0.021mmol)和diea(15μl，0.086mmol)。10min后，向混合物中添加哌啶(0.1ml)。10min后，lcms显示脱保护反应完成。将混合物通过制备型lc纯化，以获得目标化合物263(15mg，0.012mmol，94％)。ms m/z 655(m h)
。
[1274][1275]
2-(6-氨基-1-(2-(1-(4-((4-氨基-6-丁氧基-2-氧代-2,3-二氢-1h-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙氨基)-1-氧代己-2-基氨基)-2-氧代乙氧基氨基甲酸(s)-叔丁酯(264)：使用化合物262和2-(((叔丁氧基羰基)氨基)氧基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯作为起始材料，以与针对250所描述的类似的程序制备化合物264，以获得目标化合物264(108mg，0.089mmol，87％)。ms m/z 755(m h)
。
[1276]
(s)-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-6-peg24-酰氨基己酰胺(265)：使用化合物264和mpeg24-nhs作为起始材料，以与针对251所描述的类似的程序制备化合物265，以获得目标化合物265(16mg，0.007mmol，88％)。ms m/z 1753(m-h)
。
[1277][1278]
(s)-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-6-peg8-酰氨基己酰胺(266)：使用化合物264和mpeg8-nhs作为起始材料，以与针对251所描述的类似的程序制备化合物266，以获得目标化合物266(12mg，0.008mmol，97％)。ms m/z 1049(m h)
。
[1279][1280]
(s)-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-6-(peg37)己酰胺(267)：使用化合物264和mpeg37-nhs作为起始材料，以与针对251所描述的类似的程序制备化合物267，以获得
7h-嘌呤-6-基氨基甲酸丁酯(271)：在23℃下，向化合物270(160mg，粗品)于dcm(5ml)中的溶液中添加tfa(1ml)。30min后，真空去除液体，并且将混合物通过制备型lc纯化，以获得呈浅棕色固体的目标化合物271(93mg，0.104mmol，两步42％)。ms m/z 554(m h)
。
[1288]
(9-(4-((4-(2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)乙基)哌啶-1-基)甲基)苯甲基)-2-丁氧基-8-氧代-8,9-二氢-7h-嘌呤-6-基)氨基甲酸丁酯(272)：使用化合物271和2-(((叔丁氧羰基)氨基)氧基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯作为起始材料，以与针对251所描述的类似的程序制备化合物272，以获得目标化合物272(40mg，0.041mmol，82％)。ms m/z 627(m h)
。
[1289][1290]
n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)丙酰胺(273)：在23℃下，向化合物144(10mg，0.011mmol)和3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(3mg，0.012mmol)于dmf(1ml)中的溶液中添加diea(12μl，0.069mmol)。10min后，将混合物通过制备型lc纯化，以获得呈无色透明固体的化合物273(10mg，0.011mmol，96％)。ms m/z 605(m h)
。
[1291][1292]
(s)-2-氨基-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-3-(4-(((2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢-2h-吡喃-2-基)氧基)苯基)丙酰胺(274)：使用化合物144和(s)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-(4-((2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢-2h-吡喃-2-基氧基)苯基)丙酸作为起始材料，以与针对242所描述的类似的程序制备化合物274，以获得目标化合物274(47mg，0.038mmol，67％)。ms m/z 779(m h)
。
[1293]
(s)-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-3-(4-(((2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢-2h-吡喃-2-基)氧基)苯基)丙酰胺(275)：使用化合物274和2-(((叔丁氧基羰基)氨基)氧基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯作为起始材料，以与针对251所描述的类似的程序制备化合物275，以获得目标化合物275(22mg，0.018mmol，91％)。ms m/z 852(m h)
。
[1294][1295]
(r)-(5-氨基-6-((2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)氨基)-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯(276)：使用化合物144和fmoc-d-lys(boc)-oh作为起始材料，以与针对250所描述的类似的程序制备化合物276，以获得目标化合物276(110mg，0.097mmol，85％)。ms m/z 682(m h)
。
[1296]
(r)-(2-((6-氨基-1-((2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)氨基)-1-氧代己-2-基)氨基)-2-氧代乙氧基)氨基甲酸(9h-芴-9-基)甲酯(277)：使用化合物276和2-(((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)氧基)乙酸作为起始材料，以与针对242所描述的类似的程序制备化合物277，以获得目标化合物277(114mg，0.086mmol，88％)。ms m/z 877(m h)
。
[1297]
(r)-6-氨基-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)己酰胺(278)：在23℃下，向化合物277(14mg，0.011mmol)于dmf(0.5ml)中的溶液中添加哌啶(100μl，1.012mmol)。10min后，将混合物通过制备型lc纯化，以获得呈浅棕色固体的化合物278(12mg，0.011mmol，定量)。ms m/z 655(m h)
。
[1298][1299]
(r)-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-6-peg24-酰氨基己酰胺(279)：在23℃下，向化合物277(20mg，0.015mmol)和mpeg24-nhs(18mg，0.015mmol)于dmf(1ml)中的溶液中添加diea(20μl，0.069mmol)。20min后，向混合物中添加哌啶(100μl，1.012mmol)。10min后，lcms显示脱保护反应完成。真空去除挥发物，并且将残余物通过制备型lc纯化，以获得目标化合物279(28mg，0.013mmol，84％)。ms m/z 1755(m h)
。
[1300]
[1301]
(s)-4-(2-氨基-3-((2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)氨基)-3-氧代丙基)苯基二氢磷酸酯(280)：使用化合物144和fmoc-1-tyr(po3h2)-oh作为起始材料，以与针对250所描述的类似的程序制备化合物280，以获得目标化合物280(22mg，0.019mmol，30％)。ms m/z 697(m h)
。
[1302]
(s)-4-(3-((2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)氨基)-2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-3-氧代丙基)苯基二氢磷酸酯(281)：使用化合物280和2-(((叔丁氧基羰基)氨基)氧基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯作为起始材料，以与针对251所描述的类似的程序制备化合物281，以获得目标化合物281(15mg，0.012mmol，64％)。ms m/z 770(m h)
。
[1303][1304]
(r)-n1-(6-((2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)氨基)-5-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-6-氧代己基)-n5-(dpeg4)-(mpeg8)3-戊二酰胺(282)：使用化合物277和dpeg4-(m-dpeg8)3-nhs作为起始材料，以与针对279所描述的类似的程序制备化合物282，以获得目标化合物282(37mg，0.013mmol，86％)。ms m/z 1217(m 2h)
。
[1305][1306]
(r)-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)-6-(peg8)酰氨基己酰胺(283)：使用化合物277和mpeg8-nhs作为起始材料，以与针对279所描述的类似的程序制备化合物283，以获得目标化合物283(15mg，0.010mmol，66％)。ms m/z 1049(m h)
。
[1307][1308]
n-(9-(4-((4-(2-氨乙基)哌啶-1-基)甲基)苯甲基)-2-丁氧基-8-氧代-8,9-二氢-7h-嘌呤-6-基)己酰胺(284)：在23℃下，向2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基氨基甲酸叔丁酯化合物143(66mg，0.074mmol)
和正己酰氯(30μl，0.223mmol)于dcm(1ml)中的溶液中添加diea(100μl，0.574mmol)。1.5h后，向混合物中添加tfa(1ml)。10min后，真空去除挥发物，并且将残余物通过制备型lc纯化，以获得呈浅棕色固体的化合物284(50mg，0.050mmol，50％)。ms m/z 552(m h)
。
[1309][1310]
n-(9-(4-((4-(2-氨乙基)哌啶-1-基)甲基)苯甲基)-2-丁氧基-8-氧代-8,9-二氢-7h-嘌呤-6-基)乙酰胺(285)：使用化合物143和乙酰氯作为起始材料，以与针对284所描述的类似的程序制备化合物285，以获得目标化合物285(40mg，0.048mmol，99％)。ms m/z 496(m h) 。
[1311][1312]
n-(9-(4-((4-(2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)乙基)哌啶-1-基)甲基)苯甲基)-2-丁氧基-8-氧代-8,9-二氢-7h-嘌呤-6-基)己酰胺(286)：使用化合物284和2-(((叔丁氧羰基)氨基)氧基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯作为起始材料，以与针对251所描述的类似的程序制备化合物286，以获得目标化合物286(38mg，0.035mmol，79％)。ms m/z 625(m h)
。
[1313][1314]
n-(2-(1-(4-((6-乙酰氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2-(氨氧基)乙酰胺(287)：使用化合物285和2-(((叔丁氧基羰基)氨基)氧基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯作为起始材料，以与针对251所描述的类似的程序制备化合物287，以获得目标化合物287(31mg，0.030mmol，63％)。ms m/z 569(m h)
。
[1315][1316]
(4-((2-甲基-7h-吡咯并[2,3-h]喹唑啉-7-基)甲基)苯基)甲醇(288)：在23℃下，向化合物165(200mg，1.09mmol)和4-氯甲基苯甲醇(510.1mg，3.26mmol)于dmso(14.4ml)中的溶液中添加碳酸铯(1768mg，5.43mmol)。21小时后，将反应混合物倒入水(15ml)中并用二乙醚(5ml)洗涤。然后水层用二乙醚(3
×
50ml)萃取。将合并的有机层用水(2
×
100ml)洗涤，接着用盐水(50ml)洗涤。真空浓缩滤液，并且残余物通过快速硅胶色谱纯化，以获得目标化合物288(31mg，0.030mmol，9％)。ms m/z 305(m h)
。
[1317]
7-(4-(氯甲基)苯甲基)-7h-吡咯并[2,3-h]喹唑啉-2-胺(289)：向化合物288(22.6mg，0.074mmol)中添加二氯甲烷(0.67ml)。向所得悬浮液中添加亚硫酰氯(16μl，0.22mmol)，并将混合物在50℃下搅拌。1小时后，向混合物中添加甲苯(30ml)，并蒸发溶剂。再次向残余物中添加甲苯(100ml)，并蒸发溶剂。将残余物减压干燥，以获得目标化合物289(24mg，0.074mmol，100％)，其不经进一步纯化即用于下一步骤。ms m/z 323(m h)
。
[1318]
(2-(1-(4-((2-氨基-7h-吡咯并[2,3-h]喹唑啉-7-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(290)：使用化合物289和(2-(哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯作为起始材料，以与针对143所描述的类似的程序制备化合物290，以获得目标化合物290(25mg，0.049mmol，65％)。ms m/z 515(m h)
。
[1319]
7-(4-((4-(2-氨乙基)哌啶-1-基)甲基)苯甲基)-7h-吡咯并[2,3-h]喹唑啉-2-胺(291)：使用化合物290作为起始材料，以与针对144所描述的类似的程序制备化合物291，以获得目标化合物291(20mg，0.04mmol，78％)。ms m/z 415(m h)
。
[1320]
n-(2-(1-(4-((2-氨基-7h-吡咯并[2,3-h]喹唑啉-7-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2-(氨氧基)乙酰胺(292)：使用化合物291和2-(((叔丁氧基羰基)氨基)氧基)乙酸2,5-二氧代环戊酯作为起始材料，以与针对127所描述的类似的程序制备化合物292，以获得目标化合物292(3.7mg，0.006mmol，28％)。ms m/z 488(m h)
。
[1321][1322]
4-(2-(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基氧基)乙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(293)：在23℃下，向l-boc-4-(2-羟乙基)哌啶(405mg，1.766mmol)和n-羟基邻苯二甲酰亚胺(309mg，1.895mmol)于thf(10ml)中的溶液中添加三苯基膦(505mg，1.925mmol)。30min后，将温度降至0℃，并在5min内向混合物中添加diad(400μl，2.032mmol)。将混合物在0℃下搅拌过夜。20h后，真空去除溶剂并将残余物溶解于etoac(50ml)中，用1n hcl(50ml)、饱和碳酸氢钠(50ml)和盐水(50ml)洗涤，经mgso4干燥并过滤。真空去除有机溶剂。残余物通过快速色谱(sio2)纯化，以获得呈白色固体的目标化合物293(650mg，1.736mmol，98％)。ms m/z 375(m h)
。
[1323]
2-(2-(哌啶-4-基)乙氧基)异吲哚啉-1,3-二酮,tfa(294)：在23℃下，向化合物293(650mg，1.736mmol)于dcm(2ml)中的溶液中添加tfa(2ml)。10min后，真空去除液体。将残余物溶解于etoac(50ml)中，并且用饱和碳酸氢钠(50ml)和盐水(50ml)洗涤，经mgso4干燥并过滤。真空去除有机溶剂并将残余物经高真空泵干燥，以获得呈透明固体的目标化合物294(650mg，1.674mmol，96％)。ms m/z275(m h)
。
[1324]
2-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙氧基)异吲哚啉-1,3-二酮(295)：向6-氨基-2-丁氧基-9-(4-(氯甲基)苯甲基)-7h-嘌呤-8(9h)-酮(化合物142)(90mg，0.208mmol)和化合物294(90mg，0.328mmol)于dmf(2ml)中的溶液中添加diea(150μl，0.861mmol)，并将温度升至80℃。4h后，真空去除溶剂。混合物通过制备型lc纯化，以获得呈浅棕色固体的目标化合物295(70mg，0.074mmol，36％)。ms m/z 600(m h)
。
[1325]
n-(9-(4-((4-(2-(氨氧基)乙基)哌啶-1-基)甲基)苯甲基)-2-丁氧基-8-氧代-8,9-二氢-7h-嘌呤-6-基)乙酰胺(296)：在23℃下，向化合物295(30mg，0.032mmol)和乙酰氯(30μl，0.383mmol)于dcm(5ml)中的溶液中添加diea(110μl，0.632mmol)。1.5h后，真空去除液体，并将meoh(2ml)加水合肼(20μl，0.4mmol)添加至残余物中。10min后，真空去除溶剂，并且将残余物通过制备型lc纯化，以获得呈无色透明固体的目标化合物296(4mg，0.005mmol，15％)。ms m/z512(m h)
。
[1326]
6-氨基-9-(4-((4-(2-(氨氧基)乙基)哌啶-1-基)甲基)苯甲基)-2-丁氧基-7h-嘌呤-8(9h)-酮(297)：在23℃下，向化合物295(40mg，0.042mmol)于dcm(5ml)中的溶液中添加水合肼(200μl，4mmol)。5min后，真空去除液体，并且残余物通过制备型lc纯化，以获得呈浅
棕色固体的目标化合物297(33mg，0.041mmol，96％)。ms m/z 470(m h)
。
[1327][1328]
1'-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)苯甲基)-4,4'-联哌啶-1-甲酸叔丁酯(298)：使用n-boc-4,4'-联哌啶和6-氨基-2-丁氧基-9-(4-(氯甲基)苯甲基)-7,9-二氢-8h-嘌呤-8-酮(化合物142)作为起始材料，以与针对295所描述的类似的程序制备化合物298，以获得呈浅棕色固体的目标化合物298(50mg，0.053mmol，26％)。ms m/z 594(m h)
。
[1329]
n-(9-(4-(4,4'-联哌啶-1-基甲基)苯甲基)-2-丁氧基-8-氧代-8,9-二氢-7h-嘌呤-6-基)乙酰胺(299)：使用化合物298和乙酰氯作为起始材料，以与针对284所描述的类似的程序制备化合物299，以获得呈浅棕色固体的目标化合物299(29mg，0.033mmol，62％)。ms m/z 536(m h)
。
[1330]
n-(9-(4-((1'-(2-(氨氧基)乙酰基)-4,4'-联哌啶-1-基)甲基)苯甲基)-2-丁氧基-8-氧代-8,9-二氢-7h-嘌呤-6-基)乙酰胺(300)：使用化合物299和2-(((叔丁氧羰基)氨基)氧基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯作为起始材料，以与针对251所描述的类似的程序制备化合物300，以获得呈浅棕色固体的目标化合物300(12mg，0.013mmol，43％)。ms m/z 609(m h)
。
[1331]
[1332]
n-(9-(4-((4-(2-氨乙基)哌啶-1-基)甲基)苯甲基)-2-丁氧基-8-氧代-8,9-二氢-7h-嘌呤-6-基)-3-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)丙酰胺(301)：使用化合物143和3-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)丙酰氯作为起始材料，以与针对251所描述的类似的程序制备化合物301，以获得呈浅棕色固体的目标化合物301(62mg，0.064mmol，92％)。ms m/z 628(m h)
。
[1333]
n-(9-(4-((4-(2-(2-(氨氧基)乙酰氨基)乙基)哌啶-1-基)甲基)苯甲基)-2-丁氧基-8-氧代-8,9-二氢-7h-嘌呤-6-基)-3-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)丙酰胺(302)：使用化合物301和2-(((叔丁氧基羰基)氨基)氧基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯作为起始材料，以与针对251所描述的类似的程序制备化合物302，以获得呈浅棕色固体的目标化合物302(32mg，0.031mmol，56％)。ms m/z 701(m h)
。
[1334][1335]
n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9h-嘌呤-9-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-1-(氨氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(303)：在23℃下，向6-氨基-9-(4-((4-(2-氨乙基)哌啶-1-基)甲基)苯甲基)-2-丁氧基-7,9-二氢-8h-嘌呤-8-酮(化合物144)(40mg，0.044mmol)于dmf(1ml)中的溶液中添加1-((1,3-二氧代异吲哚-2-基)氧基)-3,6,9,12-四氧十五烷-15-酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(22mg，0.043mmol)和diea(40μl，0.23mmol)。30min后，向混合物中添加水合肼(100μl，0.66mmol)。10min后，真空去除液体，并且残余物通过制备型lc纯化，以获得呈浅棕色固体的目标化合物303(45mg，0.038mmol，87％)。ms m/z 717(m h)
。
[1336][1337]
3-氨基-n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)丙烯酰胺(303)：使用boc-β-丙氨酸和化合物144作为起始材料，以与针对242所描述的类似的程序制备化合物303，以获得目标化合物303(28mg，0.029mmol，26％)。ms m/z525(m h)
。
[1338]
n-(2-(1-(4-((6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7h-嘌呤-9(8h)-基)甲基)苯甲基)哌
啶-4-基)乙基)-3-(2-(氨氧基)乙酰氨基)丙烯酰胺(304)：使用化合物303和2-(((叔丁氧基羰基)氨基)氧基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯作为起始材料，以与针对251所描述的类似的程序制备化合物304，以获得目标化合物304(20mg，0.019mmol，66％)。ms m/z 598(m h)
。
[1339]
表4-tlr激动剂-核5化合物
[1340]
[1341]
[1342]
[1343]
[1344]
[1345]
[1346]
[1347]
[1348]
[1349]
[1350]
[1351][1352]
实施例4：包含以下结构的tlr激动剂的合成—核3：
[1353]
核3
[1354][1355]
在一些实施方案中，x是n或h；y是c或n；
[1356]
r1是c1至c
12
烷基、取代的c1至c
12
烷基、含氧c1至c
12
烷基、杂环、取代的杂环或h
[1357]
r2是c1至c
12
烷基、c1至c
12
取代的烷基、c4至c8环烷基、芳香环、取代的芳香环、芳香杂环、取代的芳香杂环、-onh2、末端c1至c
12
烷基或h
[1358]
具有核3结构的tlr激动剂如以下方案中所公开合成。
[1359][1360]
4-硝基-1-甲苯磺酰基-1h-吲哚(160)：将化合物159(4-硝基-1h-吲哚)(2.43g，15.0mmol)溶解于thf(15ml)中。在0℃下，向悬浮液中逐滴添加thf(30ml)中的氢化钠(900mg，22.5mmol)。将溶液升温至室温并且再搅拌1h。接着，缓慢添加thf(15ml)中的甲苯磺酰氯(3.0g，15.75mmol)并将反应物搅拌过夜，将溶液在nahco3与et2o之间分配。萃取(3
×
75ml)水层，将合并的有机层用盐水洗涤，经mgso4干燥并真空浓缩。将所得固体吸收于accn中，超声处理并过滤。不使用固体(起始材料)。将液体旋蒸并将残余物(160)(3.12g)用于下一步中。未观察到ms m/z no2。
[1361]
5-甲基-4-硝基-1-(苯磺酰基)-1h-吲哚(161)：在-15℃下，将化合物160(3.11g，9.83mmol)溶解于thf(98.3ml)中。添加甲基氯化镁(4.9ml，14.75mmol)并将溶液搅拌1h 45min。接着添加ddq(3.79g，16.71mmol)，同时保持温度低于-10℃。使反应物升温至室温并搅拌过夜。接着将反应物用dcm稀释以猝灭反应，然后旋蒸。将粗品通过dcm洗脱的sio2塞。将洗脱液干燥并通过柱色谱(己烷/dcm，0-40％，40g柱)纯化，以获得目标化合物161(2.06g，两步骤中是63％)。未观察到ms m/z no2。
[1362]
(e)n,n-二甲基-2-(4-硝基-1-(苯磺酰基)-1h-吲哚-5-基)乙烯-1-胺(162)：将5-甲基-4-硝基-1-(苯磺酰基)-1h-吲哚(161)(0.83g，2.63mmol)溶解于dmf(26.3ml)中。添加n,n-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(3.54ml，26.3mmol)并将反应物在115℃下加热。通过旋转蒸发器蒸发反应。残余物(化合物162)用于下一反应(0.98g)中。未观察到ms m/zno2。
[1363]
4-硝基-1-(苯磺酰基)-1h-吲哚-5-甲醛(163)：向化合物162(0.98g，2.6mmol)于thf(13.2ml)和水(13.2ml)中的溶液中添加偏高碘酸钠(1.7g，7.9mmol)并搅拌。将反应物过滤并用etoac(50ml)洗涤。将有机层用nahco3洗涤，经mgso4干燥，过滤并通过旋转蒸发器蒸发。将残余物(化合物163，0.56g)在真空泵上干燥并用于下一步反应中。未观察到ms m/z no2。
[1364]
4-氨基-1-(苯磺酰基)-1h-吲哚-5-甲醛(164)：向化合物163(0.56g，1.7mmol)于meoh(47ml)中的溶液中添加pd/c(0.03g)。将反应物在氢气气氛(双气球/1atm)下搅拌。将反应物用硅藻土过滤，并用meoh洗涤。真空干燥溶剂，并且残余物通过柱色谱(己烷/etoac，
0-50％，12g柱)纯化，以获得目标化合物164(93mg，三步骤内是12％)，ms m/z 301(m h)
。
[1365]
7h-吡咯并[2，3-h]喹唑啉-2-胺(165)：向化合物164(0.092g，0.31mmol)于dma(3.1ml)中的溶液中添加碳酸胍(279mg，3.09mmol)并在150℃下搅拌。lcms显示反应完成并且混合物通过制备型lc纯化，以获得目标化合物165(6mg，11％)，ms m/z 257(m h)
。
[1366]
1-(2-氨基-7h-吡咯并[2,3-h]喹唑啉-7-基)-2-甲基丙-2-醇(166)：在0℃下，向氢化钠溶液(矿物油中的60％分散液，2.2mg，0.054mmol)中添加5ml己烷，并搅动溶液。去除己烷以洗去矿物油。接着，将dmf(1.1ml)中的化合物165(2mg，0.011mmol)逐滴添加至溶液中并搅拌1h。接着，逐滴添加氧化异丁烯(1μl，0.011mmol)并搅拌反应物。将反应物过滤，并且混合物通过制备型lc纯化，以获得目标化合物166(1.5mg，23％)，ms m/z 185(m h)
。
[1367]
化合物288-292的合成：
[1368][1369]
(4-((2-甲基-7h-吡咯并[2,3-h]喹唑啉-7-基)甲基)苯基)甲醇(288)：在23℃下，向化合物165(200mg，1.09mmol)和4-氯甲基苯甲醇(510.1mg，3.26mmol)于dmso(14.4ml)中的溶液中添加碳酸铯(1768mg，5.43mmol)。21小时后，将反应混合物倒入水(15ml)中并用二乙醚(5ml)洗涤。将水层用二乙醚(3
×
50ml)萃取。将合并的有机层用水(2
×
100ml)洗涤，接着用盐水(50ml)洗涤。真空浓缩滤液，并且残余物通过快速硅胶色谱纯化，以获得目标化合物288(31mg，0.030mmol，9％)。ms m/z 305(m h)
。
[1370]
7-(4-(氯甲基)苯甲基)-7h-吡咯并[2,3-h]喹唑啉-2-胺(289)：向化合物288(22.6mg，0.074mmol)中添加二氯甲烷(0.67ml)。向所得悬浮液中加入亚硫酰氯(16μl，0.22mmol)，并将混合物在50℃下搅拌。1小时后，向混合物中添加甲苯(30ml)，并蒸发溶剂。再次向残余物中添加甲苯(100ml)，并蒸发溶剂。将残余物在减压下干燥，以获得目标化合物289(24mg，0.074mmol，100％)，其不经进一步纯化即用于下一步。ms m/z 323(m h)
。
[1371]
(2-(1-(4-((2-氨基-7h-吡咯并[2,3-h]喹唑啉-7-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(290)：使用化合物289和(2-(哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯作为起始材料，以与针对143所描述的类似的程序制备化合物290，以获得目标化合物290(25mg，0.049mmol，65％)。ms m/z 515(m h)
。
[1372]
7-(4-((4-(2-氨乙基)哌啶-1-基)甲基)苯甲基)-7h-吡咯并[2,3-h]喹唑啉-2-胺(291)：使用化合物290作为起始材料，以与针对144所描述的类似的程序制备化合物291，以
获得目标化合物291(20mg，0.04mmol，78％)。ms m/z 415(m h)
。
[1373]
n-(2-(1-(4-((2-氨基-7h-吡咯并[2,3-h]喹唑啉-7-基)甲基)苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2-(氨氧基)乙酰胺(292)：使用化合物291和2-(((叔丁氧基羰基)氨基)氧基)乙酸2,5-二氧代环戊酯作为起始材料，以与针对127所描述的类似的程序制备化合物292，以获得目标化合物292(3.7mg，0.006mmol，28％)。ms m/z 488(m h)
。
[1374]
表5-tlr激动剂-核3化合物
[1375][1376][1377]
包含核3结构的化合物axc-967、axc-968、axc-969和axc-970中的每一个显示出大于10,000nm的ec
50
。
[1378]
实施例5：包含以下代表性结构的tlr激动剂的合成-核2：
[1379]
核2
[1380][1381]
在一些实施方案中，r1或r2各自连接以形成c4至c8环烷基或独立地为-h、c1至c
12
烷基、含氮烷基、芳香环或-c(nh)nh2；
[1382]
r3是c1至c
12
烷基、取代的c1至c
12
烷基、含氧c1至c
12
烷基、杂环取代的杂环或h。
[1383]
具有核2结构的tlr激动剂如以下方案中所公开合成。
[1384][1385]
2-(5,6-二氨基嘧啶-4-基氨基)-2-氧代乙基氨基甲酸叔丁酯(167)：在23℃下，向嘧啶-4,5,6-三胺(2050mg，16.383mmol)和boc-gly-oh(2880，16.440mmol)于dcm(50ml)中的溶液中添加dcc(3800mg，18.417mmol)和dmap(80mg，0.655mmol)。3h后，通过过滤去除沉淀。混合物通过制备型lc纯化，以获得目标化合物167(2458mg，8.707mmol，53％)，ms m/z 283(m h)
。
[1386]
(6-氨基-9h-嘌呤-8-基)甲基氨基甲酸叔丁酯(168)：在23℃下，向化合物167(620mg，2.196mmol)于n-buoh(20ml)中的溶液中添加meoh中的25％ naome(2500ul，11.570mmol)。将温度升至70℃。1h后，向冰浴中的混合物中添加6n hcl(1.83ml，11mmol)，并将混合物用etoac(50ml)稀释。混合物通过饱和碳酸氢钠(50ml)和盐水(50ml)洗涤，经mgso4干燥并过滤。混合物通过快速色谱纯化，以获得目标化合物168(250mg，0.946mmol，43％)，ms m/z 265(m h)
。
[1387]
(6-氨基-9-(2-溴乙基)-9h-嘌呤-8-基)甲基氨基甲酸叔丁酯(169)：在23℃下，向化合物168(250mg，0.946mmol)于dmf(5ml)中的溶液中添加二溴乙烷(2100mg，2.795mmol)和csco3(2400mg，1.842mmol)。2.5h后，将混合物用20ml dcm稀释，并用饱和碳酸氢钠(50ml)和盐水(50m)洗涤。有机层经mgso4干燥并过滤。混合物通过制备型lc纯化，以获得化合物169(144mg，0.545mmol，58％)，ms m/z372(m h)
。
[1388]
4-氨基-8,9-二氢吡嗪并[1,2-e]嘌呤-7(6h)-甲酸叔丁酯(170)：向氢化钠溶液(矿物油中60％分散液，51.4mg，1.286mmol)中添加5ml己烷。搅动溶液，接着去除己烷以洗去矿物油。在23℃搅拌下，将dmf(2.9ml)中的化合物169(159.2mg，0.429mmol)逐滴添加至
溶液中。1h后，lcms显示反应完成。通过使用gemini nx，150x30 c18柱的使用5％至60％的水/90％ acn 0.05％ tfa梯度的制备型lc纯化混合物20min。合并含有产物的级分并通过旋转蒸发器蒸发。将残余物在高真空泵上干燥，以获得目标化合物170(36.7mg，0.05mmol，11％)，ms m/z 291(m h)
。
[1389]
6,7,8,9-四氢吡嗪并[1,2-e]嘌呤-4-胺(171)：向170(35.7mg，0.123mmol)的溶液中添加1.2ml dcm。在23℃搅拌下，逐滴添加三氟乙酸(45.7μl，0.615mmol)。1h后，lcms显示反应完成。混合物通过具有使用phme进行的额外共沸的旋转蒸发器蒸发，以获得化合物171(38.5mg，0.05mmol，41％)，ms m/z 191(m h)
。
[1390]
7-苯甲基-6,7,8,9-四氢吡嗪并[1,2-e]嘌呤-4-胺(172)：向171(10mg，0.053mmol)于dmf(1.1ml)中的溶液中添加苯甲醛(6.7μl，0.066mmol)。添加diea(18.3μl，0.105mmol)并将反应物搅拌15分钟。接着，添加硼-吡啶络合物(6.7μl，0.067mmol)并将反应物在23℃下搅拌过夜。通过使用gemini nx，150x30 c18柱的使用5％至60％的水/90％ acn 0.05％ tfa梯度的制备型lc纯化混合物20min。合并含有产物的级分并通过旋转蒸发器蒸发。将残余物在高真空泵上干燥，以获得化合物172(1.3mg，0.002mmol，3％)，ms m/z 281(m h)
。
[1391]
表6-tlr激动剂-核2化合物
[1392][1393]
实施例6：包含以下代表性结构的tlr激动剂的合成-核4：
[1394]
核4
[1395][1396]
在一些实施方案中，r1是c1至c
12
烷基、取代的c1至c
12
烷基、含氧c1至c
12
烷基、c3至c8环烷基、杂环、取代的杂环、卤素或h；r2是c1至c
12
烷基、c1至c
12
取代的烷基、c4至c8环烷基、芳香环、取代的芳香环、芳香杂环、取代的芳香杂环、-onh2、-nh2、羰基、末端c1至c
12
烷基或其组合；或r2是h；
[1397]
r3是c1至c
12
烷基、取代的c1至c
12
烷基、含氧/氮/硫的c1至c
12
烷基、杂环、取代的杂环、环烷基、取代的环烷基、-n3、-oh、末端c1至c
12
烷基、末端取代的c1至c
12
烷基或其组合；或r3是h。
[1398]
具有核4结构的tlr-激动剂如以下方案中所公开合成。
[1399][1400]
n-(4,6-二氨基嘧啶-5-基)戊酰胺(193)：在70℃下，将嘧啶-4,5,6-三胺(1015mg，8.112mmol)溶解于n-甲基-2-吡咯烷酮(10ml)中。溶液变澄清后，冷却至23℃。向混合物中添加戊酰氯(980μl，8.127mmol)并将温度升至50℃。20h后，将温度降至23℃，向混合物中添加etoac(50ml，沉淀)，并且通过过滤分离沉淀。固体用etoac(10ml)和丙酮(10ml)洗涤并干燥，以获得呈浅棕色固体的化合物193(1780mg，7.237mmol，90％)。产物不经进一步纯化即用于下一步。ms m/z 210(m h)
。
[1401]
8-丁基-9h-嘌呤-6-胺(194)：在23℃下，向粗化合物193(1780mg，7.273mmol)于n-buoh(30ml)中的溶液中添加甲醇钠(1570mg，29.063mmol)并加热至回流。1h后，将溶液冷却至室温，用6m hcl(3.2ml)中和，并且添加盐水(20ml)以获得双相混合物。分离有机层，用mgso4干燥，接着真空浓缩，以获得呈浅棕色固体的目标化合物194(1148mg，6.003mmol，83％)。ms m/z 192(m h)
。
[1402]
4-(6-氨基-8-丁基-9h-嘌呤-9-基)丁基氨基甲酸叔丁酯(195)：在0℃下，向n-boc-氨基-丁醇(1520mg，8.032mmol)和化合物194(1420mg，7.426mmol)于thf(20ml)中的溶液中添加pph3(2080mg，7.930mmol)。30min后，在0℃下历时5min向该混合物中添加diad(2200μl，11.174mmol)。3h后，真空去除溶剂。残余物通过dcm(100ml)稀释并用半饱和碳酸氢钠(100ml)和盐水(20ml)洗涤。有机层经mgso4干燥并过滤。真空去除溶剂。残余物通过快
速色谱纯化，以获得呈浅棕色固体的化合物195(1064mg，2.935mmol，37％)。ms m/z363(m h)
。
[1403]
4-(6-(n-苯甲酰基苯甲酰氨基)-8-丁基-9h-嘌呤-9-基)丁基氨基甲酸叔丁酯(196)：在0℃下，向化合物195(1064mg，2.935mmol)于dcm(10ml)中的溶液中添加苯甲酰氯(700μl，4.980mmol)和tea(900μl，17.788mmol)，并将温度升至20℃。2.5h后，将混合物用饱和碳酸氢钠(50ml)和盐水(50ml)洗涤，经mgso4干燥并过滤。真空去除溶剂，并且残余物通过快速色谱纯化，以获得呈浅棕色油状物的化合物196(1650mg，2.891mmol，98％)。ms m/z 571(m h)
。
[1404]
4-(6-(n-苯甲酰基苯甲酰氨基)-8-丁基-2-硝基-9h-嘌呤-9-基)丁基氨基甲酸叔丁酯(197)：在23℃下，向四甲基硝酸铵(780mg，5.729mmol)于dcm(10ml)中的溶液中添加三氟乙酸酐(1200μl，17.118mmol)。1h后，将混合物冷却至0℃，并添加化合物196(1650mg，2.891mmol)于dcm(20ml)中的溶液。将温度升至23℃。2h后，将混合物用dcm(20ml)稀释，用半饱和碳酸氢钠(20ml)和盐水(20ml)洗涤，经mgso4干燥并过滤。真空去除溶剂，并且残余物通过快速色谱纯化，以获得呈透明的浅黄色固体的化合物197(1067mg，1.733mmol，60％)。ms m/z 616(m h)
。
[1405]
9-(4-氨丁基)-8-丁基-9h-嘌呤-6-胺(198)和6-氨基-9-(4-氨丁基)-8-丁基-9h-嘌呤-2-醇(199)：在23℃下，向化合物197(220mg，0.357mmol)于etoh(20ml)中的溶液中添加pd/c(10％，0.1g)，并用氢气鼓泡。18h后，lcms显示制备了脱硝化合物。添加naome(30mg,0.6mmol)并将混合物搅拌4h。接着，添加tfa(3ml)。20min后，真空去除溶剂，并且混合物通过制备型lc纯化，以获得呈浅棕色固体的化合物198(94mg，0.156mmol，44％)，ms m/z 263(m h)
和呈浅棕色固体的化合物199(0.024mmol，7％)，ms m/z 279(m h)
。
[1406][1407]
4-氨基-n-(4-(6-氨基-8-丁基-2-羟基-9h-嘌呤-9-基)丁基)-3,5-二氟苯甲酰胺(200)：使用化合物199和4-氨基-3,5-二氟苯甲酸作为起始材料，以与针对150所描述的类似的程序制备化合物200，以获得呈浅棕色固体的目标化合物200(14mg，0.018mmol，61％)，ms m/z 434(m h)
。
[1408][1409]
4-氨基-n-(4-(6-氨基-8-丁基-9h-嘌呤-9-基)丁基)-3,5-二氟苯甲酰胺(201)：使用化合物198和4-氨基-3,5-二氟-苯甲酸作为起始材料，以与针对150所描述的类似的程序制备化合物201，以获得呈浅棕色固体的目标化合物201(13mg，0.017mmol，93％)，ms m/z 418(m h)
。
[1410][1411]
3-氨基-n-(4-(6-氨基-8-丁基-9h-嘌呤-9-基)丁基)苯甲酰胺(202)：使用化合物198和3-氨基苯甲酸作为起始材料，以与针对150所描述的类似的程序制备化合物202，以获得呈浅棕色固体的目标化合物202(10mg，0.014mmol，88％)，ms m/z 382(m h)
。
[1412][1413]
5-氨基-n-(4-(6-氨基-8-丁基-9h-嘌呤-9-基)丁基)烟酰胺(203)：使用化合物198和5-氨基-烟酸作为起始材料，以与针对150所描述的类似的程序制备化合物203，以获得呈浅棕色固体的目标化合物203(14mg，0.019mmol，定量)，ms m/z 383(m h)
。
[1414][1415]
4-(2,6-二氯-9h-嘌呤-9-基)丁基氨基甲酸叔丁酯(204)：在0℃下，向n-boc-氨基-丁醇(1620mg，8.560mmol和2,6-二氯嘌呤(1495mg，7.910mmol)于thf(10ml)中的溶液中添加pph3(2280mg，8.693mmol)。30min后，在0℃下历时5min添加diad(2300μl，11.681mmol)。将混合物在50℃下搅拌。6h后，真空去除溶剂。残余物用etoac(100ml)稀释，并用半饱和碳酸氢钠(100ml)和盐水(20ml)洗涤。将有机层经mgso4干燥并过滤。真空去除溶剂。残余物通过快速色谱纯化，以获得呈黄色油状物的化合物204(4500mg，《12.492mmol，《100％)。(约20％的杂质是pph3)。ms m/z 361(m h)
。
[1416]
4-(6-氨基-2-氯-9h-嘌呤-9-基)丁基氨基甲酸叔丁酯(205)：将化合物204(pph3的粗混合物，4500mg，《12.492mmol)置于配备有搅拌棒的耐压玻璃容器中。向该容器中添加meoh中的7n nh3(12ml，84mmol)。将管密封，并且然后在120℃下加热。30min后，真空去除溶剂并将残余物溶解于dcm(100ml)中。溶液用饱和碳酸氢钠(100ml)和盐水(30ml)洗涤。有机层经mgso4干燥并过滤。真空去除溶剂。将残余物通过快速色谱纯化，以获得呈浅黄色固体的化合物205(1310mg，3.844mmol，37％)。ms m/z 341(m h)
。
[1417]
4-(6-氨基-2-丁氧基-9h-嘌呤-9-基)丁基氨基甲酸叔丁酯(206)：在23℃和干燥
氮气下，向化合物205(257mg，0.754mmol)于正丁醇(5ml)中的溶液中添加金属钠(90mg，2.455mmol)。将温度升至100℃。18h后，真空去除溶剂。将残余物溶解于dcm(50ml)中并用半饱和碳酸氢钠(50ml)和盐水(50ml)洗涤。有机层经mgso4干燥并过滤。真空去除溶剂。获得呈浅棕色粗固体的化合物206(310mg，《0.819mmol，定量)。ms m/z 379(m h)
。
[1418]
4-(6-氨基-8-溴-2-丁氧基-9h-嘌呤-9-基)丁基氨基甲酸叔丁酯(207)：在23℃下，向化合物206(310mg，0.819mmol，粗品)于dcm(10ml)中的溶液中添加溴(150μl，0.563mmol)。1h后，真空去除溶剂。通过快速色谱纯化混合物，以获得呈透明的淡黄色固体的化合物207(250mg，0.547mmol，67％)。ms m/z 458(m h)
。
[1419]
4-(6-氨基-2-丁氧基-8-甲基-9h-嘌呤-9-基)丁基氨基甲酸叔丁酯(208)：在23℃下，向化合物207(82mg，0.179mmol)于无水thf(5ml)中的溶液中添加thf中的1m三甲基铝(360μl，0.36mmol)和pdcl2(pph3)2(44mg，0.063mmol)。使混合物回流。20h后，将混合物通过20ml dcm稀释并用半饱和碳酸氢钠(20ml)和盐水(20ml)洗涤。有机层经mgso4干燥并过滤。真空去除溶剂。残余物通过快速色谱纯化，以获得呈浅棕色固体的化合物208(12mg，0.031mmol，17％)。ms m/z 393(m h)
。
[1420]
9-(4-氨丁基)-2-丁氧基-8-甲基-9h-嘌呤-6-胺(209)：在23℃下，向化合物208(12mg，0.031mmol)于dcm(0.5ml)中的溶液中添加三氟乙酸(0.5ml)。1h后，真空去除溶剂。将残余物在高真空泵上干燥过夜，以获得呈浅棕色固体的化合物209(15mg，0.02mmol，定量)。ms m/z 293(m h)
。
[1421]
4-氨基-n-(4-(6-氨基-2-丁氧基-8-甲基-9h-嘌呤-9-基)丁基)-3,5-二氟苯甲酰胺(210)：使用化合物209和4-氨基-3,5-二氟-苯甲酸作为起始材料，以与针对150所描述的类似的程序制备化合物210，以获得呈浅棕色固体的目标化合物210(3.5mg，0.004mmol，22％)，ms m/z469(m h)
。
[1422][1423]
9-(4-氨丁基)-8-溴-2-丁氧基-9h-嘌呤-6-胺(211)：使用化合物207，以与针对209所描述的类似的程序制备化合物211，以获得呈浅棕色固体的目标化合物211((8mg，0.011mmol，定量)，ms m/z 358(m h)
。
[1424]
4-氨基-n-(4-(6-氨基-8-溴-2-丁氧基-9h-嘌呤-9-基)丁基)-3,5-二氟苯甲酰胺(212)：使用化合物211和4-氨基-3,5-二氟-苯甲酸作为起始材料，以与针对150所描述的类似的程序制备化合物212，以获得呈浅棕色固体的目标化合物212(8mg，0.009mmol，82％)，ms m/z 513(m h)
。
[1425]
表7-tlr激动剂-核4化合物
[1426][1427][1428]
实施例7：该实施例公开了本发明中使用的各种方法和技术。
[1429]
分子克隆-cho细胞密码子优化的抗体重链和轻链cdna序列是从商业dna合成服务(idt,san diego,ca)获得。合成的dna片段用hind iii和ecor i(均来自new england biolabs(neb),ipswich,ma)消化，并通过pcr纯化试剂盒(qiagen,valencia,ca)纯化。将消
化的抗体基因片段通过快速连接试剂盒(neb)连接到表达载体中，以产生用于表达野生型抗体重链和轻链的构建体。所得质粒在大肠埃希氏菌中繁殖，并通过dna测序服务(eton)进行验证。
[1430]
含琥珀密码子的突变体的产生-基于抗her2 fab的晶体结构，选择位于轻链恒定区的10个不同的表面可及位点以遗传掺入非天然氨基酸(例如对乙酰基-苯丙氨酸(paf)，或对叠氮基-苯丙氨酸或对氨基-苯丙氨酸)。那些位点对于抗原-抗体结合并不重要。然后通过定点诱变将所选位点的每个遗传密码子突变为琥珀密码子(tag)，以生成所述抗体突变体的表达质粒。引物购自idt。所有定点诱变实验均按照说明手册(neb)使用q5定点诱变试剂盒进行。突变体的表达质粒在大肠埃希氏菌中繁殖，并通过dna测序服务(eton)进行验证。表8提供了抗her2 fab的重链或轻链恒定区中琥珀突变位点的列表和其kabat编号，以及对应的氨基酸序列，seq id no:2、3、4和6至15。seq id no:1和5分别显示了抗her2 fab的野生型重链和轻链。抗her2 fab包括以下重链和轻链序列：seq id no:1和seq id no:5；seq id no:1和seq id no:6；seq id no:1和seq id no:7；seq id no:1和seq id no:8；seq id no:1和seq id no:9；seq id no:1和seq id no:10；seq id no:1和seq id no:11；seq id no:1和seq id no:12；seq id no:1和seq id no:13；seq id no:1和seq id no:14；seq id no:1和seq id no:15。抗her2 fab包括以下重链和轻链序列：seq id no:2和seq id no:5；seq id no:2和seq id no:6；seq id no:2和seq id no:7；seq id no:2和seq id no:8；seq id no:2和seq id no:9；seq id no:2和seq id no:10；seq id no:2和seq id no:11；seq id no:2和seq id no:12；seq id no:2和seq id no:13；seq id no:2和seq id no:14；seq id no:2和seq id no:15。抗her2 fab包括以下重链和轻链序列：seq id no:3和seq id no:5；seq id no:3和seq id no:6；seq id no:3和seq id no:7；seq id no:3和seq id no:8；seq id no:3和seq id no:9；seq id no:3和seq id no:10；seq id no:3和seq id no:11；seq id no:3和seq id no:12；seq id no:3和seq id no:13；seq id no:3和seq id no:14；seq id no:3和seq id no:15。抗her2 fab包括以下重链和轻链序列：seq id no:4和seq id no:5；seq id no:4和seq id no:6；seq id no:4和seq id no:7；seq id no:4和seq id no:8；seq id no:4和seq id no:9；seq id no:4和seq id no:10；seq id no:4和seq id no:11；seq id no:4和seq id no:12；seq id no:4和seq id no:13；seq id no:4和seq id no:14；seq id no:4和seq id no:15。在其他实施方案中，seq id no:1、2、3、4中的任一个可包括表9a中所公开的fc突变。
[1431]
表8.具有用于非天然氨基酸掺入的琥珀位点的抗her2 fab重链(hc)和轻链(lc)氨基酸序列。还公开了下表中的所有序列，其中paf被任何其他非天然氨基酸替代。
[1432]
[1433]
[1434]
[1435][1436]
x表示非天然氨基酸(nnaa)；下划线表示表9a中的fc突变
[1437]
除了位置114处的重链中的琥珀突变之外，还在抗her2抗体或抗体片段的不同位置处产生fc突变，以改良药代动力学和/或增强抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)和/或抗体依赖性细胞性细胞毒性adcc活性，(表9a和表9b)。
[1438]
表9a-抗her2 fc突变
[1439][1440]
表9b.具有用于非天然氨基酸掺入的琥珀位点和所用的额外突变的抗her2单克隆抗体变体。还公开了下表中的所有序列，其中paf被任何其他非天然氨基酸替代。
[1441]
[1442][1443]
x表示非天然氨基酸(nnaa)
[1444]
本发明中所用的抗her2单克隆抗体包括seq id no:16、或seq id no:17、或seq id no:18的重链，以及以下轻链序列中的任一个：seq id no:5；seq id seq id no:6；seq id no:7；seq id no:8；seq id no:9；seq id no:10；seq id no:11；seq id no:12；seq id no:13；seq id no:14；seq id no:15。在其他实施方案中，本发明中所用的抗her2 fab包括表9a中所公开的重链突变中的任一个和以下轻链序列中的任一个：seq id no:5；seq id seq id no:6；seq id no:7；seq id no:8；seq id no:9；seq id no:10；seq id no:11；seq id no:12；seq id no:13；seq id no:14；seq id no:15。
[1445]
瞬时表达-平台细胞系维持在补充有3mm l-谷氨酰胺(gibco)和3mm glutamax(gibco)的ex-cell 302(sigma)中。细胞每3-4天传代一次，接种密度为40万个细胞/ml。在转染之前一天，以60万个细胞/ml接种细胞。在第0天，按照说明手册使用maxcyte电穿孔平台用编码轻链和重链的抗体表达质粒转染细胞。转染后，将细胞置于125ml空摇瓶中，并在37℃静态孵育箱中孵育30min。然后将转染的细胞以3
×
106/ml的密度接种到摇瓶中的基础表达培养基(补充有50μm msx的50％ dynamis-50％ excell 302)中。转染的细胞在37℃、5％co2下在设定为140rpm的定轨振荡器上孵育。在第1天将1mm paf与7g/l cell boost 5(ge healthcare)、120μg/l long r3 igf-1(sigma)和2mm glutamax一起添加至培养物中。孵育箱内的温度从37℃变为32℃。第3天再添加7g/l cell boost 5和2mm glutamax，并在
第5天收集上清液。使用葡萄糖计监测葡萄糖水平，并且当培养基中的葡萄糖水平低于2g/l时，将额外的葡萄糖添加至培养物中。通过vi-cell仪器测量活细胞计数和存活力。生产率通过octet使用蛋白g传感器测量。
[1446]
稳定的批量池生成-使用pvu i(neb)消化6小时使表达质粒线性化。线性化后，使用苯酚萃取纯化dna，并以2.5μg/μl的浓度溶解于无内毒素的水中。平台细胞系bb-117维持在补充有3mm l-谷氨酰胺和3mm glutamax的ex-cell 302中。细胞每3-4天传代一次，接种密度为0.4
×
106/ml。在转染之前一天，以0.6
×
106/ml接种细胞。在第0天，按照说明手册使用maxcyte电穿孔平台用线性化抗体表达质粒转染细胞。转染后，将细胞置于125ml空摇瓶中，并在37℃静态孵育箱中孵育30min。然后将30ml恢复培养基(补充有3mm谷氨酰胺和3mm glutamax的50％ ex-302-50％ cd-cho)添加至烧瓶中并振荡过夜。第一天，对转染的细胞进行计数、离心、洗涤并重悬于选择培养基(具有50-100μm msx的50％ ex-302-50％ cd-cho)中以生成稳定的批量池。监测活细胞数量和存活力，并且每3-4天更换一次培养基，直到稳定的批量池的存活力回到90％。当选择结束时，制备冷冻细胞储备液，并使用产生的稳定批量池生成用于补料分批表达的材料。
[1447]
补料分批表达—在第0天，将先前生成的抗体稳定的批量池以0.5
×
106/ml的密度接种到摇瓶中的基础表达培养基(补充有50μmmsx的50％ dynamis-50％ excell 302)中。转染的细胞在37℃、5％co2下在设定为140rpm的定轨振荡器上孵育。在第3天，将0.5mm paf与10g/l cell boost 4(ge healthcare)和0.52g/l cell boost 7b(ge healthcare)一起添加至培养物中。在第5天，将120μg/l long r3 igf-1添加至培养物中。使用葡萄糖计监测葡萄糖水平，并且当培养基中的葡萄糖水平低于2g/l时，将额外的葡萄糖添加至培养物中。通过vi-cell仪器测量活细胞计数和存活力。在第7天，收集上清液进行纯化。生产率通过octet使用蛋白g传感器测量。
[1448]
从eucode表达系统中纯化含nnaa的抗体—将含有含nnaa的靶抗体的澄清的细胞培养基装载到在ph 7.5的20mm磷酸钠、100mm氯化钠中平衡的蛋白a prosep ultra柱(emd millipore)上。装载后，用缓冲液a(20mm磷酸钠、100mm氯化钠，ph 7.5)洗涤柱，接着用洗涤缓冲液b(5mm琥珀酸，ph 5.8)洗涤，以去除宿主细胞污染物。用洗脱缓冲液c(50mm甘氨酸，10mm琥珀酸，ph 3.2)从柱中洗脱靶抗体。合并靶抗体，并用2.0m tris碱将ph调节至ph 5.0。通过将条件蛋白a池装载到在ph 5.0的30mm乙酸钠中平衡的capto sp impres柱(ge healthcare)上来进一步纯化靶抗体。使用线性梯度至100％缓冲液b(30mm乙酸钠，0.5m氯化钠，ph 5.0)从柱中洗脱靶抗体，并且合并含有单体抗体的级分，通过0.22μm过滤，并在≤65℃下储存直到进一步使用。
[1449]
tlr激动剂接头有效载荷的位点特异性缀合—将含有nnaa(例如对乙酰基苯丙氨酸)的抗体缓冲液交换至缀合缓冲液(30mm乙酸钠，ph 4.0)中并浓缩至10-20mg/ml。最后将100mm乙酸酰肼添加至抗体中，接着添加10摩尔当量的羟胺官能化tlr激动剂药物-接头。将缀合反应物在25-30℃下孵育18-20小时，接着通过capto sp impres柱(ge healthcare)纯化以去除过量试剂。将纯化的adc缓冲液更换为配制物缓冲液(50mm组氨酸、100mm nacl、5％海藻糖，ph 6.0)并在≤65℃下储存直到进一步使用。
[1450]
本发明的tlr激动剂药物-接头抗体缀合如下所示：
[1451][1452]
如图所示，抗体与接头连接，所述接头可以是可裂解的氨基酸接头或不可裂解的接头，并且接头与药物或有效载荷连接。接头-药物可以是一种或多种如由n所示，其中n是1至10的整数。此外，药物或有效载荷的数量可以是一个或多个，或是大于1的整数，药物可以是1至8。
[1453]
实施例8：小分子tlr激动剂的体外功能测定
[1454]
将hek-blue
tm htlr7细胞在hek-blue
tm
检测培养基中孵育，并用增加浓度的tlr7或tlr8或tlr7/8激动剂刺激。孵育24h后，通过quanti-blue检测试剂(invivogen，san diego，ca)测定nf-kb诱导的seap水平，在655nm的od处获得读数。使用prism软件从剂量-响应曲线确定ec
50
。下表和图示出了本文实施例1-6中所描述的本发明的示例性tlr激动剂的活性。ec
50
值小于500nm表明化合物的效力高于ec
50
值介于50nm至1μm或大于1μm至3μm的那些。
[1455]
在hek-blue htlr7报告细胞系中使用ec
50
为2.08μm的商业tlr7激动剂雷西莫德(resiquimod)(r848)、ec
50
为0.435μm的化合物1和ec
50
为0.153μm的化合物2进行tlr7激动剂刺激(数据未示出)。
[1456]
测定了以上实施例1-6中所公开的示例性tlr激动剂的活性。表10示出了与商业对照dsr-6434、雷西莫德和莫托莫德(motolimod)相比的ec
50
值。
[1457]
表10-示例性tlr激动剂的活性
[1458]
化合物编号化合物tlr7 ec
50
(nm)n/a对照-dsr-64349.203n/ar848-雷西莫德519.788axc-779242.160axc-73811.0849axc-725249.454axc-732255.558axc-736213.462axc-740115.686axc-777910.487axc-77883.3489axc-78971.34109axc-800》5000106axc-801》5000112axc-802》500093axc-803331.594axc-804260.397axc-807412.661axc-73928.17
59axc-73718.764axc-74356.11
[1459]
表11示出了所选tlr7激动剂的tlr7活性。axc-887和axc-877显示ec
50
值低于10nm，表明这些化合物是非常强效的tlr7激动剂。在tlr8报告基因测定中，axc-887显示出可测量的活性，其中ec
50
为3733nm，而商业化合物莫托莫德的ec
50
为1427nm。这表明acx-887是tlr7/8双重激动剂。
[1460]
表11-示例性tlr激动剂的活性
[1461][1462][1463]
表12示出了附接至接头的所选tlr7激动剂的tlr7活性。axc-879在不同的tlr激动剂(有效载荷)接头中表现出最高的效力。
[1464]
表12-示例性tlr激动剂和接头的活性
[1465]
化合物tlr激动剂有效载荷 接头 ec
50
(nm)dsr-643414.8axc-876362.4axc-879151.2axc-880409.5axc-882550.8axc-874》10,000axc-875》10,000axc-862400.1axc-863864.2axc-867829.0axc-868》5,000axc-869》10,000axc-889696.5
[1466]
表13示出了额外tlr7激动剂和附接至接头的tlr7激动剂的tlr7活性。axc-895在
测试的不同有效载荷中表现出最高的效力，而axc-901在不同的有效载荷接头中表现出最高的效力。
[1467]
表13-示例性tlr激动剂和接头的活性
[1468][1469][1470]
表14示出了额外tlr7激动剂和附接至接头的tlr7激动剂的tlr7活性。所有测试的化合物都具有tlr7激动剂活性。axc-894、axc-903、axc-904、axc905和axc-906测试了不同有效载荷的最高效力，其中ec
50
值低于10nm。
[1471]
表14-示例性tlr激动剂和接头的活性
[1472]
化合物tlr7 ec
50
(nm)dsr-643410.5axc-9034.3axc-90751.8axc-8942.1axc-90971.9axc-9048.1axc-9052.6axc-9065.4axc-90811.5axc-860119.5axc-9102591.1
[1473]
表15比较了附接至接头(药物接头或dl)的不同tlr7激动剂的和含有最终代谢物的非天然氨基酸(例如paf(dl-paf))的tlr7活性。在所有情况下，含有最终代谢物的paf都表现出比其各自具有药物接头的有效载荷更高的效力。axc-879在不同的tlr有效载荷接头中表现出最高的效力。
[1474]
表15-在存在或不存在非天然氨基酸(nnaa)的情况下示例性tlr激动剂 接头的活
性
[1475][1476]
dl＝药物接头；dl-paf＝含有最终代谢物的paf
[1477]
实施例9：tc的位点特异性缀合
[1478]
如实施例7中所描述，使用分析型反相hplc进行tc的位点特异性缀合。在还原条件下，在氨基酸位置ha114处具有非天然氨基酸(例如paf)的未缀合的抗her2抗体的分析型反相hplc色谱图。抗her2抗体在氨基酸位置ha114处分别与tlr激动剂axc-875和axc-880缀合(数据未示出)。表16示出了来自上述标准缀合条件的tlr缀合物的药物-抗体比(dar)。在tlr缀合物之间可以看到不同的dar水平(0.3-2.0)，这主要是由于相关tlr接头-有效载荷的不同特性。
[1479]
表16.通过rp-hplc测定的tlr缀合物的药物-抗体比(dar)。
[1480][1481]
[1482]
实施例10：使用多种肿瘤细胞的体外共培养测定
[1483]
将raw-blue
tm
细胞(invivogen，san diego，ca)与具有不同her2表达水平的人肿瘤细胞以1:1e:t比共培养，其中在96孔板中每孔细胞总数为100万个。将不同浓度的小分子tlr7激动剂和缀合的免疫刺激抗体缀合物(isac)添加至共培养细胞培养基中。孵育24h后，通过quanti-blue检测试剂(invivogen，san diego，ca)测定来自raw-blue
tm
细胞的nf-kb诱导的seap水平，在od 655nm处获得读数。使用prism软件生成剂量-响应曲线。
[1484]
与抗her2抗体缀合时，所选有效载荷接头的肿瘤依赖性isac活性的比较。skov3是her2高表达肿瘤细胞系(数据未示出)；jimt-1是her2中/低表达肿瘤细胞系(数据未示出)；并且a431是her2低表达肿瘤细胞系(数据未示出)。小分子tlr7激动剂在所有肿瘤细胞系存在的情况下都显示出强效的tlr7活性。所有tlr7isac在her2低表达或中表达肿瘤细胞系存在的情况下均无活性。具有有效载荷药物接头axc-863的isac仅在her2高表达肿瘤细胞系存在的情况下显示出强效的剂量依赖性活性。
[1485]
与抗her2抗体缀合时，额外有效载荷接头的肿瘤依赖性isac活性的比较。skbr3是her2高表达肿瘤细胞系(数据未示出)，并且hcc1806是her2极低表达肿瘤细胞系(数据未示出)。小分子tlr7激动剂在所有肿瘤细胞系存在的情况下都显示出强效的tlr7活性。而所有tlr7 isac和未缀合的抗her2抗体在her2极低表达肿瘤细胞系存在的情况下均显示无活性。具有有效载荷药物接头axc-863的isac仅在her2高表达肿瘤细胞系存在的情况下显示出强效的剂量依赖性活性。
[1486]
与抗her2抗体缀合时，额外有效载荷接头的肿瘤依赖性isac活性的比较。skbr3是her2高表达肿瘤细胞系(数据未示出)，并且hcc1806是her2极低表达肿瘤细胞系(数据未示出)。小分子tlr7激动剂在所有肿瘤细胞系存在的情况下都显示出强效的tlr7活性。所有tlr7 isac和未缀合的抗her2抗体在her2极低表达肿瘤细胞系存在的情况下均显示出无活性。所有isac仅在her2高表达肿瘤细胞系存在的情况下显示出强效的剂量依赖性活性(数据未示出)。具有有效载荷药物接头axc-879的isac表现出最高的her2依赖性tlr7活性。
[1487]
与抗her2抗体缀合时，额外有效载荷接头的肿瘤依赖性isac活性的比较。skbr3是her2高表达肿瘤细胞系(数据未示出)，并且hcc1806是her2极低表达肿瘤细胞系(数据未示出)。小分子tlr7激动剂在所有肿瘤细胞系存在的情况下都显示出强效的tlr7活性。tlr7 isac和未缀合的抗her2抗体在her2极低表达肿瘤细胞系存在的情况下均显示出无活性。所有isac仅在her2高表达肿瘤细胞系存在的情况下显示出强效的剂量依赖性活性。具有有效载荷药物接头axc-901的isac表现出最高的her2依赖性tlr7活性。
[1488]
在skbr3 her2高表达肿瘤细胞系(数据未示出)和hcc1806her2极低表达肿瘤细胞系(数据未示出)中，与抗her2抗体缀合的三(3)个有效载荷接头的肿瘤依赖性isac活性的比较表明，与her2-axc-860和her2-axc-910相比，her2-axc-879具有最佳的isac活性，并且her2-axc-910代表已知的isac。表17描述了用于生成比较的her2-axc isac的tlr激动剂-接头结构。
[1489]
表17-tlr激动剂结构
[1490][1491]
实施例11：药物-接头设计/有效载荷-接头设计
[1492]
药物-接头或有效载荷-接头设计用于增强、增加或改良本发明的tlr激动剂组合物和缀合物的药代动力学和治疗概况。本发明的tc被设计为通过使用peg屏蔽和前药设计在非预期靶位点处阻断tlr的暴露来提供额外的靶特异性，例如，其中peg屏蔽或前药在肿瘤微环境处的裂解释放了活性有效载荷进一步增强特异性。
[1493]
peg屏蔽—通过peg或peg屏蔽最小化或掩盖了药物/有效载荷接头中的固有疏水性的一种方法。peg设计被并入本发明的tc中，以通过屏蔽tc免受非预期的靶标相互作用来改良或增强药物-接头溶解度，从而允许更好的靶向效率，例如在肿瘤微环境处的抗肿瘤活性。以下说明了使用tlr激动剂化合物axc-914(表示为有效载荷)的具有peg屏蔽的本发明tc的药物/有效载荷接头设计策略：
[1494][1495]
具有peg屏蔽设计的有效载荷的实例：
[1496]
[1497]
以及化合物axc-913：
[1498][1499]
使用peg24说明的具有peg屏蔽设计的axc-913有效载荷的实例：
[1500][1501]
图2和表18示出了使用peg屏蔽方法的tlr7激动剂的tlr7活性。
[1502]
表18-具有peg屏蔽的tlr激动剂的活性
[1503]
化合物ec
50
(nm)axc-91329.6axc-923434axc-924398axc-9251591axc-926824
[1504]
图3a-3b和表19示出了在用于peg屏蔽方法的线性或支化peg的存在下，tlr7激动剂药物-接头的tlr7活性。使用具有peg屏蔽的axc-913有效载荷，以化合物axc-939(peg4)、axc-937(peg8)、axc-940(peg12)和axc-936(peg48)为代表，证明了具有线性peg屏蔽的活性。类似地，具有支化peg的axc-913有效载荷，例如分别由axc-938、axc-945和axc-946代表的(peg4)3、(peg8)3和(peg12)3，在peg屏蔽下显示出活性ec
50
。
[1505]
表19-具有peg屏蔽的示例性tlr激动剂药物-接头的活性
[1506]
化合物ec
50
(nm)化合物ec
50
(nm)化合物ec
50
(nm)axc-931490axc-9461408axc-962452.6axc-932156axc-947337axc-96319.4axc-93340axc-949760axc-96410.3axc-93410.3axc-950443axc-96548.3axc-93540axc-951842axc-96665.5axc-936764axc-9521023axc-97828.9axc-937456axc-953200.9axc-97921.7axc-938644axc-954111.3axc-98029.6
axc-939303axc-955172.8axc-98110.1axc-940644axc-956157.9axc-98219.1axc-941699axc-95839.6axc-98353.3axc-942387axc-959550.7dsr-643414axc-943410axc-960266.8axc-863320axc-945232axc-961856.1
ꢀꢀ
[1507]
前药—用于改良或增强本发明的tlr激动剂的药代动力学活性的另一种方法涉及在不存在或存在peg屏蔽的情况下的蛋白水解可裂解接头设计。
[1508][1509]
使用示例性axc-914和boc以及val-cit-paba基团的具有蛋白水解可裂解基团的药物接头/有效载荷接头设计的实例。boc和val-cit-paba基团可以用本领域技术人员已知的和本文所公开的任何其他蛋白水解可裂解基团替代。
[1510][1511]
在存在和不存在peg24的情况下，使用示例性axc-913和可裂解基团val-ala或val-ala-paba基团的具有蛋白水解可裂解基团的药物接头/有效载荷接头设计的实例。应注意，任何蛋白水解可裂解的基团都可以与peg屏蔽一起使用。表4中列出了在存在或不存在peg屏蔽的情况下使用蛋白水解可裂解基团设计的tc的额外实例。
[1512]
axc-913
[1513][1514]
在存在和不存在peg24的情况下，代表性的示例性axc-913和可裂解基团val-ala
或val-ala-paba基团。
[1515][1516]
实施例12：具有peg屏蔽接头的her2 isac的活性
[1517]
图4示出了her2 isac的skbr3-rawblue共培养体外测定。图4示出了her2-axc879、her2-axc863与her2-对照tlr7激动剂缀合物的肿瘤依赖性isac活性。数据表明，就her2阳性肿瘤特异性巨噬细胞报告细胞活化而言，her2-axc879是一种更强效的isac。
[1518]
还确定了fc区对her2 isac活性的影响。图5示出了fc修饰对isac活动的影响。与具有野生型igg1 fc区的her2 isac相比，adcc增强型(ade突变，表9a)未显示出提高的效力，而fc无效突变(pva突变，表9a)显示出显著降低的效力。
[1519]
还确定了缀合位点对her2 isac活性的影响。图6示出了不同缀合位点对isac活性的影响。在所有测试的缀合位点中，重链a114(kabat编号，实际编号a121)显示出最高的靶标特异性isac活性。
[1520]
在skbr3和hcc1806细胞系中，使用rawblue共培养体外测定法来测试具有peg屏蔽tlr7激动剂有效载荷的各种her2 isac的活性。图7-9和表20a-20d示出了具有peg屏蔽tlr7激动剂有效载荷的her2 isac的her2依赖性活性。与axc-879相比，一些peg屏蔽tlr7激动剂在高浓度下表现出降低的非特异性活性。图7a-7b分别示出了在raw-blue共培养测定中，在不存在或存在peg屏蔽的情况下，axc-879衍生物的体外活性。图7c示出了具有分支修饰的axc-879衍生物的体外活性。图8a-8c和图9a-9b示出了具有peg屏蔽的各种her2 isac的体外活性。表20a-20c示出了具有peg屏蔽的各种her2 isac的活性。
[1521]
图9a-9b示出了具有d-lys阻断或l-lys阻断的axc-879衍生物与表20d的体外活性比较。
[1522]
表20a-具有peg屏蔽的各种her2 tlr激动剂有效载荷的活性
[1523][1524]
表20b-具有peg屏蔽的各种her2 tlr激动剂有效载荷的活性
[1525][1526]
表20c-具有peg屏蔽的各种her2 tlr激动剂有效载荷的活性
[1527][1528]
表20d-具有peg屏蔽的各种her2 tlr激动剂有效载荷的活性
[1529][1530]
实施例13：肿瘤细胞和报告细胞的体外共培养测定
[1531]
用肿瘤细胞和报告细胞进行实施例10中所描述的额外体外共培养测定。数据在本实施例中提供。
[1532]
还使用了用肿瘤细胞和人pbmc的体外共培养测定。简而言之，从人全血(购自allcells)中分离出新鲜人pbmc。将含4％低igg血清的rpmi-1640培养基中的总计250,000个pbmc和50,000个靶细胞(e:t的比是5:1)接种在96孔板的每一个孔中，并且将不同浓度的小分子tlr 7激动剂和缀合的isac添加至共培养细胞培养基中。孵育24h或48h后，使用来自mesoscale的u-plex multiplex测定系统测定不同细胞因子的水平。使用cytotox96non-radioactive cytotoxicity assay试剂盒(promega)通过ldh水平测量肿瘤细胞杀伤。对于树突状细胞成熟，将1
×
106个pbmc和1
×
105个靶细胞与10nm her2 mab、her2-isac或同种型对照-isac一起孵育24或48h。收集细胞并与树突状细胞标记物、hla-dr、dc-sign/cd209和cd86抗体一起孵育用于流式细胞术。使用prism软件生成剂量-响应曲线。数据在本实施例中提供。
[1533]
图10示出了在her2高肿瘤细胞系skbr3中，与未缀合的her2mab和axc-879同种型对照相比，her2-axc879具有增强的adcc介导的肿瘤杀伤。在her2低肿瘤细胞系hcc1806中，her2-axc879几乎没有显示出肿瘤细胞杀伤。
[1534]
图11-12示出了当与her2高肿瘤细胞系skbr3共培养时，与未缀合的her2 mab相比，her2-axc879在人pbmc上诱导更高的hla-dr、cd86和cd209表达水平。图11示出了在pbmc共培养测定中，her2 mab与her2-axc879 isac之间的hla-dr标志物对骨髓细胞诱导的比较。图12(图a-d)示出了在pbmc共培养测定中，her2 mab与her2-axc879 isac之间的cd86/dc-sign 双阳性细胞诱导的比较。图12，图a表示未处理的1.5％hla-dr /dc-sign /cd86 细胞。图12，图b表示her2 mab 18％hla-dr /dc-sign /cd86 细胞。图12，图c表示her-axc87940.8％ hla-dr /dc-sign /cd86 细胞。图12，图d表示psma-axc879同种型对照4.04％ hla-dr /dc-sign /cd86 细胞。数据表明her2-isac促进人pbmc中的骨髓细胞成熟和活化。
[1535]
图13a-13c示出了各种her2 isac相对于未缀合的her2 mab的增强的her2依赖性肿瘤细胞杀伤活性，并在pbmc共培养测定中比较了它们与her2-axc879的靶标依赖性细胞毒性。her2-axc879是在her2高表达细胞系(图13a)和her2低表达细胞系(图13b)中测试的所有缀合物中最具活性的isac。在her2阴性细胞系mda-mb-468(图13c)中，所有her2 isac均未显示出特异性肿瘤细胞杀伤活性。
[1536]
图14a和14b示出了在使用her2高表达细胞系nci-n87(图14a)和her2阴性细胞系
mda-mb-468(图14b)的人pbmc共培养测定中her2依赖性细胞因子的诱导。
[1537]
图15-17示出了在人pbmc共培养测定中，使用her2高表达细胞系skbr3、her2低细胞系hcc1806、her2阴性细胞系mda-mb-468和单独的人pbmc的额外her2依赖性细胞因子诱导。测量了两种不同的促炎性细胞因子tnfα和ifnγ。her2-axc879在所有测试的her2 isac中均表现出最高的效力。与her2-axc879相比，her2-axc966在her2高skbr3细胞系中表现出类似的细胞因子诱导活性，但在her2低hcc1806细胞系中表现出显著较低的细胞因子诱导活性。所有her2 isac均未在her2阴性mda-mb-468细胞系和单独的人pbmc中诱导可测量的细胞因子。图15a示出了her2 isac在her2高skbr3/pbmc共培养物中对ifnγ细胞因子的诱导。图15b示出了her2 isac在her2低hcc1806/pbmc共培养测定中对ifnγ细胞因子的诱导。图15c示出了her2 isac在her2高skbr3/pbmc共培养测定中对tnfα细胞因子的诱导。图15d示出了her2 isac在her2低hcc1806/pbmc共培养测定中对tnfα细胞因子的诱导。图16a示出了具有前药设计的her2 isac在her2高skbr3/pbmc共培养测定中对ifnγ细胞因子的诱导。图16b示出了具有前药设计的her2 isac在her2低hcc1806/pbmc共培养测定中对ifnγ细胞因子的诱导。图16c示出了具有前药设计的her2 isac在her2阴性mda-mb-468/pbmc共培养测定中对ifnγ细胞因子的诱导。图16d示出了具有前药设计的her2 isac在仅pbmc中对ifnγ细胞因子的诱导。图17a示出了具有前药设计的her2 isac在her2高skbr3/pbmc共培养测定中对tnfα细胞因子的诱导。图17b示出了具有前药设计的her2isac在her2低hcc1806/pbmc共培养测定中对tnfα细胞因子的诱导。图17c示出了具有前药设计的her2 isac在her2阴性mda-mb-468/pbmc共培养测定中对tnfα细胞因子的诱导。图17d示出了具有前药设计的her2 isac在仅pbmc中对tnfα细胞因子的诱导。
[1538]
为了测试本发明的isac平台适用于其他靶标，对靶向不同肿瘤抗原的其他抗体进行了rawblue体外共培养测定。图18a-18c示出了示例性isac axc879的效果，使用hcc1806细胞用于trop2isac(图18a)、c4-2细胞用于psma(图18b)和786-o-细胞用于cd70(图18c)。与其未缀合的抗体相比，trop2-axc879、psma-axc879和cd70-axc879都显示出靶标依赖性isac活性。数据表明本发明的isac平台可以与其他肿瘤靶标一起使用。
[1539]
测试了不同细胞系上的trop2表达水平。图19a示出了不同肿瘤细胞系上的trop2靶标表达水平。图19b示出了trop2-axc879的体外效力与不同肿瘤细胞系上的trop2表达水平相关。数据表明trop2-axc879 isac活性取决于trop2靶标表达水平。
[1540]
将额外trop2 tlr7激动剂缀合物的isac活性与trop2-axc879进行比较。使用raw-blue共培养测定在trop2阳性hcc1806细胞系(图20a)和trop2阴性hcc1395细胞系(图20b)中测试了额外trop2 isac。使用在本文别处描述的pbmc共培养测定在trop2阳性skbr3细胞系(图21a)和trop2阴性hcc1395细胞系(图21b)中进行了额外研究。数据表明所有测试的isac都具有活性，其中trop2-axc879表现出最高的活性。与hcc1395细胞(图21b)相比，trop2-isac对tnfα细胞因子的诱导在skbr3细胞(图21a)中的trop2-axc879的情况下更高。
[1541]
使用pbmc共培养测定，与未缀合的trop2 mab和axc-879同种型对照(psma-axc879)相比，进一步评估trop2-axc879在trop2阳性bxpc-3细胞系中的adcc效应(图22a)，并评估trop2-axc879在trop2阴性hcc1395细胞系中的杀伤％(图22b)。数据表明，与未缀合的trop2抗体相比，trop2-axc879在trop2阳性bxpc-3细胞中表现出增强的adcc介导的肿瘤杀伤，并且在trop2阴性hcc1395细胞中未表现出肿瘤细胞杀伤。
[1542]
表21.具有用于非天然氨基酸掺入的琥珀位点的抗trop2、抗psama和抗cd70重链(hc)和轻链(lc)氨基酸。还公开了下表中的所有序列，其中paf被任何其他非天然氨基酸替代。
[1543]
[1544]
[1545][1546]
x表示非天然氨基酸(nnaa)
[1547]
在本发明中使用的抗trop2单克隆抗体包括seq id no:19或seq id no:21的重链和seq id no:20的轻链序列。在本发明中使用的抗psma单克隆抗体包括seq id no:22或seq id no:24的重链和seq id no:23的轻链序列。在本发明中使用的抗cd70单克隆抗体包括seq id no:25或seq id no:27的重链和seq id no:26的轻链序列。
[1548]
实施例14：her2-axc879的pk研究
[1549]
将10只雌性c57bl/6j小鼠分成四组，并用单剂量(iv)her2-axc879以两个剂量水平(1mg/kg和5mg/kg)进行治疗，以评价其药代动力学。在实验开始时，动物将在剂量前放血，并且然后在注射后的指定时间点放血。在以下时间点从每只小鼠尾部采集全血样品：2h、6h、24h、48h、72h、4d、7d、10d、14d、21d和28d。将血样按1:10稀释到酪蛋白阻断缓冲液中并储存。然后使用为稀释血样中的总抗体测量而开发的pk测定评价所有样品。如图23中所
示，1mg/kg和5mg/kg组均在28天时可检测到。cmax水平大致可从1mg/kg线性扩展至5mg/kg。pk数据表明her2-axc879的良好线性pk曲线。
[1550]
实施例15：在mc38-hher2结肠肿瘤同源模型中体内测试抗her2 tlr7激动剂缀合物
[1551]
将通过敲除小鼠her2基因并在mc38细胞中过表达人her2基因进行遗传修饰的mc38-hher2细胞在dmem 10％ fbs中培养最少2周。将c57bl/6小鼠在右前腹中皮下注射1
×
106个mc38-hher2细胞和0.1ml pbs。当平均肿瘤大小达到大约200-250mm3时，将荷瘤小鼠随机分为7组。所有疗法每周一次静脉内(iv)施用，持续4周。通过卡尺测量和体重每周两次监测动物的肿瘤生长。
[1552]
如图24a-24c和图25中所示，组平均肿瘤体积针对时间作图。在图24a中，对照的肿瘤体积随时间推移持续增加，而具有不同tlr7激动剂有效载荷的三个治疗组(每周一次，以3mg/kg给药，持续4周)表现出不同程度的肿瘤生长抑制。在三种不同的her2-tlr7激动剂缀合物中，与其他组诸如her2-axc863(图24b)相比，her2-axc879显示出最强效的抗肿瘤活性(图24c)。在her2-axc879组中，10只小鼠中有10只在3mg/kg剂量治疗后表现出完全的肿瘤消退响应。
[1553]
在图25中，评价了抗pd1抗体与her2-axc879之间的协同效应。抗小鼠pd-1抗体以1mg/kg每周给药一次，持续4周，并且her2-axc879以0.3mg/kg每周给药一次，持续4周。两种药物单独给药和组合给药。与每个单一治疗组相比，组合治疗组显示出更好的肿瘤生长抑制，并且差异是统计上显著的(p值《0.05)。该数据说明her2-axc879可与抗pd-1抗体组合用于治疗癌症，并且与单独使用抗pd-1抗体治疗相比，可能会产生更好的功效。
[1554]
为了进一步比较her2-axc879与her2-axc863之间的差异，在每次剂量注射后测量总her2抗体的血清浓度。(图26a和26b)数据表明her2-axc879可以在每个治疗周期中保持高药物暴露和一致的血清浓度，而her2-axc863不能在第二个治疗周期和第三个治疗周期中保持相同的暴露水平。这表明与her2-axc863相比，her2-axc879具有更有利的pk概况。
[1555]
为了进一步研究her2-axc879的剂量-功效关系并将her2-axc879与其他her2 isac进行比较，在c57bl/6小鼠的右前腹中皮下注射1
×
106个mc38-hher2细胞和0.1ml pbs。当平均肿瘤大小达到大约200-250mm3时，将荷瘤小鼠随机分为不同的组。所有疗法每周一次静脉内(iv)施用，持续4周。通过卡尺测量和体重每周两次监测动物的肿瘤生长。
[1556]
如图27和图28中所示，组平均肿瘤体积针对时间作图。在图27中，不同剂量的her2-axc879表现出不同水平的肿瘤生长抑制。在1mg/kg剂量和更高剂量下，在大多数小鼠中观察到显著的肿瘤生长抑制和肿瘤消退，而3mg/kg剂量表现出最高水平的肿瘤消退。该实验表明her2-axc879的抗肿瘤功效与剂量水平和her2受体占有率相关。图28示出了对照组和her2-axc966的肿瘤体积随时间持续增加，而具有不同tlr7激动剂有效载荷的三个治疗组(her2-axc955、her2-axc879和her2-axc979)显示出不同程度的肿瘤生长抑制。在三种不同的her2-tlr7激动剂缀合物中，her2-axc955显示出最强效的抗肿瘤活性。
[1557]
实施例16：mc38-hher2和mc38亲代肿瘤对isac治疗的小鼠的再攻击
[1558]
为确定her2 isac治疗是否诱导抗肿瘤免疫记忆和对相同或类似肿瘤的长期保护，将先前用her2 isac治疗并显示肿瘤完全消退的小鼠分组并在最后一次药物施用后28天在左前腹中用mc38-hher2(1
×
106个细胞)或mc38亲代肿瘤(5
×
105个细胞)再攻击。作为
对照，未接受过任何先前治疗的首次试验小鼠接种了相同量的肿瘤细胞。
[1559]
图29a和图29b中示出了以平均肿瘤体积计的肿瘤生长曲线。mc38-hher2和mc38未能在肿瘤完全消退的先前治疗的小鼠中生长，而在对照首次试验小鼠中迅速生长。该数据表明her2 isac治疗在小鼠中产生了长期的mc38-hher2和mc38特异性抗肿瘤免疫响应。
[1560]
实施例17：在jimt-1乳腺肿瘤异种移植模型中体内测试抗trop2 tlr7激动剂缀合物
[1561]
在植入前，将jimt-1细胞在rpmi 10％ fbs中培养至少2周。将新鲜收获的细胞悬浮于pbs中，并与matrigel以1:1混合。将70只雌性nsg小鼠在右侧腹中皮下植入5
×
106个细胞/小鼠的0.1ml细胞悬浮液。当肿瘤达到约180mm3时，将小鼠分成5组，每组10只动物，分别是对照组和不同的治疗剂量组(对于trop2-ha114-axc879为10mg/kg、3mg/kg和1mg/kg，并且对于作为同种型对照的rsv-ha114-axc879为10mg/kg)。所有疗法每周一次静脉内(iv)施用，持续4周。通过卡尺测量和体重每周两次监测动物的肿瘤生长。
[1562]
如图30a中所示，组平均肿瘤体积针对时间作图。对照组(gr.1)和同种型对照组(gr.2)的肿瘤体积显示出类似的肿瘤生长。trop2-axc879(gr.3，1mpk)和trop2-axc879(gr.4，3mpk)显示出边际活性，其中tgi分别为25％和26％。10mpk(gr.5)下的trop2-axc879显示出对照的59％的tgi。这表明trop2 tlr7激动剂缀合物即使在免疫缺陷nsg小鼠中也具有显著的肿瘤生长抑制活性。每周两次监测动物体重并随时间推移绘制在图30b中。当用trop2-axc879治疗并且每周剂量高达10mg/kg时，对照组和治疗组的体重在该模型中未显示出任何可观察到的毒性。这表明trop2-axc879在nsg小鼠模型中具有良好的耐受性。
[1563]
实施例18：乳腺癌的治疗
[1564]
用于乳腺癌疗法的曲妥珠单抗连接的tlr激动剂衍生物的安全性和/或功效的人体临床试验
[1565]
目的：比较包含曲妥珠单抗连接的tlr激动剂衍生物的施用组合物的安全性和药代动力学。
[1566]
研究设计：本研究是对乳腺癌患者进行的i期、单中心、开放标签、随机剂量递增研究，接着是ii期研究。患者在进入研究之前，不应暴露于曲妥珠单抗连接的tlr激动剂衍生物。患者不得在试验开始2周内接受过针对其癌症的治疗。治疗包括使用化学疗法、造血生长因子和生物疗法(诸如单克隆抗体)。患者必须已从与先前治疗相关的所有毒性(0级或1级)中恢复过来。评价所有受试者的安全性，并按计划收集用于药代动力学分析的所有血液收集物。所有研究均在机构伦理委员会批准和患者同意的情况下进行。
[1567]
i期：患者在每个28天周期的第1天、第8天和第15天接受i.v.曲妥珠单抗连接的tlr激动剂衍生物。曲妥珠单抗连接的tlr激动剂衍生物的剂量可能会根据下文概述评估的毒性保持不变或修改。在不存在不可接受的毒性的情况下，每28天重复一次治疗。3-6名患者的群组接受递增剂量的曲妥珠单抗连接的tlr激动剂衍生物，直到确定曲妥珠单抗连接的tlr激动剂衍生物的最大耐受剂量(mtd)。mtd定义为3名患者中的2名或6名患者中的2名经历剂量限制性毒性之前的剂量。剂量限制性毒性是根据美国国家癌症研究所(national cancer institute,nci)不良事件通用术语(common terminology for adverse events,ctcae)3.0版(2006年8月9日)制定的定义和标准确定的。
[1568]
ii期：患者在i期确定的mtd下接受如i期中的曲妥珠单抗连接的tlr激动剂衍生
物。在不存在疾病进展或不可接受的毒性的情况下，每4周重复治疗持续2-6个时程。完成2个时程的研究疗法后，获得完全或部分响应的患者可能会再接受4个时程。完成6个时程的研究疗法后，维持疾病稳定超过2个月的患者可在疾病进展时再接受6个时程，前提是他们符合最初的资格标准。
[1569]
在施用曲妥珠单抗连接的tlr激动剂衍生物之前和之后通过直接静脉穿刺抽取血液取样系列血液。在给药前约10分钟和给药后大约以下时间获得用于测定血清浓度的静脉血样(5ml)：第1天、第8天和第15天。将每个血清样品分成两等份。所有血清样品都储存在-20℃。将血清样品在干冰上运输。
[1570]
药代动力学：患者在开始治疗前和第1天、第8天和第15天进行血浆/血清样品采集以进行药代动力学评价。使用最新版本的bioavl软件，在digital equipment corporation vax 8600计算机系统上通过模型独立方法计算药代动力学参数。测定了以下药代动力学参数：峰值血清浓度(c
max
)；达到峰值血清浓度的时间(t
max
)；使用线性梯形法则计算的从时间零到最后一次采血时间的浓度-时间曲线下面积(auc)(auc
0-72
)；以及根据消除速率常数计算的终末消除半衰期(t
1/2
)。通过对数线性浓度-时间曲线的末端线性区域中的连续数据点的线性回归来估算消除速率常数。计算每次治疗的药代动力学参数的平均值、标准偏差(sd)和变异系数(cv)。计算参数均值的比(保存的配制物/非保存的配制物)。
[1571]
患者对组合疗法的响应：经由x射线、ct扫描和mri评估患者响应，并且在开始研究之前和第一周期结束时进行成像，每四周或在后续周期结束时进行额外的成像。基于癌症类型和可行性/可用性选择成像模态，并且相同的成像模态用于类似的癌症类型以及在每个患者的整个研究过程中。使用recist标准确定响应率。(therasse等人,j.natl.cancer inst.2000年2月2日；92(3):205-16；http://ctep.cancer.gov/forms/therasserecistjnci.pdf)。患者还接受癌症/肿瘤活检，以通过流式细胞术、蛋白质印迹和ihc评估祖癌细胞表型和克隆源性细胞生长的变化，并且通过fish评估细胞遗传学的变化。完成研究治疗后，定期随访患者4周。
[1572]
实施例19：乳腺癌的治疗
[1573]
用于乳腺癌疗法的曲妥珠单抗连接的tlr激动剂衍生物的安全性和功效的人体临床试验
[1574]
目的：在患有her2过表达的转移性乳腺癌的女性中，比较在疾病进展时通过组合曲妥珠单抗和紫杉醇随访的单独曲妥珠单抗连接的tlr激动剂衍生物相对于一线组合曲妥珠单抗和紫杉醇的功效和毒性。
[1575]
研究设计：本研究是一项随机、多中心研究。根据her2/neu过表达程度(2 相对于3 )、既往含蒽环类药物的辅助治疗(无先前治疗相对于左胸壁无放疗的先前治疗相对于左胸壁具有放疗的先前治疗)、雌激素受体状态(阳性相对于阴性相对于未知)、先前疗法(一线相对于二线/三线)和中心对患者进行分层。患者被随机分配到两个治疗组之一。第i组：患者每周接受30-90分钟的曲妥珠单抗连接的tlr激动剂衍生物iv。在疾病进展时，患者接受组合曲妥珠单抗连接的tlr激动剂衍生物iv和如第ii组中的紫杉醇iv。第ii组：患者每周接受30-90分钟的曲妥珠单抗连接的tlr激动剂衍生物iv。每周iv施用紫杉醇1小时，持续3周，接着休息1周。
[1576]
在不存在疾病进展或不可接受的毒性的情况下，在两组中继续治疗。在基线和时
程2、3、4、5、6、8、10和12的第1天评估生活质量。在第1、3和6个月对患者进行随访，之后每6个月随访一次。
[1577]
实施例20：膀胱癌的治疗
[1578]
目的：在具有或不具有本文所描述的tlr激动剂衍生物的情况下，在先前经尿道膀胱切除术治疗膀胱肌浸润性移行细胞癌的患者中，测定紫杉醇和放疗的急性毒性。
[1579]
疾病特征：经组织学或细胞学证实为原发性膀胱移行细胞癌(tcc)；固有肌层浸润的组织学证据；符合以下分期标准之一：t2-4a期；nx、n0或n1；和m0疾病或临床期t1，3/3级疾病并且需要明确的局部治疗；如果满足以下标准，那么允许肿瘤累及前列腺尿道：肿瘤明显完全切除；没有前列腺间质浸润的证据，没有远处转移的证据(通过胸部x光或ct扫描和腹部/盆腔ct扫描)；在过去的3-8周内接受了经尿道膀胱切除术(尽可能彻底地诊断安全)，包括用肿瘤标测进行双合诊检查；足够的肿瘤组织可用于her2/neu分析；不是根治性膀胱切除术的候选者。
[1580]
研究设计：本研究是一项非随机、多中心研究。根据her2/neu状态(her2/neu 2 或3 染色[组1]对比her2/neu 0或1 染色[组2])将患者分配到2个治疗组中的1组。
[1581]
组1：患者在第1、8、15、22、29、36和43天接受紫杉醇iv 1小时，并在第1天接受本文所描述的曲妥珠单抗连接的tlr激动剂衍生物iv 90分钟，并且然后在第8、15、22、29、36和43天30分钟。患者还在第1-5、8-12、15-19、22-26、29-33、36-40、43-47和50天每天接受一次放疗。在不存在疾病进展或不可接受的毒性的情况下，继续治疗。
[1582]
组2：患者像组1中一样接受紫杉醇并进行放疗。完成研究治疗后，患者在4-5周内接受随访、每3个月一次持续1年、每4个月一次持续1年、每6个月一次持续3年，并且之后每年一次。
[1583]
实施例21：卵巢癌的治疗
[1584]
用于卵巢癌疗法的本文所述的曲妥珠单抗连接的tlr激动剂衍生物的安全性和功效的人体临床试验
[1585]
目的：评价包含本文所描述的曲妥珠单抗连接的tlr激动剂衍生物的组合物的四周的每周一次iv剂量在患有her2过表达卵巢癌的女性中的安全性和功效。
[1586]
研究设计：本研究是一项非随机、开放标签、11周的多中心研究。本研究将评价四种每周一次iv剂量的安全性概况、曲妥珠单抗连接的tlr激动剂衍生物的mtd、pk和免疫原性。患者被分配到单个组。患者每周接受一剂曲妥珠单抗连接的tlr激动剂衍生物持续4周。曲妥珠单抗连接的tlr激动剂衍生物将在研究第1、8、15和22天通过iv输注施用。将在第1天和第22天采集尿样。
[1587]
在施用曲妥珠单抗连接的tlr激动剂衍生物之前和之后通过直接静脉穿刺抽取血液取样系列血液。在给药前约10分钟和给药后大约以下时间获得用于测定血清浓度的静脉血样(5ml)：第1、2、4、5、8、15、22、36、43和50天。将每个血清样品分成两等份。所有血样都储存在-20℃。将血样在干冰上运输。
[1588]
在不存在疾病进展或不可接受的毒性的情况下，继续治疗。在基线和时程2、3、4、5、6、8、10和12的第1天评估生活质量。在第29、36、43和50天对患者进行随访。将询问患者的不良事件。患者将进行成像扫描和ecg以评价肿瘤大小和心脏功能(第43天)。在研究结束时，患者将在第50天进行身体检查。具有疾病消退证据的患者可以接受持续治疗，直到记录
到疾病进展的证据。
[1589]
应理解，本文所描述的实施例和实施方案仅是用于说明目的并且鉴于其的各种修改和变化将由本领域普通技术人员想到并且被包括在本技术的精神和范围以及所附权利要求的范围内。本技术中引用的所有出版物、专利、专利申请和/或其他文件出于所有目的以引用的方式整体并入，就如同每个单独的出版物、专利、专利申请和/或其他文件单独被指示为出于所有目的以引用的方式并入。
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