一种提高免疫力的益生菌发酵芸豆饮料及其制备方法与流程

1.本发明涉及一种提高免疫力的益生菌发酵芸豆饮料及其制备方法，属于食品加工技术领域。


背景技术：

2.益生菌系指活的微生物，当摄取足够数量时，对宿主健康有益。益生菌因菌株的差异，功能也有所不同，比如调节胃肠道菌群、维系内环境平衡、润肠通便、调节免疫及过敏反应等。随着益生菌调节肠道菌群作用机理不断细化完善，越来越多的研究报道证明，肠道菌群健康与机体免疫之间的影响密不可分，所以增强免疫力也是益生菌类原料在保健食品申请中比较多的功能声称，而且也有较多的文献支持。如gill等研究表明鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和乳双歧杆菌均可增强天然和获得性免疫力，显著增强血清抗体应答，同时发现鼠李糖乳杆菌还具有防治伤寒沙门氏菌感染小鼠病症的作用。黄琴等对鼠李糖乳杆菌体外免疫活性的实验结果也说明，鼠李糖乳杆菌对巨噬细胞先天性免疫应答的刺激作用远低于病原菌，能有效降低炎症反应，提高受感染巨噬细胞的促炎免疫应答反应。李琪等研究证明副干酪乳杆菌vl8胞外多糖能升高机体内相关免疫酶活性，激活巨噬细胞发挥免疫调节作用。研究证实，益生菌是通过增强免疫应答、降低炎症水平和激活细胞吞噬作用，从而发挥提升机体免疫功能的作用。
3.芸豆(phaseolus vulgaris l.)，英文名common bean，haricot bean，豆科(leguminonsae)菜豆属(phaseolus l.)，又名四季豆、饭豆、莲豆，分为多花菜豆和普通菜豆，多花菜豆包括：大白芸豆、大黑花芸豆、大红花芸豆、扁形白芸豆，普通菜豆包括：圆奶花芸豆、小红花芸豆、黑芸豆、黄芸豆，其中比较熟知的品种有奶花芸豆、白芸豆、小黑芸豆、小红芸豆等。芸豆中富含天然活性物质，如多酚、花色苷、植酸、皂苷和黄酮类化合物，这些活性物质具有降血脂、抑制肿瘤细胞的扩散、增强人体的抗病能力、促进机体的新陈代谢等功能。其中，芸豆皂甙和植物凝集素等能够增强人体的抗病能力和抑制肿瘤细胞的扩散。
4.因此，以芸豆为主要原料，利用益生菌发酵技术，在一定条件下，对全粒芸豆进行发酵，并通过系统调制工艺，开发出一种能够提高免疫力的益生菌发酵芸豆饮料是十分必要的。


技术实现要素：

5.本发明为了解决现有上述技术问题，提供一种提高免疫力的益生菌发酵芸豆饮料及其制备方法，具体工艺为：原料芸豆
→
清选去杂
→
淘洗
→
浸泡
→
蒸煮
→
冷却
→
接种发酵
→
豆液分离
→
离心分离
→
过滤
→
调配
→
加热
→
灌装
→
杀菌
→
检验
→
成品
6.本发明的技术方案：
7.一种提高免疫力的益生菌发酵芸豆饮料的制备方法，该方法包括以下步骤：
8.步骤1，芸豆预处理；
9.对芸豆进行清选，剔除杂质后进行淘洗、浸泡和蒸煮，获得发酵基质；
10.步骤2，发酵；
11.向蒸煮后的芸豆即发酵基质中接种由嗜酸乳杆菌与短乳杆菌组成的发酵剂进行发酵；
12.步骤3，发酵后处理；
13.对发酵成熟的芸豆进行分离，获得发酵后的乳酸菌发酵液和整粒芸豆，通过离心分离机将乳酸菌发酵液进行分离，去除豆沙和豆皮，获得离心液；
14.步骤4，调制；
15.将步骤3的离心液调配成一定糖度后，经加热、罐装、杀菌、检验处理，获得益生菌发酵芸豆饮料。
16.进一步限定，步骤1中浸泡为使用芸豆干重3倍重量的水，保持ph值6-7、水温15～20℃、浸泡时间为10～20小时。
17.进一步限定，步骤1中蒸煮为加入浸泡后经沥水后的湿芸豆重量的2～4倍重量的水，在温度为105℃～120℃，蒸煮10～25分钟，使芸豆完全糊化，获得发酵基质。
18.进一步限定，步骤2中接种剂由嗜酸乳杆菌与短乳杆菌按照质量比为2：1组成。
19.进一步限定，步骤2中接种剂接种量为发酵基质重量的1.5-3.0％，在温度为32℃～37℃条件下，发酵30～60小时，直至发酵液ph为3.5以下开始计时，恒温保持12小时，结束发酵。
20.进一步限定，步骤4中杀菌的温度为115℃，杀菌时间20～30分钟。
21.进一步限定，步骤4中检验为杀菌处理后冷却至室温，在30℃恒温保温7天后，检验变色、沉淀和胀罐现象。
22.上述方法制备获得的益生菌发酵芸豆饮料的芸豆总皂苷含量为1.0-1.5g/l，芸豆凝集素总凝血活力大于5.0
×
106hu。
23.本发明有益效果：
24.本发明采用嗜酸乳杆菌与短乳杆菌协同发酵经预煮的整粒芸豆，在将芸豆中蛋白质、脂肪和糖类转化为人体更易吸收的预消化状态，增加可溶性钙、磷、铁和部分b族维生素的含量，提高芸豆的消化吸收性能和营养价值的同时，通过发酵作用提高了总皂苷提取率达65％以上，同时由于降解了芸豆皂甙结构中的糖苷键，大幅提升了芸豆皂苷元提高免疫功能的作用。
具体实施方式
25.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
26.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
27.实施例1：
28.步骤1，芸豆预处理：
29.1、本实施例采用英国红芸豆作为原料，首先对芸豆进行清选和剔除杂质处理，具
体的选择色泽鲜艳光亮，粒色为红色、淡红色，长椭圆形，无虫蛀的新豆为佳；并保证水分14％以下，杂粮率1％以下，不完善粒5％以下。
30.2、英国红芸豆清洗、浸泡、蒸煮
31.①
清洗：用清水洗净芸豆颗粒表面的尘土与杂物，清洗分两次进行，然后沥干多余水分。
32.②
英国红芸豆浸泡：浸泡用饮用水，硬度8～10，ph值6～8，用水量为英国红芸豆的3倍，水温18℃，浸泡时间为20小时。
33.③
英国红芸豆蒸煮用水条件：蒸煮用水的硬度8～10，ph值6～8，用水量为浸泡后英国红芸豆的1.5倍。配料前用1～2倍的纯净水对浸泡好的芸豆进行清洗，去掉泡豆水。
34.④
英国红芸豆蒸煮其它物料用量：绵白糖为(浸泡英国红芸豆 水)
×
3％；食用盐为(浸泡英国红芸豆 水)
×
0.1％。
35.⑤
英国红芸豆蒸煮条件：温度115℃，时间16分钟；蒸煮后迅速却到37℃～39℃。
36.步骤2，发酵；
37.①
英国红芸豆发酵工艺参数：嗜酸乳杆菌与短乳杆菌的种间比为2:1；混合乳酸菌发酵液的接种量为芸豆蒸煮后冷却物料量的3％；7
°
的大米糖化液添加量为2.5％；葡萄糖添加量为1％。发酵温度为35℃～37℃；发酵时间为30～60小时；ph为3～4，发酵结束。
38.其中英国红芸豆发酵过程：(1)种子接入发酵罐后，即可进行控温培养，罐压一般自动控制在0.05mpa～0.06mpa。(2)发酵温度37℃，通过循环水箱来控制发酵温度。(3)在发酵中途要取样检查时，可通过出料口取样；达到发酵终点出料。
39.②
发酵剂培养基的制备：(1)嗜酸乳杆菌培养基(液体)为5
°
麦芽汁1000ml、酵母膏5.0g，121℃，灭菌20min。(2)短乳杆菌mrs培养基(液体)为蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、吐温801ml、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、柠檬酸二铵2g、硫酸锰0.25g、七水硫酸镁0.58g、蒸馏水1000ml，121℃，灭菌20min。(3)豆汁培养基为将英国红芸豆清洗去杂后，用清水浸泡12h，按m(英国红芸豆):m(水)＝1:1.5，加水煮沸20min后，过滤，取滤液；再按比例加入葡萄糖3％，蛋白胨1％，调节ph7.0左右；121℃灭菌20min即为豆汁培养基。
40.③
混合乳酸菌发酵剂的扩培：将各单菌株由固体斜面接至嗜酸乳杆菌与短乳杆菌的液体培养基中，于37℃条件下培养24h，活化1-2次，然后以3％的接种量接至豆汁培养液的三角瓶中进行扩大培养24h，待用。
41.步骤4，调制；
42.①
分离：对发酵成熟的英国红芸豆，自罐底经带有滤网的下口将发酵液放出，用60目双联过滤机进行粗过滤，然后用卧式离心分离机(分离因数3250)分离，收集滤液待用。
43.②
配料：在配料罐内泵入离心分离后的滤液，按糖度需求加入白砂糖、甜菊糖和柠檬酸等配料，然后加工艺水至总量，开启搅拌桨，蒸汽加热至85℃。
44.③
灌装：将配制好的红芸豆发酵饮料由灌装机装入玻璃瓶中，封盖。
45.④
高压杀菌：将待杀菌红芸豆发酵饮料间隔至于杀菌车架上，关闭高压杀菌釜前盖，按使用说明书指导操作。杀菌温度设定为121℃，恒温时间25分钟。然后打开反压系统，通水冷却至室温。
46.⑤
保温检验：将上述杀菌后的红芸豆发酵饮料经感官检定后的合格品置于30℃恒温室内，保存7天后，降温，抽样质检。同时通过感官检验，剔除泄漏、变形和破损的产品。
47.⑥
贴标及装箱检验贴标，最后检验，内容包括：手检以及对商标的检查。商标应端正、无皱褶。
48.产品成分分析及性能检测：
49.(1)对上述工艺生产乳酸菌发酵英国红芸豆饮料进行分析检测，芸豆总皂苷含量为1.15g/l，芸豆凝集素总凝血活力6.21
×
106hu。
50.(2)对上述工艺生产乳酸菌发酵英国红芸豆饮料进行提高免疫力的动物实验：
51.1.实验动物
52.spf级昆明小鼠共60只，雌雄各半，鼠龄3周，体重13g左右。
53.2.小鼠分组、免疫低下模型建立及样本制备
54.小鼠适应性喂养7天后，随机分为6组，每组10只，雌雄各半，即正常组、模型组、低剂量组(1.5g/kg)、中剂量组(3.0g/kg)、高剂量组(6.0g/kg)、左旋咪唑组(24mg/kg)。
55.每日称取小鼠体重以计算给药量。除正常组外，前三天均腹腔注射环磷酰胺80mg/kg，之后每隔三天强化注射一次，共5次，造成小鼠免疫低下模型，正常组在相同时间腹腔注射生理盐水。同时，给药组每天灌胃给药，正常组与模型组每天灌以0.5％cmc-na，给药至第14天后，禁食不禁水12h，于第15天称取小鼠体重，摘眼球取血后处死，解剖分离胸腺与脾脏，称取重量，并保存于液氮中。血液样本室温静置2h后，于低温离心机4℃、4000rpm离心15min，取上层血清用于elisa法检测血清生化指标。
56.疫器官脏器指数的测定
57.按下列公式计算小鼠的胸腺指数和脾指数。
[0058][0059]
3.芸豆发酵饮料对胸腺和脾指数的影响
[0060]
模型组小鼠经环磷酰胺注射后，毛发稀疏、毛色暗淡、行动迟缓且摄食量减少，给药组小鼠的状况相比模型组有所改善，毛发略稀疏，精神及摄食状态正常。
[0061]
芸豆发酵饮料对免疫抑制小鼠胸腺和脾指数的影响见表1。
[0062]
表1芸豆发酵饮料对小鼠胸腺和脾指数的影响
[0063]
组别胸腺指数脾指数正常组4.21
±
0.352.91
±
0.41模型组1.00
±
0.29
△△
6.55
±
1.09
△△
低剂量组1.03
±
0.354.32
±
0.47**中剂量组1.38
±
0.22*3.58
±
0.45**高剂量组1.51
±
0.26**4.15
±
0.67**左旋咪唑组1.55
±
0.32**2.96
±
0.51**
[0064]
注：与正常组比较，
△
p《0.05，
△△
p《0.01；与模型组比较，*p《0.05，**p《0.01。
[0065]
与正常组相比，模型组小鼠的胸腺指数显著降低(p《0.01)，脾指数显著升高(p《0.01)。与模型组相比，各给药组的脾指数均显著降低(p《0.01)；除低剂量组外，其余给药组小鼠的胸腺指数均显著升高(p《0.05)，且高剂量组和左旋咪唑组升高最为显著(p《0.01)。
[0066]
结论分析：与正常组相比，模型组的胸腺指数明显降低，说明环磷酰胺对小鼠胸腺的抑制非常明显；给药组的胸腺指数相比模型组有不同程度的提升，说明芸豆发酵饮料和
左旋咪唑对环磷酰胺引起的胸腺抑制有一定治疗作用。
[0067]
4.芸豆发酵饮料对血清中igg(免疫球蛋白g)、tnf-α(肿瘤坏死因子)、il-4(白细胞介素)含量的影响
[0068]
芸豆发酵饮料对小鼠血清中ig g、tnf-α、il-4含量的影响见表2。
[0069]
表2芸豆发酵饮料对小鼠免疫活性物质的影响
[0070]
组别igg(mg/dl)tnf-α(ng/l)il-4(ng/l)正常组57.13
±
8.22105.31
±
7.9933.21
±
2.88模型组27.51
±
4.87
△△
55.46
±
4.80
△△
18.88
±
1.87
△△
低剂量组25.98
±
2.1173.02
±
4.12**21.60
±
1.88*中剂量组36.87
±
5.12**80.99
±
3.65**27.01
±
2.41**高剂量组49.54
±
7.55**90.05
±
4.12**26.88
±
2.65**左旋咪唑组39.77
±
3.86**84.56
±
3.66**26.58
±
2.15**
[0071]
注：与正常组比较，
△
p《0.05，
△△
p《0.01；与模型组比较，*p《0.05，**p《0.01。
[0072]
与正常组相比，模型组小鼠的ig g、tnf-α、il-4含量显著降低，具有统计学意义(p《0.01)，说明成功制备了小鼠免疫抑制模型。与模型组相比，mrp中、高剂量组和左旋咪唑组小鼠的igg、tnf-α、il-4含量均显著升高(p《0.01)；低剂量组小鼠的tnf-α、il-4含量显著升高(p《0.05，p《0.01)。分别比较高、中、低剂量组，结果表示三组小鼠的igg、tnf-α、il-4含量均有显著差异(p《0.05，p《0.01)。高剂量组小鼠的igg和il-4含量均显著高于左旋咪唑组(p《0.05)。
[0073]
结论分析：中、高剂量的芸豆发酵饮料能大幅提高小鼠血清中igg、tnf-α和il-4的含量，说明芸豆发酵饮料对免疫低下小鼠的免疫功能有增强作用。高、中、低剂量组小鼠的igg、tnf-α和il-4含量均有显著差异，说明igg、tnf-α和il-4增强免疫功能的作用呈一定量效关系。