一种通过测定真菌生长速度和致病基因表达量相结合评价杀虫真菌与杀菌剂相容性的方法

一种通过测定真菌生长速度和致病基因表达量相结合评价杀虫真菌与杀菌剂相容性的方法
一、技术领域
1.本发明属于病虫害防治技术领域，具体涉及一种通过测定真菌生长和关键致病基因表达量以综合评价杀虫真菌与杀菌剂相容性的方法。
二、技术背景
2.农作物病虫害的生物防治是农业绿色发展的重要组成部分。真菌是最早被发现能引起昆虫发病死亡并被研制成杀虫剂的微生物。真菌杀虫剂具有对环境安全、扩散能力强和不易产生抗药性等优点，被认为是替代高毒、高抗、高残留的化学杀虫剂的重要绿色防控产品。自然界杀虫真菌资源丰富，其中绿僵菌metarhizium anisopliae、球孢白僵菌beauveria bassiana、玫烟色棒束孢isaria fumososea、爪哇虫草菌cordyceps javanica等菌种已登记为真菌杀虫剂产品，在鳞翅目、鞘翅目、半翅目等农业害虫的生物防治中取得了明显成效。
3.田间作物虫害发生时期往往伴随有病害发生。为提高防治效率、减少农事操作、降低施药成本，真菌杀虫剂与杀菌剂常常联合使用以同时防治作物虫害和病害。真菌杀虫剂产品的主要活性成分为活体的昆虫病原真菌，故对杀菌剂产品较为敏感。一些用于杀死或抑制对作物有害真菌(植物病原物)的杀菌剂可能会对真菌杀虫剂中的活体真菌产生抑制或致死作用，导致其失去杀虫活性，从而严重影响真菌杀虫剂的田间应用效果。有研究表明，化学杀菌剂甲苯甲酰氟胺和唑菌酯会降低绿僵菌和玫烟色棒束孢的毒力，是影响杀虫真菌对害虫防治效果的重要环境因子。因此，杀菌剂对杀虫真菌的影响需要客观、全面的评价体系。现有关于杀菌剂对杀虫真菌影响的评价指标主要是杀菌剂对杀虫真菌孢子萌发与生长方面，其评价结果只针对杀虫真菌短时间内的生长能力，缺乏对杀虫真菌致病方面的评价，没有全面反映出对生物防治效果的潜在影响。从害虫防治角度出发，真菌的生长能力以及对害虫的致病力都是真菌杀虫剂重要的质量评价指标。而与杀菌剂相遇后的杀虫真菌除了生长可能受影响外，其对害虫的致病力又会产生怎样的变化？这方面鲜有报道。针对这一生产重大需求，本研究将发明一种通过测定真菌生长速度和关键致病基因表达量相结合快速综合评价杀虫真菌与杀菌剂相容性的方法。本发明对于科学评价杀虫真菌与杀菌剂相容性具有直接指导作用，同时也为二者的田间联合使用提供重要参考依据。
三、

技术实现要素：

4.1、发明目的
5.提供一种理想的杀虫真菌与杀菌剂相容性的评价方法，具体涉及一种通过测定真菌生长速度和关键致病基因表达量相结合科学评价杀菌剂与真菌杀虫剂相容性的方法，以科学判断杀虫真菌与杀菌剂相容性并合理指导二者的田间联合使用。
6.2、技术方案
7.本发明具体涉及一种杀虫真菌与杀菌剂相容性评价方法，其特征在于利用测定真
green qrt-pcr master mix kit进行定量pcr测定编码s53丝氨酸家族肽酶激活域的6个基因的表达量。以actin基因(if1g_06947)为参考基因，对其他基因表达量进行均一化处理，计算公式为2-δct
，其中-δct＝(ct，target gene-ct，actin)。然后根据均一化结果，比较各杀菌剂处理后的基因表达量，计算公式为2-δδct
，其中-δδct＝(ct，target gene-ct，actin)
test group-(ct，s53-ct，actin)
control condition
。设置未加杀菌剂的pda培养基上生长13天的爪哇虫草菌为对照样本(control condition)，该条件下的s53肽酶编码基因表达量设定为1，其他条件下(test condition)的表达量与之相比。定量pcr引物序列详见表2。
19.表2 s53丝氨酸家族肽酶激活域编码基因定量pcr引物序列
[0020][0021]
五、实施效果
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1、不同杀菌剂处理后杀虫真菌爪哇虫草菌的生长情况
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比较了爪哇虫草菌在添加了杀菌剂和未加杀菌剂pda固体培养基上的生长情况。从菌落数上看，在代森锰锌、稻瘟灵、三环唑、百菌清的添加导致爪哇虫草菌在pda培养基上菌落数均无增长。接种后第15天，对照组爪哇虫草菌的菌落接近长满培养皿。因此，以此作为时间节点，记录处理组的终菌落数和菌落直径。腐霉利处理后菌落数的增长也较为缓慢，接种后15天时的平均菌落数仅为4.7个。噻呋酰胺处理后，菌落数增长较快，接种后15天时的平均菌落数达到了8.5个。稻瘟酰胺的添加对菌落数的增加影响最小，接种后15天时的平均菌落数达到了12.5个，与同时期的对照组(15.7个)无显著差异。从菌落的平均直径来看，代森锰锌、稻瘟灵、三环唑处理后爪哇虫草菌菌落直径无显著增长。腐霉利和百菌清处理后，菌落直径有小幅的增长，到接种后15天时，分别增加到了2.78cm和2.3cm。稻瘟酰胺和噻呋酰胺处理后，菌落直径增长较快，平均直径分别达到了4.12cm、4.525cm，同时期对照组的平均直径为5.225cm。抑菌率统计结果进一步显示，7种杀菌剂对爪哇虫草菌的抑制率从低到高为：噻呋酰胺＜稻瘟酰胺＜腐霉利＜百菌清＜三环唑＜稻瘟灵＜代森锰锌，抑菌率分别为12.41％、23.25％、44.63％、56.10％、64.63％、80.98％、100％。综上所述，腐霉利、百菌清、三环唑、稻瘟灵和代森锰锌对爪哇虫草菌的生长具有显著的抑制作用，相比之下酰胺
类杀菌剂噻呋酰胺和稻瘟酰胺对爪哇虫草菌比较友好，无显著抑制作用。但是，要客观评价此类杀菌剂与杀虫真菌的相容性，需要进一步测定杀菌剂处理对杀虫真菌致病相关基因表达的影响。
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2、不同杀菌剂处理后杀虫真菌爪哇虫草菌关键致病基因的表达量
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爪哇虫草菌在添加不同杀菌剂的pda培养基上生长15天后，分别比较关键致病基因s53丝氨酸肽酶编码基因(if1g_04302、if1g_04303、if1g_02256、if1g_06234)的表达量。含代森锰锌培养基上的爪哇虫草菌没有生长，因此无法进行致病基因表达量的测定。设定接种后15天的对照组爪哇虫草菌的关键致病基因表达量为1，计算并比较各个处理组爪哇虫草菌关键致病基因的相对表达量(表3)。结果显示，噻呋酰胺、稻瘟灵处理组爪哇虫草菌的关键致病基因表达与对照组差异不显著，甚至有表达量显著上调的情况。其中，生长抑制率最低的噻呋酰胺处理组爪哇虫草菌的关键致病基因表达情况最好，if1g_02256、if1g_04302、if1g_04303基因的相对表达量分别为21.91、39.67、10.19，显著高于对照组；if1g_06234基因的相对表达量为1.06，与对照组无显著差异；尽管稻瘟灵对爪哇虫草菌生长的抑制率为80.98％，但4个致病基因都有表达。其中，if1g_04302和if1g_02256的相对表达量分别为2.46和1.99，均显著高于对照组，if1g_04303和if1g_06234基因的相对表达量分别0.94和0.83，与对照组无显著差异。相比之下，稻瘟酰胺、腐霉利、百菌清、三环唑处理的爪哇虫草菌虽能不同程度的生长，但均有关键致病基因被抑制表达甚至不表达。例如，腐霉利、百菌清、三环唑处理组爪哇虫草菌的if1g_04302基因均不表达。
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表3杀菌剂对爪哇虫草菌生长以及关键致病基因表达量的影响
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注：
↑
：显著上调；
↓
：显著下调；-：与对照组无显著差异；/：无此指标数据；
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综合以上两部分的结果，杀虫真菌生长指标的测定结果只显示了杀菌剂对杀虫真菌短时间内的生长抑制，不能准确反应杀菌剂对杀虫真菌关键致病基因表达的影响程度。生长抑制率在20％以上杀虫真菌，尽管仍具有一定的生长能力，但测定关键致病基因的表达量能进一步反映杀菌剂的影响程度。因此，在掌握真菌生长指标的基础上，进一步测定关键致病基因表达量，这是建立杀虫真菌与杀菌剂相容性综合评价体系的重要步骤。评价结果将为科学评估真菌杀虫剂与杀菌剂联合应用对病虫害持续协同控制作用、防治成本以及环境安全等方面提供参考依据。