包括三重激动长效缀合物或三重激动剂的组合的治疗用途的制作方法

1.本发明涉及包括三重激动长效缀合物或三重激动剂和法尼醇x受体(fxr)激动剂的组合，或进一步包括乙酰辅酶a羧化酶(acc)抑制剂的所述组合的治疗用途。


背景技术：

2.肝脏是动物的主要器官之一，而与肝脏相关的疾病的代表性实例包括非酒精性脂肪肝、肝炎、肝纤维化、胆汁淤积性肝病、肝硬变、肝代偿失调(liver decompensation)和肝细胞癌。炎症可以由病毒、酒精、药物、免疫异常、代谢疾病等在肝脏中引起，并且已知肝脏炎症的进展和慢性化会引起疾病如肝纤维化、肝硬变和肝细胞癌。
3.一般而言，肝炎——是肝脏的炎症——占肝病的大多数，且已知肝炎的进展涉及肝脏炎症或由肝脏炎症引起的各种肝病(例如，肝纤维化和肝硬变)。肝炎根据肝炎的状况可分为急性肝炎和慢性肝炎，而根据其病因可分为病毒性肝炎、酒精性肝炎和药物引发性肝炎。据估计，胆汁淤积性肝病也是由炎性疾病引起的。
4.同时，非酒精性脂肪肝病(nafld)是一种尽管与饮酒无关，但其组织学表现与酒精性肝炎相似的疾病，并且包括单纯性脂肪变性、非酒精性脂肪肝(nafl)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、肝脏炎症、肝纤维化、肝硬变、肝代偿失调和肝细胞癌。随着肥胖和糖尿病人群的增加，非酒精性脂肪肝病也随之增加。
5.已知非酒精性脂肪肝病由多种原因引起，如胰岛素抗性、肥胖、脂毒性、炎性反应等。其中一个主要原因是胰岛素抗性。
6.为增加胰岛素抗性以预防和/或治疗非酒精性脂肪肝病，人们付出了巨大努力。例如，噻唑烷二酮(tzd)或二甲双胍作为胰岛素敏化剂的临床试验仍在广泛进行中(hepatology(2003)38:1008
–
17,j clin invest.(2001)108:1167
–
74)。
7.然而，已知由于高体重增加和低体液流速的缺点，使用基于tzd的药物的治疗不能应用于心脏病患者。除了基于tzd的药物外，glp-1受体激动剂如victoza或byetta治疗非酒精性脂肪肝病的临床试验也已积极开展。特别是因为这些药物伴随体重减轻，所以在开发的早期也预期到其对非酒精性脂肪肝病和由此引起的纤维化的治疗效果。然而，由于这些药物与其它肽激素一样，在体内的半衰期极短，因此需要每天重复施用一次、两次或更多次，给患者带来不便。这种频繁施用会给患者带来严重的疼痛和不便。尽管近年来已经对非酒精性脂肪肝病进行了semaglutide——作为glp-1受体激动剂，使施用的便利性得到改善——的临床试验，但是没有确认其对由非酒精性脂肪性肝炎引起的纤维化的治疗效果。也就是说，简单地增加胰岛素抗性的机制或者将包括glp-1受体激动剂在内的各种抗糖尿病药物应用于非酒精性脂肪肝病的治疗剂，具有诸如治疗功效不足、各种副作用和患者便利性问题的缺点。由于这些结果，本领域以各种方式已知难以直接使用已知在治疗糖尿病上有效的药物作为非酒精性脂肪肝病的治疗剂。因此，只有在基于临床试验确认了已知对治疗糖尿病有效的药物对非酒精性脂肪肝病的治疗效果之后，才可以确定该药物是否可用作非酒精性脂肪肝病的治疗剂。然而，在目前可用的抗糖尿病药物中，没有一种药物被批准
作为非酒精性脂肪肝病的治疗剂。因此，仍然需要开发能够以高患者便利性、更有效地治疗非酒精性脂肪肝病而无副作用的药物。
8.胰高血糖素样肽-1(glp-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(gip)是代表性的胃肠激素和神经激素，是参与根据食物摄入来调节血糖水平的物质。胰高血糖素是由胰腺分泌的肽激素，与上述两种物质共同参与血糖浓度的调节。
9.同时，glp-1具有作为肥胖症的治疗剂的潜力，并且gip根据血糖水平促进胰岛素从胰腺分泌以降低血糖水平，并且已经报道了其对增加glp-1的活性和抑制炎症的作用。当血糖水平因其它药物或疾病，或者激素或酶缺乏而下降时，胰高血糖素在胰腺中产生。胰高血糖素向肝脏发送糖原分解，随后释放葡萄糖的信号，在将血糖水平升高至正常范围方面发挥作用。此外，除了增加血糖水平的作用之外，还报道了通过抑制动物和人的食欲和通过激活脂肪细胞的激素敏感脂肪酶并促进能量消耗来促进脂肪分解的抗肥胖作用。
[0010][0011]
法尼醇x受体(fxr)激动剂是法尼醇x受体的激动剂，又称为胆汁酸受体(bar)，是一种核受体激活的胆汁酸。fxr在胆汁酸代谢的主要部位如肝、肠和肾中表达，并且据报道，fxr以组织特异性方式起作用以影响几种代谢途径，包括胆汁酸代谢和纤维化。因此，需要开发有效治疗由fxr介导的肝病的方法。
[0012][0013]
乙酰辅酶a羧化酶(acc)抑制剂是已知抑制乙酰辅酶a羧化酶的物质，是一种脂肪酸产生和代谢调节的重要酶。


技术实现要素：

【技术问题】
[0014]
需要开发有效预防和/或治疗肝病的药物。【技术方案】
[0015]
本发明的一个目的是提供用于治疗或预防肝病的药物组合物，其包括药学有效量的三重激动长效缀合物或三重激动剂和药学上可接受的赋形剂，其中所述药物组合物与法尼醇x受体激动剂组合。
[0016]
本发明的另一个目的是提供组合物，其包括(i)对胰高血糖素受体、胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(gip)受体具有活性的物质或其长效缀合物，和(ii)法尼醇x受体(fxr)激动剂。
[0017]
本发明的另一个目的是提供组合，其包括(i)对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质或其长效缀合物，(ii)fxr激动剂，和(iii)乙酰辅酶a羧化酶(acc)抑制剂。
[0018]
本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗肝病的药物组合物，其包括所述组合。
[0019]
本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗肝病的药物套组(kit)，其包括(i)对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质或其长效缀合物，和(ii)fxr激动剂。
[0020]
本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗肝病的药物套组，其包括(i)对胰高
血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质或其长效缀合物，(ii)fxr激动剂，和(iii)acc抑制剂。
[0021]
本发明的另一个目的是提供预防或治疗肝病的方法，所述方法包括向有需要的个体施用所述组合、所述用于治疗或预防肝病的药物组合物或所述药物套组和/或使用所述组合、所述用于治疗或预防肝病的药物组合物或所述药物套组。
[0022]
本发明的另一个目的是提供所述组合、所述药物组合物或所述药物套组用于肝病的预防或治疗用途和/或制备用于预防或治疗非酒精性脂肪肝病的药物的用途。【有利效果】
[0023]
三重激动长效缀合物或三重激动剂与fxr激动剂的组合疗法，或三重激动长效缀合物或三重激动剂、fxr激动剂和acc抑制剂的三元组合疗法，与其单一疗法相比具有改善的效果，从而有效地用于肝病的预防或治疗。
附图说明
[0024]
图1显示了根据组合施用三重激动剂的长效缀合物的nafld活性评分(nas)的变化(*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001vs.ch-hfd，通过单因素anova的赋形剂对照)。
[0025]
图2显示了根据组合施用三重激动剂的长效缀合物的肝组织中羟脯氨酸水平的变化(*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001vs.ch-hfd，通过单因素anova的赋形剂对照)。
具体实施方式
[0026]
本发明的一个方面提供了用于治疗或预防肝病的药物组合物，其包括三重激动长效缀合物或三重激动剂，其中所述药物组合物与法尼醇x受体激动剂组合。
[0027][0028]
在一个具体实施方式中，所述药物组合物是用于治疗或预防肝病的药物组合物，其包括药学有效量的三重激动长效缀合物或三重激动剂和药学上可接受的赋形剂。
[0029]
所述药物组合物的特征在于与法尼醇x受体激动剂组合。
[0030][0031]
所述药物组合物的特征在于所述三重激动长效缀合物是下列化学式1表示的物质：
[0032]
[化学式1]
[0033]z–
l
x
–
fc
[0034]
这里，l
x
是包括乙二醇重复单元的连接体，并且x是0或自然数，
[0035]
fc是免疫球蛋白fc区，
[0036]
–
分别表示l
x
和z之间以及fc和l
x
之间的共价键，
[0037]
z或三重激动剂是包含下列通式1表示的氨基酸序列的肽，
[0038]
xaa1
–
xaa2
–
xaa3
–
gly
–
thr
–
phe
–
xaa7
–
ser
–
asp
–
xaa10
–
ser
–
xaa12
–
xaa13
–
xaa14
–
xaa15
–
xaa16
–
xaa17
–
xaa18
–
xaa19
–
xaa20
–
xaa21
–
phe
–
xaa23
–
xaa24
–
trp
–
leu
–
xaa27
–
xa a28
–
xaa29
–
xaa30
–
r1(通式1，seq id no:103)。
[0039]
在上述通式1中，
[0040]
xaa1是组氨酸(his，h)、4-咪唑乙酰基(ca)或酪氨酸(tyr，y)，
[0041]
xaa2是甘氨酸(gly，g)、α-甲基-谷氨酸或2-氨基异丁酸(aib)，
[0042]
xaa3是谷氨酸(glu，e)或谷氨酰胺(gln，q)，
[0043]
xaa7是苏氨酸(thr，t)或异亮氨酸(ile，i)，
[0044]
xaa10是亮氨酸(leu，l)、酪氨酸(tyr，y)、赖氨酸(lys，k)、半胱氨酸(cys，c)或缬氨酸(val，v)，
[0045]
xaa12是赖氨酸(lys，k)、丝氨酸(ser，s)或异亮氨酸(ile，i)，
[0046]
xaa13是谷氨酰胺(gln，q)、酪氨酸(tyr，y)、丙氨酸(ala，a)或半胱氨酸(cys，c)，
[0047]
xaa14是亮氨酸(leu，l)、甲硫氨酸(met，m)或酪氨酸(tyr，y)，
[0048]
xaa15是半胱氨酸(cys，c)、天冬氨酸(asp，d)、谷氨酸(glu，e)或亮氨酸(leu，l)，
[0049]
xaa16是甘氨酸(gly，g)、谷氨酸(glu，e)或丝氨酸(ser，s)，
[0050]
xaa17是谷氨酰胺(gln，q)、精氨酸(arg，r)、异亮氨酸(ile，i)、谷氨酸(glu，e)、半胱氨酸(cys，c)或赖氨酸(lys，k)，
[0051]
xaa18是丙氨酸(ala，a)、谷氨酰胺(gln，q)、精氨酸(arg，r)或组氨酸(his，h)，
[0052]
xaa19是丙氨酸(ala，a)、谷氨酰胺(gln，q)、半胱氨酸(cys，c)或缬氨酸(val，v)，
[0053]
xaa20是赖氨酸(lys，k)、谷氨酰胺(gln，q)或精氨酸(arg，r)，
[0054]
xaa21是谷氨酸(glu，e)、谷氨酰胺(gln，q)、亮氨酸(leu，l)、半胱氨酸(cys，c)或天冬氨酸(asp，d)，
[0055]
xaa23是异亮氨酸(ile，i)或缬氨酸(val，v)，
[0056]
xaa24是丙氨酸(ala，a)、谷氨酰胺(gln，q)、半胱氨酸(cys，c)、天冬酰胺(asn，n)、天冬氨酸(asp，d)或谷氨酸(glu，e)，
[0057]
xaa27是缬氨酸(val，v)、亮氨酸(leu，l)或赖氨酸(lys，k)，
[0058]
xaa28是半胱氨酸(cys，c)、赖氨酸(lys，k)、丙氨酸(ala，a)、天冬酰胺(asn，n)或天冬氨酸(asp，d)，
[0059]
xaa29是半胱氨酸(cys，c)、甘氨酸(gly，g)、谷氨酰胺(gln，q)、苏氨酸(thr，t)、谷氨酸(glu，e)或组氨酸(his，h)，
[0060]
xaa30是半胱氨酸(cys，c)、甘氨酸(gly，g)、赖氨酸(lys，k)或组氨酸(his，h)或不存在，
[0061]
r1是半胱氨酸(cys，c)、gkkndwkhnit(seq id no:106)、m
–
ssgappps
–
n(seq id no:107)或m
–
ssgqppps
–
n(seq id no:108)或不存在，
[0062]
m是
–
cys
–
、
–
pro
–
或
–
gly
–
pro
–
，并且
[0063]
n不存在或是
–
cys
–
、
–
gly
–
、
–
ser
–
或
–
his
–
gly
–
。
[0064][0065]
根据前述实施方式中任一项的药物组合物的特征在于在上述通式1中，
[0066]
xaa2是甘氨酸、α-甲基-谷氨酸或2-氨基异丁酸，
[0067]
xaa7是苏氨酸，
[0068]
xaa10是酪氨酸、半胱氨酸或缬氨酸，
[0069]
xaa12是赖氨酸或异亮氨酸，
[0070]
xaa13是酪氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺或半胱氨酸，
[0071]
xaa14是亮氨酸、酪氨酸或甲硫氨酸；
[0072]
xaa15是半胱氨酸、亮氨酸、谷氨酸或天冬氨酸，
[0073]
xaa17是谷氨酰胺、精氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸、谷氨酸或赖氨酸，
[0074]
xaa18是丙氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或组氨酸，
[0075]
xaa19是丙氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸或半胱氨酸，
[0076]
xaa20是赖氨酸、精氨酸或谷氨酰胺，
[0077]
xaa21是谷氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、半胱氨酸或天冬氨酸，
[0078]
xaa23是异亮氨酸或缬氨酸，
[0079]
xaa24是半胱氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸或天冬氨酸，并且
[0080]
xaa27是亮氨酸或赖氨酸。
[0081][0082]
根据前述实施方式中任一项的药物组合物的特征在于z或三重激动剂是包含下列通式2表示的氨基酸序列的肽。
[0083]
xaa1
–
xaa2
–
gln
–
gly
–
thr
–
phe
–
thr
–
ser
–
asp
–
xaa10
–
ser
–
lys
–
xaa13
–
xaa14
–
xaa15
–
xaa16
–
xaa17
–
xaa18
–
xaa19
–
xaa20
–
xaa21
–
phe
–
xaa23
–
xaa24
–
trp
–
leu
–
leu
–
xaa28
–
xaa29
–
xaa30
–
xaa31
–
ser
–
ser
–
gly
–
gln
–
pro
–
pro
–
pro
–
ser
–
xaa40(通式2，seq id no:104)
[0084]
在上述通式2中，
[0085]
xaa1是4-咪唑乙酰基、组氨酸或酪氨酸，
[0086]
xaa2是甘氨酸、α-甲基-谷氨酸或2-氨基异丁酸，
[0087]
xaa10是酪氨酸或半胱氨酸，
[0088]
xaa13是丙氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸或半胱氨酸，
[0089]
xaa14是亮氨酸、甲硫氨酸或酪氨酸，
[0090]
xaa15是天冬氨酸、谷氨酸或亮氨酸，
[0091]
xaa16是甘氨酸、谷氨酸或丝氨酸，
[0092]
xaa17是谷氨酰胺、精氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、半胱氨酸或赖氨酸，
[0093]
xaa18是丙氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或组氨酸，
[0094]
xaa19是丙氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或缬氨酸，
[0095]
xaa20是赖氨酸、谷氨酰胺或精氨酸，
[0096]
xaa21是半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸或天冬氨酸，
[0097]
xaa23是异亮氨酸或缬氨酸，
[0098]
xaa24是半胱氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或谷氨酸，
[0099]
xaa28是赖氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸，
[0100]
xaa29是甘氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或组氨酸，
[0101]
xaa30是半胱氨酸、甘氨酸、赖氨酸或组氨酸，
[0102]
xaa31是脯氨酸或半胱氨酸；并且
[0103]
xaa40是半胱氨酸或不存在。
[0104][0105]
根据前述实施方式中任一项的药物组合物的特征在于z或三重激动剂是包含下列通式3表示的氨基酸序列的肽。
[0106]
xaa1
–
xaa2
–
gln
–
gly
–
thr
–
phe
–
thr
–
ser
–
asp
–
tyr
–
ser
–
lys
–
xaa13
–
leu
–
asp
–
glu
–
xaa17
–
xaa18
–
xaa19
–
lys
–
xaa21
–
phe
–
val
–
xaa24
–
trp
–
leu
–
leu
–
xaa28
–
xaa29
–
xaa30
–
xaa31
–
ser
–
ser
–
gly
–
gln
–
pro
–
pro
–
pro
–
ser
–
xaa40(通式3，seq id no:105)
[0107]
在上述通式3中，
[0108]
xaa1是组氨酸或酪氨酸，
[0109]
xaa2是α-甲基-谷氨酸或2-氨基异丁酸，
[0110]
xaa13是丙氨酸、酪氨酸或半胱氨酸，
[0111]
xaa17是精氨酸、半胱氨酸或赖氨酸，
[0112]
xaa18是丙氨酸或精氨酸，
[0113]
xaa19是丙氨酸或半胱氨酸，
[0114]
xaa21是谷氨酸或天冬氨酸，
[0115]
xaa24是谷氨酰胺或天冬酰胺，
[0116]
xaa28是半胱氨酸或天冬氨酸，
[0117]
xaa29是半胱氨酸、组氨酸或谷氨酰胺，
[0118]
xaa30是半胱氨酸或组氨酸，
[0119]
xaa31是脯氨酸或半胱氨酸，并且
[0120]
xaa40是半胱氨酸或不存在。
[0121]
根据前述实施方式中任一项的药物组合物的特征在于，在z或三重激动剂中，xaa16是谷氨酸，xaa20是赖氨酸，并且谷氨酸和赖氨酸形成内酰胺环。
[0122]
根据前述实施方式中任一项的药物组合物的特征在于z或三重激动剂的c端被酰胺化。
[0123]
根据前述实施方式中任一项的药物组合物的特征在于l
x
中的乙二醇重复单元的式量在1kda至100kda的范围内。
[0124]
根据前述实施方式中任一项的药物组合物的特征在于z或三重激动剂是包含选自seq id no:1至102的氨基酸序列的肽。
[0125]
根据前述实施方式中任一项的药物组合物的特征在于z或三重激动剂是包含选自seq id no:21、22、42、43、50、64、66、67、70、71、76、77、96、97和100的氨基酸序列的肽。
[0126]
根据前述实施方式中任一项的药物组合物的特征在于z或三重激动剂是包含选自seq id no:21、22、42、43、50、66、67、77、96、97和100的氨基酸序列的肽。
[0127]
根据前述实施方式中任一项的药物组合物的特征在于z或三重激动剂是包含选自seq id no:21、22、42、43、50、77和96的氨基酸序列的肽。
[0128]
根据前述实施方式中任一项的药物组合物的特征在于所述法尼醇x受体激动剂包括选自下列的至少一种：咖啡醇、鹅脱氧胆酸、奥贝胆酸(obeticholic acid)、非那明(fexaramine)、gw 4064、px104、6-乙基-鹅脱氧胆酸(6-ethyl-chedeoxycholic acid,6e-cdca)、akn-083、tropifexor、cilofexor、edp-305、agn-242266、agn-242256、ep-024297、rdx-023、bwl-200、gnf-5120、gs-9674、lmb-763、px-102、px-103、m790、m780、m450、m-480、met-409、met-642、px20606、eyp-001、tern-101、tc-100和int-2228。
[0129]
根据前述实施方式中任一项的药物组合物的特征在于所述药物组合物还与乙酰辅酶a羧化酶抑制剂组合。
[0130]
根据前述实施方式中任一项的药物组合物的特征在于所述乙酰辅酶a羧化酶抑制
剂包括选自下列的至少一种：cp-640186、(4-哌啶基)-哌嗪衍生物、1,4-二取代环己烷衍生物、螺色满酮(spirochromanone)衍生物、螺内酰胺(spirolactam)衍生物、螺二胺(spirodiamine)衍生物、螺五酰基酰胺(spiropentacylamide)衍生物、假肽吡咯烷二酮(pseudopeptide pyrrolidinedione)衍生物、大环聚酮衍生物、含firsocostat的噻吩嘧啶酮衍生物、氨基-唑衍生物、偶氮苯并咪唑衍生物和pf-05221304。
[0131]
根据前述实施方式中任一项的药物组合物的特征在于所述肝病是非酒精性脂肪肝病或胆汁淤积性肝病。
[0132]
根据前述实施方式中任一项的药物组合物的特征在于所述非酒精性脂肪肝病包括选自下列的至少一种：单纯性脂肪变性、肝脏炎症、非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬变、肝纤维化、肝代偿失调和肝细胞癌。
[0133]
根据前述实施方式中任一项的药物组合物的特征在于胆汁淤积性肝病包括选自下列的至少一种：原发性胆汁性肝硬变、原发性硬化性胆管炎及其任意组合。
[0134]
根据前述实施方式中任一项的药物组合物的特征在于所述非酒精性脂肪肝病包括选自下列的至少一种疾病：肝脏炎症、非酒精性脂肪性肝炎和肝纤维化。
[0135][0136]
本发明的另一方面提供了组合，其包括(i)对胰高血糖素受体、胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(gip)受体具有活性的物质或其长效缀合物，和(ii)法尼醇x受体(fxr)激动剂。
[0137]
在一个具体实施方式中，所述组合的特征在于还包括(iii)乙酰辅酶a羧化酶(acc)抑制剂。
[0138][0139]
根据前述实施方式中任一项的组合的特征在于所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质是包含上述通式1表示的氨基酸序列的肽。
[0140][0141]
根据前述实施方式中任一项的组合的特征在于，在上述通式1中，
[0142]
xaa14是亮氨酸或甲硫氨酸，并且
[0143]
xaa15是半胱氨酸、天冬氨酸或亮氨酸。
[0144][0145]
根据前述实施方式中任一项的组合的特征在于所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质是包含上述通式2表示的氨基酸序列的肽。
[0146][0147]
根据前述实施方式中任一项的组合的特征在于，在上述通式1中，
[0148]
xaa2是甘氨酸、α-甲基-谷氨酸或aib，
[0149]
xaa7是苏氨酸，
[0150]
xaa10是酪氨酸、半胱氨酸或缬氨酸，
[0151]
xaa12是赖氨酸或异亮氨酸，
[0152]
xaa13是酪氨酸、丙氨酸或半胱氨酸，
[0153]
xaa14是亮氨酸或甲硫氨酸，
[0154]
xaa15是半胱氨酸或天冬氨酸，
[0155]
xaa17是谷氨酰胺、精氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸或赖氨酸，
[0156]
xaa18是丙氨酸、精氨酸或组氨酸，
[0157]
xaa19是丙氨酸、谷氨酰胺或半胱氨酸，
[0158]
xaa20是赖氨酸或谷氨酰胺，
[0159]
xaa21是谷氨酸、半胱氨酸或天冬氨酸，
[0160]
xaa23是缬氨酸，
[0161]
xaa24是丙氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸，并且
[0162]
xaa27是亮氨酸或赖氨酸。
[0163]
根据前述实施方式中任一项的组合的特征在于，在上述通式2中，
[0164]
xaa13是丙氨酸、酪氨酸或半胱氨酸，
[0165]
xaa15是天冬氨酸或谷氨酸，
[0166]
xaa17是谷氨酰胺、精氨酸、半胱氨酸或赖氨酸，
[0167]
xaa18是丙氨酸、精氨酸或组氨酸，
[0168]
xaa21是半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺或天冬氨酸，
[0169]
xaa23是异亮氨酸或缬氨酸，
[0170]
xaa24是半胱氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺，
[0171]
xaa28是半胱氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸，
[0172]
xaa29是谷氨酰胺、半胱氨酸或组氨酸，并且
[0173]
xaa30是半胱氨酸、赖氨酸或组氨酸。
[0174][0175]
根据前述实施方式中任一项的组合的特征在于，在上述通式1中，
[0176]
xaa2是α-甲基-谷氨酸或aib，
[0177]
xaa7是苏氨酸，
[0178]
xaa10是酪氨酸或半胱氨酸，
[0179]
xaa12是赖氨酸或异亮氨酸，
[0180]
xaa13是酪氨酸、丙氨酸或半胱氨酸，
[0181]
xaa14是亮氨酸或甲硫氨酸，
[0182]
xaa15是半胱氨酸或天冬氨酸，
[0183]
xaa16是谷氨酸，
[0184]
xaa17是精氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸或赖氨酸，
[0185]
xaa18是丙氨酸、精氨酸或组氨酸，
[0186]
xaa19是丙氨酸、谷氨酰胺或半胱氨酸，
[0187]
xaa20是赖氨酸或谷氨酰胺，
[0188]
xaa21是谷氨酸或天冬氨酸，
[0189]
xaa23是缬氨酸，
[0190]
xaa24是谷氨酰胺、天冬酰胺或天冬氨酸，
[0191]
xaa27是亮氨酸，并且
[0192]
xaa28是半胱氨酸、丙氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸。
[0193][0194]
根据前述实施方式中任一项的组合的特征在于，在上述通式1中，
[0195]
xaa1是组氨酸或4-咪唑乙酰基，
[0196]
xaa2是α-甲基-谷氨酸或aib，
[0197]
xaa3是谷氨酰胺，
[0198]
xaa7是苏氨酸，
[0199]
xaa10是酪氨酸，
[0200]
xaa12是异亮氨酸，
[0201]
xaa13是丙氨酸或半胱氨酸，
[0202]
xaa14是甲硫氨酸，
[0203]
xaa15是天冬氨酸，
[0204]
xaa16是谷氨酸，
[0205]
xaa17是异亮氨酸或赖氨酸，
[0206]
xaa18是丙氨酸或组氨酸，
[0207]
xaa19是谷氨酰胺或半胱氨酸，
[0208]
xaa20是赖氨酸，
[0209]
xaa21是天冬氨酸，
[0210]
xaa23是缬氨酸，
[0211]
xaa24是天冬酰胺，
[0212]
xaa27是亮氨酸，
[0213]
xaa28是丙氨酸或天冬酰胺，
[0214]
xaa29是谷氨酰胺或苏氨酸，并且
[0215]
xaa30是半胱氨酸或赖氨酸，或不存在。
[0216][0217]
根据前述实施方式中任一项的组合的特征在于所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质是包含上述通式3表示的氨基酸序列的肽。
[0218][0219]
根据前述实施方式中任一项的组合的特征在于，在上述通式1中，
[0220]
r1是半胱氨酸、gkkndwkhnit(seq id no:106)、cssgqppps(seq id no:109)、gpssgappps(seq id no:110)、gpssgapppsc(seq id no:111)、pssgappps(seq id no:112)、pssgapppsg(seq id no:113)、pssgapppshg(seq id no:114)、pssgapppss(seq id no:115)、pssgqppps(seq id no:116)或pssgqpppsc(seq id no:117)，或不存在。
[0221][0222]
根据前述实施方式中任一项的组合的特征在于，在从所述通式的n端起第16位氨基酸与从所述通式的n端起第20位氨基酸之间形成环。
[0223]
根据前述实施方式中任一项的组合的特征在于所述肽的c端被酰胺化或具有游离羧基。
[0224]
根据前述实施方式中任一项的组合的特征在于所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质是包含选自seq id no:1至102的氨基酸序列的肽。
[0225]
根据前述实施方式中任一项的组合的特征在于所述fxr激动剂选自咖啡醇、鹅脱氧胆酸、奥贝胆酸、非那明、gw 4064、px104、6-乙基-鹅脱氧胆酸(6e-cdca)、akn-083、tropifexor、cilofexor、edp-305、agn-242266、agn-242256、ep-024297、rdx-023、bwl-200、gnf-5120、gs-9674、lmb-763、px-102、px-103、m790、m780、m450、m-480、met-409、met-642、px20606、eyp-001、tern-101、tc-100和int-2228。
[0226]
根据前述实施方式中任一项的组合的特征在于所述acc抑制剂选自cp-640186、(4-哌啶基)-哌嗪衍生物、1,4-二取代环己烷衍生物、螺色满酮衍生物、螺内酰胺衍生物、螺二胺衍生物、螺五酰基酰胺衍生物、假肽吡咯烷二酮衍生物、大环聚酮衍生物、含firsocostat的噻吩嘧啶酮衍生物、氨基-唑衍生物、偶氮苯并咪唑衍生物和pf-05221304。
[0227]
根据前述实施方式中任一项的组合的特征在于所述缀合物是长效缀合物的形式，其中所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质与能够增加所述物质的体内半衰期的生物相容性材料连接。
[0228]
根据前述实施方式中任一项的组合的特征在于所述缀合物由上述化学式1表示。
[0229][0230]
根据前述实施方式中任一项的组合的特征在于化学式1的fc是免疫球蛋白fc区。
[0231]
根据前述实施方式中任一项的药物组合物或组合的特征在于所述fc区是igg fc区。
[0232][0233]
根据前述实施方式中任一项的药物组合物或组合的特征在于l
x
是聚乙二醇。
[0234]
根据前述实施方式中任一项的组合的特征在于所述组合用于预防或治疗肝病。
[0235]
根据前述实施方式中任一项的组合的特征在于所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质是包含选自seq id no:1至102的氨基酸序列的肽，并且所述其缀合物是所述肽通过作为连接体的非肽基聚合物与所述免疫球蛋白fc区连接的形式。
[0236][0237]
本发明的另一方面提供了用于预防或治疗肝病的药物组合物，其包括所述组合。
[0238]
在一个具体实施方式中，所述肝病是非酒精性脂肪肝病或胆汁淤积性肝病。
[0239]
根据前述实施方式中任一项的药物组合物的特征在于所述非酒精性脂肪肝病选自单纯性脂肪变性、肝脏炎症、非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬变、肝纤维化、肝代偿失调和肝细胞癌。
[0240]
根据前述实施方式中任一项的药物组合物的特征在于所述胆汁淤积性肝病选自原发性胆汁性肝硬变、原发性硬化性胆管炎及其任意组合。
[0241][0242]
本发明的另一方面提供了用于预防或治疗肝病的药物组合物，其包括对胰高血糖素受体、胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(gip)受体具有活性的物质或其缀合物，并且与法尼醇x受体(fxr)激动剂组合使用。
[0243]
在一个具体实施方式中，所述组合物进一步与乙酰辅酶a羧化酶(acc)抑制剂组合。
或“三角激动剂(trigonal agonist)”。
[0269]
在本发明中，与未连接载体的肽相比，作为肽的缀合物的“三重激动长效缀合物”可表现出所增加的效果的延长的持续时间。在本发明中，所述缀合物被称为“长效缀合物”并且可与“缀合物”、“三重激动剂的长效缀合物”或“对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质的缀合物”互换使用。
[0270][0271]
在本发明的一个具体实施方式中，所述药物组合物是用于治疗或预防肝病的药物组合物，其包括药学有效量的三重激动长效缀合物或三重激动剂和药学上可接受的赋形剂。
[0272]
所述药物组合物的特征在于与法尼醇x受体激动剂组合。
[0273]“三重激动长效缀合物”可以是由下列化学式1表示的物质，但不限于此。
[0274]
[化学式1]
[0275]z–
l
x
–
fc
[0276]
在化学式1中，l
x
是包括乙二醇重复单元的连接体，x是0或自然数，
[0277]
fc是免疫球蛋白fc区，
[0278]
–
表示l
x
和z之间的共价键以及fc和l
x
之间的共价键，并且
[0279]
z或三重激动剂是包含由下列通式1表示的氨基酸序列的肽。
[0280]
xaa1
–
xaa2
–
xaa3
–
gly
–
thr
–
phe
–
xaa7
–
ser
–
asp
–
xaa10
–
ser
–
xaa12
–
xaa13
–
xaa14
–
xaa15
–
xaa16
–
xaa17
–
xaa18
–
xaa19
–
xaa20
–
xaa21
–
phe
–
xaa23
–
xaa24
–
trp
–
leu
–
xaa27
–
x aa28
–
xaa29
–
xaa30
–
r1(通式1，seq id no:103)。
[0281]
在上述通式1中，
[0282]
xaa1是组氨酸(his，h)、4-咪唑乙酰基(ca)或酪氨酸(tyr，y)，
[0283]
xaa2是甘氨酸(gly，g)、α-甲基-谷氨酸或2-氨基异丁酸(aib)，
[0284]
xaa3是谷氨酸(glu，e)或谷氨酰胺(gln，q)，
[0285]
xaa7是苏氨酸(thr，t)或异亮氨酸(ile，i)，
[0286]
xaa10是亮氨酸(leu，l)、酪氨酸(tyr，y)、赖氨酸(lys，k)、半胱氨酸(cys，c)或缬氨酸(val，v)，
[0287]
xaa12是赖氨酸(lys，k)、丝氨酸(ser，s)或异亮氨酸(ile，i)，
[0288]
xaa13是谷氨酰胺(gln，q)、酪氨酸(tyr，y)、丙氨酸(ala，a)或半胱氨酸(cys，c)，
[0289]
xaa14是亮氨酸(leu，l)、甲硫氨酸(met，m)或酪氨酸(tyr，y)，
[0290]
xaa15是半胱氨酸(cys，c)、天冬氨酸(asp，d)、谷氨酸(glu，e)或亮氨酸(leu，l)，
[0291]
xaa16是甘氨酸(gly，g)、谷氨酸(glu，e)或丝氨酸(ser，s)，
[0292]
xaa17是谷氨酰胺(gln，q)、精氨酸(arg，r)、异亮氨酸(ile，i)、谷氨酸(glu，e)、半胱氨酸(cys，c)或赖氨酸(lys，k)，
[0293]
xaa18是丙氨酸(ala，a)、谷氨酰胺(gln，q)、精氨酸(arg，r)或组氨酸(his，h)，
[0294]
xaa19是丙氨酸(ala，a)、谷氨酰胺(gln，q)、半胱氨酸(cys，c)或缬氨酸(val，v)，
[0295]
xaa20是赖氨酸(lys，k)、谷氨酰胺(gln，q)或精氨酸(arg，r)，
[0296]
xaa21是谷氨酸(glu，e)、谷氨酰胺(gln，q)、亮氨酸(leu，l)、半胱氨酸(cys，c)或天冬氨酸(asp，d)，
[0297]
xaa23是异亮氨酸(ile，i)或缬氨酸(val，v)，
[0298]
xaa24是丙氨酸(ala，a)、谷氨酰胺(gln，q)、半胱氨酸(cys，c)、天冬酰胺(asn，n)、天冬氨酸(asp，d)或谷氨酸(glu，e)，
[0299]
xaa27是缬氨酸(val，v)、亮氨酸(leu，l)或赖氨酸(lys，k)，
[0300]
xaa28是半胱氨酸(cys，c)、赖氨酸(lys，k)、丙氨酸(ala，a)、天冬酰胺(asn，n)或天冬氨酸(asp，d)，
[0301]
xaa29是半胱氨酸(cys，c)、甘氨酸(gly，g)、谷氨酰胺(gln，q)、苏氨酸(thr，t)、谷氨酸(glu，e)或组氨酸(his，h)，
[0302]
xaa30是半胱氨酸(cys，c)、甘氨酸(gly，g)、赖氨酸(lys，k)或组氨酸(his，h)或不存在，
[0303]
r1是半胱氨酸(cys，c)、gkkndwkhnit(seq id no:106)、m
–
ssgappps
–
n(seq id no:107)或m
–
ssgqppps
–
n(seq id no:108)或不存在，
[0304]
m是
–
cys
–
、
–
pro
–
或
–
gly
–
pro
–
，并且
[0305]
n不存在或是
–
cys
–
、
–
gly
–
、
–
ser
–
或
–
his
–
gly
–
。
[0306]
在通式1具有seq id no:12的情况下，xaa27可例外地是甲硫氨酸(met，m)。
[0307][0308]
所述药物组合物还可与乙酰辅酶a羧化酶(acc)抑制剂组合。
[0309][0310]
本发明的另一方面提供了(i)对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质或其长效缀合物与(ii)法尼醇x受体(fxr)激动剂的组合的治疗用途。
[0311][0312]
另一个具体实施方式提供了(i)对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质或其长效缀合物、(ii)fxr激动剂和(iii)乙酰辅酶a羧化酶(acc)抑制剂的组合的治疗用途。
[0313][0314]
另一个具体实施方式提供了用于预防或治疗肝病的药物组合物，其中组合了(i)三重激动长效缀合物或三重激动剂和(ii)fxr激动剂。
[0315][0316]
另一个具体实施方式提供了用于预防或治疗肝病的药物组合物，其中组合了(i)三重激动长效缀合物或三重激动剂、(ii)fxr激动剂和(iii)acc抑制剂。
[0317][0318]
具体地，本发明的一个方面提供了组合、药物组合物或套组，其包括对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)；和fxr激动剂。
[0319]
在一个具体实例中，包括所述三重激动剂或其长效缀合物；以及所述fxr激动剂的所述组合、药物组合物或套组可以是用于预防或治疗肝病的组合、药物组合物或套组。
[0320][0321]
所述组合还可包括acc抑制剂。在这种情况下，提供了包括对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)；fxr激动剂；以及acc抑制剂的组合、药物组合物或套组。在一个具体实例中，包括所述
三重激动剂或其长效缀合物；fxr激动剂；以及acc抑制剂的所述组合、药物组合物或套组可以是用于预防或治疗肝病的组合、药物组合物或套组。
[0322][0323]
如本文所用，术语“组合”旨在用于共同施用(a)对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)；和(b)fxr激动剂或(b
′
)fxr激动剂和acc抑制剂，并且可被理解为与“组合使用”同义。这种组合还包括特征在于所述三重激动长效缀合物或所述三重激动剂与所述fxr激动剂组合的药物组合物，或通过进一步将所述acc抑制剂加入到所述药物组合物中制备而成的组合物，但不限于此。在本发明中，共同施用(a)所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)；和(b)所述fxr激动剂可与“组合共同施用”或“组合施用”互换使用。共同施用(a)所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)；和(b
′
)所述fxr激动剂和所述acc抑制剂可与“三元组合共同施用”或“三元组合施用”互换使用。
[0324]
所述组合或药物组合物可以以下列形式施用，但不限于下列，
[0325]
a)作为(i)所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)和(ii)所述fxr激动剂的混合物，或作为(i)所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)、(ii)所述fxr激动剂和(iii)所述acc抑制剂的混合物；或者
[0326]
b)分离形式的(i)所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)和(ii)所述fxr激动剂，或分离形式的(i)所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)、(ii)所述fxr激动剂和(iii)所述acc抑制剂。
[0327]
当所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)和所述fxr激动剂以分离形式施用时，或当所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)、所述fxr激动剂和所述acc抑制剂以分离形式施用时，所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)和所述fxr激动剂；或所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)、所述fxr激动剂和所述acc抑制剂可单独配制并同时、单独、相继或以相反顺序施用。
[0328]
在本发明中，“共同施用”、“组合使用”和“组合”不仅是指其同时施用，而且可理解为以能够一起作用于个体使得a)(i)所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)和(ii)所述fxr激动剂；或b)(i)所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)、(ii)所述fxr激动剂和(iii)所述acc抑制剂以与所述(i)、(ii)和/或(iii)的天然功能相同或更高的水平发挥其功能的剂型施用。因此，当本文使用术语“组合使用”时，应理解这些组分同时、单独、相继或以相反顺序施用，并且施用顺序没有特别限制。当施用是相继、单独或以相反顺序执行时，施用顺序没有特别限制，但两个组分之间的间隔设定不应使组合使用的有益效果丧失。
可互换使用。三重激动剂可以是化学式1的组分z。
[0338]
所述肽包括对所述胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有显著的活性水平的各种物质，例如各种肽。
[0339]
尽管并不特别限于此，但对所述胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有显著的活性水平的三重激动剂与相应受体的天然配体(天然胰高血糖素、天然glp-1和天然gip)相比，可表现出约0.001％或更多、约0.01％或更多、约0.1％或更多、约1％或更多、约2％或更多、约3％或更多、约4％或更多、约5％或更多、约6％或更多、约7％或更多、约8％或更多、约9％或更多、约10％或更多、约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多、约90％或更多、约100％、约150％或更多或者约200％或更多的对所述胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体中的一种或多种，具体是两种或更多种受体，更具体是全部三种受体的体外活性，并且显著增加的范围非限制地包括在其中。
[0340]
这里，对所述受体的活性可包括，例如，与天然形式相比，所述体外活性为约0.001％或更多、0.01％或更多、0.1％或更多、1％或更多、2％或更多、3％或更多、4％或更多、5％或更多、6％或更多、7％或更多、8％或更多、9％或更多、10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多的情况。然而，这些实施方式不限于此。
[0341]
如本文所用，术语“约”是指包括
±
0.5、
±
0.4、
±
0.3、
±
0.2、
±
0.1等全部的范围，并且包括与紧接术语“约”之后的数值等同的数值或在类似范围内的数值全部，但不限于此。
[0342][0343]
测量所述三重激动剂的体外活性的方法将描述于本发明的实施例3中，而方法不限于此。
[0344]
同时，所述肽的特征在于具有下列i)至iii)活性中的一种或多种，两种或更多种活性，并且具体是全部三种活性，特别地其显著的活性水平：
[0345]
i)激活所述glp-1受体；ii)激活所述胰高血糖素受体；和iii)激活所述gip受体。
[0346]
在这方面，所述受体的激活可指代这样的情况，其中与天然形式相比，所述肽对所述受体的体外活性为约0.001％或更多、约0.1％或更多、约1％或更多、约2％或更多、约3％或更多、约4％或更多、约5％或更多、约6％或更多、约7％或更多、约8％或更多、约9％或更多、约10％或更多、约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多、约90％或更多、约100％或更多、约150％或更多、约200％或更多。然而，实施方式不限于此。
[0347]
另外，所述肽与天然glp-1、天然胰高血糖素和天然gip中的一种相比可具有增加的体内半衰期，但不限于此。
[0348]
尽管并不特别限制于此，但所述肽可以是非天然存在的肽。
[0349][0350]
所述肽可包括分子内桥(例如，共价交联或非共价交联)，并且具体是包括环的形式，例如，是在所述肽的第16位氨基酸和第20位氨基酸之间形成环的形式，但不限于此。作为具体实例，第16位氨基酸可以是谷氨酸，并且第20位氨基酸可以是赖氨酸，但不限于此。
[0351]
所述环的非限制性实例可包括内酰胺桥(或内酰胺环)。
[0352]
另外，所述肽包括所有那些对能够在目标位置处形成环的氨基酸进行修饰以具有环的肽。
[0353]
例如，所述肽可以是一对第16位和第20位的氨基酸被能够形成环的谷氨酸或赖氨酸取代的肽，但不限于此。
[0354]
所述环可在所述肽内的氨基酸侧链之间形成，例如内酰胺环可在赖氨酸侧链和谷氨酸侧链之间形成，但不限于此。
[0355]
由这些方法的组合所制备的肽的实例可包括对所述胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的肽，其中至少一个氨基酸序列与天然胰高血糖素的氨基酸序列不同，n端氨基酸残基的α-碳被去除，但不限于此。根据本发明的肽可通过组合用于制备类似物的各种方法来制备。
[0356]
此外，尽管并不限于此，但在本发明的肽中，一些氨基酸可被其它氨基酸或非天然化合物取代以避免被降解激动剂的酶识别来增加体内半衰期。
[0357]
具体地，所述肽可以是这样的肽：其体内半衰期通过取代所述肽的氨基酸序列中第2位氨基酸来避免被降解激动剂的酶识别得以增加，但避免被活生物体内降解激动剂的酶识别的任何氨基酸取代或修饰都可被非限制地包括。
[0358]
另外，用于制备所述肽的这种修饰包括利用l型或d型氨基酸和/或非天然氨基酸的全部修饰；和/或天然序列的修饰，如侧链官能团的修饰、分子内共价键合(例如，侧链之间的成环)、甲基化、酰基化、泛素化、磷酸化、氨基己烷化(aminohexanation)、生物素化等。
[0359]
另外，所述修饰可包括将一个或多个氨基酸添加到天然胰高血糖素的氨基端和/或羧基端。
[0360]
在取代或添加氨基酸时，不仅可以使用常见于人类蛋白质中的20种氨基酸，也可以使用非典型或非天然存在的氨基酸。非典型氨基酸的商业来源包括sigma-aldrich、chempep inc.和genzyme pharmaceuticals。包含这些氨基酸的肽以及典型肽序列可被合成和从商业供应商(例如，american peptide company、bachem或anygen(韩国))购买。
[0361]
可以以相同的方式获得氨基酸衍生物，并且作为一个实例，可以使用4-咪唑乙酸等。
[0362]
另外，根据本发明的肽可以是变体的形式，其中所述肽的n端和/或c端被化学修饰或被有机基团保护，或氨基酸可被添加到所述肽的末端，以保护其在活体内免受蛋白酶影响，同时增加其稳定性。
[0363]
特别地，由于化学合成肽的n端和c端是带电荷的，因此为了去除这些电荷，n端可被乙酰化和/或c端可被酰胺化，但实施方式不限于此。
[0364]
另外，根据本发明的肽包括所述肽本身、其盐(例如，所述肽的药学上可接受的盐)或其溶剂化物形式的所有肽。另外，所述肽可以是任何药学上可接受的形式。
[0365]
盐的种类没有特别限制。然而，盐优选是对个体(例如，哺乳动物)安全且有效的形式，但不限于此。
[0366]
术语“药学上可接受的”是指可以在不引起过度毒性、刺激性、过敏反应等的情况下在药物医学决策范围内有效地用于期望用途的物质。
[0367]
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指衍生自药学上可接受的无机酸、有机酸或碱的盐。合适的酸的实例可包括盐酸、溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、
乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、甲苯-对-磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。衍生自合适的碱的盐的可包括碱金属，如钠和钾；碱土金属，如镁；以及铵。
[0368]
此外，如本文所用，术语“溶剂化物”是指根据本发明的肽或其盐与溶剂分子之间形成的复合物。
[0369][0370]
在一个具体实施方式中，化学式1的肽(三重激动剂)或z可包含由下列通式1表示的氨基酸序列。
[0371]
xaa1
–
xaa2
–
xaa3
–
gly
–
thr
–
phe
–
xaa7
–
ser
–
asp
–
xaa10
–
ser
–
xaa12
–
xaa13
–
xaa14
–
xaa15
–
xaa16
–
xaa17
–
xaa18
–
xaa19
–
xaa20
–
xaa21
–
phe
–
xaa23
–
xaa24
–
trp
–
leu
–
xaa27
–
x aa28
–
xaa29
–
xaa30
–
r1(通式1，seq id no:103)。
[0372]
在上述通式1中，
[0373]
xaa1是组氨酸、4-咪唑乙酰基或酪氨酸，
[0374]
xaa2是甘氨酸、α-甲基-谷氨酸或aib，
[0375]
xaa3是谷氨酸或谷氨酰胺，
[0376]
xaa7是苏氨酸或异亮氨酸，
[0377]
xaa10是亮氨酸、酪氨酸、赖氨酸、半胱氨酸或缬氨酸，
[0378]
xaa12是赖氨酸、丝氨酸或异亮氨酸，
[0379]
xaa13是谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸或半胱氨酸，
[0380]
xaa14是亮氨酸、甲硫氨酸或酪氨酸，
[0381]
xaa15是半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或亮氨酸，
[0382]
xaa16是甘氨酸、谷氨酸或丝氨酸，
[0383]
xaa17是谷氨酰胺、精氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、半胱氨酸或赖氨酸，
[0384]
xaa18是丙氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或组氨酸，
[0385]
xaa19是丙氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或缬氨酸，
[0386]
xaa20是赖氨酸、谷氨酰胺或精氨酸，
[0387]
xaa21是谷氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、半胱氨酸或天冬氨酸，
[0388]
xaa23是异亮氨酸或缬氨酸，
[0389]
xaa24是丙氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸或谷氨酸，
[0390]
xaa27是缬氨酸、亮氨酸或赖氨酸，
[0391]
xaa28是半胱氨酸、赖氨酸、丙氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸，
[0392]
xaa29是半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、谷氨酸或组氨酸，
[0393]
xaa30是半胱氨酸、甘氨酸、赖氨酸或组氨酸或不存在，并且
[0394]
r1是半胱氨酸、gkkndwkhnit(seq id no:106)、m
–
ssgappps
–
n(seq id no:107)或m
–
ssgqppps
–
n(seq id no:108)或不存在，
[0395]
其中
[0396]
m是
–
cys
–
、
–
pro
–
或
–
gly
–
pro
–
，并且
[0397]
n是
–
cys
–
、
–
gly
–
、
–
ser
–
或
–
his
–
gly
–
或不存在。
[0398]
在通式1具有seq id no:12的情况下，xaa27可例外地是甲硫氨酸。
[0399]
化学式1的三重激动剂或z的实例可以是包含选自seq id no:1至102的氨基酸序列的肽、包含选自seq id no:1至11和13至102的氨基酸序列的肽或(主要)由选自seq id no:1至11和13至102的氨基酸序列组成的肽，但不限于此。
[0400]
作为另一个实例，化学式1的三重激动剂或z可以是肽，其包含选自seq id no:21、22、42、43、50、64、66、67、70、71、76、77、96、97和100的氨基酸序列或(主要)由其组成，但不限于此。
[0401]
作为另一个实例，化学式1的三重激动剂或z可以是肽，其包含选自seq id no:21、22、42、43、50、66、67、77、96、97和100的氨基酸序列或(主要)由其组成，但不限于此。
[0402]
作为另一个实例，化学式1的三重激动剂或z可以是肽，其包含选自seq id no:21、22、42、43、50、77和96的氨基酸序列或(主要)由其组成，但不限于此。
[0403]
此外，尽管在本发明中被描述为“由某seq id no:组成的肽”，但这种描述不排除可能天然发生的突变或在所述seq id no的氨基酸序列的上游或下游添加无意义序列而发生的突变或其沉默突变，只要所述肽具有与由所述氨基酸序列组成的肽相同或等同的活性即可，并且即使这种序列添加或突变存在时，其也显然属于本发明的范围。也就是说，序列中的任何局部差异都可落入本发明的范围内，只要所述肽具有一定水平或更高的同源性并且对所述胰高血糖素受体、所述glp-1受体和/或所述gip受体具有活性即可。
[0404]
例如，关于本发明的肽，参见wo 2017-116204和wo 2017-116205。
[0405]
以上给出的描述也可适用于本发明的其它具体实施方式或方面，但不限于此。
[0406]
具体地，在上述通式1中，xaa14可以是亮氨酸或甲硫氨酸，xaa15可以是半胱氨酸、天冬氨酸或亮氨酸。
[0407]
所述肽的实例可包括包含选自seq id no:1至11、14至17和21至102的氨基酸序列或(主要)由其组成的肽，但不限于此。
[0408]
所述肽可以是显著激活所述胰高血糖素受体、所述glp-1受体和所述gip受体中至少一种的肽，但不限于此。具体地，所述肽可以是显著激活所述glp-1受体或进一步显著激活所述胰高血糖素受体和/或gip受体的肽，但不限于此。
[0409]
作为一个具体实例，
[0410]
在上述通式1中，
[0411]
xaa2是甘氨酸、α-甲基-谷氨酸或aib，
[0412]
xaa7是苏氨酸，
[0413]
xaa10是酪氨酸、半胱氨酸或缬氨酸，
[0414]
xaa12是赖氨酸或异亮氨酸，
[0415]
xaa13是酪氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺或半胱氨酸，
[0416]
xaa14是亮氨酸、酪氨酸或甲硫氨酸，
[0417]
xaa15是半胱氨酸、亮氨酸、谷氨酸或天冬氨酸，
[0418]
xaa17是谷氨酰胺、精氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸、谷氨酸或赖氨酸，
[0419]
xaa18是丙氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或组氨酸，
[0420]
xaa19是丙氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸或半胱氨酸，
[0421]
xaa20是赖氨酸、精氨酸或谷氨酰胺，
[0422]
xaa21是谷氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、半胱氨酸或天冬氨酸，
[0423]
xaa23是异亮氨酸或缬氨酸，
[0424]
xaa24是半胱氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸或天冬氨酸，并且
[0425]
xaa27是亮氨酸或赖氨酸，但不限于此。
[0426][0427]
作为另一个具体实例，
[0428]
在上述通式1中，
[0429]
xaa2是甘氨酸、α-甲基-谷氨酸或aib，
[0430]
xaa7是苏氨酸，
[0431]
xaa10是酪氨酸、半胱氨酸或缬氨酸，
[0432]
xaa12是赖氨酸或异亮氨酸，
[0433]
xaa13是酪氨酸、丙氨酸或半胱氨酸，
[0434]
xaa14是亮氨酸或甲硫氨酸，
[0435]
xaa15是半胱氨酸或天冬氨酸，
[0436]
xaa17是谷氨酰胺、精氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸或赖氨酸，
[0437]
xaa18是丙氨酸、精氨酸或组氨酸，
[0438]
xaa19是丙氨酸、谷氨酰胺或半胱氨酸，
[0439]
xaa20是赖氨酸或谷氨酰胺，
[0440]
xaa21是谷氨酸、半胱氨酸或天冬氨酸，
[0441]
xaa23是缬氨酸，
[0442]
xaa24是丙氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸，并且
[0443]
xaa27是亮氨酸或赖氨酸，但不限于此。
[0444][0445]
作为另一个具体实例，
[0446]
在上述通式1中，
[0447]
xaa2是α-甲基-谷氨酸或aib，
[0448]
xaa7是苏氨酸，
[0449]
xaa10是酪氨酸或半胱氨酸，
[0450]
xaa12是赖氨酸或异亮氨酸，
[0451]
xaa13是酪氨酸、丙氨酸或半胱氨酸，
[0452]
xaa14是亮氨酸或甲硫氨酸，
[0453]
xaa15是半胱氨酸或天冬氨酸，
[0454]
xaa16是谷氨酸，
[0455]
xaa17是精氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸或赖氨酸，
[0456]
xaa18是丙氨酸、精氨酸或组氨酸，
[0457]
xaa19是丙氨酸、谷氨酰胺或半胱氨酸，
[0458]
xaa20是赖氨酸或谷氨酰胺，
[0459]
xaa21是谷氨酸或天冬氨酸，
[0460]
xaa23是缬氨酸，
[0461]
xaa24是谷氨酰胺、天冬酰胺或天冬氨酸，
[0462]
xaa27是亮氨酸，并且
[0463]
xaa28是半胱氨酸、丙氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸。
[0464][0465]
作为另一个具体实例，
[0466]
在上述通式1中，
[0467]
xaa1是组氨酸或4-咪唑乙酰基，
[0468]
xaa2是α-甲基-谷氨酸或aib，
[0469]
xaa3是谷氨酰胺，
[0470]
xaa7是苏氨酸，
[0471]
xaa10是酪氨酸，
[0472]
xaa12是异亮氨酸，
[0473]
xaa13是丙氨酸或半胱氨酸，
[0474]
xaa14是甲硫氨酸，
[0475]
xaa15是天冬氨酸，
[0476]
xaa16是谷氨酸，
[0477]
xaa17是异亮氨酸或赖氨酸，
[0478]
xaa18是丙氨酸或组氨酸，
[0479]
xaa19是谷氨酰胺或半胱氨酸，
[0480]
xaa20是赖氨酸，
[0481]
xaa21是天冬氨酸，
[0482]
xaa23是缬氨酸，
[0483]
xaa24是天冬酰胺，
[0484]
xaa27是亮氨酸，
[0485]
xaa28是丙氨酸或天冬酰胺，
[0486]
xaa29是谷氨酰胺或苏氨酸，并且
[0487]
xaa30是半胱氨酸或赖氨酸，或不存在。
[0488][0489]
作为另一个具体实例，
[0490]
在上述通式1中，
[0491]
xaa2是甘氨酸、α-甲基-谷氨酸或aib，
[0492]
xaa3是谷氨酰胺，
[0493]
xaa7是苏氨酸，
[0494]
xaa10是酪氨酸、半胱氨酸或缬氨酸，
[0495]
xaa12是赖氨酸，
[0496]
xaa13是酪氨酸，
[0497]
xaa14是亮氨酸，
[0498]
xaa15是天冬氨酸，
[0499]
xaa16是甘氨酸、谷氨酸或丝氨酸，
[0500]
xaa17是谷氨酰胺、精氨酸、半胱氨酸或赖氨酸，
[0501]
xaa18是丙氨酸、精氨酸或组氨酸，
[0502]
xaa19是丙氨酸或谷氨酰胺，
[0503]
xaa20是赖氨酸或谷氨酰胺，
[0504]
xaa21是谷氨酸、半胱氨酸或天冬氨酸，
[0505]
xaa23是缬氨酸，
[0506]
xaa24是丙氨酸、谷氨酰胺或半胱氨酸，
[0507]
xaa27是亮氨酸或赖氨酸，并且
[0508]
xaa29是甘氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸或组氨酸，但不限于此。
[0509]
所述肽可以是具有显著的激活所述glp-1受体和所述胰高血糖素受体的能力以及更高的激活所述gip受体的能力的肽；具有显著的激活全部所述glp-1受体、所述胰高血糖素受体和所述gip受体的能力的肽；或具有显著的激活所述glp-1受体和所述gip受体的能力以及更高的激活所述胰高血糖素受体的能力的肽，但不限于此。
[0510]
所述肽的实例可以是包含选自seq id no:8、9、21至37、39、42、43、49至61、64至83、85、86、88、89、91至93以及95至102的氨基酸序列或(主要)由其组成的肽，但不限于此。
[0511]
在一个具体实施方式中，所述肽可包含由下列通式2表示的氨基酸序列。
[0512]
xaa1
–
xaa2
–
gln
–
gly
–
thr
–
phe
–
thr
–
ser
–
asp
–
xaa10
–
ser
–
lys
–
xaa13
–
xaa14
–
xaa15
–
xaa16
–
xaa17
–
xaa18
–
xaa19
–
xaa20
–
xaa21
–
phe
–
xaa23
–
xaa24
–
trp
–
leu
–
leu
–
xaa28
–
xa a29
–
xaa30
–
xaa31
–
ser
–
ser
–
gly
–
gln
–
pro
–
pro
–
pro
–
ser
–
xaa40(通式2，seq id no:104)。
[0513]
在上述通式2中，
[0514]
xaa1是4-咪唑乙酰基、组氨酸或酪氨酸；
[0515]
xaa2是甘氨酸、α-甲基-谷氨酸或aib
[0516]
xaa10是酪氨酸或半胱氨酸；
[0517]
xaa13是丙氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸或半胱氨酸；
[0518]
xaa14是亮氨酸、甲硫氨酸或酪氨酸；
[0519]
xaa15是天冬氨酸、谷氨酸或亮氨酸；
[0520]
xaa16是甘氨酸、谷氨酸或丝氨酸；
[0521]
xaa17为谷氨酰胺、精氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、半胱氨酸或赖氨酸；
[0522]
xaa18是丙氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或组氨酸；
[0523]
xaa19是丙氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或缬氨酸；
[0524]
xaa20是赖氨酸、谷氨酰胺或精氨酸；
[0525]
xaa21是半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸或天冬氨酸；
[0526]
xaa23是异亮氨酸或缬氨酸；
[0527]
xaa24是半胱氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或谷氨酸；
[0528]
xaa28是赖氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸；
[0529]
xaa29是甘氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或组氨酸；
[0530]
xaa30是半胱氨酸、甘氨酸、赖氨酸或组氨酸；
[0531]
xaa31是脯氨酸或半胱氨酸；并且
[0532]
xaa40是半胱氨酸或不存在。
no:114)、pssgapppss(seq id no:115)、pssgqppps(seq id no:116)或pssgqpppsc(seq id no:117)，或者可以不存在，但不限于此。
[0565]
另外，本发明的肽可根据长度通过本领域公知的方法(例如，通过自动肽合成仪)合成，并且可通过基因工程技术生产。
[0566]
具体地，本发明的肽可通过标准合成方法、重组表达系统或本领域已知的任何其它方法来制备。因此，根据本发明的肽可通过多种方法合成，包括下列方法：
[0567]
(a)通过固相或液相法以逐步或片段组装方式合成肽，然后分离和纯化最终肽产物的方法；
[0568]
(b)在宿主细胞中表达编码肽的核酸构建体并从宿主细胞培养物回收表达产物的方法；
[0569]
(c)进行编码肽的核酸构建体的体外无细胞表达并从中回收表达产物的方法；或
[0570]
通过方法(a)、(b)和(c)的任意组合获得肽片段，通过连接肽片段获得肽，然后回收肽的方法。
[0571][0572]
同时，所述三重激动长效缀合物或三重激动剂可以是非天然存在的。
[0573]
在本发明的一个具体实施方式中，所述三重激动长效缀合物可以是由上述化学式1表示的缀合物，但不限于此。
[0574]
具体地，将描述化学式1。
[0575]
[化学式1]
[0576]z–
l
x
–
fc
[0577]
在化学式1中，l
x
是包括乙二醇重复单元的连接体，并且x是0或自然数，
[0578]
fc是免疫球蛋白fc区，
[0579]
–
分别表示l
x
和z之间以及fc和l
x
之间的共价键，并且
[0580]
z如上所述。z可指代三重激动剂。
[0581][0582]
在所述缀合物中，fc是能够增加z的半衰期的物质，即对所述胰高血糖素受体、所述glp-1受体和所述gip受体具有活性的肽，对应于构成本发明缀合物的部分的组分。
[0583]
fc和z可通过共价化学键或非化学键相互连接。通过共价化学键、非共价化学键或其任意组合，fc可通过l
x
与z连接。
[0584]
fc可直接与z连接(即化学式1中x为0)，或通过连接体(l
x
)连接。
[0585]
具体地，l
x
可以是非肽基连接体，例如包括乙二醇重复单元的连接体。
[0586][0587]
在本发明中，“非肽基连接体”包括两个或更多个重复单元连接的生物相容性聚合物。重复单元通过非肽键的任意共价键彼此连接。所述非肽基连接体可以是构成本发明缀合物的部分的组分并且对应于化学式1中的l
x
。
[0588]
在l
x
中，x可以是1或更大。当x是2或更大时，每个l可以是独立的。
[0589]
在本发明中，在活体中对蛋白酶具有抗性的任何聚合物都可无限制地用作非肽基连接体。在本发明中，所述非肽基连接体可与非肽基聚合物互换使用。
[0590]
尽管并不特别限于此，但所述非肽基连接体可以是包括乙二醇重复单元(例如，聚
乙二醇)的连接体，以及本领域公知且在本发明范围内本领域技术水平上容易制备的其任意衍生物。
[0591]
所述非肽基连接体的重复单元可以是乙二醇重复单元，具体地，所述非肽基连接体可包括乙二醇重复单元和在其一端处用于制备所述缀合物的官能团。在根据本发明的长效缀合物中，z可通过所述官能团与fc连接，但不限于此。在本发明中，所述非肽基连接体可以包括两个、三个或更多个官能团，这些官能团可以相同或不同，但不限于此。
[0592]
具体地，所述连接体可以是由下列化学式2表示的聚乙二醇(peg)，但不限于此。
[0593]
[化学式2]
[0594][0595]
在化学式2中，n是从10至2400，n是从10至480，或n是从50至250，但不限于此。
[0596]
所述长效缀合物，peg部分可以不仅包括
–
(ch2ch2o)n–
结构，还包括插入在连接元件和
–
(ch2ch2o)n–
结构之间的氧原子，但不限于此。
[0597]
此外，在具体实施方式中，所述缀合物可具有这样的结构，其中包含通式1的氨基酸序列或seq id no:1至102的氨基酸序列之一的肽(z)经由包括乙二醇重复单元的连接体通过共价键连接至免疫球蛋白fc区(fc)，但不限于此。
[0598][0599]
所述聚乙二醇是这样的术语，其包括乙二醇均聚物、peg共聚物和单甲基取代的peg聚合物(mpeg)的所有形式，但不限于此。
[0600]
作为具体实例，所述乙二醇重复单元可由[och2ch2]n表示，并且作为自然数的n可被确定使得所述肽缀合物中[och2ch2]n区域的平均分子量，例如数均分子量大于0且小于约100kda，但不限于此。作为另一个实例，作为自然值的n可被确定使得所述肽缀合物的[och2ch2]n区域的平均分子量，例如数均分子量为约1kda至约100kda、约1kda至约80kda、约1kda至约50kda、约1kda至约30kda、约1kda至约25kda、约1kda至约20kda、约1kda至约15kda、约1kda至约13kda、约1kda至约11kda、约1kda至约10kda、约1kda至约8kda、约1kda至约5kda、约1kda至约3.4kda、约3kda至约30kda、约3kda至约27kda、约3kda至约25kda、约3kda至约22kda、约3kda至约20kda、约3kda至约18kda、约3kda至约16kda、约3kda至约15kda、约3kda至约13kda、约3kda至约11kda、约3kda至约10kda、约3kda至约8kda、约3kda至约5kda、约3kda至约3.4kda、约8kda至约30kda、约8kda至约27kda、约8kda至约25kda、约8kda至约22kda、约8kda至约20kda、约8kda至约18kda、约8kda至约16kda、约8kda至约15kda、约8kda至约13kda、约8kda至约11kda、约8kda至约10kda、约9kda至约15kda、约9kda至约14kda、约9kda至约13kda、约9kda至约12kda、约9kda至约11kda、约9.5kda至约10.5kda或约10kda，但不限于此。
[0601]
在本发明中，包括在活体内对蛋白酶具有抗性的乙二醇重复单元的任何聚合物都可非限制地用作非肽基连接体。所述非肽基聚合物的分子量可在大于0kd且小于约100kda的范围内，约1kda至约100kda的范围，具体地约1kda至约20kda的范围或约1kda至约10kda的范围，但不限于此。另外，连接至对应于fc的多肽的本发明的非肽基连接体不仅可包括单一种类的聚合物，而且可包括不同种类的聚合物的组合。
[0602]
在具体实施方式中，所述非肽基连接体的两端可连接至fc(例如，所述免疫球蛋白fc区)的胺基、硫醇基或羟基和z的胺基、硫醇基、叠氮基或羟基，但不限于此。
[0603]
具体地，所述非肽基聚合物可在两端包括分别与fc(例如免疫球蛋白fc区)和z连接的反应性基团，具体是与所述免疫球蛋白fc区的半胱氨酸的硫醇基；n端、赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和/或组氨酸的胺基；和/或c端的羟基连接的反应性基团，和与z的半胱氨酸的硫醇基；赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和/或组氨酸的胺基；叠氮赖氨酸(azidolysine)的叠氮基；和/或羟基连接的反应性基团，但不限于此。
[0604]
在一个具体实施方式中，所述非肽基连接体的两端可分别连接至fc(例如所述免疫球蛋白fc区)的胺基或硫醇基，和z的胺基或硫醇基。
[0605]
具体地，所述非肽基聚合物可在两端包括分别与fc(例如，免疫球蛋白fc区)和z连接的反应性基团，具体是z或fc(例如，免疫球蛋白fc区)的n端或赖氨酸的胺基和半胱氨酸的硫醇基连接的反应性基团，但不限于此。
[0606]
此外，与fc(即免疫球蛋白fc区)和z连接的非肽基聚合物的反应性基团可选自醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物，但不限于此。
[0607]
在以上描述中，所述醛基可以是丙醛基或丁醛基，但不限于此。
[0608]
在以上描述中，所述琥珀酰亚胺衍生物可以是琥珀酰亚胺戊酸酯、琥珀酰亚胺甲基丁酸酯、琥珀酰亚胺甲基丙酸酯、琥珀酰亚胺丁酸酯、琥珀酰亚胺丙酸酯、n-羟基琥珀酰亚胺、羟基琥珀酰亚胺基、琥珀酰亚胺基羧基甲基或琥珀酰亚胺基碳酸酯，但不限于此。
[0609]
所述非肽基连接体可通过转化为非肽基连接体单元的反应性基团与z和fc连接，但不限于此。
[0610]
此外，经由醛键通过还原性胺化生成的最终产物比经由酰胺键形成的要更稳定。醛反应性基团选择性地在低ph下与n端反应，同时在高ph(例如，在ph 9.0)下与赖氨酸残基形成共价键。
[0611]
此外，所述非肽基连接体两端的反应性基团可以相同或不同，例如，一端可提供马来酰亚胺基团，而另一端可提供醛基、丙醛基或丁醛基。然而，这些反应性基团并不特别限于此，只要fc(具体是所述免疫球蛋白fc区)和z可与所述非肽基连接体的相应端连接即可。
[0612]
例如，所述非肽基连接体可在一端包括马来酰亚胺基作为反应性基团，而在另一端包括醛基、丙醛基或丁醛基作为反应性基团。
[0613]
当两端均具有反应性羟基的聚乙二醇用作所述非肽基聚合物时，可通过已知的化学反应将羟基激活为各种反应性基团，或者通过利用具有修饰的反应性基团的商业可获得的聚乙二醇来制备根据本发明的长效缀合物。
[0614]
在一个具体实施方式中，所述非肽基聚合物可与z的半胱氨酸残基，更具体是半胱氨酸的
–
sh基团连接，但不限于此。
[0615][0616]
例如，所述非肽基聚合物可连接至与z对应的肽的第10位半胱氨酸残基、第13位半胱氨酸残基、第15位半胱氨酸残基、第17位半胱氨酸残基、第19位半胱氨酸残基、第21位半胱氨酸残基、第24位半胱氨酸残基、第28位半胱氨酸残基、第29位半胱氨酸残基、第30位半胱氨酸残基、第31位半胱氨酸残基、第40位半胱氨酸残基或第41位半胱氨酸残基，而不限于此。
[0617]
具体地，所述非肽基聚合物的反应性基团可连接至所述半胱氨酸残基的
–
sh基团，并且反应性基团如上所述。在采用马来酰亚胺
–
peg
–
醛时，马来酰亚胺基可通过硫醚键与z的
–
sh基团连接，而醛基可通过还原胺化与fc(具体是所述免疫球蛋白fc区)的
–
nh2基团连接，但这只是一个实例，而本发明不限制于此。
[0618]
位于所述peg部分——是一种非肽基聚合物——一端的氧原子经由还原烷基化，通过具有
–
ch2ch2ch2–
结构的连接体官能团与所述免疫球蛋白fc区的n端氨基连接，以形成
–
peg
–o–
ch2ch2ch2nh
–
免疫球蛋白fc结构。所述peg部分的另一端可通过硫醚键与位于包含通式1的氨基酸序列或seq id no:1至102的氨基酸序列之一的肽的半胱氨酸处的硫原子连接。上述硫醚键可具有结构。
[0619]
然而，该实施方式不限于上述那些，而仅仅是一个实例。
[0620]
在另一个具体实施方式中，所述非肽基聚合物可连接至z的赖氨酸残基，更具体地，赖氨酸的氨基，但不限于此。
[0621]
此外，在所述缀合物中，所述非肽基聚合物的反应性基团可连接至位于所述免疫球蛋白fc区的n端的
–
nh2基团，但这仅仅是一个实例。
[0622]
此外，在所述缀合物中，所述肽可通过c端与具有反应性基团的连接体连接，但这仅仅是一个实例。
[0623]
在本发明中，“c端”是指肽的羧基端，鉴于本发明的目的，表示用于连接连接体的位点。例如，c端不仅可包括c端的最后一个氨基酸残基，还可包括c端附近的氨基酸残基，具体地，从最后一个氨基酸起上至第20位氨基酸残基的氨基酸残基，但不限于此。
[0624][0625]
同时，fc可以是免疫球蛋白fc区，更具体地，所述免疫球蛋白fc区可衍生自igg，不限于此。
[0626]
如本文所用，术语“免疫球蛋白fc区”是指包括重链恒定区2(ch2)和/或重链恒定区3(ch3)，不包括免疫球蛋白的重链和轻链可变区的区域。所述免疫球蛋白fc区可以是构成本发明缀合物的部分的组分。所述免疫球蛋白fc区可与“免疫球蛋白fc片段”互换使用。
[0627]
在整个说明书中，所述fc区不仅包括通过免疫球蛋白的木瓜蛋白酶消化而获得的天然序列，还包括其衍生物，例如，不同于该天然序列且一个或多个氨基酸残基通过缺失、插入、非保守或保守取代或其组合进行修饰所获得的序列。
[0628]
fc可具有这样的结构：两个多肽链通过二硫键彼此连接，其中该键合是通过这两个链中仅一条链的氮原子形成的，但不限于此。通过所述氮原子进行的键合可经由还原胺化赖氨酸的ε氨基或n端氨基形成。
[0629]
还原胺化是指这样的反应：其中一个反应物的胺基或氨基与另一反应物的醛基(能够参与还原胺化的官能团)反应产生胺，然后通过还原形成胺键——作为本领域公知的
有机合成反应。
[0630]
作为一个具体实例，fc可通过n端脯氨酸的氮原子连接，但不限于此。
[0631]
作为构成本发明化学式1的缀合物的部分的组分，所述免疫球蛋白fc区可具体对应于上示化学式1中的fc。
[0632][0633]
所述免疫球蛋白fc区可包括重链恒定区中的铰链区，但不限于此。
[0634]
在本发明中，所述免疫球蛋白fc区可在n端包括特定的铰链序列。
[0635]
如本文所用，术语“铰链序列”是指位于重链且通过间二硫键(inter disulfide bond)形成所述免疫球蛋白fc区的二聚体的位点。
[0636]
在本发明中，所述铰链序列可通过缺失所述铰链序列的一部分(包括下列氨基酸序列)而突变为具有一个半胱氨酸残基，但不限于此。
[0637]
glu
–
ser
–
lys
–
tyr
–
gly
–
pro
–
pro
–
cys
–
pro
–
ser
–
cys
–
pro(seq id no:118)。
[0638]
所述铰链序列可包括一个半胱氨酸残基，因为第8或11位的半胱氨酸残基从seq id no:118的铰链序列中缺失。本发明的铰链序列可由3至12个氨基酸组成，仅包括一个半胱氨酸残基，但不限于此。更具体地，本发明的铰链序列可具有下列序列：glu
–
ser
–
lys
–
tyr
–
gly
–
pro
–
pro
–
pro
–
ser
–
cys
–
pro(seq id no:119)、glu
–
ser
–
lys
–
tyr
–
gly
–
pro
–
pro
–
cys
–
pro
–
ser
–
pro(seq id no:120)、glu
–
ser
–
lys
–
tyr
–
gly
–
pro
–
pro
–
cys
–
pro
–
ser(seq id no:121)、glu
–
ser
–
lys
–
tyr
–
gly
–
pro
–
pro
–
cys
–
pro
–
pro(seq id no:122)、lys
–
tyr
–
gly
–
pro
–
pro
–
cys
–
pro
–
ser(seq id no:123)、glu
–
ser
–
lys
–
tyr
–
gly
–
pro
–
pro
–
cys(seq id no:124)、glu
–
lys
–
tyr
–
gly
–
pro
–
pro
–
cys(seq id no:125)、glu
–
ser
–
pro
–
ser
–
cys
–
pro(seq id no:126)、glu
–
pro
–
ser
–
cys
–
pro(seq id no:127)、pro
–
ser
–
cys
–
pro(seq id no:128)、glu
–
ser
–
lys
–
tyr
–
gly
–
pro
–
pro
–
ser
–
cys
–
pro(seq id no:129)、lys
–
tyr
–
gly
–
pro
–
pro
–
pro
–
ser
–
cys
–
pro(seq id no:130)、glu
–
ser
–
lys
–
tyr
–
gly
–
pro
–
ser
–
cys
–
pro(seq id no:131)、glu
–
ser
–
lys
–
tyr
–
gly
–
pro
–
pro
–
cys(seq id no:132)、lys
–
tyr
–
gly
–
pro
–
pro
–
cys
–
pro(seq id no:133)、glu
–
ser
–
lys
–
pro
–
ser
–
cys
–
pro(seq id no:134)、glu
–
ser
–
pro
–
ser
–
cys
–
pro(seq id no:135)、glu
–
pro
–
ser
–
cys(seq id no:136)和ser
–
cys
–
pro(seq id no:137)。
[0639]
更具体地，所述铰链序列可包括seq id no:128(pro
–
ser
–
cys
–
pro)或seq id no:137(ser
–
cys
–
pro)的氨基酸序列，但不限于此。
[0640]
本发明的免疫球蛋白fc区可以是在所述铰链序列存在的情况下所述免疫球蛋白fc区的两个链分子形成的二聚体的形式，并且根据本发明的由化学式1表示的缀合物可以是连接体一端连接到二聚体免疫球蛋白fc区的一个链的形式，但不限于此。
[0641]
如本文所用，术语“n端”是指蛋白质或多肽的氨基端，并且可包括位于该氨基端末端的氨基酸残基或从该氨基端末端起1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸。本发明的免疫球蛋白fc区可在n端包括铰链序列，但不限于此。
[0642][0643]
此外，本发明的免疫球蛋白fc区可以是延伸的fc区，其包括重链恒定区1(ch1)和/或轻链恒定区1(cl1)的部分或全部，不包括免疫球蛋白的重链和轻链可变区，只要所述免疫球蛋白fc区具有与其天然型基本上相同或增强的效果即可。此外，所述免疫球蛋白fc区
可以是对应于ch2和/或ch3的氨基酸序列的相对长的部分被去除的区域。
[0644]
例如，本发明的免疫球蛋白fc区可包括1)ch1结构域、ch2结构域、ch3结构域和ch4结构域；2)ch1结构域和ch2结构域；3)ch1结构域和ch3结构域；4)ch2结构域和ch3结构域；5)选自ch1结构域、ch2结构域、ch3结构域和ch4结构域中的一个或多个结构域与免疫球蛋白铰链区(或部分铰链区)的组合；或6)重链恒定区中的各结构域与轻链恒定区的二聚体，但不限于此。
[0645]
此外，作为一个具体实例，所述免疫球蛋白fc区可以是二聚体形式，并且一个z分子以二聚体形式共价连接至一个免疫球蛋白fc区。在这种情况下，所述免疫球蛋白fc可通过包括乙二醇重复单元的连接体与z共价连接。同时，两个z分子也可以以二聚体形式对称连接至一个免疫球蛋白fc区。在这种情况下，所述免疫球蛋白fc区可通过包括乙二醇重复单元的连接体与z连接。然而，该实施方式不限于上述实例。在该实施方式的一个具体实例中，z可通过连接体l
x
共价连接至fc区二聚体的两条多肽链中的仅一条上。例如，只有一个z分子可通过连接体l
x
与fc区二聚体的两条多肽链之一共价连接。例如，fc可以是同型二聚体。
[0646]
在另一个具体实例中，fc，即所述免疫球蛋白fc区，是由两条多肽链形成的二聚体的形式，而l
x
的一端仅与两条多肽链中的一条连接，但不限于此。
[0647][0648][0649]
此外，本发明的免疫球蛋白fc区不仅包括天然氨基酸序列，还包括其序列衍生物。氨基酸序列衍生物是由于一个或多个氨基酸残基的缺失、添加、非保守或保守取代或其任意组合而与其天然氨基酸序列不同的序列。
[0650]
例如，在igg fc中，已知对于键合重要的第214至238、297至299、318至322或327至331位氨基酸残基可用作适于修饰的位点。
[0651]
此外，其它各种类型的衍生物也是可能的，这些衍生物包括其中能够形成二硫键的区域缺失或者某些氨基酸残基从天然fc形式的n端去除，并且甲硫氨酸残基被添加至其的衍生物。此外，为了去除效应物功能，缺失可发生在补体结合位点(如c1q结合位点)以及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)位点中。制备此类免疫球蛋白fc区的序列衍生物的技术被公开在国际专利公开号wo 97/34631和wo 96/32478中。
[0652]
蛋白质或肽中不改变分子整体活性的氨基酸交换(取代，exchanges)在本领域中是已知的(h.neurath,r.l.hill,the proteins,academic press,new york,1979)。最常发生的交换是双向ala/ser、val/ile、asp/glu、thr/ser、ala/gly、ala/thr、ser/asn、ala/val、ser/gly、thy/phe、ala/pro、lys/arg、asp/asn、leu/ile、leu/val、ala/glu和asp/gly。如果需要，则fc区可通过磷酸化、硫酸化、丙烯酸化(acrylation)、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化和酰胺化进行修饰。
[0653]
上述fc衍生物是具有与本发明的fc区等同的生物学活性或对热、ph等具有改善的结构稳定性的衍生物。
[0654]
此外，这些fc区可从分离自人类和其它动物(包括牛、山羊、猪、小鼠、兔子、仓鼠、大鼠和豚鼠)的天然形式获得，或者可以是从转化的动物细胞或微生物获得的重组体或其衍生物。在这方面，它们可通过从人体或动物体分离整个免疫球蛋白并用蛋白水解酶处理
它们，从天然免疫球蛋白获得这些fc区。木瓜蛋白酶将天然免疫球蛋白消化成fab和fc区，而胃蛋白酶将天然免疫球蛋白消化成pf
′
c和f(ab)2片段。这些片段可经历尺寸排阻色谱法以分离fc和pf
′
c。在更具体的实例中，人源fc区是获自微生物的重组免疫球蛋白fc区。
[0655]
此外，所述免疫球蛋白fc区可具有天然聚糖或与天然型相比增加或减少的聚糖，或是去糖基化的形式。所述免疫球蛋白fc的聚糖的增加、减少或去除可通过本领域常用的任意方法如化学法、酶促法和使用微生物的基因工程法实现。在这方面，通过去除聚糖所获得的免疫球蛋白fc区显示补体c1q结合亲和力显著降低以及抗体依赖性细胞毒性或补体依赖性细胞毒性降低或丧失，并因此不会在活生物体内引起不必要的免疫反应。在此基础上，鉴于本发明的目的，去糖基化的或非糖基化(aglycosylated)的免疫球蛋白fc区可能更适合作为药物载体。
[0656]
如本文所用，术语“去糖基化”指代用酶去除了聚糖的fc区，而术语“非糖基化”指代未被糖基化且在原核生物(更具体地在大肠杆菌(e.coli.))中产生的fc区。
[0657]
同时，所述免疫球蛋白fc区可衍生自人类或动物如牛、山羊、猪、小鼠、兔子、仓鼠、大鼠活豚鼠等。在更具体的实施方式中，所述免疫球蛋白fc区可衍生自人类。
[0658]
另外，所述免疫球蛋白fc区可衍生自igg、iga、igd、ige或igm或其任意组合或杂合体(hybrid)。在更具体的实施方式中，所述免疫球蛋白fc区衍生自igg或igm——人类血液中最丰富的蛋白质，而在甚至更具体的实施方式中，其衍生自igg——已知增加配体结合蛋白的半衰期。在还甚至更具体的实施方式中，所述免疫球蛋白fc区是igg4 fc区，而在最具体的实施方式中，所述免疫球蛋白fc区是衍生自人igg4的非糖基化的fc区，但不限于此。
[0659]
另外，在具体实施方式中，所述免疫球蛋白fc片段可以是人igg4 fc片段，同型二聚体形式，其中两个单体通过在半胱氨酸——各单体的第3位氨基酸——之间形成的二硫键(链间)彼此连接。在这方面，同型二聚体的各单体具有或可以具有独立的两个内二硫键(链内)，即在第35和95位半胱氨酸之间形成的二硫键以及在第141和199位半胱氨酸之间形成的二硫键。各单体可由221个氨基酸组成，并且构成同型二聚体的氨基酸总数可以是442，但不限于此。具体地，所述免疫球蛋白fc片段可以是各自具有seq id no:138的氨基酸序列(由221个氨基酸组成)的两个单体经由半胱氨酸——各单体的第3位氨基酸——之间的二硫键彼此连接的同型二聚体形式，其中同型二聚体的单体各自独立地具有形成在第35和95位半胱氨酸之间的二硫键以及形成在第141和199位半胱氨酸之间的二硫键，但不限于此。
[0660]
化学式1的fc可包括具有seq id no:138的氨基酸序列的单体，并且fc可以是具有seq id no:138的氨基酸序列的单体的同型二聚体，但不限于此。
[0661]
例如，所述免疫球蛋白fc区可以是包括seq id no:139的氨基酸序列(由442个氨基酸组成)的同型二聚体，但不限于此。
[0662]
同时，如本文所用，与所述免疫球蛋白fc区相关的术语“组合”是指当形成二聚体或多聚体时，编码相同来源的单链免疫球蛋白fc区的多肽与不同来源的单链多肽之间形成键合。即，可使用选自igg fc、igafc、igm fc、igd fc和ige fc片段的两个或更多个片段制备二聚体或多聚体。
[0663]
如本文所用，术语“杂合体”是指对应于不同来源的两个或更多个免疫球蛋白fc区的序列存在于免疫球蛋白恒定区的一条链中。在本发明中，各种杂合体形式是可能的。即，结构域杂合体可由选自igg fc、igm fc、igafc、ige fc和igd fc的ch1、ch2、ch3和ch4的一
至四个结构域组成，并且可进一步包括铰链区。
[0664]
同时，igg还可分为igg1、igg2、igg3和igg4亚类，其在本发明中可被组合或杂合。优选的是igg2和igg4亚类，而最优选的是igg4的fc片段，其少有效应物功能如补体依赖性细胞毒性(cdc)。
[0665]
此外，与天然的glp-1、gip或胰高血糖素相比，或与未对fc修饰的z相比，上述缀合物可具有改善的长效特性，并且所述缀合物可包括包封在可生物降解的纳米颗粒以及上述那些中的形式，但不限于此。
[0666][0667]
所述fxr激动剂是法尼醇x受体的激动剂，也称为胆汁酸受体(bar)，是一种由胆汁酸激活的核受体。所述fxr激动剂可包括但不限于当与根据本发明的所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物在组合疗法中使用时，相比其单一使用能够改善对肝病的预防或治疗效果的任何物质。
[0668]
fxr在胆汁酸代谢的主要部位如肝、肠和肾中表达，并以组织特异性方式起作用以影响几种代谢途径，包括胆汁酸代谢。已发现fxr通过肝和肠中的各种机制抑制胆汁酸的产生并促进其消除。此外，尽管已知fxr激动剂通过减少肝甘油三酯的合成来减少脂肪变性，抑制肝星状细胞的激活，减少肝纤维化，以及通过刺激fgf15/fgf19(胆汁酸代谢的主要调节物)的表达来改善肝胰岛素敏感性，但是还没有报道当与根据本发明的三重激动剂或其缀合物(三重激动长效缀合物)在组合疗法中使用时，fxr改善对肝病的预防或治疗效果。
[0669]
所述fxr激动剂可包括但不限于当与根据本发明的所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)在组合疗法中使用时，相比其单一疗法能够改善对肝病的预防或治疗效果的任何物质，并且其实例可以是咖啡醇、鹅脱氧胆酸、奥贝胆酸、非那明、gw 4064、px104、6-乙基-鹅脱氧胆酸(6e-cdca)、akn-083、tropifexor、cilofexor、edp-305、agn-242266、agn-242256、ep-024297、rdx-023、bwl-200、gnf-5120、gs-9674、lmb-763、px-102、px-103、m790、m780、m450、m-480、met-409、met-642、px20606、eyp-001、tern-101、tc-100或int-2228。
[0670][0671]
所述acc抑制剂是指能够抑制乙酰辅酶a羧化酶——一种重要的用于调节脂肪酸的产生和代谢酶——的物质，可与根据本发明的所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)在组合疗法中使用，并且所述fxr激动剂可包括但不限于与单一使用相比能够改善对肝病的预防或治疗效果的任何物质。
[0672]
所述acc抑制剂可包括但不限于当与根据本发明的所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)在组合疗法中使用时，相比其单一疗法能够改善对肝病的预防或治疗效果的任何物质，并且其实例可以是cp-640186、(4-哌啶基)-哌嗪衍生物、1,4-二取代环己烷衍生物、螺色满酮衍生物、螺内酰胺衍生物、螺二胺衍生物、螺五酰基酰胺衍生物、假肽吡咯烷二酮衍生物、大环聚酮衍生物、含firsocostat的噻吩嘧啶酮衍生物、氨基-唑衍生物、偶氮苯并咪唑衍生物或pf-05221304。所述acc抑制剂公开在例如future med chem.2020mar；12(6):533
–
561(doi:10.4155/fmc-2019-0312)等已知文件中，其全部内容通过引用并入本文。
[0673][0674]
本发明的组合、药物组合物或套组可用于预防或治疗肝病。
[0675]
如本文所用，术语“预防”是指通过施用组合或组合物来抑制或延迟目标疾病例如肝病发作的所有行为，所述组合或组合物包括(a)对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)和fxr激动剂；或(b)对胰血高糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)、fxr激动剂和acc抑制剂。术语“治疗”是指通过施用组合或组合物来改善或有益地改变目标疾病例如肝病的症状的所有行为，所述组合或组合物包括(a)对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)和fxr激动剂；或(b)对胰血高糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)、fxr激动剂和acc抑制剂。
[0676]
如本文所用，术语“施用”是指通过任何适当的方法将预先确定的物质引入患者体内，并且组合物的施用途径可以是只要组合物到达体内目标即可的任何一般途径，例如，腹膜内施用、静脉内施用、肌内施用、皮下施用、皮内施用、口服施用、局部施用、鼻内施用、肺内施用或直肠施用。
[0677]
(a)所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)和所述fxr激动剂；或(b)所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)、所述fxr激动剂和所述acc抑制剂可组合用于预防或治疗肝病。
[0678]
如本文所用，术语“肝病”是指发生在肝脏中的疾病，并且可包括代谢性肝病或肝脏炎症，但不限于此。肝病的代表性实例可包括非酒精性脂肪肝病或胆汁淤积性肝病。肝脏中组织异常和功能障碍的各种肝病可包括在本发明的肝病范围内，只要肝病通过根据本发明的组合疗法中使用的药物组合物、组合和套组得到预防或治疗即可，但不限于此。
[0679]
如本文所用，术语“非酒精性脂肪肝病”是指伴有脂肪肝的一类疾病，尽管没有酒精摄入史或该疾病与酒精摄入无关。脂肪肝是指与正常情况不同，肝细胞中甘油三酯异常积聚的现象。健康的肝脏包含约5％的脂质，主要包括甘油三酯、脂肪酸、磷脂、胆固醇和胆固醇酯。然而，一旦出现脂肪肝，大部分组分就会被甘油三酯取代，而当甘油三酯的含量超过肝脏重量的5％时，即诊断为脂肪肝。脂肪肝由肝细胞的脂肪代谢障碍或运输过量脂肪的过程中的缺陷引起，主要因脂肪代谢障碍而发生。脂肪肝中积聚的大部分脂肪可能是甘油三酯。经证实，根据本发明的组合物降低了nafld活性评分(nas)并抑制了纤维化，由此可预防或治疗非酒精性脂肪肝病的病变。
[0680]
所述非酒精性脂肪肝病可以是单纯性脂肪变性、肝脏炎症、非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬变、肝纤维化、肝代偿失调或肝细胞癌，但可进一步非限制地包括由本发明的组合物预防或治疗的任何非酒精性脂肪肝病。
[0681]
作为另一个实例，所述非酒精性脂肪肝病可包括至少一种选自肝脏炎症、非酒精性脂肪性肝炎和肝纤维化的疾病，但可进一步非限制地包括由本发明的组合物预防或治疗的任何非酒精性脂肪肝病。
[0682]
如本文所用，“非酒精性脂肪性肝炎”，非酒精性脂肪肝病的一种，是伴有肝细胞坏死、炎症和纤维化的代表性肝病实例。根据本发明的组合物可通过降低nafld活性评分
(nas)和抑制纤维化而对非酒精性脂肪性肝炎具有作用，具体地，对伴有脂肪肝、肝纤维化或肝硬变的非酒精性脂肪性肝炎；或由非酒精性脂肪性肝炎引起的肝细胞癌具有作用，但不限于此。
[0683]
本文所用，“肝脏炎症”，作为肝病的最大病因，是指引起肝脏中的炎症的疾病，并且根据病因和症状分为急性肝炎和慢性肝炎。其主要病因是病毒、酒精、药物、免疫异常、代谢性疾病等。
[0684]
如本文所用，“肝纤维化”是由重复性肝损伤引起的伤口愈合过程的结果。与肝硬变不同，已知“肝纤维化”是可逆的并且由细纤丝组成，无结节形成。一旦肝损伤病因消除，肝脏就可能恢复正常状态。然而，当这种肝纤维化机制持续重复时，肝纤维化会导致不可逆的肝硬变，其中细胞外基质(emc)之间的交联增加，形成结节。
[0685]
本发明的组合物可通过降低施用其的个体中羟脯氨酸的含量而对肝纤维化表现出预防或治疗效果，但不限于此。根据本发明的缀合物不仅可具有减轻肝纤维化的效果，而且还可具有对伴有肝纤维化或由其引起的疾病的效果。
[0686]
如本文所用，“肝硬变”是由于肝细胞的重复再生和纤维组织的增加而发生的慢性疾病，并且病理上伴有坏死、炎症和纤维化。肝硬变最终发展为肝硬变并发症如肝代偿失调和肝细胞癌，导致死亡。特别地，由于肝硬变仅在大幅进展之后才被发现，而没有可检测到的症状，因此需要迅速治疗肝纤维化，这是进展成肝硬变之前的状况等。
[0687]
如本文所用，“肝代偿失调”是指由于病毒性肝炎、肝硬变、药物或酒精诱导的肝损伤或肝病，肝脏的功能减弱并且肝脏不能执行作为正常生理作用的蛋白质合成和代谢功能的状况。肝代偿失调根据进展速度分为急性肝代偿失调或慢性肝代偿失调，并且已知会导致各种并发症。
[0688]
如本文所用，“肝细胞癌”是指起源于肝细胞的恶性肿瘤，并且可分为由肝细胞引起的原发性肝细胞癌和从其它组织转移的转移性肝细胞癌。约90％或更多的肝细胞癌是原发性肝细胞癌。已知其主要病因是酒精、吸烟、肥胖以及肝炎和慢性肝病。
[0689]
如本文所用，“胆汁淤积”是胆汁从肝脏到十二指肠的流动变得较慢或被阻断的病理状况，而“胆汁淤积性肝病”是胆汁的合成被病理状况如各种疾病、扩张的颈静脉或某些药物(例如一些抗生素)的副作用破坏的状况。胆汁淤积的常见症状包括疲劳、瘙痒(痒)、黄疸和黄色瘤(皮肤下沉积富含胆固醇的物质)。胆汁淤积的影响是严重且广泛的，导致肝病恶化为全身性疾病、肝代偿失调和需要肝移植。胆汁淤积性肝病的病因可包括急性肝炎和胆管的炎症。
[0690]
胆汁淤积性肝病可包括原发性胆汁性胆管炎(pbc)、原发性硬化性胆管炎(psc)、进行性家族性肝内胆汁淤积(pfic)和阿拉杰里综合征(alagille syndrome,as)，但不限于此。
[0691]
原发性胆汁性肝硬变，也称为原发性胆汁性胆管炎(pbc)，是一种病因不明的慢性胆汁淤积性肝病。由门脉和门脉周炎症引起的进行性胆管损伤可能导致进行性纤维化和最终的肝硬变。已知免疫、遗传和环境因素是其潜在病因。原发性胆汁性肝硬变主要发生于中年女性，并且早期症状可能包括疲劳和瘙痒，或不明原因的高脂血症也可视为原发性胆汁性肝硬变的症状。
[0692]
到目前为止，原发性胆汁性肝硬变被认为是一种免疫介导的疾病，具体地，门脉和
门脉周区域中t淋巴细胞的免疫组织化学染色显示出cd4阳性和cd8阴性t细胞。此外，在受影响个体的无症状一级亲属中也有异常的抑制t细胞活性的报告。还有报道称，白细胞介素可能通过导致免疫功能改变和纤维化而在pbc病的发病机制中发挥作用(g.j.webb et al.,j.autoimmunity,2015nov；64:42
–
52)。
[0693]
使用熊脱氧胆酸(ursodeoxicholic acid,udsa)和奥贝胆酸(oca)的胆汁酸疗法被用作治疗pbc的方法。两种药物在pbc中的作用机制与其激活fxr和tgfr-5的能力有关，从而导致抗炎效果的发挥。然而，约40％接受udca治疗的患者未达到足够的生化反应。
[0694]
原发性硬化性胆管炎(psc)是一种由肝内/外胆管炎症和纤维化引起的慢性进行性胆汁淤积性肝病，病因不明。具体地，发生在胆管和胆道中的炎性疾病会导致psc，psc是一种由于纤维化或狭窄导致胆管壁增厚而伴随胆管狭窄的疾病。虽然尚未揭示其病因，但估计psc是由复杂原因引起的，包括诸如遗传因素、环境因素和与其相关的免疫反应等多种因素。
[0695]
当用于测量肝脏功能的血液测试中碱性磷酸酶水平升高、转氨酶水平升高、γ球蛋白血症发生等时，便诊断为原发性硬化性胆管炎。
[0696]
治疗psc的方法尚未有明确的报道，而肝移植是唯一的基本治疗。
[0697]
因此，仍然需要开发用于治疗pbc和psc、患者便利性高而没有副作用的药物，以及三重激动剂或其长效缀合物与fxr激动剂的组合疗法；或者根据本发明的三重激动剂或其长效缀合物、fxr激动剂和acc抑制剂的组合疗法适用于治疗所述疾病。
[0698]
根据本发明的组合物的特征在于不存在体重增加或存在相对低水平的体重增加，体重增加是非酒精性脂肪肝病的常规治疗剂的副作用。
[0699]
此外，所述组合物可通过进行下列作用(a)至(e)中的至少一种来预防或治疗肝病：(a)通过降低纤维化标志物胶原-1a的表达或活性；(b)通过降低促炎标志物肿瘤坏死因子-α(tnf-α)的表达或活性；(c)通过降低脂肪生成标志物甾醇调节元件结合蛋白-1c(srebp-1c)的表达或活性；(d)通过降低肝甘油三酯水平；和(e)通过降低血液胆固醇水平。然而，该实施方式不限于此。
[0700]
此外，所述组合物可通过降低nafld活性评分(nas)来预防或治疗肝病，例如非酒精性脂肪肝病。
[0701]
此外，所述组合物可通过降低已知在肝组织中是纤维化标志物的羟脯氨酸的含量来预防或治疗肝病，例如非酒精性脂肪肝病。
[0702][0703]
本发明的药物组合物还可包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂可以是非天然存在的。
[0704]
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指这样的量：足以表现出治疗效果而不引起副作用，并且可容易基于医学领域中公知的因素如疾病类型、年龄、体重、健康状况、性别以及患者的药物敏感性、施用途径、施用方法、施用数量、治疗持续时间和组合或同时使用的药物来确定。
[0705]
本发明的包括肽的药物组合物可进一步包括药学上可接受的赋形剂。赋形剂可包括但不具体限于，对于口服施用，粘合剂、润滑剂、崩解剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂、风味剂等；对于可注射制剂，缓冲剂、防腐剂、镇痛剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等等；
以及对于局部施用，碱、润滑剂、防腐剂等。
[0706]
本发明的组合物可通过与上述药学上可接受的赋形剂组合而配制成多种形式。例如，对于口服施用，所述药物组合物可被配制成片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、晶片(wafer)等；以及对于可注射制剂，所述药物组合物可被配制成单剂量安瓿或多剂量形式。所述药物组合物还可被配制成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂等。
[0707]
同时，适于制剂的载体、赋形剂或稀释剂的实例可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、非晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。此外，所述药物组合物可进一步包括填充剂、抗凝剂、润滑剂、润湿剂、风味剂、防腐剂等。
[0708]
另外，本发明的药物组合物可被配制成选自下列的制剂：片剂、丸剂、粉末、颗粒、胶囊、悬浮液、内用制剂、乳液、糖浆、无菌水溶液、非水性溶剂、冻干制剂和栓剂。
[0709]
另外，所述组合物被可被配制成适于施用到患者身体内的单位剂型，具体地，按照本领域中常用的方法被配制成对蛋白药物的施用有用的形式，并采用本领域常用的施用方法通过口服施用途径或肠胃外施用途径如皮内、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、肺内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、胃内、局部、舌下、阴道或直肠途径施用，但不限制于此。
[0710][0711]
此外，所述三重激动剂或其长效缀合物可与各种允许作为药物的载体如盐水溶液或有机溶剂组合来使用。为了提高稳定性或吸收性，碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)、抗氧化剂(如抗坏血酸或谷胱甘肽)、螯合剂、低分子量蛋白质或其它稳定剂可作为药物使用。
[0712]
本发明的药物组合物的施用剂量和频率可根据药物(作为活性成分)的类型连同各种相关因素如待治疗的疾病、施用途径、患者的年龄、性别和体重以及疾病的严重程度来确定。具体地，本发明的组合物可包括药学有效量的所述肽或包含其的长效缀合物，但不限于此。
[0713]
所述肽或其长效缀合物的药学有效量可指这样的量：通过使用所述肽或所述长效缀合物或药学上可接受的水平获得期望的药理活性(例如，肝病的预防、改善或治疗效果)，而在施用所述肽或其长效缀合物的个体中不引起毒性或副作用，或引起不显著的毒性或副作用，但不限于此。这样的药学有效量可根据施用频率、患者、制剂等来确定。
[0714][0715]
虽然并不特别限于此，但本发明的药物组合物可包括范围在0.01重量％至99重量％的组分(活性成分)。
[0716][0717]
本发明的组合物的总有效量可以以单剂向患者施用，或者可采用分级治疗方案——将施用执行延长的时间段——以多剂向患者施用。本发明药物组合物的活性成分的量可根据疾病严重程度而改变。具体地，本发明的肽或其长效缀合物的优选日剂量可以是每1kg患者体重约0.0001mg至约500mg，而不限于此。然而，由于所述缀合物的剂量是考虑各种因素如患者的年龄、体重、健康状况、性别、疾病严重程度、饮食和排泄率以及药物组合物的施用途径和频率针对患者确定的，因此本领域普通技术人员可通过考虑这些因素来确定
适于本发明组合物的具体用途的有效剂量。本发明药物组合物的配制、施用途径和施用方法并不特别受限，只要获得本发明的效果即可。
[0718]
本发明的三重激动剂或其长效缀合物可与所述fxr激动剂；或所述fxr激动剂和所述acc抑制剂以适当比例共同施用。例如，基于单剂量，本发明的三重激动剂或其长效缀合物可以以下列量施用：约0.1mg至约100mg、约0.5mg至约80mg、约1mg至约60mg、约1mg至约25mg、约5mg至约20mg或约10mg至约15mg，所述fxr激动剂可以以下列量施用：约1mg至约100mg、约1mg至约250mg、约5mg至约250mg、约5mg至约50mg、约5mg至约40mg、约5mg至约40mg、约5mg至约25mg、约5mg至约30mg、约90mg至约250mg、约140mg至约250mg或约140mg至约200mg，以及所述acc抑制剂可以以下列量施用：约1mg至1000mg、约5mg至约1000mg、约5mg至150mg、约5mg至约50mg、约5mg至约30mg、约5mg至约750mg或约10mg至约550mg，但不限于此。
[0719]
本发明的三重激动剂或其长效缀合物可与所述fxr激动剂；或所述fxr激动剂和所述acc抑制剂以适当比例共同施用以表现出对肝病的优异治疗效果。
[0720]
本发明的药物组合物具有优异的体内持久性和效力，根据本发明的药物制剂的施用次数和频率可显著减少，但不限于此。
[0721][0722]
本发明的另一方面提供了用于预防或治疗肝病的药物组合物，其包括与fxr激动剂组合使用的对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)。
[0723]
在另一个具体实施方式中，所述药物组合物可进一步与acc抑制剂组合。
[0724]
包括所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)、所述fxr激动剂和所述acc激动剂的组合物、预防、治疗、肝病和药物组合物如上所述。
[0725][0726]
本发明的另一方面提供了预防或治疗肝病的方法，所述方法包括向有需要的个体施用(i)所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)和(ii)所述fxr激动剂。
[0727]
本发明的另一方面提供了预防或治疗肝病的方法，所述方法包括向有需要的个体施用(i)所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)、(ii)所述fxr激动剂和(iii)所述acc抑制剂。
[0728]
本发明的另一方面提供了预防或治疗肝病的方法，所述方法包括以药学有效量向需要肝病治疗的个体(i)施用所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)；和(ii)施用所述fxr激动剂，其中步骤(i)和(ii)相继、以相反顺序或同时进行。
[0729]
本发明的另一方面提供了预防或治疗肝病的方法，所述方法包括以药学有效量向需要肝病治疗的个体(i)施用所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)；(ii)施用所述fxr激动剂；和(iii)施用所述acc抑制剂，其中步骤(i)、(ii)和(iii)相继、以相反顺序或同时进行。
[0730]
施用预防或治疗肝病的方法的活性成分的步骤可以按任意顺序进行，并且(i)、
(ii)和(iii)不是指该顺序，而是将这些活性成分分类，使得这些步骤可相继、以相反顺序或同时进行，但不限于此。
[0731][0732]
包括所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)、所述fxr激动剂和所述acc激动剂的组合物、预防、治疗、肝病和药物组合物如上所述。
[0733][0734]
在本发明中，所述个体是疑似患有肝病的对象，并且所述疑似患有肝病的个体可指患有所述疾病或处于发展所述疾病的风险中的哺乳动物，包括人类和大鼠以及家畜，但是可非限制地包括任何个体，只要该个体可用根据本发明的组合物治疗即可，所述组合物包括所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)；和(a)所述fxr激动剂，或(b)所述fxr激动剂和所述acc抑制剂。此外，通过向疑似患有肝病的个体施用包括所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)；和(a)所述fxr激动剂，或(b)所述fxr激动剂和所述acc抑制剂的药物组合物，可有效地治疗所述个体。所述肝病如上所述。
[0735]
本发明的方法可包括以药学有效量施用组合或药物组合物，其包括所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)；和(a)所述fxr激动剂，或(b)所述fxr激动剂和所述acc抑制剂。本发明的方法可包括以单一制剂或以单独的制剂同时、独立、相继或以相反顺序施用所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)；和(a)所述fxr激动剂，或(b)所述fxr激动剂和所述acc抑制剂，但不限于此。
[0736]
如本文所用，术语“施用”是指通过任何适当的方法将预先确定的物质引入患者(个体)体内。所述三重激动剂或其长效缀合物、所述fxr激动剂和所述acc抑制剂的施用途径可以是，但并不特别限于，任何一般途径——只要所述三重激动剂或其长效缀合物、所述fxr激动剂和所述acc抑制剂到达活体内的目标即可，例如，可使用腹膜内施用、静脉内施用、肌内施用、皮下施用、皮内施用、口服施用、局部施用、鼻内施用、肺内施用或直肠施用。
[0737]
在本发明的方法中，所述三重激动剂或其长效缀合物、所述fxr激动剂和所述acc抑制剂可通过相同的施用途径或不同的施用途径施用，并且共同施用的药物的施用途径可以是独立的。
[0738]
虽然并不特别限制，但是所述组合物——其包括所述三重激动剂或其长效缀合物，和所述fxr激动剂；或所述三重激动剂或其长效缀合物、所述fxr激动剂和所述acc抑制剂——可每天施用一次、每两天施用一次、每三天施用一次、每周施用一次、每两周施用一次、每四周施用一次或每月施用一次，但不限于此。
[0739]
同时，所述fxr激动剂和所述acc抑制剂的施用频率并不特别限制，只要当与所述三重激动剂或其长效缀合物或根据本发明的包括其的组合物共同施用时它们对肝病具有预防或治疗效果即可，但是可以是例如每天一次、每两天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次、每四周一次或每月一次。此外，所述fxr激动剂和所述acc抑制剂可以以与所述三重激动剂或其长效缀合物相同的间隔或以与其不同的间隔施用，例如，以1天、2天、3天、4天、5
天、6天、7天、8天、9天或10天或更长的间隔施用，但不限于此。
[0740][0741]
可在合理的医学判断范围内确定适当的日剂量为是按弹丸(bolus)还是按多剂量。然而，出于本发明目的，优选的是特定患者的具体治疗有效量是根据各种因素而被不同地施用的，包括：待实现的响应的类型和程度、具体的组合物——包括是否其它制剂根据患者的病情、年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食来使用、所述组合物的施用时间、施用途径、排泄率、治疗持续时间、与所述具体组合物组合或同时使用的药物以及医学领域公知的类似因素。
[0742][0743]
本发明的另一方面提供了预防或治疗肝病的方法，所述方法包括向有需要的个体施用所述组合、用于治疗或预防所述疾病的所述药物组合物或所述药物套组和/或使用所述组合、用于治疗或预防所述疾病的所述药物组合物或所述药物套组。
[0744]
包括所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)、所述fxr激动剂和所述acc激动剂的所述组合、套组和组合物、预防、治疗、肝病和药物组合物如上所述。
[0745][0746]
本发明的另一方面提供了所述组合、所述药物组合物或所述药物套组用于肝病的预防或治疗用途和/或用于制备预防或治疗肝病的药物的用途。
[0747]
包括所述对胰高血糖素受体、glp-1受体和gip受体具有活性的物质(三重激动剂)或其长效缀合物(三重激动长效缀合物)、所述fxr激动剂和所述acc激动剂的所述组合、套组和组合物、预防、治疗、肝病和药物组合物如上所述。
[0748][0749]
在下文中，将参考下列实施例更详细地描述本发明。然而，下列实施例仅用于举例说明本发明，而本发明的范围不限于此。
[0750][0751]
实施例1：三重激动剂的制备
[0752][0753]
制备了对所有glp-1受体、gip受体和胰高血糖素受体均具有活性的三重激动剂，其序列显示在下表1中。
[0754][0755]
表1
[0756]
在表1列出的序列中，x代表的氨基酸表示2-氨基异丁酸(aib)，其是非天然氨基酸，而下划线的氨基酸表示下划线的氨基酸的侧链之间的形成的内酰胺环。另外，在表1中，ca表示4-咪唑乙酰基。
[0757][0758]
实施例2：三重激动剂的长效缀合物的制备
[0759][0760]
为了用在两端包含马来酰亚胺基和醛基的10kda peg，即马来酰亚胺
–
peg
–
醛(10kda,nof,日本)使实施例1中的各个三重激动剂(seq id no:21、22、42、43、50、77和96)的半胱氨酸残基聚乙二醇化，使三重激动剂和马来酰亚胺
–
peg
–
醛以1:1至3的摩尔比，1mg/ml至5mg/ml的蛋白质浓度，在低温下反应0.5至3小时。在这方面，反应在其中将20％至60％异丙醇添加到50mm tris缓冲液(ph 7.5)中的环境中进行。具体地，为了在三重激动剂和聚乙二醇连接体之间制备键合，使马来酰亚胺
–
peg
–
醛(nof,日本)与三重激动剂的半胱氨酸残基反应，将三重激动剂聚乙二醇化至马来酰亚胺
–
peg
–
醛的马来酰亚胺端，所述马来酰亚胺
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peg
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醛是分子量为10kda的线性改性聚乙二醇，其中两端的氢原子分别被3-(3-马来酰亚胺基丙酰氨基)丙基和3-氧代丙基(丙醛基)取代。
[0761]
反应完成后，将反应溶液施加到sp琼脂糖凝胶hp(ge healthcare,usa)以纯化单聚乙二醇化至半胱氨酸的三重激动剂。
[0762]
随后，将纯化的单聚乙二醇化三重激动剂与免疫球蛋白fc(seq id no:138的同型二聚体)以1:1至5的摩尔比，10mg/ml至50mg/ml的蛋白浓度，在4℃至8℃的温度下反应12至18小时。反应在其中将10mm至50mm作为还原剂的氰基硼氢化钠和10％至30％异丙醇添加到100mm磷酸钾缓冲液(ph 6.0)中的环境中进行。反应完成后，将反应溶液施加到丁基琼脂糖凝胶ff纯化柱(ge healthcare,usa)和source iso纯化柱(ge healthcare,usa)以纯化包含三重激动剂和免疫球蛋白fc的缀合物。纯化的长效缀合物具有这样的结构：三重激动剂肽、聚乙二醇(peg)连接体和fc二聚体在分子中以1:1:1的摩尔比共价连接，并且peg连接体仅连接至两个多肽链中的一个链。
[0763]
同时，免疫球蛋白fc是具有seq id no:138的氨基酸序列(由221个氨基酸组成)的两个单体经由半胱氨酸——各单体的第3位氨基酸——之间的二硫键连接的同型二聚体形式，同型二聚体的各单体具有独立的两个内二硫键，即形成在第35和95位半胱氨酸之间的二硫键以及形成在第141和199位半胱氨酸之间的二硫键。具体地，根据国际专利公开号wo 2007/021129中公开的方法，通过使用在n端具有pro
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ser
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cys
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pro序列的铰链区的免疫球蛋白fc片段(其中seq id no:138的两条链通过二硫键连接的同型二聚体)制备免疫球蛋白fc。
[0764][0765]
制备后，通过反相色谱法、尺寸排阻色谱法和离子交换色谱法分析的纯度为95％或更高。
[0766]
在这方面，其中seq id no:21的三重激动剂与免疫球蛋白fc通过peg连接体连接的缀合物被命名为“包含seq id no:21和免疫球蛋白fc的缀合物”或“seq id no:21的长效缀合物”，并且它们在本发明中可以互换使用。
[0767]
在这方面，其中seq id no:22的三重激动剂与免疫球蛋白fc通过peg连接体连接的缀合物被命名为“包含seq id no:22和免疫球蛋白fc的缀合物”或“seq id no:22的长效缀合物”，并且它们在本发明中可以互换使用。
[0768]
在这方面，其中seq id no:42的三重激动剂与免疫球蛋白fc通过peg连接体连接的缀合物被命名为“包含seq id no:42和免疫球蛋白fc的缀合物”或“seq id no:42的长效缀合物”，并且它们在本发明中可以互换使用。
[0769]
在这方面，其中seq id no:43的三重激动剂与免疫球蛋白fc通过peg连接体连接的缀合物被命名为“包含seq id no:43和免疫球蛋白fc的缀合物”或“seq id no:43的长效缀合物”，并且它们在本发明中可以互换使用。
[0770]
在这方面，其中seq id no:50的三重激动剂与免疫球蛋白fc通过peg连接体连接的缀合物被命名为“包含seq id no:50和免疫球蛋白fc的缀合物”或“seq id no:50的长效缀合物”，并且它们在本发明中可以互换使用。
[0771]
在这方面，其中seq id no:77的三重激动剂与免疫球蛋白fc通过peg连接体连接的缀合物被命名为“包含seq id no:77和免疫球蛋白fc的缀合物”或“seq id no:77的长效缀合物”，并且它们在本发明中可以互换使用。
[0772]
在这方面，其中seq id no:96的三重激动剂与免疫球蛋白fc通过peg连接体连接
的缀合物被命名为“包含seq id no:96和免疫球蛋白fc的缀合物”或“seq id no:96的长效缀合物”，并且它们在本发明中可以互换使用。
[0773][0774]
实施例3：三重激动剂及其长效缀合物的体外活性的测量
[0775]
使用分别转化有glp-1受体、胰高血糖素(gcg)受体和gip受体的细胞系，通过体外细胞活性测量方法测量分别在实施例1和实施例2中制备的三重激动剂及其长效缀合物的活性。
[0776][0777]
这些细胞系——其转化使得人glp-1受体、人gcg受体和人gip受体的基因分别在中国仓鼠卵巢(cho)中表达——适用于测量glp-1、gcg和gip的活性。因此，使用各个转化的细胞系测量活性。
[0778][0779]
为了测量分别在实施例1和实施例2中制备的三重激动剂及其长效缀合物中的每一种对glp-1的活性，使人glp-1经历从50nm到0.000048nm的4倍连续稀释，并使分别在实施例1和实施例2中制备的三重激动剂及其长效缀合物经历从400nm到0.00038nm的4倍连续稀释。从培养的表达人glp-1受体的cho细胞中移出培养肉汤，并将各连续稀释的物质以5μl的量添加到cho细胞中。然后，以5μl的量向其中添加包含camp抗体的缓冲液，并在室温下培养15分钟。然后，以10μl的量向其中添加包含细胞裂解缓冲液的检测混合物以裂解细胞，随后在室温下反应90分钟。反应终止后，将细胞裂解物施加到lance camp试剂盒(perkinelmer,usa)，以通过累积的camp计算ec
50
值，然后将这些值相互比较。与人glp-1相比的相对效力显示在下表2和3中。
[0780][0781]
为了测量分别在实施例1和实施例2中制备的三重激动剂及其长效缀合物对gcg的活性，使人gcg经历从50nm到0.000048nm的4倍连续稀释，并使分别在实施例1和实施例2中制备的三重激动剂及其长效缀合物经历从400nm到0.00038nm的4倍连续稀释。从培养的表达人gcg受体的cho细胞中移出培养肉汤，并将各连续稀释的物质以5μl的量添加到cho细胞中。然后，以5μl的量向其中添加包含camp抗体的缓冲液，并在室温下培养15分钟。然后，以10μl的量向其中添加包含细胞裂解缓冲液的检测混合物以裂解细胞，随后在室温下反应90分钟。反应终止后，将细胞裂解物施加到lance camp试剂盒(perkinelmer,usa)，以通过累积的camp计算ec
50
值，然后将这些值相互比较。与人gcg相比的相对效力显示在下表2和3中。
[0782][0783]
为了测量分别在实施例1和实施例2中制备的三重激动剂及其长效缀合物对gip的活性，使人gip经历从50nm到0.000048nm的4倍连续稀释，并使分别在实施例1和实施例2中制备的三重激动剂及其长效缀合物经历从400nm到0.00038nm的4倍连续稀释。从培养的表达人gip受体的cho细胞中移出培养肉汤，并将各连续稀释的物质以5μl的量添加到cho细胞中。然后，以5μl的量向其中添加包含camp抗体的缓冲液，并在室温下培养15分钟。然后，以10μl的量向其中添加包含细胞裂解缓冲液的检测混合物以裂解细胞，随后在室温下反应90分钟。反应终止后，将细胞裂解物施加到lance camp试剂盒(perkinelmer,usa)，以通过累积的camp计算ec
50
值，然后将这些值相互比较。与人gip相比的相对效力显示在下表2和3中。
[0784][0785]
表2
[0786]
三重激动剂的相对效力比
[0787]
表3
[0788]
三重激动剂的长效缀合物的相对效力比
[0789]
如上所述制备的三重激动剂或其长效缀合物具有作为能够激活所有glp-1受体、gip受体和胰高血糖素受体的三重激动剂的功能，并且可用作目标疾病的治疗剂。
[0790][0791]
实施例4：肝病治疗效果的鉴定
[0792][0793]
为了鉴定组合施用实施例中制备的三重激动剂的长效缀合物和法尼醇x受体(fxr)激动剂，或组合施用三重激动剂的长效缀合物、法尼醇x受体(fxr)激动剂和乙酰辅酶a羧化酶(acc)抑制剂对nash和纤维化——是肝病的代表性实例——的效果，使用被称为nash和纤维化模型的胆碱缺乏高脂饮食(cd-hfd)小鼠模型，其中通过使用胆碱缺乏、高脂且高胆固醇饮食诱导nash和纤维化。已知cd-hfd诱导脂肪性肝炎和纤维化。简言之，在c57bl/6小鼠中诱导cd-hfd模型8周。
[0794][0795]
选择seq id no:42的三重激动剂的长效缀合物作为三重激动剂的长效缀合物的代表性实例，选择cilofexor作为fxr激动剂的代表性实例，以及选择firsocostat作为acc抑制剂的代表性实例用于实验。cilofexor和firsocostat购自mce(medchemexpress)。
[0796][0797]
4-1：对缓解患有nash和纤维化的小鼠中nash的效果的鉴定
[0798][0799]
将诱导的动物模型分为赋形剂对照组、施用seq id no:42的三重激动剂的长效缀合物的单一疗法组(2.6nmol/kg,q2d,皮下)、施用fxr激动剂的单一疗法组(4.3mmol/kg,qd,口服)、施用acc抑制剂的单一疗法组(51.1mmol/kg,od,口服)、施用seq id no:42的三重激动剂的长效缀合物(2.6nmol/kg,q2d,皮下)和fxr激动剂(4.3mmol/kg,qd,口服)的组合疗法组以及施用seq id no:42的三重激动剂的长效缀合物(2.6nmol/kg,q2d,皮下)、acc抑制剂(51.1mmol/kg,qd,口服)和fxr激动剂(4.3mmol/kg,qd,口服)的三元组合疗法组，并且将施用重复6周。6周的重复施用后，通过h&e染色对尸检获得的每只小鼠的肝组织进行染色，并获得了nafld活性评分(nas)——被称为是用于评估对nash功效的方法。
[0800]
在这方面，qd是指每天一次，而q2d是指每两天一次。
[0801]
如图1所示，证实了与cd-hfd赋形剂对照组和分别施用acc抑制剂和fxr激动剂的单一疗法组相比，由于重复施用三重激动剂的长效缀合物6周，nas显著降低。此外，还证实了在组合施用三重激动剂的长效缀合物和fxr激动剂或三元组合施用三重激动剂的长效缀合物、acc抑制剂和fxr激动剂的情况下，nas更有效地降低。
[0802][0803]
在此基础上，证实了通过与fxr激动剂组合施用或与fxr激动剂和acc抑制剂三元组合施用，可进一步改善三重激动剂或其长效缀合物对nash的治疗效果。
[0804][0805]
4-2：对改善患有nash和纤维化的小鼠中纤维化标志物的效果的鉴定
[0806][0807]
为了鉴定上文证实的组合施用三重激动剂的长效缀合物和fxr激动剂以及三元组合施用三重激动剂的长效缀合物、acc抑制剂和fxr激动剂对纤维化的治疗效果，在cd-hfd小鼠模型的肝组织中测量被称为侵袭性纤维化的标志物的羟脯氨酸的含量。
[0808]
具体地，在上文证实的cd-hfd小鼠模型的施用seq id no:42的三重激动剂的长效缀合物——作为三重激动剂的长效缀合物的代表性实例——的单一疗法组、施用fxr激动剂的单一疗法组、施用acc抑制剂的单一疗法组、施用seq id no:42的三重激动剂的长效缀合物和fxr激动剂的组合施用组以及施用seq id no:42的三重激动剂的长效缀合物、acc抑
制剂和fxr激动剂的三元组合施用组的肝组织中测量羟脯氨酸的含量。
[0809][0810]
结果，与分别单独施用acc抑制剂和fxr激动剂的单一疗法组相比，施用三重激动剂的长效缀合物降低的羟脯氨酸的含量更多。此外，观察到羟脯氨酸的含量——通过施用三重激动剂的长效缀合物而显著降低——通过与fxr激动剂组合施用以及与acc抑制剂和fxr激动剂三元组合施用而更有效地降低(图2)。
[0811][0812]
在此基础上，证实了根据本发明的三重激动剂或其长效缀合物对纤维化的治疗效果可通过与fxr激动剂组合施用，或与fxr激动剂和acc抑制剂三元组合施用而进一步改善。
[0813][0814]
上述结果表明，根据本发明的三重激动剂或其长效缀合物可通过与fxr激动剂组合施用，或与fxr激动剂和acc抑制剂三元组合施用，进一步改善对各种非酒精性脂肪肝病的治疗效果，从而表明三重激动剂或其长效缀合物可用作组合施用或三元组合施用的新制剂。
[0815]
本发明的以上描述是出于说明的目的提供的，而本领域技术人员将理解，在不改变本发明的技术构思和基本特征的情况下，可进行各种改变和修改。因此，很明显，上述实施方式在所有方面都是说明性的，而不限制本发明。此外，本发明的范围应当由所附权利要求而不是详细描述来限定，并且应当理解，衍生自本发明的含义和范围的所有修改或变型及其等同物都包括在本发明的范围内。