新型丝氨酸蛋白酶的制作方法

新型丝氨酸蛋白酶
1.相关申请的互相参引
2.本技术要求2020年9月21日提交的美国临时专利申请号63/081,271的优先权，其全部内容通过引用的方式纳入本文。
3.序列表的合并
4.创建于2021年8月4日的32千字节(通过计算)的文件名为“bcs209004wo_st25.txt”的序列表包含14条序列，其全部内容通过引用的方式纳入本文。
技术领域
5.本发明涉及经工程化改造以表现出改进的重组丝氨酸蛋白酶，以及包含这些新型丝氨酸蛋白酶的细胞和生物体。还提供了使用重组丝氨酸蛋白酶改进植物健康或生长的方法。


背景技术：

6.植物寄生虫和病原体是经济作物产量损失的主要原因，导致了巨大的经济损失。通过种子、叶片或土壤处理用微生物处理植物可通过向植物或周围土壤提供外源蛋白质来改进植物健康。由于丝氨酸蛋白酶的表达，某些细菌菌株保护植物免受害虫(如植物寄生线虫和真菌植物病原体)的侵害。丝氨酸蛋白酶在蛋白质的特异性识别位点内的丝氨酸残基处裂解肽键，并且已经显示出降解线虫的肠组织以及具有对某些真菌特异的抗真菌活性。本领域持续需要开发新型微生物组合物和方法，其可用于在各种农业田间环境中进一步改进作物植物生长和产量。


技术实现要素：

7.一方面，本发明提供了重组dna分子，其包含编码具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的核酸序列。所述多肽可在对应于seq id no：1的残基49的残基处包含天冬氨酸、或可在对应于seq id no：1的残基86的残基处包含组氨酸、或可在对应于seq id no：1的残基244的残基处包含丝氨酸、或可包含这三个残基中任一种的保守置换，且包含相对于seq id no：1的至少第一个氨基酸残基缺失。在某些实施方案中，所述多肽可在对应于seq id no：1的残基49的残基处包含天冬氨酸，且可在对应于seq id no：1的残基86的残基处包含组氨酸，且可在对应于seq id no：1的残基244的残基处包含丝氨酸，或可包含这三个残基中任意或全部的保守置换。
8.在一些实施方案中，由所提供的重组dna分子编码的多肽可包含对应于seq id no：1的残基177-243中任何的至少一个残基的氨基酸缺失、或包含对应于seq id no：1的残基181-240中任何的至少一个残基的氨基酸缺失。在一个实施方案中，氨基酸缺失对应于少于seq id no：1的残基181-240中的所有残基。在另一个实施方案中，编码的多肽可包含至少对应于seq id no：1的残基226-241的残基的氨基酸缺失，或包含至少对应于seq id no：1的残基182-211的残基的氨基酸缺失，或包含至少对应于seq id no：1的残基178-243的残
基的氨基酸缺失，或包含至少对应于seq id no：1的残基178-240的残基的氨基酸缺失。编码的多肽可具有以下任一种序列：seq id nos：2或4-13。
9.由本发明的重组dna分子编码的多肽与seq id no：1的多肽相比可表现出丝氨酸蛋白酶活性增加，或与seq id no：1的多肽相比可表现出杀线虫活性增加或抗真菌活性增加。编码的多肽与seq id no：1的多肽相比还可表现出底物结合力相同或增强。编码的多肽可进一步在对应于seq id no：1的残基122的残基处包含甘氨酸、在对应于seq id no：1的残基123的残基处包含丝氨酸、在对应于seq id no：1的残基124的残基处包含甘氨酸、在对应于seq id no：1的残基125的残基处包含谷氨酰胺、在对应于seq id no：1的残基126的残基处包含酪氨酸、在对应于seq id no：1的残基146的残基处包含甲硫氨酸、在对应于seq id no：1的残基147的残基处包含丝氨酸、在对应于seq id no：1的残基148的位置包含亮氨酸、在对应于seq id no：1的残基149的残基处包含甘氨酸、在对应于seq id no：1的残基150的残基处包含甘氨酸，或包含这些残基中任一种的保守置换。
10.另一方面，本发明提供了由本文提供的重组dna分子编码的多肽。在某些实施方案中，所述多肽可包含选自seq id nos：2或4-13的序列，例如seq id nos：2、4-6或8-10中的任一种。
11.另一方面，本发明提供了dna构建体，其包含与启动子可操作地连接的本文提供的重组dna分子。
12.又另一方面，本发明提供了宿主细胞，其包含本文提供的重组dna分子。在一些实施方案中，宿主细胞可以是细菌宿主细胞，例如来自芽孢杆菌属(bacillus)的细菌宿主细胞，例如选自以下芽孢杆菌属的宿主细胞：炭疽芽孢杆菌(bacillus anthracis)、蜡状芽孢杆菌(bacillus cereus)、苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)、蕈状芽孢杆菌(bacillus mycoides)、假蕈状芽孢杆菌(bacillus pseudomycoides)、bacillus samanii、大山芽孢杆菌(bacillus gaemokensis)、韦氏芽孢杆菌(bacillus weihenstephensis)和东洋芽孢杆菌(bacillus toyoiensis)。还提供了包含宿主细胞和农业上可接受的载体的制剂。还提供了用本文公开的制剂处理的植物种子。
13.另一方面，提供了刺激植物生长和/或促进植物健康和/或防治线虫的方法，包括将本文提供的重组宿主细胞施用至植物生长介质、植物、植物种子、或植物或植物种子的周围区域。
14.另一方面，本发明提供了转基因植物细胞，其包含编码本文提供的多肽的重组dna分子，例如在对应于seq id no：1的残基49的残基处包含天冬氨酸、或在对应于seq id no：1的残基86的残基处包含组氨酸、或在对应于seq id no：1的残基244的残基处包含丝氨酸，或包含这三个残基中任一种的保守置换，且包含相对于seq id no：1的至少第一个氨基酸残基缺失的多肽。
15.又另一方面，本发明提供了转基因植物、转基因植物部位和转基因种子，其包含编码本文提供的多肽的重组dna分子。本发明还提供了转基因植物细胞、转基因植物、转基因植物部位和转基因种子，其表达或包含本文公开的多肽。
16.另一方面，本发明提供了转基因植物细胞、转基因植物、转基因植物部位和转基因种子，其包含编码具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的重组dna分子，其中所述多肽在对应于seq id no：1的残基49的残基处包含天冬氨酸、在对应于seq id no：1的残基86的残基处包
含组氨酸、且在对应于seq id no：1的残基244的残基处包含丝氨酸、或包含这三个残基中任一种的保守置换。在另一个实施方案中，转基因植物细胞、转基因植物、转基因植物部位和转基因种子表达或包含具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽，其中所述多肽在对应于seq id no：1的残基49的残基处包含天冬氨酸、在对应于seq id no：1的残基86的残基处包含组氨酸、且在对应于seq id no：1的残基244的残基处包含丝氨酸、或包含这三个残基中任一种的保守置换。在这些实施方案的一方面，所述多肽包含seq id no：1；另一方面，所述多肽包含seq id no：2；另一方面，所述多肽包含seq id nos：4-13中任何一个。
17.包含编码本文提供的多肽的重组dna分子的植物细胞、植物、植物部位和种子可表现出对植物寄生线虫的抗性或真菌抗性。还提供了包含本文公开的重组dna分子的子代植物。
18.本文还提供了产生转基因植物的方法，包括用本发明的重组dna分子转化植物细胞以产生转化的植物细胞，并使转化的植物细胞再生以产生转基因植物。所得的转基因植物可表现出对植物寄生线虫的抗性或真菌抗性增强。
19.在另一方面，本发明提供了产生包含本文提供的重组dna分子的转基因植物的方法，包括将包含本发明的重组dna分子的转基因植物与其自身或另一种植物杂交以产生一株或多株子代植物，并选择包含所述重组dna分子的子代植物。子代植物可表现出对植物寄生线虫的抗性或真菌抗性增加。
20.在某些方面，本发明提供了融合蛋白，其包含：a)靶向序列、孢子外壁蛋白(exosporium protein)或孢子外壁蛋白片段，其将融合蛋白靶向至重组芽孢杆菌属宿主细胞的孢子外壁；和b)本文提供的多肽。在一个实施方案中，靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段包含序列x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-x
6-x
7-x
8-x
9-x
10-x
11-x
12-x
13-x
14-x
15-x
16
，其中：
21.x1是任何氨基酸或不存在；
22.x2是苯丙氨酸(f)、亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)或甲硫氨酸(m)；
23.x3是任何氨基酸；
24.x4是脯氨酸(p)或丝氨酸(s)；
25.x5是任何氨基酸；
26.x6是亮氨酸(l)、天冬酰胺(n)、丝氨酸(s)或异亮氨酸(i)；
27.x7是缬氨酸(v)或异亮氨酸(i)；
28.x8是甘氨酸(g)；
29.x9是脯氨酸(p)；
30.x
10
是苏氨酸(t)或脯氨酸(p)；
31.x
11
是亮氨酸(l)或苯丙氨酸(f)；
32.x
12
是脯氨酸(p)；
33.x
13
是任何氨基酸；
34.x
14
是任何氨基酸；
35.x
15
是脯氨酸(p)、谷氨酰胺(q)或苏氨酸(t)；以及
36.x
16
是脯氨酸(p)、苏氨酸(t)或丝氨酸(s)。
37.在另一个实施方案中，靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段包含seq id no：14。
38.还提供了包含融合蛋白的重组宿主细胞，例如细菌宿主细胞。在某些实施方案中，提供了包含融合蛋白的来自蜡状芽孢杆菌家族成员的细菌宿主细胞。在本实施方案的一方面，蜡状芽孢杆菌家族成员是炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、假蕈状芽孢杆菌、bacillus samanii、大山芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌、或bacillus toyonensis。在本实施方案的特定方面，蜡状芽孢杆菌家族成员是苏云金芽孢杆菌。还提供了包含细菌宿主细胞的发酵产物，以及包含所述发酵产物和农业上可接受的载体的制剂。
39.另一方面，提供了刺激植物生长和/或促进植物健康和/或防治线虫的方法，包括将本文提供的制剂施用至植物生长介质、植物、植物种子、或植物或植物种子周围的区域。
40.附图简要说明
41.图1示出了在不表达蛋白质、表达野生型丝氨酸蛋白酶(seq id no：1)或表达丝氨酸蛋白酶变体(seq id no：2)的苏云金芽孢杆菌的全肉汤培养物中的丝氨酸蛋白酶活性。
42.图2a-2f示出了野生型坚强芽孢杆菌(bacillus firmus)ds-1细胞内丝氨酸蛋白酶(seq id no：1)、坚强芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶的变体(seq id no：2)、用于同源性建模的同源丝氨酸蛋白酶模板(seq id no：3)、与seq id no：2相比包含中间缺失的丝氨酸蛋白酶变体(seq id nos：4-6)以及与seq id no：2相比包含延伸缺失的丝氨酸蛋白酶变体(seq id nos：7-13)的多序列比对。
43.图3示出了(a)用于同源性建模的丝氨酸蛋白酶模板(seq id no：3)的结构；以及(b)同源性建模后的野生型坚强芽孢杆菌ds-1丝氨酸蛋白酶(seq id no：1)的结构。
44.图4示出了(a)用于同源性建模的丝氨酸蛋白酶模板(seq id no：3)的结构；以及(b)同源性建模后的坚强芽孢杆菌菌株ds-1丝氨酸蛋白酶变体(sep1截短)(seq id no：2)的结构。
45.图5示出了(a)用于同源性建模的丝氨酸蛋白酶模板(seq id no：3)的结构；以及(b)同源性建模后的丝氨酸蛋白酶变体——中间缺失_1(seq id no：4)的结构。
46.图6示出了(a)用于同源性建模的丝氨酸蛋白酶模板(seq id no：3)的结构；以及(b)同源性建模后的丝氨酸蛋白酶变体——中间缺失_2(seq id no：5)的结构。
47.图7示出了(a)用于同源性建模的丝氨酸蛋白酶模板(seq id no：3)的结构；以及(b)同源性建模后的丝氨酸蛋白酶变体——中间缺失_3(seq id no：6)的结构。
48.图8示出了(a)用于同源性建模的丝氨酸蛋白酶模板(seq id no：3)的结构；以及(b)同源性建模后的丝氨酸蛋白酶变体——延伸缺失_1(seq id no：7)的结构。
49.图9示出了(a)用于同源性建模的丝氨酸蛋白酶模板(seq id no：3)的结构；以及(b)同源性建模后的丝氨酸蛋白酶变体——延伸缺失_2(seq id no：8)的结构。
50.图10示出了(a)用于同源性建模的丝氨酸蛋白酶模板(seq id no：3)的结构；以及(b)同源性建模后的丝氨酸蛋白酶变体——延伸缺失_3(seq id no：9)的结构。
51.图11示出了(a)用于同源性建模的丝氨酸蛋白酶模板(seq id no：3)的结构；以及(b)同源性建模后的丝氨酸蛋白酶变体——延伸缺失_4(seq id no：10)的结构。
52.图12示出了(a)用于同源性建模的丝氨酸蛋白酶模板(seq id no：3)的结构；以及(b)同源性建模后的丝氨酸蛋白酶变体——延伸缺失_5(seq id no：11)的结构。
53.图13示出了(a)用于同源性建模的丝氨酸蛋白酶模板(seq id no：3)的结构；以及(b)同源性建模后的丝氨酸蛋白酶变体——延伸缺失_6(seq id no：12)的结构。
54.图14示出了(a)用于同源性建模的丝氨酸蛋白酶模板(seq id no：3)的结构；以及(b)同源性建模后的丝氨酸蛋白酶变体——延伸缺失_7(seq id no：13)的结构。
55.序列简要说明
56.seq id no：1是野生型坚强芽孢杆菌ds-1细胞内丝氨酸蛋白酶(uniprot登录号w7krh1_bacfi)。
57.seq id no：2是seq id no：1的坚强芽孢杆菌ds-1细胞内丝氨酸蛋白酶的变体，其中对应于seq id no：1的位置181-240的残基缺失。
58.seq id no：3是来自短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)的丝氨酸蛋白酶(uniprot登录号p07518(subt_bacpu))，其用作同源性建模的模板。
59.seq id no：4是丝氨酸蛋白酶变体-中间缺失_1，其中对应于seq id no：1的位置226-242的残基缺失。
60.seq id no：5是丝氨酸蛋白酶变体——中间缺失_2，其中对应于seq id no：1的位置212-241的残基缺失。
61.seq id no：6是丝氨酸蛋白酶变体——中间缺失_3，其中对应于seq id no：1的位置182-211的残基缺失，且在对应于seq id no：1的位置243的残基处用d来替换t。
62.seq id no：7是丝氨酸蛋白酶变体——延伸缺失_1，其中对应于seq id no：1的位置181-243的残基缺失。
63.seq id no：8是丝氨酸蛋白酶变体——延伸缺失_2，其中对应于seq id no：1的位置178-240的残基缺失。
64.seq id no：9是丝氨酸蛋白酶变体——延伸缺失_3，其中对应于seq id no：1的位置178-243的残基缺失。
65.seq id no：10是丝氨酸蛋白酶变体——延伸缺失_4，其中对应于seq id no：1的位置177-243的残基缺失。
66.seq id no：11是丝氨酸蛋白酶变体——延伸缺失_5，其中对应于seq id no：1的位置176-243的残基缺失。
67.seq id no：12是丝氨酸蛋白酶变体——延伸缺失_6，其中对应于seq id no：1的位置175-243的残基缺失。
68.seq id no：13是丝氨酸蛋白酶变体——延伸缺失_7，其中对应于seq id no：1的位置174-243的残基缺失。
69.seq id no：14是炭疽芽孢杆菌sterne的bcla的氨基酸1-41。
具体实施方式
70.植物害虫和病原体可对作物造成重大损害，导致巨大的经济损失。最近的研究引起了表达能够减少植物害虫或病原体损害的酶的细菌菌株的开发，所述细菌菌株可用作种子、叶片或土壤处理剂以改进植物健康和产量。然而，需要改进的酶来处理导致特别广泛的产量损失的某些害虫，例如植物寄生线虫。
71.表达丝氨酸蛋白酶的细菌表现出杀线虫以及抗真菌活性。本发明提供了具有改进的丝氨酸蛋白酶活性的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶变体，其可在重组细菌菌株中表达以改进植物健康和增加产量。
72.i.丝氨酸蛋白酶
73.丝氨酸蛋白酶是蛋白酶中最大和分布最广的一类。丝氨酸蛋白酶在蛋白质中的特定识别位点内的丝氨酸残基处裂解肽键，并且经常被细菌用于环境中的营养物清除。已证明丝氨酸蛋白酶通过消化线虫的肠组织而表现出杀线虫活性。坚强芽孢杆菌菌株ds-1显示出对南方根结线虫(meloidogyne incognita)和大豆胞囊线虫(soybean cyst nematode)的杀线虫活性，对该菌株的研究表明，由其产生的丝氨酸蛋白酶具有丝氨酸蛋白酶活性并降解线虫的肠组织。geng，c.，等人，scientific reports，2016，vol.6，no.25012。
74.其他研究表明丝氨酸蛋白酶具有抗病原体的活性，如真菌植物病原体和卵菌，如腐霉属(pythium)。dunne，等人，microbiology，2000，vol.146，pp.2069-2078，和yen，y.，等人，enzyme and microbial technology，2006，vol.39，pp.311-317。
75.本文提供的seq id no：1和2是野生型和变体酶的氨基酸序列，其表现出或预测表现出丝氨酸蛋白酶活性。因此，例如，seq id no：1提供了野生型丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列。seq id no：2提供了除seq id no：1的氨基酸181-240缺失以外，与seq id no：1相同的酶的氨基酸序列，使seq id no：1和2具有81％的序列相似性。geng，等人，2016中引用的催化残基保留在seq id no：2的变体丝氨酸蛋白酶氨基酸序列中。
76.ii.丝氨酸蛋白酶变体
77.具有本文所述的丝氨酸蛋白酶活性的多肽可包含来自坚强芽孢杆菌的丝氨酸蛋白酶，也称为坚强芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶。在另一个实施方案中，来自坚强芽孢杆菌的丝氨酸蛋白酶可以是来自坚强芽孢杆菌菌株的sep1酶。在又一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶可以是来自坚强芽孢杆菌ds-1的sep1酶，其为seq id no：1。在又一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶可以是来自另一种坚强芽孢杆菌菌株的sep1酶。
78.附加地或可选地，本文提供的具有丝氨酸蛋白酶活性的酶可包含相对于来自坚强芽孢杆菌的野生型丝氨酸蛋白酶的序列具有至少一个氨基酸置换或缺失的氨基酸序列，其中所述氨基酸置换或缺失保留了野生型的催化残基，并且与相同条件下野生型丝氨酸蛋白酶的丝氨酸蛋白酶活性相比，导致丝氨酸蛋白酶活性相同或增加。
79.在一些实施方案中，与相同条件下野生型丝氨酸蛋白酶的丝氨酸蛋白酶活性相比，该酶具有增加的丝氨酸蛋白酶活性。
80.在一些实施方案中，与相同条件下但未使用变体丝氨酸蛋白酶处理产生的植物比较时，本发明的变体丝氨酸蛋白酶使线虫和/或线虫对经处理的植物的损害减少至少约0.5％、或至少约1％、或至少约2％、或至少约3％、或至少约5％、或至少约6％、或至少约7％、或至少约8％、或至少约9％、或至少约10％、或至少约11％、或至少约12％。
81.在一些实施方案中，与相同条件下但未使用变体丝氨酸蛋白酶处理产生的植物比较时，本发明的变体丝氨酸蛋白酶使真菌生长和/或真菌对经处理的植物的损害减少至少约0.5％、或至少约1％、或至少约2％、或至少约3％、或至少约5％、或至少约6％、或至少约7％、或至少约8％、或至少约9％、或至少约10％、或至少约11％、或至少约12％。
82.本文提供的丝氨酸蛋白酶变体相对于它们所衍生自的碱基序列可包含一个或多个突变、缺失或插入。在某些实施方案中，丝氨酸蛋白酶变体与seq id no：1相比可具有一个或多个突变、缺失或插入。在其他实施方案中，丝氨酸蛋白酶变体与seq id nos：1-13中的任一个相比可具有一个或多个突变、缺失或插入。衍生自seq id nos：1-13中任一个的丝
氨酸蛋白酶变体可具有seq id nos：1-13中任一个的丝氨酸蛋白酶活性。衍生自seq id nos：1-13中任一个的丝氨酸蛋白酶变体与seq id nos：1-13相比丝氨酸蛋白酶活性增加，或与seq id nos：1-13相比丝氨酸蛋白酶活性降低。
83.本文提供的丝氨酸蛋白酶变体对应于seq id no：1的给定残基的残基可包含一个或多个突变、缺失或插入。如本文所用，“对应于seq id no：1的给定残基的残基”是指，当包含该残基的序列与seq id no：1最佳比对，该残基与seq id no：1的给定残基对齐。例如，如果序列在对应于seq id no：1的残基49的残基处包含天冬氨酸，当两个序列最佳地比对时，该序列包含与seq id no：1的残基49对齐的天冬氨酸。
84.在某些实施方案中，本文提供的丝氨酸蛋白酶变体包含对应于seq id no：1的残基181-240中任何残基的至少一个残基的氨基酸缺失(如seq id no：2)。在本实施方案的一方面，丝氨酸蛋白酶变体不包括seq id no：1的残基181-240中所有残基的缺失。在一个实施方案中，氨基酸缺失包含对应于seq id no：1的残基181-240中任何残基的至少2个残基、至少3个残基、至少4个残基、至少5个残基、至少6个残基、至少7个残基、至少8个残基、至少9个残基、至少10个残基、至少11个残基、至少12个残基、至少13个残基、至少14个残基、至少15个残基、至少16个残基、至少20个残基、至少30个残基、至少40个残基、至少50个残基、至少51个残基、至少52个残基、至少53个残基、至少54个残基、至少55个残基、至少56个残基、至少57个残基、至少58个残基、至少59个残基的缺失。在本实施方案的一方面，丝氨酸蛋白酶变体包含至少对应于seq id no：1的残基182-211的残基的氨基酸缺失(seq id no：6)。
85.在其他实施方案中，本文提供的丝氨酸蛋白酶变体包含seq id no：1的氨基酸残基181-240中的一些或全部或其他氨基酸残基的氨基酸缺失。本文提供的丝氨酸蛋白酶变体可进一步包含至少对应于seq id no：1的残基226-242的残基的氨基酸缺失(seq id no：4)或至少对应于seq id no：1的残基212-241的残基的氨基酸缺失(seq id no：5)。本文提供的丝氨酸蛋白酶变体可进一步包含至少对应于seq id no：1的残基117-243的残基的氨基酸缺失(seq id no：10)或至少对应于seq id no：1的残基178-243的残基的氨基酸缺失(seq id no：9)或至少对应于seq id no：1的残基178-240的残基的氨基酸缺失(seq id no：8)或至少对应于seq id no：1的残基181-243的残基的氨基酸缺失(seq id no：7)。
86.与seq id no：1的多肽相比，所提供的丝氨酸蛋白酶变体可表现出增加的丝氨酸蛋白酶活性或增加的抗真菌活性。
87.本文公开的丝氨酸蛋白酶变体与其衍生自的碱基序列，例如seq id nos：1-13中任一个或在示例性实施方案中seq id no：1相比，可包含一个或多个保守突变。如图2所示，丝氨酸蛋白酶变体在比对序列之间共享显著的氨基酸残基类型相似性程度。例如，氨基酸可以根据结构、大小、电荷和对氨基酸在水中溶解度的影响分为五组：非极性脂肪族(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸)、芳香族(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)、极性不带电(丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺)、带负电荷(天冬氨酸、谷氨酸)和带正电荷(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)。因此，本发明的丝氨酸蛋白酶变体与seq id nos：1-13中任一个相比可包含保守突变，其中非极性脂肪族残基被不同的非极性脂肪族残基替换、芳香族残基被不同的芳香族残基替换、极性不带电残基被不同的极性不带电残基替换、带负电荷残基被不同的带负电荷残基替换、或带正电荷残基被不同的带正电荷残基替换。本发明的丝氨酸蛋白酶变体与seq id nos：1-13中任一个相比可包含保守突变，其中
氨基酸残基被具有相似的r基团的不同氨基酸残基替换，例如丝氨酸/苏氨酸、天冬氨酸/谷氨酸、天冬酰胺/谷氨酰胺或亮氨酸/异亮氨酸。包含保守突变的丝氨酸蛋白酶变体可表现出与其所衍生的碱基序列相同、更高或更低的丝氨酸蛋白酶活性。
88.本文提供的丝氨酸蛋白酶变体可进一步包含与丝氨酸蛋白酶活性相关的一个或多个保守残基、区域或结构域，或其保守置换。例如，丝氨酸蛋白酶变体可在对应于seq id no：1的残基49的位置包含天冬氨酸残基。丝氨酸蛋白酶变体可在对应于seq id no：1的残基86的位置包含组氨酸残基。此外或可选地，丝氨酸蛋白酶变体可在对应于seq id no：1的残基244的位置包含丝氨酸残基。asp49、his86和ser244涉及野生型酶中的催化三联体(catalytic triad)，并在图2中用矩形标识。geng，等人，2016。丝氨酸蛋白酶变体还可在对应于seq id no：1的asp49、his86和s244的催化三联体的任何残基处包含保守突变。丝氨酸蛋白酶变体还可在对应于seq id no：1的残基177的位置包含天冬酰胺残基或其保守置换。
89.本文提供的丝氨酸蛋白酶变体还可在对应于seq id no：1的gly122、ser123、gly124、gln125、和tyr126和/或met146、ser147、leu148、gly149、gly150、pro151的位置包含保守的底物结合槽(binding groove)。在某些实施方案中，本文提供的丝氨酸蛋白酶变体在对应于seq id no：1的gly122、ser123、gly124、gln125、和tyr126和/或met146、ser147、leu148、gly149、gly150、pro151的位置包含与seq id no：1相同的残基。本发明的丝氨酸蛋白酶变体还可在对应于seq id no：1的残基122-126和146-151的位置包含保守突变。与seq id no：1的多肽相比，本文提供的丝氨酸蛋白酶变体可表现出相同或增加的底物结合力，并且可在对应于seq id no：1的残基122的残基处包含甘氨酸、在对应于seq id no：1的残基123的残基处包含丝氨酸、在对应于seq id no：1的残基124的残基处包含甘氨酸、在对应于seq id no：1的残基125的残基处包含谷氨酰胺、在对应于seq id no：1的残基126的残基处包含酪氨酸、在对应于seq id no：1的残基146的残基处包含甲硫氨酸、在对应于seq id no：1的残基147的残基处包含丝氨酸、在对应于seq id no：1的残基148的残基处包含亮氨酸、在对应于seq id no：1的残基149的残基处包含甘氨酸、在对应于seq id no：1的残基150的残基处包含甘氨酸、在对应于seq id no：1的残基151的残基处包含脯氨酸，或包含这些残基中任一种的保守置换。
90.本文提供的丝氨酸蛋白酶变体还可包含替换seq id no：1的氨基酸残基的非天然氨基酸，只要具有该替换氨基酸的丝氨酸蛋白酶变体保持丝氨酸蛋白酶活性。
91.丝氨酸蛋白酶变体可以是合成生产的或操作的多肽，或者可通过两种或多种异源多肽的融合生产。产生修饰的丝氨酸蛋白酶变体或编码丝氨酸蛋白酶变体的dna序列的方法是本领域公知的。由于遗传密码的简并性，多种不同的多核苷酸序列可编码本文公开的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶变体。所有可能的三联体密码子(并且其中u也替换t)和由每个密码子编码的氨基酸是本领域公知的。另外，本领域技术人员完全有能力创建编码相同或基本相同的本公开的突变型多肽的可选的多核苷酸序列。编码本公开内容的野生型或突变的多肽的核苷酸序列的等位基因变体也被涵盖在本发明的范围内。
92.本发明还提供了编码本文公开的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶变体的重组dna分子。还提供了重组dna构建体，其包含编码本发明的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶变体的dna分子，所述dna分子与启动子或其他调控元件可操作地连接。在某些实施方案中，启动子相对于重组dna分子可以是异源的。如本文所用，术语“异源的”是指两个或多个dna分子的
组合，这种组合在自然界中通常不存在。例如，两个dna分子可以来源于不同的物种和/或两个dna分子可以来源于不同的基因，例如，来自相同物种的不同基因或来自不同物种的相同基因。因此，如果这种组合在自然界中通常没有发现，即不是天然存在重组dna分子与启动子可操作地连接，则调节元件相对于可操作地连接的可转录dna分子是异源的。
93.如本文所用，“重组多肽”是包含在没有人为干预的情况下不会天然一起出现的多肽的组合的多肽。例如，重组多肽可以是：由至少两种彼此异源的多肽组成的多肽、包含不同于天然存在的多肽序列的多肽序列的多肽、包含合成多肽序列的多肽或由通过遗传转化或基因编辑引入宿主细胞的dna的重组dna序列表达的多肽。
94.在本技术中提及的“分离的多肽”或等同的术语或短语是指多肽是单独存在或与其他组合物组合存在，但不存在于其天然环境中的多肽。类似地，编码丝氨酸蛋白酶或任何天然存在的丝氨酸蛋白酶变体的dna分子将是分离的dna分子，只要该核苷酸序列不存在于天然发现编码该蛋白质的序列的细菌的dna内。出于本公开内容的目的，编码天然存在的丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列的合成核苷酸序列将被认为是分离的。出于本公开内容的目的，任何转基因核苷酸序列，即插入到植物或细菌细胞基因组中或存在于染色体外载体中的dna的核苷酸序列将被认为是分离的核苷酸序列，无论其存在于质粒或用于转化细胞的类似结构中、在植物或细菌的基因组内、或以可检测的量存在于衍生自植物或细菌的组织、子代、生物样品或商品中。
95.本公开内容进一步预期丝氨酸蛋白酶的改进的变体可通过使用本领域已知的各种基因编辑方法在细胞内进行工程化改造。用于基因组编辑的此类技术包括但不限于：zfn(锌指核酸酶)、大范围核酸酶、talen(转录激活因子样效应物核酸酶)和crispr(规律间隔成簇短回文重复序列)/cas(crispr相关)系统。这些基因组编辑方法可用于将植物细胞内转化的丝氨酸蛋白酶编码序列改变为不同的丝氨酸蛋白酶编码序列。具体地，通过这些方法，改变丝氨酸蛋白酶编码序列内的一个或多个密码子以工程化改造新的蛋白质氨基酸序列。可选地，替换或缺失编码序列内的片段，或将另外的dna片段插入编码序列，以工程化改造新的丝氨酸蛋白酶编码序列。新的编码序列可以编码具有新特性的丝氨酸蛋白酶，例如抗昆虫害虫的活性或范围增加，以及提供抗昆虫害虫物种的活性，其中已经产生了对原始昆虫毒素蛋白的抗性。包含经基因编辑的丝氨酸蛋白酶编码序列的植物细胞可通过本领域已知的方法用于生成表达修饰的丝氨酸蛋白酶的细胞，包括细菌或植物细胞。
96.对于本文所述的丝氨酸蛋白酶，“序列同一性”或“序列同一性百分比”或“序列同一性％”是通过以获得最佳匹配的方式比对序列的全长来确定的，使得需要最小数目的编辑操作(例如，插入、缺失和置换)以便将一个序列转化为另一个被比对序列的精确副本。emboss needle双序列比对是此类分析的一个实例，其是可通过欧洲生物信息学研究所(embl-ebi)网站获得的算法。
97.可选地或此外，具有丝氨酸蛋白酶活性的酶可包含定义为与seq id nos：1-13的一种或多种具有至少70％同一性的氨基酸序列。
98.例如，具有丝氨酸蛋白酶活性的酶可包含定义为与seq id nos：1-13的一种或多种具有至少75％同一性的氨基酸序列。
99.具有丝氨酸蛋白酶活性的酶可包含定义为与seq id nos：1-13的一种或多种具有至少80％同一性的氨基酸序列。
100.具有丝氨酸蛋白酶活性的酶可包含定义为与seq id nos：1-13的一种或多种具有至少85％同一性的氨基酸序列。
101.具有丝氨酸蛋白酶活性的酶可包含定义为与seq id nos：1-13的一种或多种具有至少90％同一性的氨基酸序列。
102.具有丝氨酸蛋白酶活性的酶可包含定义为与seq id nos：1-13的一种或多种具有至少95％同一性的氨基酸序列。
103.具有丝氨酸蛋白酶活性的酶可包含定义为与seq id nos：1-13的一种或多种具有至少98％同一性的氨基酸序列。
104.具有丝氨酸蛋白酶活性的酶可包含定义为与seq id nos：1-13的一种或多种具有至少99％同一性的氨基酸序列。
105.具有丝氨酸蛋白酶活性的酶可包含与seq id nos：1-13的任一种具有100％同一性的氨基酸序列。
106.例如，该酶可包含seq id nos：1-13中的任一种。
107.可选的，该酶可由seq id nos：1-13中的任一种组成。
108.此外，具有丝氨酸蛋白酶活性且与seq id nos：1-13的任一种或多种具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的酶可包含seq id no：2中的缺失(seq id no：1的氨基酸181-240)。
109.iii.游离酶
110.本文所述的任何酶也可用作游离酶或在重组微生物中表达的酶。
111.iv.丝氨酸蛋白酶变体在蜡状芽孢杆菌外孢子上的表达
112.本发明的丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶变体也可以表达为融合蛋白，其包含将融合蛋白靶向至重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子外壁的靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段。融合蛋白还包含具有本文所述的丝氨酸蛋白酶活性的多肽。当在蜡状芽孢杆菌细菌中表达时，这些融合蛋白靶向至孢子的孢子外壁层，并被物理定向以使丝氨酸蛋白酶展示在孢子的外部。
113.包含本文所述的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶变体的融合蛋白可包含能够将融合蛋白靶向至重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子外壁的任何靶向序列。先前发现，来自bcla和bclb的n末端区域的某些序列可用于将肽或蛋白质靶向至蜡状芽孢杆菌家族成员内生孢子的孢子外壁(参见美国专利申请公布号2010/0233124和201i/0281316，以及thompson等人，
″
targeting of the bcla and bclb proteins to the bacillus anthracis spore surface，molecular microbiology 70(2)：421-34(2008))。还发现炭疽芽孢杆菌的beta/bas3290蛋白质定位到孢子外壁。可引入融合蛋白并用于将目的肽或蛋白质靶向至重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子外壁的其他靶向序列以及孢子外壁蛋白和孢子外壁蛋白的片段记载于美国专利申请公布号2016/0031948和2016/0108096，其全部内容通过引用的方式纳入本文。
114.芽孢杆菌属是杆状细菌属。蜡状芽孢杆菌家族细菌包括能够产生孢子外壁的任何芽孢杆菌属物种。因此，细菌的蜡状芽孢杆菌家族包括以下物种：炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、假蕈状芽孢杆菌、bacillus samanii、大山芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌和东洋芽孢杆菌。在胁迫的环境条件下，蜡状芽孢杆菌家族细菌经历孢子
形成并形成椭圆形的内生孢子，其可以在延长的时间段保持休眠。内生孢子的最外层被称为孢子外壁，包括被毛发状突起的外部绒毛包围的基底层。毛发状绒毛上的细丝主要由胶原样糖蛋白bcla形成，而基底层由许多不同的蛋白质组成。另一种胶原相关蛋白bclb也存在于孢子外壁中，并暴露于蜡状芽孢杆菌家族成员的内生孢子上。bcla是表面绒毛的主要成分，已显示其附着于孢子外壁，其氨基末端(n末端)位于基底层，其羧基末端(c末端)从孢子向外延伸。
115.科学文献将蜡状芽孢杆菌“家族”或“群”描述为芽孢杆菌属内的亚群。参见priest等人，
″
population structure and evolution of the bacillus cereus group，
″
j.bacteriology，2004，v0l.186，no.23，pp.7959-7970；peng等人，
″
the regulation of exosporium-related genes in bacillus thuringiensis，
″
nature scientific reports，2016，vol.6，no.19005，pp.1-12.peng等人陈述：
116.蜡状芽孢杆菌群的孢子是复杂多层结构。含有核的类核被包围在肽聚糖皮层内，而肽聚糖皮层被孢子包衣(spore coat)包围。所有蜡状芽孢杆菌物种的孢子被称为孢子外壁的另外的松散配合层包围，该层不存在于其他物种(如枯草芽孢杆菌)上，对于枯草芽孢杆菌，包衣构成成熟孢子的最外层。孢子外壁是气球状的层，作为孢子的外部渗透屏障，有助于孢子的存活和毒性。
117.本发明的靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段也可以根据提供靶向功能的基序(motif)来描述。bcla的氨基末端区域(seq id no：14)与许多其他蜡状芽孢杆菌家族成员孢子外壁蛋白的相应氨基末端区域的序列比对显示，在bcla的氨基酸20-35处存在保守基序，在bcla的氨基酸25-35处具有更高度保守的基序。更多详情，参见国际公布号wo 2019/060574的图1a和1b中提供的比对。该更高度保守的区域是引导所述孢子外壁蛋白并将其装配在孢子外壁表面上的exsfa/bxpb/exspb和同源物的识别序列。
118.此外，虽然bcla的氨基酸20-35是保守的，并且氨基酸25-35更保守，但是在该区域中可以发生一定程度的变异而不影响靶向序列将蛋白质靶向至孢子外壁的能力。与bcla的氨基酸20-35(seq id no：14)具有低至43.8％的靶向序列同一性，其中与bcla的氨基酸20-35的同一性为54.5％的序列，保留了将融合蛋白靶向孢子外壁的能力。一些数据提供于pct公布号wo 2016/044661的实施例59的表58，其全部内容通过引用的方式纳入本文。
119.这些数据显示将目的蛋白(例如酶)靶向至孢子外壁蛋白可以使用与bcla的氨基酸20-35(seq id no：14)具有50-68.8％同一性的靶向序列来实现，其中与bcla的氨基酸25-35的同一性为63.6％至81.8％。此类基序存在于靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段中，所述靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段将融合蛋白靶向至重组芽孢杆菌属细菌的孢子外壁且包含序列
120.x
1-x
2-x
3-x
4-x
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12-x
13-x
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16
，其中：
121.x1是任何氨基酸或不存在；
122.x2是苯丙氨酸(f)、亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)或甲硫氨酸(m)；
123.x3是任何氨基酸；
124.x4是脯氨酸(p)或丝氨酸(s)；
125.x5是任何氨基酸；
126.x6是亮氨酸(l)、天冬酰胺(n)、丝氨酸(s)或异亮氨酸(i)；
127.x7是缬氨酸(v)或异亮氨酸(i)；
128.x8是甘氨酸(g)；
129.x9是脯氨酸(p)；
130.x
10
是苏氨酸(t)或脯氨酸(p)；
131.x
11
是亮氨酸(l)或苯丙氨酸(f)；
132.x
12
是脯氨酸(p)；
133.x
13
是任何氨基酸；
134.x
14
是任何氨基酸；
135.x
15
是脯氨酸(p)、谷氨酰胺(q)或苏氨酸(t)；以及
136.x
16
是脯氨酸(p)、苏氨酸(t)或丝氨酸(s)。
137.任何靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段可用于将任何目的蛋白或肽(包括本文所述的具有丝氨酸蛋白酶活性的蛋白质)靶向至重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子外壁。
138.在表达本文所述的任何融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子形成期间，靶向基序、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段被孢子外壁装配机制识别并导向孢子外壁，导致融合蛋白目的部分的蛋白质或肽(例如，具有丝氨酸蛋白酶活性的酶)展示在孢子的外部。
139.不同靶向序列的使用允许控制融合蛋白在蜡状芽孢杆菌家族成员孢子表面上的表达水平。使用本文所述的某些靶向序列将导致融合蛋白的表达水平较高，而使用其他靶向序列将导致融合蛋白在孢子表面上的表达水平较低。
140.在本文所述的任何融合蛋白中，靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段可在其羧基末端包含氨基酸序列gxt，其中x是任何氨基酸。
141.在本文所述的任何融合蛋白中，靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段可在靶向序列的对应于seq id no：14的氨基酸20的位置包含丙氨酸残基。
142.在本文所述的任何融合蛋白中，靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段还可在紧邻靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段的第一个氨基酸之前的氨基酸位置或在靶向序列的对应于seq id no：14的氨基酸20的位置包含甲硫氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基。
143.该芽孢杆菌孢子外壁展示(bemd)系统可用于将本文所述的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶变体递送至植物(例如，植物叶、果实、花、茎或根)或植物生长介质(如土壤)。以这种方式递送到土壤或另一种植物生长介质中的酶和蛋白质在土壤中持续存在并表现出长时间的活性。将表达包含本文所述的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶变体的融合蛋白的重组蜡状芽孢杆菌家族成员细菌引入到土壤或植物的根际中，导致在许多不同的土壤条件下有益地增强植物生长和/或防治害虫(如线虫)。使用bemd来生产这些酶，允许它们在植物生命的最初几个月内继续对植物和根际发挥它们的有益效果。
144.此外，可以改良bemd系统，使得可以从孢子中除去重组蜡状芽孢杆菌家族成员的孢子外壁，生成含有融合蛋白的孢子外壁片段，如国际公布号wo 2016/044661中所记载。孢子外壁片段也可用于以无细胞制剂形式将丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶变体递送至植物。
145.v.制剂
146.还提供了包含宿主细胞的制剂，所述宿主细胞包含本文提供的任何重组丝氨酸蛋白酶。在某些实施例中，宿主细胞可以是细菌宿主细胞，例如重组蜡状芽孢杆菌家族成员。本文提供的制剂还可包含农业上可接受的载体。
147.在另一个实施方案中，本文提供的制剂可包含源自包含本文提供的任何重组丝氨酸蛋白酶的宿主细胞的孢子外壁片段。在一些实施例中，孢子外壁片段可源自细菌宿主细胞，例如重组蜡状芽孢杆菌家族成员。该制剂还可包含农业上可接受的载体。
148.vi.转基因植物
149.本发明的一方面包括转基因植物细胞、转基因植物组织、转基因植物和转基因种子，其包含本发明提供的编码丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶变体的重组dna分子。本发明还提供了表达或包含本文公开的丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶变体的转基因植物细胞、转基因植物组织、转基因植物和转基因种子。这些包含重组dna分子、丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶变体的植物细胞、植物组织、植物和种子可表现出对植物寄生线虫的抗性或真菌抗性。
150.用于本发明的转化宿主植物细胞的合适方法实际上包括可将dna导入细胞的任何方法(例如，其中重组dna构建体稳定整合到植物染色体中)，并且是本领域公知的。用于将重组dna构建体引入植物的示例性和广泛使用的方法是农杆菌(agrobacterium)转化系统，其是本领域技术人员所公知的。转基因植物可以通过植物细胞培养方法从转化的植物细胞再生。
151.本发明的转基因植物、子代、种子、植物细胞和植物部位还可含有一种或多种其他转基因性状。通过将含有包含本发明提供的重组dna分子的转基因的植物与含有其他转基因性状的另一种植物杂交，可以引入其他转基因性状。如本文所用，“杂交”是指培育两个个体植物以产生子代植物。因此，两种转基因植物可以杂交以产生含有转基因性状的子代。如本文所用，“子代”是指亲本植物任何代的后代，并且转基因子代包含本发明提供的并且遗传自至少一个亲本植物的dna构建体。可选地，可通过将用于其他转基因性状的dna构建体与包含本发明提供的重组dna分子的dna构建体共转化(例如，所有dna构建体作为用于植物转化的相同载体的一部分存在)或通过将其他性状插入包含本发明提供的dna构建体的转基因植物中或反之亦然(例如，通过在转基因植物或植物细胞上使用任何植物转化方法)来引入其他转基因性状。
152.含有本发明提供的转基因性状的转基因植物和子代可与本领域公知的任何育种方法一起使用。在包含两种或更多种转基因性状的植物品系中，转基因性状在包含三种或更多种转基因性状的植物品系中可独立地分离、连锁或两者的组合。与亲本植物回交和与非转基因植物异交也是预期的，营养繁殖也是如此。对通常用于不同性状和作物的育种方法的描述是本领域技术人员公知的。为了证实转基因在特定植物或种子中的存在，可以进行多种测定。此类测定包括，例如，分子生物学分析，如southern和northern印迹、pcr和dna测序；生物化学测定，例如检测蛋白质产物的存在，例如通过免疫学方法(elisa和western印迹)或通过酶功能；植物部位测定，例如叶或根测定；以及通过分析整个植物的表型。
153.vii.处理的种子
154.还提供了经处理的植物种子。植物种子可以用包含本文提供的任何重组丝氨酸蛋白酶的宿主细胞(例如重组细菌)处理。重组细菌可以是蜡状芽孢杆菌家族成员。重组细菌可表达本文所述的任何丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶变体。
155.还提供了经处理的植物种子，其可用本文所述的任何孢子外壁片段处理。孢子外壁片段可源自本文所述的蜡状芽孢杆菌家族成员中的任何一种。孢子外壁片段可包含本文所述的任何丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶变体。
156.还提供了用本文所述的任何制剂处理的植物种子。
157.在所提供的任何经处理的植物种子中，植物种子可以用包含本文提供的任何重组丝氨酸蛋白酶的宿主细胞(例如重组细菌)、或用包含所提供的重组丝氨酸蛋白酶的孢子外壁片段、或用包含所提供的重组丝氨酸蛋白酶的制剂包被。
158.宿主细胞、重组细菌、孢子外壁片段或制剂可用作种子处理剂，例如，种子包衣或拌种制剂。种子包衣或拌种制剂可以是液体载体制剂、浆液制剂或粉末制剂形式。
159.种子包衣或拌种制剂可以与常规添加剂一起施用，所述添加剂用于使种子处理剂具有粘性以粘附并包被种子。合适的添加剂包括：滑石、石墨、树胶、稳定聚合物、包衣聚合物、整理聚合物(finishing polymer)、用于种子流动和可种植性的光滑剂、美容剂和纤维素材料(如羧甲基纤维素)等。
160.种子处理制剂可以进一步包含着色剂和/或其他添加剂。
161.种子处理制剂可以在合适的载体如水或粉末中施用于种子。然后可以使种子干燥并以常规方式种植。宿主细胞、重组细菌、孢子外壁片段或制剂可作为溶液或与其他市售添加剂组合直接施用于种子。例如，重组宿主细胞、重组细菌、孢子外壁片段或制剂可以与幼苗可接受的载体(例如，液体载体或固体载体)组合施用。
162.可以将含有重组宿主细胞、重组细菌、孢子外壁片段或制剂的溶液喷雾或以其他方式施用于种子(例如，在种子浆液或种子浸泡液中)。
163.含有重组宿主细胞、重组细菌、孢子外壁片段或制剂的固体或干燥材料也可用于促进有效的幼苗萌发、生长和早期幼苗建立期间的保护。
164.重组宿主细胞、重组细菌、孢子外壁片段或制剂可与增溶载体一起使用，如水、缓冲液(例如，柠檬酸盐或磷酸盐缓冲液)、其他处理剂(例如，醇或其他溶剂)和/或任何可溶性试剂。
165.此外，少量的干燥剂增强剂(如低级醇等)可用于种子包衣制剂中。
166.表面活性剂、乳化剂和防腐剂也可以以相对低量(例如，约0.5％重量/体积或更低)水平添加以增强种子包衣产品的稳定性。
167.可使用多种方法处理种子，包括但不限于：将含有重组宿主细胞、重组细菌、孢子外壁片段或制剂的水溶液倾倒、泵送、喷洒或喷雾在种子上；或使用或不使用传送系统将重组宿主细胞、重组细菌、孢子外壁片段或制剂喷雾或施用到种子层上。
168.可用于种子处理的混合装置包括但不限于滚筒、混合池、混合罐和包括用于在包衣时容纳种子的池或罐的流体施用装置。
169.种子处理后，可将种子风干或任选地使用干燥空气流以辅助种子包衣的干燥。
170.含有重组宿主细胞、重组细菌、孢子外壁片段或制剂的种子处理剂可使用任何市售的种子处理机器施用，或者也可使用任何可接受的非市售方法施用，例如使用注射器或任何其他种子处理装置。
171.viii.刺激植物生长和/或促进植物健康和/或防治植物病原体的方法
172.提供了刺激植物生长和/或促进植物健康和/或防治植物害虫(如线虫)和/或防治
spp.)、球胞囊线虫种属(globodera spp.)、螺旋线虫属种(helicotylenchus spp.)、半轮线虫属种(hemicriconemoides spp.)、鞘线虫属种(hemicycliophora spp.)、异皮线虫属种(heterodera spp.)、纽带线虫属种(hoplolaimus spp.)、长针线虫属种(longidorus spp.)、lygus spp.、根结线虫属种(meloidogyne spp.)、meloinema spp.、珍珠线虫属种(nacobbus spp.)、拟茎线虫属种(neotylenchus spp.)、异长针线虫属种(paralongidorus spp.)、拟滑刃线虫属种(paraphelenchus spp.)、拟毛刺属种(paratrichodorus spp.)、根腐线虫属种(pratylenchus spp.)、pseudohalenchus spp.、平滑垫刃属种(psilenchus spp.)、斑皮胞囊属种(punctodera spp.)、五沟属种(quinisulcius spp.)、穿孔线虫属种(radopholus spp.)、肾形线虫属种(rotylenchulus spp.)、盘旋属种(rotylenchus spp.)、盾线虫属种(scutellonema spp.)、subanguina spp.、毛刺线虫属种(trichodorus spp.)、线虫属种(tylenchulus spp.)、矮化属种(tylenchorhynchus spp.)、剑线虫属种(xiphinema spp)。
186.在本文所述的任何方法中，在相同条件下，与酶或微生物不存在的情况下生长的植物相比，在重组宿主细胞、重组细菌、孢子外壁片段或制剂存在下生长的植物可表现出生长增强。
187.在本文所述的任何方法中，在相同条件下，与未施用酶或微生物的种子相比，施用了重组宿主细胞、重组细菌、孢子外壁片段或制剂的种子可表现出发芽率提高。
188.在本文所述的任何方法中，在相同条件下，与酶或微生物不存在的情况下生长的植物相比，在重组宿主细胞、重组细菌、孢子外壁片段或制剂存在下生长的植物可表现出养分吸收增强。
189.在本文所述的任何方法中，在相同条件下，与酶或微生物不存在的情况下生长的植物相比，在重组宿主细胞、重组细菌、孢子外壁片段或制剂存在下生长的植物可表现出对害虫(例如线虫)的易感性降低。
190.在本文所述的任何方法中，在相同条件下，与酶或微生物不存在的情况下生长的植物相比，在重组宿主细胞、重组细菌、孢子外壁片段或制剂存在下生长的植物可表现出线虫损害减少，包括擦伤减少、孢囊减少和/或单位重量的根的线虫减少。
191.在本文所述的任何方法中，在相同条件下，与酶或微生物不存在的情况下生长的植物相比，施用了重组宿主细胞、重组细菌、孢子外壁片段或制剂的植物或植物生长位置(例如土壤)可表现出每体积土壤中线虫卵减少和/或线虫减少。
192.在一个实施方案中，与在相同条件下但未处理产生的植物相比，本发明的重组宿主细胞、重组细菌、孢子外壁片段或制剂使线虫和/或线虫伤害降低至少约0.5％、或至少约1％、或至少约2％、或至少约3％、或至少约5％、或至少约6％、或至少约7％、或至少约8％、或至少约9％、或至少约10％、或至少约11％、或至少约12％。
193.在本文所述的任何方法中，在相同条件下，与酶或微生物不存在的情况下生长的植物相比，在重组宿主细胞、重组细菌、孢子外壁片段或制剂存在下生长的植物可表现出对病原体的易感性降低。
194.在本文所述的任何方法中，在相同条件下，与酶或微生物不存在的情况下生长的植物相比，在重组宿主细胞、重组细菌、孢子外壁片段或制剂存在下生长的植物可表现出对环境胁迫(例如，干旱、洪水、热、冷、盐、重金属、低ph、高ph或其任意组合)的易感性降低。
195.在本文所述的任何方法中，在相同条件下，与酶或微生物不存在的情况下生长的植物相比，在重组宿主细胞、重组细菌、孢子外壁片段或制剂存在下生长的植物可表现出根瘤形成增强。
196.在本文所述的任何方法中，在相同条件下，与酶或微生物不存在的情况下生长的植物相比，在重组宿主细胞、重组细菌、孢子外壁片段或制剂存在下生长的植物可表现出作物产量更高。在一个实施方案中，与在相同条件下但未处理产生的植物相比，本发明的重组宿主细胞、重组细菌、孢子外壁片段或制剂使产量或总植物重量增加至少约0.5％、或至少约1％、或至少约2％、或至少约3％、或至少约5％、或至少约6％、或至少约7％、或至少约8％、或至少约9％、或至少约10％、或至少约11％、或至少约12％。在另一个实施方案中，与在相同条件下但未处理产生的植物相比，本发明的重组宿主细胞、重组细菌、孢子外壁片段或制剂使植物活力的一些方面(例如发芽)改进了至少约0.5％、或至少约1％、或至少约2％、或至少约3％、或至少约5％、或至少约6％、或至少约7％、或至少约8％、或至少约9％、或至少约10％、或至少约11％、或至少约12％。
197.在本文所述的任何方法中，在相同条件下，与酶或微生物不存在的情况下生长的植物相比，在重组宿主细胞、重组细菌、孢子外壁片段或制剂存在下生长的植物可表现出叶片衰老改变。
198.ix.载体
199.如上所述，本文所述的制剂包含农业上可接受的载体。
200.农业上可接受的载体可包含分散剂、表面活性剂(例如，重质石油、重质石油馏出物、多元醇脂肪酸酯、聚乙氧基化脂肪酸酯、芳基烷基聚氧乙烯二醇、烷基胺乙酸盐、烷基芳基磺酸盐、多元醇、磷酸烷基酯或其任意组合)、添加剂(例如，油、树胶、树脂、粘土、聚氧乙烯二醇、萜烯、粘性有机物、脂肪酸酯、硫酸化醇、烷基磺酸盐、石油磺酸盐、醇硫酸盐、烷基丁二酸钠、硫代丁二酸钠的聚酯、苯乙腈衍生物、蛋白质材料或其任意组合)、水、增稠剂(聚乙二醇的长链烷基磺酸盐、聚氧乙烯油酸酯或其任意组合)、防结块剂(例如，钠盐、碳酸钙、硅藻土或其任意组合)、残余物分解产物、堆肥制剂、粒状施用物、硅藻土、油、着色剂、稳定剂、防腐剂、聚合物、包衣剂或其任意组合。
201.当农业上可接受的载体包含表面活性剂时，表面活性剂可包含非离子表面活性剂。
202.当农业上可接受的载体包含添加剂且添加剂包含蛋白质材料时，蛋白质材料可包含乳制品、小麦粉、大豆粉、血液、白蛋白、明胶、苜蓿粉、酵母提取物或其任意组合。
203.当农业上可接受的载体包含防结块剂且防结块剂包含钠盐时，钠盐可包含单甲基萘磺酸钠盐、二甲基萘磺酸钠盐、亚硫酸钠、硫酸钠或其任意组合。
204.农业上可接受的载体可包含蛭石、木炭、糖厂碳酸化压榨泥、稻壳、羧甲基纤维素、泥炭、珍珠岩、细砂、碳酸钙、面粉、明矶、淀粉、滑石、聚乙烯吡咯烷酮或其任意组合。
205.本文所述的任何制剂可包含种子包衣制剂(例如，施用于种子的水或油基溶液或施用于种子的粉末或颗粒制剂)、施用于植物或植物生长介质的液体制剂(例如，浓缩制剂或即用制剂)、或施用于植物或植物生长介质的固体制剂(例如，颗粒制剂或粉末剂)。
206.农业上可接受的载体可包含制剂成分。制剂成分可以是润湿剂、增量剂、溶剂、自发性促进剂、乳化剂、分散剂、防冻剂、增稠剂和/或助剂。在一个实施方案中，制剂成分是润
湿剂。
207.本发明的组合物可包括加入到本发明的组合物中以改进回收、功效或物理性质和/或有助于加工、包装和给药的制剂成分。此类制剂成分可单独或组合添加。
208.可将制剂成分添加到包含细胞的组合物、无细胞制剂和/或孢子膜外片段中，以改进功效、稳定性和物理性质、可用性和/或促进加工、包装和最终用途应用。此类制剂成分可包括惰性物质、稳定剂、防腐剂、营养物或物理性质改性剂，它们可以单独或组合添加。在一些实施方案中，载体可包括液体材料，如水、油和其他有机或无机溶剂，以及固体材料，如矿物质、聚合物或生物或化学合成衍生的聚合物复合物。在一些实施方案中，制剂成分是促进组合物粘附到植物部分(如叶、种子或根)的粘合剂、助剂或粘着剂。参见例如taylor，a.g.，等人，
″
concepts and technologies of selected seed treatments，
″
annu.rev.phytopathol.，28：321-339(1990)。稳定剂可包括防结块剂、抗氧化剂、抗沉降剂、消泡剂、干燥剂、保护剂或防腐剂。营养物可包括碳、氮和磷源，例如糖、多糖、油、蛋白质、氨基酸、脂肪酸和磷酸盐。物理性质改性剂可包括填充剂、润湿剂、增稠剂、ph改性剂、流变改性剂、分散剂、助剂、表面活性剂、成膜剂、助水溶剂、增洁剂、防冻剂或着色剂。在一些实施方案中，包含细胞的组合物、无细胞制剂和/或孢子外壁片段可以直接使用，使用或不使用水作为稀释剂，而不使用任何其他制剂制品。在具体实施方案中，将润湿剂或分散剂添加到发酵得到的全培养液的干燥浓缩物(例如冷冻干燥或喷雾干燥粉末)中。润湿剂增强铺展和渗透性能，或分散剂增强活性成分(一旦稀释)在施用于表面时的分散性和溶解度。示例性润湿剂是本领域技术人员已知的，包括磺基琥珀酸酯及其衍生物，如multiwet
tm mo-70r(croda inc.，edison，nj)；硅氧烷，如(evonik，germany)；非离子化合物，如atlox
tm 4894(croda inc.，edison，nj)；烷基聚葡糖苷，如3001(huntsman international llc，the woodlands，texas)；c12-c14醇乙氧基化物，如15-s-15(the dow chemical company，midland，michigan)；磷酸酯，如bg-510(rhodia，inc.)；以及烷基醚羧酸盐，如emulsogen
tm ls(clariant corporation，north carolina)。
209.如上所述，本文所述的任何制剂可包含农用化学品。
210.x.植物
211.在本文所述的涉及植物的任何方法中，植物可以是双子叶植物、单子叶植物、裸子植物或被子植物。
212.同样，对于本文所述的任何种子，种子可以是双子叶植物、单子叶植物、裸子植物或被子植物的种子。
213.例如，当植物是双子叶植物或种子是双子叶植物的种子时，双子叶植物可选自豆、豌豆、番茄、胡椒、西葫芦、苜蓿、杏仁、茴香子、苹果、杏、滨藜、洋蓟、鳄梨、班巴拉花生、甜菜、香柠檬、黑胡椒、黑荆树、黑莓、蓝莓、苦橙、小白菜、巴西坚果、面包果、花茎甘蓝、蚕豆、布鲁塞尔子甘蓝、荞麦、卷心菜、山茶、大白菜、可可豆、哈密瓜、葛缕子、刺菜蓟、角豆、胡萝卜、腰果、木薯、蓖麻子、花椰菜、块根芹、芹菜、樱桃、栗子、鹰嘴豆、菊苣、红辣椒、菊花、肉桂、香橼、柑橘、克莱门氏小柑橘、丁香、三叶草、咖啡豆、可乐果、油菜、玉米、棉花、棉籽、豇
豆、海甘蓝、蔓越莓、水芹、黄瓜、红醋栗、番荔枝、鼓槌树、豌豆(earth pea)、茄子、莴苣、茴香、胡芦巴、无花果、榛子、亚麻、天竺葵、醋栗、葫芦、葡萄、葡萄柚、番石榴、大麻、大麻籽、指甲花、啤酒花、马蚕豆、辣根、木蓝、茉莉、洋姜、黄麻、羽衣甘蓝、木棉、洋麻、猕猴桃、大头菜、金桔、熏衣草、柠檬、兵豆、胡枝子、生菜、酸橙、甘草、荔枝、枇杷、羽扇豆、澳洲坚果、肉豆蔻皮、柑橘、饲料甜菜、芒果、欧楂、甜瓜、簿荷、桑葚、芥末、油桃、黑芝麻、肉豆蔻、秋葵、橄榄、鸦片、橙子、番木瓜、欧洲防风草、豌豆、桃、花生、梨、山核桃、柿子、木豆、开心果、车前草、李子、石榴、柚子、罂粟籽、马铃薯、甘薯、西梅、南瓜、白坚木、温柏、金鸡纳属树、奎奴亚藜、小萝卜、苎麻、油菜籽、覆盆子、苎麻、大黄、玫瑰、橡胶、芜菁甘蓝、红花、红豆草、婆罗门参、人心果、无核小蜜橘、鸦葱、芝麻、乳木果树、大豆、菠菜、西葫芦、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、瑞典甘蓝、甜椒、柑橘、茶、画眉草、烟草、番茄、车轴草、油桐、芜菁、梵天花、野豌豆、胡桃、西瓜、马黛茶、山芥、荠菜、水芹、胡椒菜、水田芥、菥蓂、八角茴香、月桂树、月桂、肉桂、贾蒙(jamun)、莳萝、罗望子、薄荷、牛至、迷迭香、鼠尾草、刺果番荔枝、脐景天、美珊瑚、苦瓜、夏威夷核果、大溪地栗子、罗勒、越橘、木槿、西番莲、杨桃、黄樟、仙人掌、圣约翰草、珍珠菜、山楂、芜荽、意大利腊菊、猕猴桃、百里香、绿皮西葫芦、块茎藜、豆薯、幌菊、棘猴橙、黄芒果(yellow mombin)、杨桃、苋菜、山葵、日本胡椒、黄李、马舒阿(mashua)、香椿、番杏、菜心菠菜(bower spinach)、乌古(ugu)、艾菊、繁缕、红浆果、马来苹果、天神草、苦菜、山药、马欧芹、绿篱芥菜、剪秋罗、青苹果(agate)、卡索树、蓟、地榆、星状醋栗、钾猪毛菜、厚岸草、酢浆草、银叶蕨、羽衣甘蓝、报春花、樱草、马齿苋、两耳草、笃耨香、树莴苣、野生槟榔、西非胡椒、散塔草、龙蒿、欧芹、山萝卜、陆生水芹、茴芹、honeyherb、蜂蜜草、蜂斗菜、紫苏、水胡椒、紫苏叶、苦豆、块茎酢浆草、甘榜(kampong)、香芹、柠檬罗勒、泰国罗勒、水含羞草、香根芹、卷心菜树、辣木、mauka、鸵鸟蕨、大叶石龙尾、黄叶莴苣、独活草、胡椒草、玛卡(maca)、葫芦、扁豆、空心菜、猫耳菊、鱼腥草、冲绳菠菜、星粟草、小花牛膝菊、刺芹、芝麻菜、刺棘蓟、菜瓜、鸭儿芹、chipilin、圣彼得草、mampat、野茼蒿、红瓜、卷心菜蓟、海甘蓝、驱虫苋、huauzontle、埃塞俄比亚芥菜、magenta spreen、亨利藜、土荆芥、羊腿藜、积雪草、刺山柑、西洋菜台、纳帕甘蓝、水菜、皱叶甘兰、芥蓝、芥菜叶、落葵、莙荙菜、药用蜀葵、攀缘荆树、中国黄麻、红辣椒、胭脂树籽、绿薄荷、香薄荷、马郁兰、莳萝、甘菊、香蜂草、多香果、越桔、番荔枝、云莓、西洋李子、火龙果、榴莲、接骨木、费约果、菠萝蜜、蒲桃、枣、酸浆、紫山竹、红毛丹树、红醋栗、黑醋栗、萨拉尔浆果、无核小蜜橘、牙买加丑橘、红豆、黑豆、黑眼豌豆、菠罗蒂豆、菜豆、绿豆、四季豆、利马豆、绿豆(mung bean)、海军豆、平托豆、红花菜豆、嫩豌豆、食荚菜豆、香豌豆、球花甘蓝、花茎甘蓝、荨麻、甜椒、法国西菜、萝卜、白萝卜、泽芹、塌棵菜、小西兰花、黑萝卜、牛蒡根、蚕豆、束球花甘蓝、扁豆(lablab)、羽扇豆、苹婆(sterculia)、绒毛豆、四棱豆、山药豆、无脉相思树、铁草、伞形灌木、tjuntjula、wakalpulka、金合欢、wiry wattle、芡欧鼠尾草、山毛榉坚果、桐树、药西瓜、蜜果、玛雅果、蒙刚果、奥博诺果、奶油果和小菠萝蜜。
214.当植物是单子叶植物或种子是单子叶植物的种子时，单子叶植物可以选自：玉米、小麦、燕麦、稻、大麦、粟、香蕉、洋葱、大蒜、芦笋、黑麦草、粟、福尼奥米、莱山米、尼帕草、姜黄、藏红花、高良姜、细香葱、小豆蔻、枣椰、菠萝、葱、韭葱、青葱、荸荠、蒜苗、薏米、竹子、鸭脚稗、无斑萍(spotless water meal)、箭叶象耳(arrowleaf elephant ear)、大溪地菠菜(tahitian spinach)、马尼拉麻(abaca)、槟榔(areca)、珍珠粟、槟榔(betel nut)、帚用小米(broom millet)、帚用高粱(broom sorghum)、香茅、椰子、芋头、玉米、芋、高粱、硬质小
麦、edo、菲奎叶、formio、姜、野茅、芦苇草、苏丹草、几内亚玉米、马尼拉麻、灰叶剑麻、杂交玉米、高梁(jowar)、柠檬草、龙舌兰、芦苇粟、龙爪粟、狐尾粟、日本粟、proso millet、新西兰亚麻、燕麦、油棕榈、扇叶树头榈(palm palmyra)、西谷椰子、小糠草、剑麻、高粱(sorghum)、斯佩尔特小麦、甜玉米、甜高粱、甘蔗、芋头、画眉草、梯牧草、黑小麦、香草、小麦和山药。
215.当植物是裸子植物或种子是裸子植物的种子时，裸子植物可以选自以下科：南洋杉科(araucariaceae)、鲍恩氏树科(boweniaceae)、十字花科(brassicaceae)、三尖杉科(cephalotaxaceae)、柏科(cupressaceae)、苏铁科(cycadaceae)、麻黄科(ephedraceae)、银杏科(ginkgoaceae)、买麻藤科(gnetaceae)、松科(pinaceae)、罗汉松科(podocarpaceae)、红豆杉科(taxaceae)、杉科(taxodiaceae)、百岁兰科(welwitschiaceae)、和泽米铁科(zamiaceae)。
216.本文所述的植物和植物种子可包括转基因植物或植物种子，例如转基因谷物(小麦、稻)、玉米、大豆、马铃薯、棉花、烟草、油菜和水果植物(苹果、梨、柑橘类水果和葡萄，包括酿酒葡萄的果实)。优选的转基因植物包括玉米、大豆、马铃薯、棉花、烟草、甜菜、甘蔗和油菜。
217.如本文所述的植物种子可以是遗传修饰的(例如，产生表达除草剂耐受性、对环境因素(如水胁迫、干旱、病毒)耐受性和氮生产、或对细菌、真菌或昆虫毒素抗性的遗传修饰的植物或植物部位的任何种子)。合适的遗传修饰的种子包括芸苔属作物、蔬菜、水果、树木、纤维作物、油料作物、块茎作物、咖啡豆、花卉、豆类、谷类以及单子叶和双子叶物种的其他植物的种子。优选地，遗传修饰的种子包括花生、烟草、禾本科植物、小麦、大麦、黑麦、高粱、水稻、油菜籽、甜菜、向日葵、番茄、胡椒、豆类、莴苣、马铃薯和胡萝卜。最优选地，遗传修饰的种子包括棉花、大豆和玉米(甜玉米、大田玉米、种子玉米或爆米花玉米)。
218.可根据本发明处理的特别有用的转基因植物是含有转化事件或转化事件组合的植物，其例如在来自不同国家或地区管理机构的数据库中列出(参见例如www.gmoinfo.jrc.it/gmp_browse.aspx和www.agbios.com/dbase.php)。
219.已经详细描述了本发明，显而易见的是，在不脱离所附权利要求限定的本发明的范围的情况下，可能发生修改和变化。
220.实施例
221.实施例1
222.蜡状芽孢杆菌中sep1或sep1变体的丝氨酸蛋白酶活性的测定
223.1.展示丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶变体的蜡状芽孢杆菌家族成员的构建
224.为了评估野生型和变体丝氨酸蛋白酶的丝氨酸蛋白酶活性，构建了展示seq id no：1的丝氨酸蛋白酶或seq id no：2的丝氨酸蛋白酶变体的蜡状芽孢杆菌家族成员。通过将puc57质粒(含有氨苄青霉素抗性盒和cole1复制起点)与来自蜡状芽孢杆菌的pbc16-1质粒(含有四环素抗性基因、repu复制基因和oriu复制起点)融合生成psuper质粒。该5.8kb质粒可在大肠杆菌和芽孢杆菌属种中复制，并且可以通过在大肠杆菌中赋予β-内酰胺抗生素抗性和在芽孢杆菌种属中赋予四环素抗性来筛选。基础psuper质粒通过插入pcr生成的片段进行修饰，所述片段与seq id no：1或seq id no：2在框内融合了启动子、起始密码子、靶向序列和丙氨酸接头序列，产生psuper质粒。将这些构建体转化到大肠杆菌中，并铺展在加
氨苄青霉素(100μg/ml)的溶原性肉汤(lysogeny broth)平板上以获得单菌落。使用单个菌落接种于加氨苄青霉素的溶源性肉汤，并在37℃、300rpm下孵育过夜。使用市售质粒纯化试剂盒提取所得培养物中的质粒。通过分光光度法测定这些质粒提取物的dna浓度，并将获得的质粒用适当的限制酶组合进行分析消化。通过琼脂糖凝胶电泳观察所得消化模式以研究质粒大小和不同质粒特征的存在。通过桑格测序进一步研究纯化的psuper衍生物的相关部分，例如seq id no：1或seq id no：2表达盒。
225.另外，如上所述的psuper质粒的衍生质粒创建如下。通过pcr扩增上述psuper质粒的pbc片段(psuper的pbc16-1衍生部分，包括bcla/丝氨酸蛋白酶变体表达盒和四环素抗性)，然后通过平端连接环化。
226.通过电穿孔将如上所述验证的psuper和pbc质粒连接引入苏云金芽孢杆菌bt013a(登录号nrrl b-50924)中。通过在含有四环素(10μg/ml)的营养肉汤平板上铺展来分离单个转化菌落。将单个阳性菌落用于接种含有四环素(10μg/ml)的脑心浸液肉汤，并在30℃、300rpm下孵育过夜。纯化所得培养物的基因组dna，并对psuper质粒或pbc质粒的相关部分重新测序，以确认克隆序列的遗传纯度和pbc的正确连接位点。使经验证的菌落在含有10μg/ml四环素的脑心浸液肉汤中生长过夜，并通过在基于酵母提取物的培养基中在30℃下孵育48小时来诱导孢子形成。
227.2.表达丝氨酸蛋白酶变体的苏云金芽孢杆菌的基因敲除突变菌株的构建及纯化
228.为了制备苏云金芽孢杆菌bt013a的exsy敲除(ko)突变菌株，构建了含有puc57骨架(其能够在大肠杆菌中复制)以及复制起点和来自pe194的红霉素抗性盒的pkoki穿梭质粒和整合载体。该构建体可在大肠杆菌和芽孢杆菌属种中复制。制备含有对应于exsy基因的上游区域的1kb dna区域和对应于exsy基因的下游区域的1kb区域的构建体，这两个区域均由苏云金芽孢杆菌bt013a通过pcr扩增。对于每种构建体，随后使用同源重组将两个1kb区域剪接在一起，这两个区域分别具有彼此重叠的区域和与pkoki质粒重叠的区域。通过消化和dna测序验证该质粒构建体。通过红霉素抗性筛选克隆。
229.将克隆在高温(40℃)下在脑心浸液肉汤中传代。将单个菌落用牙签挑到含有5μg/ml红霉素的lb琼脂平板上，在30℃下生长，并通过菌落pcr筛选整合到染色体中的pkoki质粒的存在。具有整合事件的菌落继续传代以筛选失去红霉素抗性的单菌落(表示通过重组而丢失质粒和去除exsy基因)。通过pcr扩增和染色体靶区域的测序确认所验证的缺失。最后，将pcr扩增的、环化的psuper质粒的pbc部分(如上所述)转化到该bt013a的exsy突变菌株中。
230.对于表达seq id no：1的丝氨酸蛋白酶或seq id no：2的丝氨酸蛋白酶变体的每个esxyko突变体，将过夜培养物在具有抗生素选择的挡板烧瓶中在30℃、300rpm下在bhi培养基中培养。将1毫升该过夜培养物接种到挡板烧瓶中的基于酵母提取物的培养基(50ml)中，并在30℃下培养2天。取出一等分孢子并通过涡旋搅拌。通过在8,000
×
g下离心10分钟收集孢子，并将含有孢子外壁片段的上清液通过0.22μm过滤器过滤以除去任何残留的孢子。在滤液中未发现孢子。
231.3.丝氨酸蛋白酶变体的活性
232.将不含重组质粒(9.79
×
107cfu/ml)或表达seq id no：1(7.06
×
107cfu/ml)或seq id no：2(7.06
×
107cfu/ml)的丝氨酸蛋白酶的esxyko突变体全肉汤培养物培养至每种菌
株指定的cfu浓度。生成孢子外壁片段滤液，并将每份等体积的滤液进行如下测试。使用合成肽底物(ala-ala-pro-phe)测定酶活性。肽底物在c末端与硝基苯基融合，在n末端与琥珀酰基融合。在蛋白酶裂解前，肽在320nm处显示吸光度最大值，并且在裂解后转变为390nm。测定混合物由含有5mm cacl2的溶于240μl ph 7.5的50mm hepes缓冲液的10μl 2.5mg/ml的肽底物组成。将底物和缓冲液在室温下预孵育，然后加入25μl酶溶液。结果如图1所示。该数据显示两种全肉汤培养物均具有酶活性，并且包含丝氨酸蛋白酶变体seq id no：2的菌株比包含seq id no：1的菌株的活性略高。不希望囿于任何理论，申请人假设含有变体丝氨酸蛋白酶(seq id no：2)的重组蜡状芽孢杆菌家族成员比含有全长丝氨酸蛋白酶(seq id no：1)的重组蜡状芽孢杆菌家族成员的生物活性更强。同样不希望囿于任何理论，假设seq id no：2的丝氨酸蛋白酶变体内的缺失可通过使对应于seq id no：1的残基122-126和146-151的结合槽更容易接近底物而改变或提高丝氨酸蛋白酶活性。
233.实施例2
234.丝氨酸蛋白酶变体的计算机建模
235.为了进一步研究序列修饰对丝氨酸蛋白酶活性的影响，开发并测试了其他丝氨酸蛋白酶变体。本研究中用于研究结构特征去除或故意干扰催化三联体的影响的野生型和变体序列如表1所示。
236.表1.用于同源性建模的坚强芽孢杆菌的sep1丝氨酸蛋白酶的变体
[0237][0238]
seq id no：1是来自坚强芽孢杆菌菌株ds-1的野生型sep1丝氨酸蛋白酶。seq id no：2是seq id no：1的变体，通过缺失seq id no：1的氨基酸181-240构建。如上文实施例1所示，seq id no：2表现出丝氨酸蛋白酶活性。seq id nos：4-6代表seq id no：1的中间缺失。seq id nos：7-13代表seq id no：1的延伸缺失，其中与seq id no：2相比还缺失了其他残基。
[0239]
对于建模研究，选择来自短小芽孢杆菌的同源丝氨酸蛋白酶(unitprot登录号p07518(subt_bacpu)；seq id no：3)作为同源模板。通常基于丝氨酸蛋白酶之间的序列相似性和高度结构特征保守性来选择模板。如图2所示，seq id no：3的模板序列显示了比对序列之间的显著的氨基酸残基类型相似度。例如，极性残基与不同的极性残基对齐。
[0240]
此外，如图2中的多重序列比对所示，野生型丝氨酸蛋白酶的关键特征是在催化三联体和结合区中是保守的。例如，对应于在野生型序列中形成催化三联体的seq id no：1的asp49、his86和ser244的残基(在图2a、2b和2e中用矩形标识)在每个建模变体中是保守的。
此外，对应于seq id no：1的gly122、ser123、gly124、gln125、和tyr126和met146、ser147、leu148、gly149、gly150、pro151的底物结合区(在图2c中用矩形标识)基于多序列比对在建模变体和seq id no：3之间是完全保守的。此外，催化三联体和结合槽内的保守残基保持其通常的几何位置，如图3-14的模型所示。
[0241]
实施例3
[0242]
丝氨酸蛋白酶变体之间二级结构的保守性
[0243]
使用triad建模套件(protabit，llc)，以及短小芽孢杆菌的1meepdb条目(entry)(unitprot登录号p07518(subt_bacpu)；seq id no：3)作为建模模板，对序列进行建模。进行标准细化设置(standard refinement setting)的基于模板的同源性建模。具体地，允许软件在每个建模循环中调整随机原子扰动半径。此外，进行了六次加权约束循环以保存模板特征，权重为[1.0，0.001，0.75，0.001，0.25，0.0]，从而朝向模板“震动”该结构，然后使其松弛并脱离模板。提供了用于建模的模板，其在其序列相似性方面是合理的，并且其衍生自系统发生性相关物种，则使用[1.0]的剪切误差阈值(trim error threshold)。既不进行参考比对、对称性限制，也不进行未比对序列剪切。选择最佳评分模型用于输出。未在triad中进行进一步分析。使用pymol(schroedinger)将所得结构可视化、比对和分析。
[0244]
如图3所示，同源性建模表明了seq id no：3模板和野生型(seq id no：1)之间的强结构保守性。该结构在seq id no：3模板和变体丝氨酸蛋白酶seq id no：2之间也是保守的，如图4所示。
[0245]
图5-7示出了检测的所有中间缺失变体(seq id nos：4-6)和模板序列(seq id no：3)之间的结构保守性。如图8-13所示，同样预测所有延伸缺失变体保持相似的结构，特别是在保守的催化三联体和结合区内。
[0246]
实施例4
[0247]
sep1变体中催化三联体几何结构的分析
[0248]
电荷中继(charge relay)是丝氨酸蛋白酶酶促活性所必需的，并且催化三联体的显著变形将破坏电荷中继和催化能力。在同源性建模之后，为了研究丝氨酸蛋白酶变体中催化三联体的几何结构，计算催化三联体的每个残基与1mee同源模板(seq id no：3)相比的α碳距离。还计算了与1mee相比的三联体的均方根偏差(rmsd)。与已知的活性模板相比，根据所生成模型中的序列比对和二级结构的一般保守性，三联体rmsd约为的变体表现出实质性的结构相似性并且可能保留电荷中继功能和酶活性。
[0249]
表2.丝氨酸蛋白酶变体的催化三联体的几何结构分析
[0250][0251]
如表2所示，野生型丝氨酸蛋白酶(w7krh1_bacfi；seq id no：1)显示了组成催化三联体的残基的最小干扰。类似地，每个中间缺失变体(seq id nos：4-6)保持与同源模板的结构相似性。截短变体(seq id no：2)以及延伸缺失_2(seq id no：8)和延伸缺失_4(seq id no：10)也表现出对催化三联体的最小干扰。延伸缺失_3(seq id no：9)表现出对催化三联体的中度扰动，而延伸缺失_1(seq id no：7)、延伸缺失_5(seq id no：11)、延伸缺失_7(seq id no：13)和延伸缺失_6(seq id no：12)表现出或更高的rmsd。
[0252]
这些数据表明，在实施例1中显示具有丝氨酸蛋白酶活性的seq id no：2，在总体二级特征方面保持结构相似性，特别是在蛋白质的结合槽内以及关于催化三联体的定位。类似地，对于较短和中间缺失变体(seq id nos：4-6和8-10)，观察到关于催化三联体α碳的相对几何结构的最小干扰。
[0253]
与seq id no：2相比，在n末端方向上缺失超过7个其他残基似乎对催化三联体造成更显著的几何干扰，特别是在丝氨酸残基处。此外，与seq id no：2相比，从催化丝氨酸到n末端缺失7个其他残基会导致缺失seq id no：2的位置177处的天冬酰胺。asn177被定位以在催化过程中参与活性位点中的氧阴离子空穴，并且该残基的破坏可降低催化能力。