小鼠抗人IV型胶原α5链NC1段单克隆抗体及其应用

小鼠抗人iv型胶原
α
5链nc1段单克隆抗体及其应用
技术领域
1.本发明涉及抗体领域，具体涉及小鼠抗人iv型胶原α5链nc1段单克隆抗体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.iv型胶原(type iv collagen)是构成基底膜的重要框架蛋白，α链是构成iv型胶原分子的亚单位，一个iv型胶原分子由3条α链组成。迄今为止，人类iv型胶原α链发现6种，分别称为α1～α6链，其编码基因分别为col4a1-6。根据氨基酸序列和功能不同α5链可分为三个结构域：1.氨基端7s区；2.胶原区，包含“gly-x-y”重复序列；3.羧基端非胶原区(nc1)。nc1区控制了iv型胶原单体的缔结，在不同种族之间其氨基酸序列是高度保守的，但不同α链nc1区氨基酸序列明显不同，这是制备单克隆抗体的分子基础。
3.alport综合征(alport syndrome，as)，又称遗传性肾炎、眼-耳-肾综合征，是一最为常见的遗传性肾小球疾病，临床主要表现为血尿、蛋白尿、进行性肾功能衰竭伴感音神经性耳聋、眼部病变。1988年atkin首先将as相关基因定位于x染色体，1990年barker等成功克隆到col4a5基因即编码ⅳ型胶原α5链的基因，并在x伴性遗传as(xlas)患者中发现了第一个col4a5基因突变，随后越来越多的col4a5基因突变被发现，而col4a3和col4a4基因与常染色体遗传as相关。
4.采用针对iv型胶原α5链nc1段的单克隆抗体行免疫荧光检测，对xlas和常染色体隐性遗传as(aras)具重要诊断价值。正常情况下，α5(ⅳ)链存在于肾小球基底膜、远端肾小管基底膜和包氏囊壁内，免疫荧光呈阳性、连续线样，而在xlas男性患者，α5链免疫荧光绝大多数呈阴性，xlas女性患者免疫荧光则多呈不连续阳性。此外，iv型胶原α5链亦见于皮肤的表皮基底膜，同肾脏，正常情况下，α5链免疫荧光亦呈阳性、连续线样，而xlas男性免疫荧光绝大多数为阴性，xlas女性免疫荧光多为不连续阳性，因此对于部分发现疾病时肾功能已出现严重损害而丧失肾穿刺机会的患者，皮肤活检行iv型胶原α5链检测可替代肾组织起到疾病诊断的作用。对于部分aras患者，研究者发现抗α5链单抗在远端肾小管基底膜和包氏囊呈连续沉积，但在肾小球基底膜上无沉积，这一特异免疫荧光检测结果仅见于aras。因此α5链免疫荧光检测不仅对xlas具重要诊断价值，对部分aras患者亦具诊断价值，更有助于as遗传方式的确定。
5.专利文献cn110531088a公开了一种iv型胶原蛋白检测试剂盒，包含混有包被鼠抗人iv型胶原蛋白单克隆抗体胶乳颗粒的试剂；专利文献cn102010470b公开了一种抗iv型胶原单克隆抗体。而目前未见如本文所述小鼠抗人iv型胶原α5链nc1段单克隆抗体。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合人iv型胶原α5链nc1段，由保藏号为cctcc no:c2022240的杂交瘤细胞株nc1#4分泌产生。
7.本专利还提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体包含：h链可变区和l链可变区，
其中(a)所述h链可变区包括三个互补决定区，为seq id no:17表示的cdr1序列、由seq id no:19表示的cdr2序列和由seq id no:21表示的cdr3序列，以及(b)所述l链可变区包括三个互补决定区，为seq id no:37表示的cdr1序列、由seq id no:39表示的cdr2序列和由seq id no:41表示的cdr3序列。
8.优选地，所述单克隆抗体识别包含由seq id no:1表示的第251-475位氨基酸序列的表位。
9.优选地，所述单克隆抗体是人源化的。
10.本专利还提供了单克隆抗体在制备检测人iv型胶原的试剂盒中的应用。
11.优选地，所述试剂盒用于人iv型胶原α5链的免疫荧光检测。
12.优选地，所述试剂盒用于诊断alport综合征。
13.本专利还提供了一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株保藏编号为cctcc no:c2022240。
14.本发明的有益效果在于：在国内首先开发、成功制备了小鼠抗人iv型胶原α5链nc1段单克隆抗体，该单抗是iv型胶原α5链免疫荧光或组化检测得以开展的关键，而这对as诊断具重要意义，并有助于遗传方式的确定。目前国际仅日本具有这一单抗产品，价格昂贵。预初临床验证实验显示，我们制备的单抗与日本公司的抗体免疫荧光检测结果完全一致，且更易解读结果。
附图说明
15.图1：co4a5-ecoli的sds-page和western blot分析。
16.图2：肾组织细胞上清克隆免疫荧光检测。上清4,11,19免疫荧光阳性，阳性部位上清4和19同对照抗体，但19上清荧光强度明显弱；11#上清荧光明显阳性部位与对照抗体类似，但除远端肾小管基底膜外其他肾小管基底膜亦有非特异弱阳性。a：cosmobio抗体；b：上清2；c：上清3；d：上清4；e：上清5；f:上清6；g：上清8；h：上清9；i：上清10；j：上清11；k：上清12；l：上清13；m：上清14；n：上清15；o：上清17；p：上清18；q：上清19；r：上清21。(400x)
17.图3：皮肤组织细胞上清克隆免疫荧光检测。a：cosmobio抗体(200x)；b：4#上清(200x)；c：11l#上清(200x)；d：19#上清(200x)。
18.图4：肾组织抗α5(iv)单克隆抗体免疫荧光检测。a,b：cosmobio抗体(a:100x；b:400x)；c,d：4#单抗(c:100x；d:400x)；e,f：5#单抗(e:100x；f:400)；g,h：11#单抗(g:100x；h:400x)。
19.图5：皮肤组织抗α5(iv)单克隆抗体免疫荧光检测。a：cosmobio抗体(200x)；b：4#单抗(200x)；c：5#单抗(200x)；d：11#单抗(200x)。
20.图6：4#单抗肾组织免疫荧光检测。a,b：cosmobio抗体在对照非alport综合征患者肾组织免疫荧光检测结果(a:100x；b:400x)；c,d：4#单抗在对照非alport综合征患者肾组织免疫荧光检测结果(c:100x；d:400x)；e,f：cosmobio抗体在x伴性遗传alport综合征女性患者肾组织免疫荧光检测结果示阳性不连续(e；100x；f:400x)；g,h：4#单抗在x伴性遗传alport综合征女性患者肾组织免疫荧光检测结果示阳性不连续(g:100x；h:400x)。
21.图7：皮肤组织4#单抗免疫荧光检测。a：cosmobio抗体在对照非alport综合征患者皮肤组织免疫荧光检测结果(200x)；b：4#单抗在对照非alport综合征患者肾组织免疫荧光
检测结果(200x)；c：cosmobio抗体在x伴性遗传alport综合征男性患者皮肤组织免疫荧光检测结果示阴性(200x)；d：4#单抗在x伴性遗传alport综合征男性患者皮肤组织免疫荧光检测结果示阴性(200x)。
具体实施方式
22.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
23.实施例1
24.一、抗原制备：基因克隆、蛋白表达纯化
25.订购基因human co4a5，亚克隆到同时带his标签和gst标签的pgs-21a质粒载体上，转化e.coli做表达鉴定，实验结果表明蛋白表达在包涵体中，包涵体用8m尿素pbs溶解，后续用镍柱亲和纯化human co4a5，蛋白溶解在8m尿素pbs，浓度1.05mg/ml，6ml，纯度90％。
26.克隆策略：atg
‑‑
his tag
‑‑
gst tag
‑‑
kpni
‑‑
tev protease site
‑‑
co4a5-ecoli
‑‑
stop codon-hindiii，其aa序列如seq id no:1所示，其中，第5-10位为his tag，第14-233位为gst tag，第244-250位为tev protease site，第251-475位为co4a5-ecoli，即co4a5 nc1段。co4a5 nc1段的编码序列如seq id no:2的第28-702bp所示。
27.原核表达，亲和纯化蛋白检测。结果见图1。
28.二、小鼠免疫
29.定期配佐剂(完全和不完全佐剂)各免疫5只balb/c小鼠(皮下多点注射5次)(实际免疫11只小鼠，存活9只小鼠)，免疫三次后收集小样血清做elisa测试，如下表所示。
[0030][0031][0032][0033][0034]
(一)elisa数据分析
[0035]
1.co4a5蛋白带有gst和his标签，蛋白免疫11鼠，存活9只小鼠，编号c-1#～c-9#；
[0036]
2.分别用co4a5蛋白，gst蛋白和his蛋白包被，9鼠四免血1∶100开始，gst和his单抗正对照1ug/ml开始，1∶3梯度稀释；
[0037]
3.co4a5蛋白：三鼠(1#，4#，6#)无效价，其他6鼠效价：9#＞3#＝5#＞2#＝7#＞8#；
[0038]
4.gst蛋白检测，三鼠：3#，7#，9#与gst蛋白反应，7#特异性差；
[0039]
5.his蛋白检测，确认2#，3#鼠与his蛋白不反应。
[0040]
(二)结论
[0041]
1.小鼠血清与gst和his有微弱交叉反应，主要还是跟co4a5蛋白反应；
[0042]
2.选取6鼠按照效价优先循序9#＞3#＝5#＞2#＝7#＞8#做细胞融合。
[0043]
三、细胞融合筛选及亚克隆
[0044]
时间内容备注第1天小鼠终加强80μg鼠，无佐剂，腹腔注射第3天细胞融合peg法第7-10天融合初筛包被偶联物elisa第9天融合复检包被偶联物elisa，竞争反应，elisa仿照法第19天第一次亚克隆初步筛选的杂交瘤单克隆化第29天第二次亚克隆 第39天第三次亚克隆 [0045]
6只小鼠做细胞融合，elisa筛选细胞上清共得到21个阳性克隆，elisa数值：
[0046][0047]
21个克隆做免疫荧光(if)检测，实验步骤如下：
[0048]
1.取冰冻肾组织切片(0.2-0.3um)，在空气中风干；
[0049]
2.丙酮固定10分钟，pbs冲洗3次，每次3分钟；
[0050]
3.滴加变性剂(0.1m甘氨酸，6m尿索，ph3.5)，空气中孵育10分钟；
[0051]
4.双蒸水冲洗3次，每次3分钟；
[0052]
5.滴加稀释好的i抗(获得的21个细胞上清，原液，空白对照滴加等体积pbs)抗α2/α5抗体(cosmobio，日本)为阳性对照，原液，37℃，孵育30分钟；
[0053]
6.pbs冲洗3次，每次3分钟；
[0054]
7.滴加稀释好的fitc标记的羊抗小鼠f(ab)2igg二抗(sigma)，37℃，孵育30分钟；
[0055]
8.pbs冲洗3次，每次3分钟；pbs-甘油封片，镜检。
[0056]
9.结果：共得到3个克隆可检测到免疫荧光阳性：4#，11#，19#，其中4#和19#上清荧光阳性部位同对照抗体，但19#荧光强度非常弱，11#上清荧光明显，阳性的部位与对照抗体相似，但除远端肾小管基底膜外其他肾小管基底膜均有免疫荧光弱阳性，存在非特异信号。(见图2)
[0057]
检测到的阳性克隆进一步在皮肤组织进行免疫荧光检测，实验步骤同上，结果同肾组织。(见图3)
[0058]
四、细胞建株冻存及抗体小量生产
[0059]
对免疫荧光筛选出的细胞克隆进行建株、冻存，并生产小量抗体。
[0060]
时间内容备注第1天96孔细胞转24孔细胞扩大培养、鉴定第14天24孔细胞转t25瓶 第28天t25瓶细胞转t75瓶 第38天细胞冻存细胞冻存第42天细胞注射小鼠生产腹水第56天采集腹水 第58天腹水protein a纯化腹水纯化
[0061]
最后获得三个单克隆抗体，分别是4#，5#，11#抗体，4#和11#对应原来4#和11#细胞克隆，5#抗体对应19#细胞克隆，分别生产了5mg抗体。4#细胞克隆已于2022年09月06日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉大学，430072)，保藏编号为cctcc no：c2022240，培养物名称为杂交瘤细胞株nc1#4。其序列信息如下：
[0062]
[0063]
[0064][0065]
五、3个抗体免疫荧光检测，进一步验证
[0066]
1.取冰冻肾及皮肤组织切片(厚度0.2-0.3um)，在空气中风干；
[0067]
2.丙酮固定10分钟，pbs冲洗3次，每次3分钟；
[0068]
3.滴加变性剂(0.1m甘氨酸，6m尿素，ph3.5)，空气中孵育10分钟；
[0069]
4.双蒸水冲洗3次，每次3分钟；
[0070]
5.滴加稀释好的i抗(获得的不同克隆的单克隆抗体，稀释度均为1:100，抗α2/α5抗体为阳性对照(cosmobio，日本，原液)，空白对照滴加等体积pbs，37℃，孵育30分钟；
[0071]
6.pbs冲洗3次，每次3分钟；
[0072]
7.滴加稀释好的fitc标记的羊抗小鼠f(ab)2igg二抗(sigma)，37℃，孵育30分钟；
[0073]
8.pbs冲洗3次，每次3分钟；pbs-甘油封片，镜检。
[0074]
9.结果：
[0075]
皮肤组织：共检测12个皮肤标本，其中1个为col4a5突变和2个col4a4突变患者，余为非iv型胶原α链突变的肾病患者；
[0076]
肾组织：共检测15个标本，其中1个为col4a5基因突变和1个col4a4基因突变患者，其他为非alport综合征肾病患者或手术切除肾组织；
[0077]
荧光结果：4#抗体效果最好，与cosmobio抗体检测结果一致，无论是alport综合征和非alport综合征患者，稀释100倍的情况下荧光强度与cosmobio抗体匹配，5#抗体虽然检测结果与cosmobio抗体一致，但即使原浓度，荧光强度亦非常弱，而11#抗体有非特异信号，因此最后筛选出4#单抗符合最终要求。(见图4,5,6,7)
[0078]
以上所描述的实施例是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。本技术的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本技术的范围，而是仅仅表示本技术的选定实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。