控制分生组织大小以改良作物的方法与流程

控制分生组织大小以改良作物的方法
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4.本技术根据35u.s.c.
§
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技术领域
5.本发明涉及用于修饰植物中的clavata3/embryo surrounding region-related(clv3/esr-related)(cle)基因、任选地用于增加穗行数(kernel row number)的组合物和方法。本发明还涉及使用本发明的方法和组合物生产的具有增加的穗行数的植物。


背景技术：

6.新的植物器官在植物的称为分生组织的生长尖端处起始。在分生组织中维持着未分化干细胞群。在生长期间，分生组织将干细胞分配给新形成的器官，包括种子，同时保留一些干细胞以连续维持分生组织。已经描述了几种保守的分子机制，其控制干细胞群的大小以确保组织化生长和适当的分生组织大小。
7.由于玉米穗发育的模块化性质，较大的分生组织倾向于启动更多的花，因此，分生组织尺寸对穗行数和产量具有直接影响。在玉米穗的发育期间启动的花的数量直接限制了谷粒产量。围绕穗周围启动的花的增加数量(穗行数或krn)是在玉米驯化期间选择的一个主要性状。通过育种的显著进步已经导致了穗行数的急剧增加，从作为玉米先辈的teosinte中的2行，到现代优秀玉米品种中的～8-20行。在各种玉米品系中，穗行数可以高达36。
8.在模型植物拟南芥模型中描述的经典调控途径中，分生组织顶点中的细胞分泌clavata3(clv3)肽，其移动通过质外体进入中心干细胞结构域，在那里它与包括clavata1(clv1)和clavata2(clv2)的若干富含亮氨酸的受体(leucine rich receptors，lrr)相互作用。这种受体-配体相互作用刺激信号传导，其最终起到降低wus表达和限制干细胞群扩增的作用。wus的靶标之一是clv3基因本身，通过这种方式，wus起到限制其自身表达并维持干细胞稳态的作用(fletcher,j.c.,plants 7:87(2018))。
9.clv1、clv2或clv3中功能丧失突变(loss of function mutations)导致wus结构域的扩增和增加的分生组织大小(schoof等人,cell 100:635
–
644(2000))。这种分生组织大小的增加常常导致异常的植物生长，因为分生组织不受控制地扩张并且变得紊乱，这种现象被称为扁化(fasciation)(je等人,nat genet 48:ng.3567(2016a))。重要的是，较大的分生组织不仅制造较大的器官，而且围绕较大区域的器官数量增加。由于分生组织大小和器官数目之间的这种关系，玉米clv-wus信号传导基因中的突变可能导致增加的花数目
和产量。
10.需要用于调节分生组织大小的新策略以改善作物性能。


技术实现要素：

11.本发明的一个方面提供了一种植物或其植物部分，其包含在编码cle蛋白的内源clavata3/embryo surrounding region-related(clv3/esr-related)(cle)基因中的至少一个非天然突变。
12.本发明的第二方面提供了一种植物细胞，其包含编辑系统，所述编辑系统包含：(a)crispr-cas效应子蛋白；和(b)指导核酸(例如grna、gdna、crrna、crdna、sgrna、sgdna)，其包含与编码cle蛋白的内源性靶基因具有互补性的间隔子序列。
13.本发明的第三方面提供了在cle基因内包含至少一个非天然存在的突变的玉米植物细胞，其中所述突变是使用编辑系统引入的取代、插入、缺失或颠换(inversion)，所述编辑系统包含与所述cle基因中的靶位点结合的核酸结合结构域。
14.本发明的第四方面提供了一种产生/培育无转基因的经过编辑的玉米植物的方法，包括：将本发明的玉米植物与无转基因的玉米植物杂交，从而将所述至少一个非天然突变引入所述无转基因的玉米植物中；和选择包含所述至少一个非天然突变且无转基因的后代玉米植物，从而产生无转基因的经过编辑的玉米植物。
15.本发明的第五方面提供了一种提供具有增加的穗行数的多个玉米植物的方法，该方法包括在生长区域中种植本发明的两株或更多株植物，从而提供与不包含所述突变的多个对照玉米植物相比具有增加的穗行数的多个玉米植物。
16.本发明的第六方面提供了一种在成熟玉米cle肽中产生变异的方法，包括：将编辑系统引入玉米植物细胞中，其中所述编辑系统靶向编码成熟玉米cle肽蛋白的玉米cle基因的区域，其中所述区域包含与seq id no：75、seq id no：76或seq id no：77的氨基酸序列中的任一个具有至少95％序列同一性的序列，或者所述区域由与seq id no：81-83的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的序列编码；以及使玉米cle基因的区域与编辑系统接触，从而在玉米植物细胞的成熟玉米cle肽中引入突变；以及在成熟玉米cle肽中产生变异。
17.本发明的第七方面提供了一种用于编辑玉米植物细胞的基因组中的特异性位点的方法，所述方法包括：以位点特异性方式切割玉米植物细胞中的内源cle基因内的靶位点，所述内源cle基因(a)包含(i)与seq id no：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列，和/或(ii)与seq id no：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的区域；和/或(b)编码(i)与seq id no：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或(ii)与seq id no：75-77的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列的结构域，从而在编码成熟cle肽的玉米植物细胞的内源基因的部分中产生编辑并产生在所述内源基因的所述部分中包含所述编辑的植物细胞。
18.第八方面提供了一种用于制造玉米植物的方法，其包括：(a)使包含编码前体cle多肽的内源cle基因的玉米植物细胞群与连接了核酸结合结构域(例如，dna结合结构域；例如，编辑系统)的核酸酶接触，所述核酸结合结构域结合这样的序列，所述序列(i)与seq id no：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少90％的序列同一性，(ii)与seq id no：81-83的
任何一个核苷酸序列具有至少90％的序列同一性，(iii)编码与seq id no：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列，或(ii)编码具有与seq id no：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域；(b)从所述细胞群中选择内源cle基因已经突变的植物细胞，从而产生在所述内源cle基因中包含突变的植物细胞；和(c)将所选择的植物细胞生长成植物。
19.第九方面提供了用于增加玉米植物中的穗行数的方法，其包括(a)使包含内源cle基因的玉米植物细胞与靶向所述内源cle基因的核酸酶接触，其中所述核酸酶与结合所述内源cle基因中的靶位点的核酸结合结构域(例如，dna结合结构域；例如，编辑系统)连接，其中所述内源cle基因：(i)包含与seq id no：78-80的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的序列；(ii)包含与seq id no：81-83的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的区域；(iii)编码与seq id no：72-74的氨基酸序列中的任一个具有至少95％序列同一性的序列；和/或(iv)编码具有与seq id no：75-77的氨基酸序列中的任一个有至少95％序列同一性的序列的结构域，以产生在所述内源cle基因中包含突变的玉米植物细胞；和(b)将所述玉米植物细胞生长成在所述内源cle基因中包含所述突变的玉米植物，从而产生具有突变的内源cle基因和增加的穗行数的玉米植物。
20.第十方面提供了生产包含具有突变的内源cle基因的至少一个细胞的玉米植物或其部分的方法，该方法包括使玉米植物或植物部分中的内源cle基因中的靶位点与包含切割结构域和核酸结合结构域的核酸酶接触，其中所述核酸结合结构域与所述内源cle基因中的靶位点结合，其中所述内源cle基因(a)包含与seq id no：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(b)包含与seq id no：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的区域；(c)编码与seq id no：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或(d)编码具有与seq id no：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域，从而生产包含在所述内源cle基因中具有突变的至少一个细胞的玉米植物或其部分。
21.本发明的第十一方面提供了生产包含突变的内源cle基因并显示增加的穗行数的玉米植物或其部分的方法，该方法包括使玉米植物或植物部分中的内源cle基因中的靶位点与包含切割结构域和核酸结合结构域(例如，dna结合结构域)的核酸酶接触，其中所述核酸结合结构域与所述内源cle基因中的靶位点结合，其中所述内源cle基因：(a)包含与seq id no：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(b)包含与seq id no：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的区域；(c)编码与seq id no：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或(d)编码具有与seq id no：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域，从而生产包含具有突变的内源cle基因并显示增加的穗行数的玉米植物或其部分。
22.第十二方面提供了一种与编码前体cle肽的cle基因中的靶位点的部分结合的指导核酸，所述靶位点包含与seq id no：81-83的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的序列或编码与seq id no：75-77的氨基酸序列中的任一个具有至少95％序列同一性的序列。
23.在第十三方面，提供了一种系统，其包含本发明的指导核酸和与所述指导核酸结合的crispr-cas效应子蛋白。
24.第十四方面提供了一种基因编辑系统，其包含与指导核酸结合的crispr-cas效应子蛋白，其中所述指导核酸包含与内源cle基因结合的间隔子序列。
25.在第十五方面，提供了包含crispr-cas效应子蛋白的复合物，所述复合物包含切割结构域和指导核酸，其中所述指导核酸结合编码前体cle多肽的内源cle基因中的靶位点，其中所述内源cle基因：(a)包含与seq id no：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(b)包含与seq id no：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少95％序列同一性的区域；(c)编码与seq id no：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或(d)编码具有与seq id no：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域，其中所述切割结构域切割所述cle基因中的靶标链。
26.在第十六方面，提供了一种表达盒，所述表达盒包含(a)编码crispr-cas效应子蛋白的多核苷酸，所述crispr-cas效应子蛋白包含切割结构域和(b)结合编码前体cle肽的内源cle基因中的靶位点的指导核酸，其中所述指导核酸包含与以下互补并与之结合的间隔子序列：(a)包含与seq id no：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(b)包含与seq id no：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少95％序列同一性的区域；(c)编码与seq id no：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或(d)编码具有与seq id no：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域。
27.在又一个方面，提供了一种在植物中的内源cle基因中产生突变的方法，其包括：(a)将基因编辑系统靶向cle基因的编码位于位置3、5、6、8或9处的氨基酸残基的部分，所述位置是参考seq id no：75、seq id no：76或seq id no：77的氨基酸位置编号而言的，和(b)选择在位置3、5、6、8或9之一处包含备选氨基酸的植物，所述位置是参考seq id no：75、seq id no：76或seq id no：77的氨基酸位置编号而言的。
28.本发明的另一方面提供了编码玉米cle蛋白的显性阴性突变(dominant negative mutation)、半显性突变(semi-dominant mutation)、弱的功能损失突变(weak loss-of-function mutation)、无效等位基因(null allele)或亚效突变(hypomorphic mutation)的核酸。
29.在另一方面，提供了包含本发明的核酸的玉米植物或其部分。
30.在另一方面，提供了一种玉米植物或其部分，其表现出增加的穗行数。
31.在一些方面，提供了一种玉米植物，其还表现出增加的产量，和改善的线虫抗性，以及表现出更大的分生组织。
32.还提供了在其基因组中包含通过本发明的方法产生的一个或多个突变的cle基因的植物以及用于制造本发明的植物的多肽、多核苷酸、核酸构建体、表达盒和载体。
33.在下面的本发明描述中更详细地阐述了本发明的这些和其他方面。
34.序列的简要描述
35.seq id no：1-17是可用于本发明的示例性cas12a氨基酸序列。
36.seq id no：18-20是可用于本发明的示例性cas12a核苷酸序列。
37.seq id no：21-22是编码启动子和内含子的示例性调节序列。
38.seq id no：23-29是可用于本发明的示例性胞嘧啶脱氨酶序列。
39.seq id no：30-40是可用于本发明的示例性腺嘌呤脱氨酶氨基酸序列。
40.seq id no：41是可用于本发明的示例性尿嘧啶-dna糖基化酶抑制剂(ugi)序列。
41.seq id no：42-44提供v型crispr-cas12a核酸酶的原间隔子邻近基序位置的实例。
42.seq id no：45-47提供可用于本发明的示例性肽标签和亲和多肽。
43.seq id no：48-58提供可用于本发明的rna募集基序示例和相应的亲和多肽。
44.seq id no：59-60是可用于本发明的示例性cas9多肽序列。
45.seq id no：61-71是可用于本发明的示例性cas9多核苷酸序列。
46.seq id no：72是未加工的fcp1多肽序列实例。
47.seq id no：73是未加工的cle14多肽序列实例。
48.seq id no：74是未加工的cle7多肽序列实例。
49.seq id no：75是加工的fcp1多肽序列实例。
50.seq id no：76是加工的cle14多肽序列实例。
51.seq id no：77是加工的cle7多肽序列实例。
52.seq id no：78是fcp1编码(cds)序列实例。
53.seq id no：79是cle14编码(cds)序列实例。
54.seq id no：80是cle7编码(cds)序列实例。
55.seq id no：81是fcp1编码(cds)序列的示例性靶区域。
56.seq id no：82是cle14编码(cds)序列的示例性靶区域。
57.seq id no：83是cle7编码(cds)序列的示例性靶区域。
58.seq id no：84-90是突变的fcp1多肽序列实例。
59.seq id no：91-93是突变的cle14多肽序列实例。
60.seq id no：94-100是突变的cle7多肽序列实例。
61.seq id no：101-104是可用于本发明的核酸指导的示例性间隔子序列。
62.seq id no：105-109是编码经加工的cle多肽的示例性突变cle多核苷酸。
附图说明
63.图1提供了fcp1编码序列的图，其中显示了fcp1肽结构域和示例性靶区域。
具体实施方式
64.现在将在下文中参考附图和实施例描述本发明，其中示出了本发明的一些实施方式。该描述并非意在详细列出可以执行本发明的所有不同方式或者可以添加到本发明中的所有特征。例如，关于一个实施方式示出的特征可以并入其他实施方式中，并且关于一个特定实施方式示出的特征可以从该实施方式中删除。因此，本发明中包括，在本发明的一些实施方式中，可以排除或省略本文示出的任何特征或特征组合。另外，基于本发明的本公开，对本文提出的各种实施方式的许多变化和添加对于本领域技术人员将是显而易见的，它们并不脱离本发明。因此，以下描述旨在说明本发明的一些具体实施方式，而不是详尽地指明其所有排列、组合和变化。
65.除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文在对本发明的描述中所使用的术语仅出于描述具体
实施方式的目的，并不意图限制本发明。
66.本文引用的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入本文，以获得与呈现参考文献的句子和/或段落相关的教导。
67.除非上下文另有说明，否则本文描述的本发明的各种特征可以任何组合使用。此外，本发明还预期在本发明的一些实施方式中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征组合。举例来说，如果说明书中陈述组合物包含组分a、b和c，则其具体地表明可以单独地或以任何组合省略何具体放弃a、b或c中的任何一个或其组合。
68.如在本发明的说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一种”、“一个”和“该”/“所述”旨在也包括其复数形式，除非上下文另有明确说明。
69.同样如本文所使用的，“和/或”是指示并且涵盖相关联的所列项目中的一个或多个的任何和所有可能组合，以及当以备选方式(“或”)理解时指没有组合。
70.当提及诸如量或浓度等的可测量值时，如本文所用的术语“约”意在涵盖指定值以及指定值的
±
10％、
±
5％、
±
1％、
±
0.5％或甚至
±
0.1％的变化。例如，“约x”(其中x是可测量值)是指包括x以及x的
±
10％、
±
5％、
±
1％、
±
0.5％或甚至
±
0.1％的变化。本文中针对可测量值提供的范围可包含其中的任何其它范围及/或具体值。
71.如本文所用，诸如“在x和y之间”/“x-y”和“在约x和y之间”/“约x-y”的短语应被解释为包括x和y。如本文所用，短语诸如“在约x与y之间”/“约x-y”意指“在约x与约y之间”，短语诸如“从约x至y”意指“从约x至约y”。
72.除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的叙述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独的值并入本说明书中，如同其在本文中被单独记载一样。例如，如果公开了范围10到15，则还公开了11、12、13和14。
73.如本文中所使用的术语“包括”、“具有”和“包含”等是指存在所陈述的特征、整数、步骤、操作、要素和/或组分，但不排除一个或多个其它特征、整数、步骤、操作、要素、组分和/或其群组的存在或添加。
74.如本文所用，过渡短语“基本上由
……
组成”是指权利要求的范围应被解释为涵盖权利要求中所述的指定材料或步骤以及不实质上影响所要求保护的本发明的基本和新颖特征的那些材料或步骤。因此，当在本发明的权利要求中使用时，术语“基本上由
……
组成”不旨在被解释为等同于“包括”。
75.如本文所用，术语“增加”、“增加的”、“增强”、“增强的”(及其语法变型)描述了与对照相比至少约5％、10％、15％、20％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或更多的升高。例如，包含如本文所述的cle基因中的突变的植物可以表现出增加的穗行数，其比不包含相同突变的对照植物的穗行数多至少约5％或更多。对照植物通常是与被编辑的植物相同的植物，但是对照植物尚未被类似地编辑，因此缺乏所述突变。对照植物可以是等基因植物和/或野生型植物。因此，对照植物可以是与渐渗本文所述突变的受试植物相同的育种系、品种或栽培品种，但对照育种系、品种或栽培品种没有所述突变。在一些实施方案中，本发明的植物和对照植物之间的比较是在相同的生长条件下进行的，例如相同的环境条件(土壤、水合、光、热、营养物等)。
76.如本文所用，术语“减少”、“减少的”、“降低”、“降低的”(及其语法变体)描述了例如与对照物相比至少约5％、10％、15％、20％、25％、35％、50％、75％、80％、85％、90％、
95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％的减少。在特定实施方式中，该减少可以导致没有或基本上没有(即，不显著的量，例如小于约10％或甚至5％)可检测的活性或量。
77.如本文所用，关于核酸分子和/或核苷酸序列(例如rna或dna)使用的术语“表达”、“表达的”等表示核酸分子和/或核苷酸序列被转录并任选地被翻译。因此，核酸分子和/或核苷酸序列可以表达感兴趣的多肽或例如功能性非翻译rna。
[0078]“异源”或“重组”核苷酸序列是不与其被引入的宿主细胞天然关联的核苷酸序列，包括天然存在的核苷酸序列的非天然存在的多个拷贝。“异源”核苷酸/多肽可以源自外来物种，或者如果来自相同物种，则其通过有意的人类干预从组合物和/或基因组基因座的其天然形式被实质性修饰。
[0079]“天然”或“野生型”核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列是指天然存在的或内源的核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列。在一些情况下，“野生型”核酸是没有如本文所述进行编辑的核酸，其可以不同于可能如本文所述进行编辑的“内源”基因(例如，突变的内源基因)。在一些情况下，“野生型”核酸(例如，未编辑的)可以与在其中发现有所述野生型核酸的生物体(例如，转基因生物体)是异源的。作为示例，“野生型内源性clavata3/embryo surrounding region-related(clv3/esr-related)(cle)基因”是cle基因，可选地fcp1基因、cle14基因或cle7基因，其天然存在于参考生物体(例如植物，例如玉蜀黍植物)中或是其内源性的，并且可以经受如本文所述的修饰，之后，这种修饰的内源性基因不再是野生型的。
[0080]
如本文所用，术语“杂合”是指其中不同等位基因存在于同源染色体上的相应基因座处的遗传状态。
[0081]
如本文所用，术语“纯合”是指其中相同等位基因存在于同源染色体上的相应基因座处的遗传状态。
[0082]
如本文所用，术语“等位基因”是指在特定基因座处出现的两个或更多个不同核苷酸或核苷酸序列中的一个。
[0083]“无效等位基因”是由基因突变引起的非功能性等位基因，其导致完全缺乏相应蛋白质的产生或产生非功能性的蛋白质。
[0084]“显性阴性突变”是产生改变的基因产物(例如相对于野生型而言具有异常功能)的突变，该基因产物不利地影响野生型等位基因或基因产物的功能。例如，“显性阴性突变”可以阻断野生型基因产物的功能。显性阴性突变也可以被称为“反效等位基因突变”(anti-morphic mutation)。
[0085]“半显性突变”是指杂合生物体中表型的渐渗小于对纯合生物体观察到的渐渗的突变。
[0086]“弱的功能损失突变”(weak loss-of-function mutation)是导致与野生型基因产物相比具有部分功能或功能降低(部分失活)的基因产物的突变。
[0087]“亚效突变”(hypomorphic mutation)是导致基因功能的部分损失的突变，其可以通过降低的表达(例如，降低的蛋白质和/或降低的rna)或降低的功能性能(例如，降低的活性)而不是功能/活性的完全丧失而发生。“亚效”等位基因是由遗传突变引起的半功能性等位基因，所述遗传突变导致产生以正常效率的1％与99％之间的任何水平发挥功能的对应
蛋白质。
[0088]“基因座”是染色体上基因或标记或等位基因所在的位置。在一些实施方式中，基因座可以涵盖一或多个核苷酸。
[0089]
如本文所用，术语“所需等位基因”、“靶等位基因”和/或“感兴趣的等位基因”可互换使用，以指代与所需性状相关的等位基因。在一些实施方案中，取决于所需表型的性质，所需等位基因可以与给定性状的增加或减少(相对于对照)相关联。
[0090]
当性状与标记连锁时以及当标记的存在是所需性状或性状形式是否存在于和/或在何种程度上将存在于包含所述标记的植物/种质中的指标时，则所述标记与所述性状“相关联”。类似地，当标记与等位基因或染色体间隔连锁时并且当标记的存在是所述等位基因或染色体间隔是否存在于包含该标记的植物/种质中的指标时，则所述标记与所述等位基因或所述染色体间隔“相关联”。
[0091]
如本文所用，术语“回交”和“进行回交”是指后代植物与其亲本之一进行一次或多次(例如1、2、3、4、5、6、7、8次等)回交的过程。在回交方案中，“供体”亲本是指具有待渐渗的所需基因或基因座的亲本植物。“接受者”亲本(使用一次或多次)或“回交”亲本(使用两次或更多次)是指基因或基因座被渐渗其中的亲本植物。例如参见ragot,m.等人，marker-assisted backcrossing:a practical example,in techniques et utilisations des marqueurs moleculaires les colloques,vol.72,pp.45-56(1995)；和openshaw等人,marker-assisted selection in backcross breeding,in proceedings of the symposium"analysis of molecular marker data,"pp.41-43(1994)。初始杂交产生f1代。术语“bc1”是指回交亲本的第二次使用，“bc2”是指回交亲本的第三次使用，等等。
[0092]
如本文所用，术语“杂交”或“杂交的”是指通过授粉而配子融合以产生子代(例如细胞、种子或植物)。该术语包括有性杂交(一株植物被另一株植物授粉)和自交(自花授粉，例如当花粉和胚珠来自同一植物时)。术语“杂交”是指通过授粉融合配子以产生子代的动作。
[0093]
如本文中所用，术语“渐渗(introgression)”、“进行渐渗(introgressing)”和“渐渗的(introgressed)”是指一个或多个基因座的所需等位基因或所需等位基因的组合从一个遗传背景到另一个遗传背景的自然和人工传递。例如，指定基因座处的所需等位基因可以通过同一物种的两个亲本间的有性杂交而传递给至少一个(例如一个或多个)后代，其中至少一个亲本在其基因组中具有所需等位基因。或者，例如，等位基因的传递可以例如在融合的原生质体中通过两个供体基因组之间的重组发生，其中至少一个供体原生质体在其基因组中具有所需的等位基因。所需等位基因可以是标记、qtl、转基因等的选定等位基因。包含所需等位基因的后代可以与具有所需遗传背景的品系回交一次或多次(例如1次、2次、3次、4次或更多次)，选择所需等位基因，结果是所需等位基因变成固定在所需遗传背景中。例如，与非水分胁迫条件下产量增加相关联的标记可从供体渐渗到不包含该标记且在非水分胁迫条件下不显示产量增加的回交亲本中。然后可以将得到的后代回交一次或多次，并进行选择，直至后代具有与在回交亲本背景下非水分胁迫条件下产量增加相关联的遗传标记。
[0094]“遗传图谱”是对给定物种中一条或多条染色体上的基因座之间的遗传连锁关系的描述，通常以图表或表格的形式描述。对于每个遗传图谱，基因座之间的距离通过它们之
间的重组频率来测量。可以使用多种标记来检测基因座之间的重组。遗传图谱是作图群体、所用标记类型和不同群体间每个标记的多态性潜力的产物。基因座之间的顺序和遗传距离可以因遗传图谱的不同而不同。
[0095]
如本文中所用，术语“基因型”是指个体(或个体组)在一个或多个基因座处的遗传组成，与可观察和/或可检测和/或表现的性状(表型)形成对比。基因型由个体从其亲本遗传的一个或多个已知基因座的等位基因定义。术语基因型可用于指个体在单个基因座、多个基因座的遗传组成，或者更一般地，术语基因型可用于指个体基因组中所有基因的个体遗传组成。基因型可以例如使用标记间接表征和/或通过核酸测序直接表征。
[0096]
如本文中所用，术语“种质”指个体(例如植物)、个体群(例如植物品系、品种或家族)或源自品系、品种、物种或培养物的克隆的遗传物质，或来自其的遗传物质。种质可以是生物体或细胞的一部分，或者可以与生物体或细胞分开。一般来说，种质提供了具有特定遗传组成的遗传物质，所述遗传物质为生物体或细胞培养物的一些或全部遗传性质提供了基础。如本文中所用，种质包括可从其生长出新植物的细胞、种子或组织，以及可培养成完整植物的植物部分(例如叶、茎、芽、根、花粉、细胞等)。
[0097]
如本文中所用，术语“栽培品种”和“品种”是指一组相似的植物，它们通过结构或遗传特征和/或性能可以与同一物种内的其它品种相区别。
[0098]
如本文中所用，术语“外来的”、“外来品系”和“外来种质”是指任何非优良的植物、品系或种质。一般来说，外来植物/种质不源自任何已知的优良植物或种质，而是被选择来将一种或多种所需遗传元件引入育种程序(例如以将新颖等位基因引入育种程序)。
[0099]
如本文中所用，植物育种上下文中的术语“杂种”是指通过不同品系或品种或物种的植物杂交(包括但不限于两个近交系之间的杂交)产生的遗传上相异的亲本的后代。
[0100]
如本文中所用，术语“近交”是指基本上纯合的植物或品种。该术语可以指在整个基因组中基本上纯合的植物或植物品种，或者就特别感兴趣的基因组部分而言基本上纯合的植物或植物品种。
[0101]“单倍型”是个体在多个基因座的基因型，即等位基因的组合。通常，定义单倍型的遗传基因座是物理和遗传连锁的，即在同一染色体区段上。术语“单倍型”可以指特定基因座处的多态性，诸如单个标记基因座，或沿染色体区段的多个基因座处的多态性。
[0102]
如本文中所用，术语“异源的”是指这样的核苷酸/多肽，其源自外来物种，或者，如果源自同一物种，则是通过有意的人为干预而在组成和/或基因组基因座上由其天然形式进行了实质性的修饰。
[0103]
与在所述至少一个cle基因中不包含所述修饰的植物相比，其中至少一个(例如一个或多个，例如1、2、3或4或更多个)cle基因(例如一个或多个cle基因)如本文所述被修饰(例如，包含如本文所述的修饰)的植物可具有改善的产量性状。如本文所用，“改善的产量性状”是指与生长相关联的任何植物性状，例如生物量、产量、氮利用效率(nue)、花序尺寸/重量、果实产量、果实质量、果实尺寸、种子尺寸、种子数量、叶组织重量、结瘤数、结瘤质量、结瘤活性、种子头数、分蘖数、分枝数、花数、块茎数、块茎质量、球茎质量、种子数、总种子质量、出叶率、分蘖/分枝出现率(rate of tiller/branch emergence)、出苗率、根的长度、根的数量、根团的尺寸和/或重量，或其任意组合。因此，在一些方面，“改善的产量性状”可包括但不限于与对照植物或其部分(例如，不包含突变的内源cle核酸(例如突变的cle基因)
的植物)相比，具有增加的花序产生，增加的果实产生(例如，增加的果实的数量、重量和/或尺寸；例如，增加的例如玉米的穗的数量、重量和/或尺寸)、增加的果实品质、增加的根的数量、尺寸和/或重量、增加的分生组织尺寸、增加的种子尺寸、增加的生物量、增加的叶尺寸、增加的氮利用效率、增加的高度、增加的节间数和/或增加的节间长度。改善的产量性状也可以由本发明的植物的增加的种植密度产生。因此，在一些方面，本发明的植物能够以增加的密度种植(由于由所述内源性突变引起的植物结构改变所致)，与以相同密度种植的对照植物相比，这导致改善的产量性状。在一些方面，改善的产量性状可以表示为每土地面积生产的谷粒量(例如，每英亩土地的蒲式耳)。
[0104]
如本文所用，“对照植物”意指不含有如本文所述的一个或多个编辑的cle基因的植物，其赋予增强/改善的性状(例如产量性状)或改变的表型。对照植物用于识别和选择如本文所述进行编辑、并且与对照植物相比具有增强的性状或改变的表型的植物。合适的对照植物可以是用于产生包含突变的cle基因的植物的亲本系的植物，例如，没有如本文所述的内源cle基因中的编辑的野生型植物。合适的对照植物也可以是含有赋予其它性状的重组核酸的植物，例如具有增强的除草剂耐受性的转基因植物。在一些情况下，合适的对照植物可以是不含本文所述的突变cle基因的杂合或半合转基因植物系的子代，称为阴性分离株(negative segregant)或阴性等基因系(negative isogenic line)。
[0105]
增强的性状可以是例如与对照植物相比，从种植到成熟的天数减少、茎秆尺寸增加、叶子数量增加、营养阶段的植物高度生长速率增加、穗尺寸增加、每个植物的穗干重增加、每个穗的谷粒数量增加、每个谷粒的重量增加、每个植物的谷粒数量增加、穗空隙减少、谷粒填充期延长、植物高度降低、根分枝数量增加、总根长增加、产量增加、氮使用效率增加和水使用效率增加。改变的表型可以是例如植物高度、生物质、冠层面积、花色素苷含量、叶绿素含量、施用的水、水含量和水使用效率。
[0106]
如本文所用，“性状”是植物或特定植物材料或细胞的生理、形态、生物化学或物理特征。在一些情况下，该特征对于人眼是可见的，并且可以机械地测量，例如种子或植物尺寸、重量、形状、形式、长度、高度、生长速率和发育阶段，或者可以通过生物化学技术测量，例如检测蛋白质、淀粉、某些代谢物或种子或叶子的油含量，或者通过观察代谢或生理过程，例如通过测量对缺水或者特定盐或糖浓度的耐受性，或者通过测量一个或多个基因的表达水平，例如通过采用northern分析、rt-pcr、微阵列基因表达测定或报道基因表达系统，或者通过农业观察，例如高渗胁迫耐受性或产量。然而，可以使用任何技术来测量转基因植物中任何选择的化合物或大分子的量、比较水平或差异。
[0107]
如本文所用，“增强的性状”意指由如本文所述的cle基因中的突变产生的植物特征。这样的性状包括但不限于以增强的植物形态、生理学、生长和发育、产量、营养增强、疾病或害虫抗性或者环境或化学耐受性为特征的增强的农学性状。在一些实施方案中，增强的性状/改变的表型可以是例如从种植到成熟的天数减少、茎秆大小增加、叶的数量增加、生长阶段的植物高度生长速率增加、穗大小增加、每个植物的穗干重增加、每个穗的谷粒数量增加、每个谷粒的重量增加、每个植物的谷粒数量增加、穗空隙减少、谷粒填充期延长、植物高度减少、根分枝数量增加、总根长增加、干旱耐受性、水使用效率增加、寒冷耐受性、氮使用效率增加和产量增加。在一些实施方案中，性状是在非胁迫条件下的产量增加或在环境胁迫条件(environmental stress conditions)下的产量增加。胁迫条件可包括生物胁
迫和非生物胁迫，例如干旱、阴影、真菌疾病、病毒疾病、细菌疾病、昆虫侵袭、线虫侵袭、寒冷温度暴露、热暴露、渗透胁迫、氮养分可用性降低、磷养分可用性降低和高植物密度。“产量”可受许多性质的影响，包括但不限于植物高度、植物生物质、荚数目、植物上的荚位置、节间数目、荚破碎的发生率、谷粒尺寸、穗尺寸、穗尖填充、籽粒败育(kernel abortion)、结瘤和氮固定的效率、营养物同化的效率、对生物和非生物胁迫的抗性、碳同化、植物结构、对倒伏的抗性、种子萌发百分比、幼苗活力和早期性状。产量还可能受到出芽效率(包括在胁迫条件下的发芽)、生长速率(包括在胁迫条件下的生长速率)、开花时间和持续时间、穗数目、穗尺寸、穗重量、每只穗或荚的种子数、种子尺寸、种子组成(淀粉、油、蛋白质)和种子填充特性影响。
[0108]
本文中还使用的术语“性状修饰”包括相对于不包含所述突变的植物(例如野生型植物或阴性分离物)而言，通过在包含如本文所述的内源cle基因中的突变的植物中导致特征的可检测差异来改变所述性状。在一些情况下，可以定量评估所述性状修饰。例如，性状修饰可能是与对照植物相比，观察的性状特征或表型的增加或减少。已知修饰的性状可以存在自然变化。因此，与对照植物相比，观察到的性状修饰需要植物中的性状特征或表型的正态分布和幅度的改变。
[0109]
本公开涉及具有改进的经济上重要的特性、更具体地提高的产量的植物。更具体地，本公开涉及包含本文所述的cle基因中的突变的植物，其中与没有所述突变的对照植物相比，所述植物具有增加的产量。在一些实施方案中，与对照植物相比，如本文所述生产的植物表现出增加的产量或改善的产量性状组分。在一些实施方案中，本公开的植物表现出与产量相关的改进的性状，包括但不限于增加的氮使用效率、增加的氮胁迫耐受性、增加的水使用效率和增加的干旱耐受性，如下文所定义和讨论的。
[0110]
产量可定义为作物的经济价值的可测量产量。产率可以在数量和/或质量的范围内定义。产量可以直接取决于若干因素，例如器官的数量和尺寸、植物结构(例如分枝的数量、植物生物质，例如增加的根部生物质、更陡的根部角度和/或更长的根部等)、开花时间和持续时间、谷物填充时间。根结构和发育、光合效率、营养物摄取、胁迫耐受性、早期活力、延迟衰老和功能保持绿色表型可以是确定产量的因素。因此，优化上述因素可以有助于增加作物产量。
[0111]
本文提及产量相关性状的增加/改善也可以表示植物的一个或多个部分的生物质(重量)的增加，其可以包括地上和/或地下(可收获的)植物部分。特别地，这种可收获的部分是种子，并且本公开的方法的执行导致相对于合适的对照植物而言产量、特别是种子产量增加的植物。术语植物的“产量”可以涉及该植物的营养生物质(根和/或芽生物质)、繁殖器官和/或繁殖体(例如种子)。
[0112]
本公开的植物的增加的产量可以以多种方式测量，包括测试重量、每个植物的种子数、种子重量、每单位面积的种子数(例如，每英亩的种子或种子重量)、每英亩的蒲式耳、每英亩的吨数或每公顷的千数。增加的产量可以因关键生化化合物(例如氮、磷和碳水化合物)的利用改进引起，或者因对环境胁迫(例如冷、热、干旱、盐、阴影、高植物密度和害虫或病原体的攻击)的响应改善引起。
[0113]“增加的产量”可以表现为以下中的一个或多个：(i)植物的一个或多个部分的增加的植物生物质(重量)，特别是植物的地上(可收获)部分，增加的根生物质(增加的根数
量，增加的根厚度，增加的根长度)或任何其他可收获部分的增加的生物质；或(ii)增加的早期活力，本文定义为在萌发后大约三周的改进的幼苗地上区域。
[0114]“早期活力”是指特别是在植物生长的早期阶段期间的活性健康植物生长，可以由由于例如植物更好地适应其环境(例如，优化能源的使用、营养物的摄取以及在芽和根之间的碳分配)而引起的植物适应性增加导致。例如，早期的活力可以是种子在种植后发芽和出苗的能力和幼小植物在发育后生长和发育的能力的组合。具有早期活力的植物还显示出增加的幼苗存活和更好的作物长成，这通常导致高度均匀的田地，其中大多数植物基本上同时达到各种发育阶段，这通常导致产量增加。因此，早期活力可以通过测量各种因素来确定，例如谷粒重量、发芽百分比、出苗百分比、幼苗生长、幼苗高度、根长度、根和芽生物量、冠幅尺寸和颜色等。
[0115]
此外，增加的产量也可以表现为增加的总种子产量，其可以由以下中的一个或多个引起：由于每个植物和/或基于单个种子的种子重量增加而导致的种子生物质(种子重量)的增加，例如每个植物的花/圆锥花序的数量增加；荚的数量增加；节点的数量增加；每个花序/植物的花(“小花”)的数量增加；种子填充速率增加；填充种子的数量增加；种子尺寸(长度、宽度、面积、周长)增加，其也可以影响种子的组成；和/或种子体积增加，其也可以影响种子的组成。在一个实施例中，增加的产量可以是增加的种子产量，例如增加的种子重量；增加的填充种子数量；以及增加的收获指数。
[0116]
增加的产量也可能导致修饰的架构，或者可能由于改进的植物架构而发生。
[0117]
产量增加也可以表现为收获指数增加，表示为可收获部分诸如种子的收率与总生物质的比率
[0118]
本公开还扩展到植物的可收获部分，例如但不限于种子、叶、果实、花、棉铃(boll)、荚、角果(siliques)、坚果、茎、根茎、块茎和球茎。本公开还涉及源自这种植物的可收获部分的产品，例如干颗粒、粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。
[0119]
本公开提供了一种用于增加植物的“产量”或者植物或植物部分的“宽英亩产量”的方法，所述植物或植物部分被定义为每单位面积可收获的植物部分，例如每英亩的种子或种子重量、每英亩的磅数、每英亩的蒲式耳数、每英亩的吨数、每英亩的吨数、每公顷的千克数。
[0120]
如本文所用，“氮使用效率”是指导致所施加的每个氮单位的植物产量、生物质、活力和生长速率增加的过程。所述方法可包括植物摄取、同化、积累、信号传导、感测、重新易位(在植物内)和使用氮。
[0121]
如本文所用，“增加的氮使用效率”是指当经受与正常或标准条件下相同量的可用/施加的氮时，植物比正常更快或更好地生长、发育或产生的能力；当经受少于最佳量的可用/施加的氮时，或在氮限制条件下，植物比正常更快或更好地生长、发育或产生的能力。
[0122]
如本文所用，“氮限制条件”是指提供比足够或成功植物代谢、生长、繁殖成功和/或活力所需的少于最佳量的氮的生长条件或环境。
[0123]
如本文所用，“增加的氮胁迫耐受性”(increased nitrogen stress tolerance)是指当经受少于最佳量的可用/施加的氮时，或在氮限制条件下，植物正常生长、发育或产量，或者生长、发育或产量更快或更好的能力。
[0124]
增加的植物氮使用效率在本领域中可以理解为供应较少的氮而收获相似量的产
量，或通过供应最佳/足够量的氮获得增加的产量。增加的氮使用效率可以改善植物氮胁迫耐受性，并且还可以改善种子的作物质量和生化成分，例如蛋白质产量和油产量。术语“提高的氮使用效率”、“增加的氮使用效率”和“氮胁迫耐受性”在本公开中可互换地用于指在氮限制条件下具有提高的生产率的植物。
[0125]
如本文所用，“水使用效率”是指蒸腾的每单位水蒸气被叶同化的二氧化碳的量。它构成了控制干燥环境中的植物生产力的最重要特性之一。“干旱耐受性”是指植物适应干旱或干旱条件的程度。植物对水缺乏的生理反应包括叶萎缩、叶面积的减小、叶脱裂和通过将营养物引导到植物的地下部分来刺激根生长。通常，植物在开花和种子发育(生殖阶段)期间对干旱更易感，因为植物的资源被偏向支持根生长。此外，脱落酸(aba)，一种植物胁迫激素，诱导叶气孔(涉及气体交换的微观孔隙)闭合，从而减少通过蒸腾的水损失，并降低光合作用的速率。这些响应在短期内提高了植物的用水效率。术语“增加的水使用效率”、“提高的水使用效率”和“增加的干旱耐受性”在本公开中可互换地用于指在水限制性条件下具有改善的生产力的植物。
[0126]
如本文所用，“增加的水使用效率”是指当经受与正常或标准条件下相同量的可用/施加的水时，植物比正常更快或更好地生长、发育或收益的能力；当经受减少量的可用/施加的水(水输入)或在水分胁迫或水不足胁迫的条件下，植物正常地生长、发育或收益或者更快或更好地生长、发育或收益的能力。
[0127]
如本文所用，“增加的干旱耐受性”是指当经受减少量的可用/施加的水和/或在急性或慢性干旱的条件下时，植物正常生长、发育或收益，或者比正常更快或更好地生长、发育或收益的能力；或者当经受减少量的可用/施加的水(水输入)或在缺水胁迫的条件下或在急性或慢性干旱的条件下时，植物正常生长、发育或收益的能力。
[0128]
如本文所用，“干旱胁迫”是指导致缺水和使植物经受对植物组织的胁迫和/或损害和/或负面地影响谷物/作物产量的干燥期(急性或慢性/长期)；导致缺水和/或更高温度和使植物经受对植物组织的胁迫和/或损害和/或负面地影响谷物/作物产量的干燥期(急性或慢性/长期)。
[0129]
如本文所用，“缺水”是指提供的水少于植物充分/成功生长和发育所需的最佳量的条件或环境。
[0130]
如本文所用，“水分胁迫”(water stress)是指提供的水量比植物/作物的充分/成功生长和发育所需的量更不适当(更少/不足或更多/过量)的条件或环境，从而使植物经受对植物组织的胁迫和/或损害和/或不利地影响谷粒/作物产量。
[0131]
如本文所用，“缺水胁迫”(water deficit stress)是指提供的水量比植物/作物的充分/成功生长和发育所需的水量更少/不足、从而使植物经受对植物组织的胁迫和/或损害和/或不利地影响谷粒产量的条件或环境。
[0132]
如本文中所用，术语“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸序列”和“多核苷酸”指线性或分支的、单链或双链的rna或dna，或其杂交体。该术语还包括rna/dna杂交体。当合成产生dsrna时，不太常见的碱基，诸如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤等也可用于反义、dsrna和核酶配对。例如，含有尿苷和胞苷的c-5丙炔类似物的多核苷酸已经显示出以高亲和力结合rna，并且是基因表达的强效反义抑制剂。也可以进行其他修饰，诸如对磷酸二酯骨架或rna的核糖基团中的2
’‑
羟基的修饰。
[0133]
如本文中所用，术语“核苷酸序列”是指核苷酸的杂聚物或这些核苷酸从核酸分子的5’末端至3'末端的序列，包括dna或rna分子，包括cdna、dna片段或部分、基因组dna、合成的(例如化学合成的)dna、质粒dna、mrna和反义rna，其中任一种都可以是单链或双链的。术语“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸构建体”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”在本文中也可互换使用，是指核苷酸的杂多聚体。本文提供的核酸分子和/或核苷酸序列在本文中以从左至右的5’至3’方向呈现，并且使用美国测序规则37cfr
§§
1.821-1.825和世界知识产权组织(wipo)标准st.25中阐述的用于表示核苷酸特征的标准代码来表示。如本文中所用，“5’区”可以指多核苷酸的最靠近多核苷酸5’末端的区域。因此，例如，多核苷酸的5’区中的元件可以位于从位于所述多核苷酸的5’末端的第一个核苷酸至位于该多核苷酸中间的核苷酸的任何位置。如本文中所用，“3’区”可以指多核苷酸的最靠近多核苷酸3’末端的区域。因此，例如，多核苷酸的3’区中的元件可以位于从位于所述多核苷酸的3’末端的第一个核苷酸至位于该多核苷酸中间的核苷酸的任何位置。
[0134]
如本文中关于核酸所使用的，术语“片段”或“部分”是指相对于参考核酸而言长度缩短(例如缩短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、20、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850或900个或更多个核苷酸或者其间的任何范围或数值)的核酸，并且其包含与所述参考核酸的相应部分相同或几乎相同(例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同)的连续核苷酸的核苷酸序列、基本上由所述核苷酸序列组成和/或由所述核苷酸序列组成。如果合适，这种核酸片段可以包含在更大的多核苷酸中作为其组分。例如，本发明的指导核酸的重复序列可以包含野生型crispr-cas重复序列(例如野生型crispr-cas重复序列；例如来自例如cas9、cas12a(cpf1)、cas12b、cas12c(c2c3)、cas12d(casy)、cas12e(casx)、cas12g、cas12h、cas12i、c2c4、c2c5、c2c8、c2c9、c2c10、cas14a、cas14b和/或cas14c等的crispr cas系统的重复)的“部分”。
[0135]
在一些实施方案中，核酸片段可包含编码cle多肽的核酸的约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、285、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、395、396、397、398、399、400、410、411、412、413、414、415、420、425、430、435、440、445、450或500或者更多个连续核苷酸或者其中的任何范围或数值，基本上由其组成或由其组成，任选地，cle基因的片段可以是约5、6、7、8、9、10个连续核苷酸至约35、36、37、3839或40个连续核苷酸长，约85、90、95、100个连续核苷酸至约300、320、350、375、400或更多个连续核苷酸长，或其中的任何范围或数值。在一些实施方案中，编码cle多肽的核酸的片段可以是约36个连续核苷酸长。
[0136]
在一些实施方案中，“序列特异性核酸结合结构域”可与编码例如本文所述的cle多肽的核苷酸序列(例如dna、rna)的一个或多个片段或部分结合。
[0137]
如本文关于多肽所使用的，术语“片段”或“部分”可指相对于参考多肽而言长度缩短的多肽，其包含与所述参考多肽的相应部分相同或几乎相同(例如90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同)的连续氨基酸的氨基酸序列或基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。在适当的情况下，这种多肽片段可以包含在一个更大的多肽中作为其构成部分。在一些实施方案中，所述多肽片段包含参考多肽的至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、260、270、280或290个或更多个连续氨基酸，基本上由所述连续氨基酸组成或由所述连续氨基酸组成。在一些实施方式中，多肽片段可包含cle多肽的约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135或136或更多个连续氨基酸残基，或其间的任何范围或数值(例如seq id no：66-68的片段或部分(例如seq id no：69-71))，基本上由其组成或由其组成。
[0138]
在一些实施方案中，这种缺失可以是显性阴性等位基因、半显性等位基因、弱的功能损失等位基因、无效等位基因或亚效突变(hypomorphic mutation)，其被包含在植物中时可以导致植物与不包含所述缺失的植物相比表现出增加的穗行数。在一些实施方式中，这样的植物还可表现出增加的产量和增加的线虫抗性，以及更大的分生组织。可以在多于一个位置编辑cle基因，从而提供包含多于一个突变的cle基因。在一些实施方案中，如本文所述突变的cle多肽可能包含多于一个编辑，其可能导致具有多于一个氨基酸取代的肽。
[0139]
在一些实施方案中，针对核酸的“部分”是指来自基因(例如cle基因)的至少2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、285、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、395、396、397、398、399、400、410、411、412、413、414、415、420、425、430、435、440、445、450或500个或更多个连续的核苷酸。在一些实施方案中，编码cle多肽的基因组序列的部分可以长度为约285、399或411个连续核苷酸(例如seq id no：78-80；例如cle编码序列)。在一些实施方案中，cle多肽基因的部分可以长度为约36个连续核苷酸(例如seq id no：81-83)。在一些实施方案中，针对多肽的“部分”意指来自多肽(例如cle多肽)的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52个或更多个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，cle多肽的“部分”可以具有约12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或更多个连续氨基酸残基(例如seq id no：72或seq id no：73的氨基酸残基53-104、63-94、73-84；或者seq id no：74的氨基酸残基78-129、88-119、98-109)。
[0140]
如本文关于核酸所使用的，术语“功能性片段”是指编码多肽的功能性片段的核酸。
[0141]
如本文中所用，术语“基因”是指能够用于产生mrna、反义rna、mirna、抗微小rna反义寡脱氧核糖核苷酸(amo)等的核酸分子。基因可以能够用于或不能够用于产生功能性蛋白质或基因产物。基因可以包括编码区和非编码区(例如内含子、调控元件、启动子、增强子、终止序列和/或5’和3’非翻译区)。基因可以是“分离的”，其是指核酸实质性或基本上不含通常被发现与以其天然状态存在的所述核酸相关联的组分。此类组分包括来自重组生产的其他细胞材料、培养基和/或用于化学合成所述核酸的各种化学物质。
[0142]
术语“突变”是指点突变(例如错义或无义，或导致移框的单个碱基对的插入或缺失)、插入、缺失和/或截短。当突变是氨基酸序列中的残基被另一个残基取代，或者序列中一个或多个残基的缺失或插入时，通常通过列出原始残基、随后是该残基在所述序列中的位置以及新取代的残基的身份来描述突变。截短可包括在多肽的c末端或在多肽的n末端的截短。多肽的截短可以是编码所述多肽的基因的相应5’端或3’端的缺失的结果。当将一个或多个碱基对的缺失或插入引入基因时，可以发生移框突变。基因中的移框突变可以导致产生与野生型多肽相比更长、更短或相同长度的多肽，这取决于第一终止密码子在所述基因的突变区域之后何时出现。在一些实施方案中，突变可以是约10至约2000个连续碱基对的dna颠换。
[0143]
如本文中所用，术语“互补的”或“互补性”是指多核苷酸在允许的盐和温度条件下通过碱基配对的天然结合。例如，序列“a-g-t”(5’至3’)与互补序列“t-c-a”(3’至5’)结合。两个单链分子之间的互补性可以是“部分的”，其中只有一些核苷酸结合，或者当单链分子之间存在完全互补性时，互补性可以是完全的。核酸链之间的互补程度对核酸链之间杂交的效率和强度有显著影响。
[0144]
如本文中所用，“互补”可以指与比较核苷酸序列有100％互补性，或者其可以指与比较核苷酸序列有小于100％互补性(例如约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％等的互补性)。
[0145]
具有同源性的不同核酸或蛋白质在本文中被称为“同源物”。术语同源物包括来自相同物种和其他物种的同源序列以及来自相同物种和其他物种的直向同源序列。“同源性”是指两个或更多个核酸和/或氨基酸序列之间以位置同一性百分比(即，序列相似性或同一性)表示的相似性水平。同源性也指不同核酸或蛋白质之间相似功能特性的概念。因此，本发明的组合物和方法还包含与本发明核苷酸序列和多肽序列的同源物。如本文中所用，“直向同源”是指在物种形成期间从共同的祖先基因产生的不同物种中的同源核苷酸序列和/或氨基酸序列。本发明核苷酸序列的同源物与本发明的所述核苷酸序列具有实质性的序列同一性(例如至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％)。
[0146]
如本文中所用，“序列同一性”是指两个最佳比对的多核苷酸或多肽序列在组分(例如核苷酸或氨基酸)比对窗口中不变的程度。“同一性”可以通过已知的方法容易地计算，所述方法包括、但不限于在以下文献中描述的方法：computational molecular biology(lesk,a.m.编辑)oxford university press,new york(1988)；biocomputing:informatics and genome projects(smith,d.w.编辑)academic press,new york(1993)；
computer analysis of sequence data,part i(griffin,a.m.和griffin,h.g.编辑)humana press,new jersey(1994)；sequence analysis in molecular biology(von heinje,g.编辑)academic press(1987)；和sequence analysis primer(gribskov,m.和devereux,j.编辑)stockton press,new york(1991)。
[0147]
如本文中所用，术语“序列同一性百分比”或“同一性百分比”是指当两个序列最佳比对时，参考(“查询”)多核苷酸分子(或其互补链)的线性多核苷酸序列中与测试(“受试”)多核苷酸分子(或其互补链)的线性多核苷酸序列中相同核苷酸的百分比。在一些实施方案中，“序列同一性百分比”可以指与参照多肽相比，氨基酸序列中相同氨基酸的百分比。
[0148]
如本文中所用，在两个核酸分子、核苷酸序列或多肽序列的上下文中，短语“实质性同一”/“实质性相同”或“实质性同一性”是指两个或更多个序列或亚序列在就最大对应性进行比较和比对时，具有如使用以下序列比较算法之一或通过目测检查所测量的至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％核苷酸或氨基酸残基同一性。在本发明的一些实施方案中，实质性同一性存在于本发明核苷酸序列的连续核苷酸区域中，所述连续核苷酸区域的长度为约10个核苷酸至约20个核苷酸、约10个核苷酸至约25个核苷酸、约10个核苷酸至约30个核苷酸、约15个核苷酸至约25个核苷酸、约30个核苷酸至约40个核苷酸、约50个核苷酸至约60个核苷酸、约70个核苷酸至约80个核苷酸、约90个核苷酸至约100个核苷酸、约100个核苷酸至约200个核苷酸、约100个核苷酸至约300个核苷酸、约100个核苷酸至约400个核苷酸、约100个核苷酸至约500个核苷酸、约100个核苷酸至约600个核苷酸、约100个核苷酸至约800个核苷酸、约100个核苷酸至约900个核苷酸、或更多个核苷酸，或者其间的任何范围，直至序列的全长。在一些实施方案中，核苷酸序列可以在至少约20个核苷酸(例如约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、50、60、70或80个核苷酸或更多个)上实质性相同。
[0149]
在本发明的一些实施方案中，实质性同一性存在于本发明多肽的连续氨基酸残基区域上，其为长度为约3个氨基酸残基至约20个氨基酸残基、约5个氨基酸残基至约25个氨基酸残基、约7个氨基酸残基至约30个氨基酸残基、约10个氨基酸残基至约25个氨基酸残基、约15个氨基酸残基至约30个氨基酸残基、约20个氨基酸残基至约40个氨基酸残基、约25个氨基酸残基至约40个氨基酸残基、约25个氨基酸残基至约50个氨基酸残基、约30个氨基酸残基至约50个氨基酸残基、约40个氨基酸残基至约50个氨基酸残基、约40个氨基酸残基至约70个氨基酸残基、约50个氨基酸残基至约70个氨基酸残基、约60个氨基酸残基至约80个氨基酸残基、约70个氨基酸残基至约80个氨基酸残基、约90个氨基酸残基至约100个氨基酸残基，或更多个氨基酸残基，以及其中的任何范围，直至序列的全长。在一些实施方案中，多肽序列可以在至少约8个连续的氨基酸残基(例如长度约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、130、140、150、175、200、225、250、300、350个或更多个
氨基酸，或更多连续氨基酸残基)上彼此实质性相同。在一些实施方式中，两种或更多种cle多肽可以相同或基本上相同(例如至少70％至99.9％相同)；例如约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％相同或其间的任何范围或数值。
[0150]
对于序列比较，通常一个序列作为与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数，计算一个或多个测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
[0151]
用于比对比较窗口的序列的最佳比对是本领域技术人员公知的，并且可以通过诸如以下的工具进行：smith和waterman的局部同源性算法、needleman和wunsch的同源性比对算法、pearson和lipman的相似性搜索方法，以及任选地通过这些算法的计算机化实现(诸如gap、bestfit、fasta和tfasta(可作为wisconsin(accelrys inc.,san diego,ca)的一部分获得))进行。测试序列和参考序列的比对区段的“同一性分数”是两个比对的序列共有的相同组分的数目除以参考序列区段(例如整个参考序列或参考序列的较小确定部分)中组分的总数。序列同一性百分比表示为同一性分数乘以100。一个或多个多核苷酸序列的比较可以是与全长多核苷酸序列或其一部分的比较，或者是与更长的多核苷酸序列的比较。出于本发明的目的，对于翻译的核苷酸序列，也可以使用blastx 2.0版，对于多核苷酸序列，使用blastn 2.0版来确定“同一性百分比”。
[0152]
当两个核苷酸序列在严格条件下相互杂交时，也可以认为这两个序列是实质性互补的。在一些实施方案中，被认为实质性互补的两个核苷酸序列在高度严格条件下相互杂交。
[0153]
核酸杂交实验如southern和northern杂交上下文中的“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。核酸杂交的详细指南可见于laboratory techniques in biochemistry and molecular biology-hybridization with nucleic acid probes第i部分第2章"overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”，elsevier,new york(1993)。通常，在确定的离子强度和ph下，高度严格的杂交和洗涤条件被选择为比具体序列的热熔点(tm)低约5℃。
[0154]
tm是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和ph下)。选择非常严格的条件，使其等于特定探针的tm。在southern或northern印迹中，用于具有超过100个互补残基的互补核苷酸序列在滤膜上杂交的严格杂交条件的实例是42℃下的50％甲酰胺和1mg肝素，其中杂交进行过夜。高度严格的洗涤条件的实例是在72℃下用0.1 5m nacl洗涤约15分钟。严格洗涤条件的实例是在65℃下用0.2x ssc洗涤15分钟(关于ssc缓冲液的描述，参见sambrook，同下)。通常，高严格洗涤之前是低严格性洗涤，以去除背景探针信号。对于例如超过100个核苷酸的双链体，中等严格洗涤的实例是在45℃下用1x ssc洗涤15分钟。对于例如超过100个核苷酸的双链体，低严格洗涤的实例是在40℃下用4-6x ssc洗涤15分钟。对于短探针(例如约10至50个核苷酸)，严格条件通常涉及小于约1.0m na离子的盐浓度，在ph 7.0至8.3下通常为约0.01至1.0m na离子浓度(或其他盐)，并且温度通常为
至少约30℃。还可通过加入诸如甲酰胺等去稳定剂来达到严格条件。一般来说，在特定的杂交测定中，信噪比为对于无关探针观察的信噪比的2倍(或更高)表明检测到了特异性杂交。如果在严格条件下不相互杂交的核苷酸序列编码的蛋白质实质性相同，则所述核苷酸序列仍然是实质性相同的。这可以在例如使用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生核苷酸序列的拷贝时发生。
[0155]
可以对本发明的多核苷酸和/或重组核酸构建体(例如表达盒和/或载体)进行密码子优化以用于表达。在一些实施方案中，可以对本发明编辑系统的多核苷酸、核酸构建体、表达盒和/或载体(例如包含/编码序列特异性核酸结合结构域(例如dna结合结构域)(例如来自多核苷酸引导的核酸内切酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(talen)、argonaute蛋白和/或crispr-cas核酸内切酶(例如crispr-cas效应子蛋白)(例如i型crispr-cas效应子蛋白、ii型crispr-cas效应子蛋白、iii型crispr-cas效应子蛋白、iv型crispr-cas效应子蛋白、v型crispr-cas效应子蛋白或vi型crispr-cas效应子蛋白)、核酸酶(例如核酸内切酶(例如fok1)、多核苷酸引导的核酸内切酶、crispr-cas核酸内切酶(例如crispr-cas效应子蛋白)、锌指核酸酶和/或转录激活因子样效应核酸酶(talen))、脱氨酶蛋白/结构域(例如腺嘌呤脱氨酶、胞嘧啶脱氨酶)、编码逆转录酶或结构域的多核苷酸、编码5'-3’核酸外切酶多肽的多核苷酸和/或亲和多肽、肽标签等的序列特异性核酸结合结构域)进行密码子优化，以用于在植物中表达。在一些实施方案中，本发明的经密码子优化的核酸、多核苷酸、表达盒和/或载体与未经密码子优化的参考核酸、多核苷酸、表达盒和/或载体具有约70％至约99.9％(例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％)同一性或更高同一性。
[0156]
在本文所述的任何实施方案中，本发明的多核苷酸或核酸构建体可以与多种启动子和/或其它调控元件可操作地连接，用于在植物和/或植物细胞中表达。因此，在一些实施方案中，本发明的多核苷酸或核酸构建体还可包含与一个或多个核苷酸序列可操作地连接的一个或多个启动子、内含子、增强子和/或终止子。在一些实施方案中，启动子可以与内含子(例如ubi1启动子和内含子)可操作地相关联。在一些实施方案中，与内含子相关联的启动子可被称为“启动子区”(例如ubi1启动子和内含子)。
[0157]
如本文中提及多核苷酸时使用的“可操作地连接”或“可操作地相关联的”是指所示元件在功能上彼此相关，并且通常在物理上也相关。因此，如本文中所用，术语“可操作地连接”或“可操作地相关联的”是指单个核酸分子上功能上相关联的核苷酸序列。因此，与第二核苷酸序列可操作连接的第一核苷酸序列意指第一核苷酸序列被放置成与第二核苷酸序列处于功能关系中时的情况。例如，如果启动子实现核苷酸序列的转录或表达，则所述启动子与所述核苷酸序列可操作地相关联。本领域技术人员将会理解，控制序列(例如启动子)不需要与与其可操作地相关联的核苷酸序列毗邻，只要控制序列能够指导其表达即可。因此，例如居间的不翻译、但仍转录的核酸序列可存在于启动子与所述核苷酸序列之间，并且所述启动子仍然可以被认为是可与该核苷酸序列“可操作地连接”。
[0158]
如本文中所用，涉及多肽时，术语“连接的”是指一个多肽与另一个多肽的附接。多肽可以直接(例如通过肽键)或通过接头与另一多肽(在n-末端或c-末端)连接。
[0159]
术语“接头”是本领域公认的，是指连接两个分子或部分(例如,融合蛋白的两个结
构域，例如核酸结合多肽或结构域和肽标签和/或逆转录酶和与肽标签结合的亲和多肽；或dna核酸内切酶多肽或结构域和肽标签和/或逆转录酶和与肽标签结合的亲和多肽)的化学基团或分子。接头可以由单个连接分子组成，或者可以包含不止一个连接分子。在一些实施方案中，接头可以是有机分子、基团、聚合物或化学部分，诸如二价有机部分。在一些实施方案中，接头可以是氨基酸或者其可以是肽。在一些实施方案中，接头是肽。
[0160]
在一些实施方案中，可用于本发明的肽接头的长度可为约2至约100个或更多个氨基酸，例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多个氨基酸(例如长度为约2至约40、约2至约50、约2至约60、约4至约40、约4至约50、约4至约60、约5至约40、约5至约50、约5至约60、约9至约40、约9至约50、约9至约60、约10至约40、约10至约50、约10至约60个，或长度为约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个氨基酸至约26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多个氨基酸(例如长度为约105、110、115、120、130、140、150个或更多个氨基酸))。在一些实施方案中，肽接头可以是gs接头。
[0161]
如本文中所用，关于多核苷酸的术语“连接的”或“融合的”是指一个多核苷酸与另一个多核苷酸的附接。在一些实施方案中，两个或更多个多核苷酸分子可以通过接头连接，所述接头可以是有机分子、基团、聚合物或化学部分，诸如二价有机部分。多核苷酸可以通过共价或非共价键联或结合(包括例如watson-crick碱基配对)或通过一个或多个连接核苷酸与另一个多核苷酸(在5’末端或3’末端)连接或融合。在一些实施方案中，某一结构的多核苷酸基序可插入另一多核苷酸序列中(例如引导rna中发夹结构的延伸)。在一些实施方案中，连接核苷酸可以是天然存在的核苷酸。在一些实施方案中，连接核苷酸可以是非天然存在的核苷酸。
[0162]“启动子”是控制或调节与所述启动子可操作地相关联的核苷酸序列(例如编码序列)的转录的核苷酸序列。由启动子控制或调节的编码序列可以编码多肽和/或功能性rna。通常，“启动子”是指含有rna聚合酶ii的结合位点并指导转录起始的核苷酸序列。通常，相对于相应编码序列的编码区的起始，启动子位于5’或上游。启动子可包含作为基因表达的调控子的其它元件；例如启动子区域。这些包括tata盒共有序列，并且通常是caat盒共有序列(breathnach和chambon，(1981)annu.rev.biochem.50:349)。在植物中，caat盒可用agga盒代替(messing等，(1983)于genetic engineering of plants,t.kosuge,c.meredith和a.hollaender(编辑),plenum press，第211-227页中)。
[0163]
可用于本发明的启动子可包括例如组成型、诱导型、时间调控型、发育调控型、化学调控型、组织优先型和/或组织特异性启动子，用于制备重组核酸分子，例如“合成核酸构建体”或“蛋白质-rna复合物”。这些不同类型的启动子是本领域已知的。
[0164]
启动子的选择可以根据表达的时间和空间要求而变化，也可以根据待转化的宿主细胞而变化。用于许多不同生物体的启动子是本领域公知的。基于本领域的广泛知识，可以
为特定目标宿主生物选择合适的启动子。因此，例如，对模式生物中高度组成型表达的基因上游的启动子了解很多，此类知识可以容易地访问并在适当的情况下应用于其它系统中。
[0165]
在一些实施方案中，在植物中有功能的启动子可以与本发明的构建体一起使用。可用于在植物中驱动表达的启动子的非限制性实例包括rubisco小亚基基因1的启动子(prbcs1)、肌动蛋白基因的启动子(pactin)、硝酸还原酶基因的启动子(pnr)和重复碳酸酐酶基因1的启动子(pdca1)(参见walker等人，plant cell rep.23:727-735(2005)；li等人，gene 403:132-142(2007)；li等人，mol biol.rep.37:1143-1154(2010))。prbcs1和pactin是组成型启动子，pnr和pdca1是诱导型启动子。pnr受硝酸盐诱导，受铵抑制(li等人，gene 403:132-142(2007))，pdca1受盐诱导(li等人，mol biol.rep.37:1143-1154(2010))。在一些实施方案中，可用于本发明的启动子是rna聚合酶ii(pol ii)启动子。在一些实施方案中，来自玉米的u6启动子或7sl启动子可用于本发明的构建体。在一些实施方案中，来自玉米的u6c启动子和/或7sl启动子可用于驱动指导核酸的表达。在一些实施方案中，来自大豆的u6c启动子、u6i启动子和/或7sl启动子可用于本发明的构建体。在一些实施方案中，来自大豆的u6c启动子、u6i启动子和/或7sl启动子可用于驱动指导核酸的表达。
[0166]
可用于植物的组成型启动子的实例包括但不限于，叶香树病毒启动子(cestrum virus promotet,cmp)(美国专利第7,166,770号)、水稻肌动蛋白1启动子(wang等人(1992)mol.cell.biol.12:3399-3406；以及美国专利第5,641,876号)、camv 35s启动子(odell等人(1985)nature313:810-812)、camv 19s启动子(lawton等人(1987)plant mol.biol.9:315-324)、nos启动子(ebert等人(1987)proc.natl.acad.sci usa 84:5745-5749)、adh启动子(walker等人(1987)proc.natl.acad.sci.usa 84:6624-6629)、蔗糖合酶启动子(yang&russell(1990)proc.natl.acad.sci.usa 87:4144-4148)和遍在蛋白启动子。来源于遍在蛋白的组成型启动子在许多细胞类型中积累。已经从几种植物物种中克隆了遍在蛋白启动子用于转基因植物，例如向日葵(binet等人，1991.plant science 79:87-94)、玉米(christensen等人，1989，plant molec.biol.12:619-632)和拟南芥(norris等人1993.plant molec.biol.21:895-906)。已经在转基因单子叶植物系统中开发了玉米遍在蛋白启动子(ubip)，专利公开ep 0 342 926中公开了其序列和构建用于单子叶植物转化的载体。遍在蛋白启动子适用于在转基因植物，尤其是单子叶植物中表达本发明的核苷酸序列。另外，由mcelroy等人描述的启动子表达盒(mol.gen.genet.231:150-160(1991))可被容易地修饰以表达本发明的核苷酸序列，并且特别适用于单子叶宿主。
[0167]
在一些实施方案中，组织特异性/组织偏好启动子可用于在植物细胞中表达异源多核苷酸。组织特异性或偏好性表达模式包括但不限于绿色组织特异性或偏好性、根特异性或偏好性、茎特异性或偏好性、花特异性或偏好性或者花粉特异性或偏好性表达模式。适于在绿色组织中表达的启动子包括许多调节参与光合作用的基因的启动子，这些启动子中的许多启动子已被从单子叶植物和双子叶植物中克隆出来。在一个实施方案中，可用于本发明的启动子是来自磷酸烯醇羧化酶基因的玉米pepc启动子(hudspeth&grula,plant molec.biol.12:579-589(1989))。组织特异性启动子的非限制性实例包括那些与编码种子贮藏蛋白(诸如β-伴大豆球蛋白、十字花科蛋白(cruciferin)、油菜籽蛋白(napin)和菜豆蛋白)、玉米蛋白或油体蛋白(诸如油质蛋白)、或参与脂肪酸生物合成的蛋白(包括酰基载体蛋白、硬脂酰-acp去饱和酶和脂肪酸去饱和酶(fad 2-1))的基因相关联的启动子，以及
在胚胎发育期间表达的其它核酸(诸如bce4，参见例如kridl等人(1991)seed sci.res.1:209-219；以及欧洲专利第255378号)。可用于在植物，特别是玉米中表达本发明核苷酸序列的组织特异性或组织偏好性启动子包括但不限于在根、髓、叶或花粉中指导表达的启动子。此类启动子公开于例如wo 93/07278(通过引用以其整体并入本文)中。可用于本发明的组织特异性或组织偏好性启动子的其它非限制性实例：美国专利6,040,504中公开的棉花rubisco启动子；美国专利5,604,121中公开的水稻蔗糖合酶启动子；de framond(febs 290:103-106(1991)；属于ciba-geigy的ep 0 452 269)描述的根特异性启动子；美国专利5,625,136(属于ciba-geigy)中描述的茎特异性启动子，其驱动玉米trpa基因的表达；wo 01/73087中公开的夜香树夜香树黄叶卷曲病毒启动子；和花粉特异性或偏好性启动子，包括但不限于来自水稻的prooslps10和prooslps11(nguyen等人，plant biotechnol.reports 9(5):297-306(2015))、来自玉米的zmstk2_usp(wang等人，genome 60(6):485-495(2017))、来自番茄的lat52和lat59(twell等人，development 109(3):705-713(1990))、zm13(美国专利第10,421,972号)、来自拟南芥的pla
2-δ启动子(美国专利第7,141,424号)和/或来自玉米的zmc5启动子(国际pct公布第wo1999/042587号)。
[0168]
植物组织特异性/组织偏好性启动子的其他实例包括但不限于根毛特异性顺式元件(rhe)(kim等人，the plant cell 18:2958-2970(2006))、根特异性启动子rcc3(jeong等人，plant physiol.153:185-197(2010))和rb7(美国专利第5459252号)、植物凝集素启动子(lindstrom等人(1990)der.genet.11:160-167；和vodkin(1983)prog.clin.biol.res.138:87-98)、玉米醇脱氢酶1启动子(dennis等人(1984)nucleic acids res.12:3983-4000)、s-腺苷-l-甲硫氨酸合成酶(sams)(vander mijnsbrugge等人(1996)plant and cell physiology,37(8):1108-1115)、玉米光收获复合物启动子(bansal等人(1992)proc.natl.acad.sci.usa 89:3654-3658)、玉米热休克蛋白启动子(o'dell等人(1985)embo j.5:451-458；和rochester等人(1986)embo j.5:451-458)、豌豆小亚基rubp羧化酶启动子(cashmore,"nuclear genes encoding the small subunit of ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase”第29-39页:genetic engineering of plants(hollaender编辑，plenum press 1983；和poulsen等人(1986)mol.gen.genet.205:193-200)、ti质粒甘露碱合酶启动子(langridge等人(1989)proc.natl.acad.sci.usa 86:3219-3223)、ti质粒胭脂氨酸合酶启动子(langridge等人(1989)，同上)，矮牵牛查尔酮异构酶启动子(van tunen等人(1988)embo j.7:1257-1263)、大豆富含甘氨酸蛋白1启动子(keller等人(1989)genes dev.3:1639-1646)、截短的camv 35s启动子(o'dell等人(1985)nature 313:810-812)、马铃薯块茎储藏蛋白(patatin)启动子(wenzler等人(1989)plant mol.biol.13:347-354)、根细胞启动子(yamamoto等人(1990)nucleic acids res.18:7449)、玉米醇溶蛋白启动子(kriz等人(1987)mol.gen.genet.207:90-98；langridge等人(1983)cell 34:1015-1022；reina等人(1990)nucleic acids res.18:6425；reina等人(1990)nucleic acids res.18:7449；和wandelt等人(1989)nucleic acids res.17:2354)、球蛋白-1启动子(belanger等人(1991)genetics 129:863-872)、α-微管蛋白cab启动子(sullivan等人(1989)mol.gen.genet.215:431-440)、pepcase启动子(hudspeth&grula(1989)plant mol.biol.12:579-589)、r基因复合物相关启动子(chandler等人(1989)plant cell 1:1175-1183)和查尔酮合酶启动子(franken等人(1991)embo j.10:
2605-2612)。
[0169]
对种子特异性表达有用的是豌豆的豌豆球蛋白启动子(czako等人(1992)mol.gen.genet.235:33-40)；以及美国专利第5,625,136号中公开的种子特异性启动子。用于在成熟叶中表达的有用启动子是那些在衰老开始时被转换的启动子，诸如来自拟南芥的sag启动子(gan等人(1995)science 270:1986-1988)。
[0170]
另外，可以使用在叶绿体中有功能的启动子。此类启动子的非限制性实例包括噬菌体t3基因9的5’utr和美国专利第7,579,516号中公开的其他启动子。可用于本发明的其它启动子包括但不限于s-e9小亚基rubp羧化酶启动子和kunitz胰蛋白酶抑制剂基因启动子(kti3)。
[0171]
可用于本发明的其它调控元件包括但不限于内含子、增强子、终止序列和/或5’和3’非翻译区。
[0172]
可用于本发明的内含子可以是从植物中鉴定和分离的内含子，然后被插入到用于植物转化的表达盒。如本领域技术人员所理解的，内含子可以包含自我切除所需的序列，并被框内整合到核酸构建体/表达盒中。内含子可以用作间隔子来分隔一个核酸构建体中的多个蛋白质编码序列，或者可在一个蛋白质编码序列内部使用内含子来例如稳定mrna。如果它们被用在蛋白质编码序列中，则它们被插入“框内”，其中包括切除位点。还可将内含子与启动子结合以改善或修饰表达。例如，可用于本发明的启动子/内含子组合包括但不限于玉米ubi1启动子和内含子的组合(参见例如seq id no：21和seq id no：22)。
[0173]
可用于本发明的内含子的非限制性实例包括来自adhi基因(例如adh1-s内含子1、2和6)、遍在蛋白基因(ubi1)、rubisco小亚基(rbcs)基因、rubisco大亚基(rbcl)基因、肌动蛋白基因(例如肌动蛋白-1内含子)、丙酮酸脱氢酶激酶基因(pdk)、硝酸还原酶基因(nr)、重复碳酸酐酶基因1(tdca1)、psba基因、atpa基因或其任意组合的内含子。
[0174]
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸和/或核酸构建体可以是“表达盒”或可以包含在表达盒内。如本文中所用，“表达盒”意指包含例如一种或多种本发明的多核苷酸的重组核酸分子(例如编码序列特异性核酸结合结构域的多核苷酸、编码脱氨酶蛋白或结构域的多核苷酸、编码逆转录酶蛋白或结构域的多核苷酸、编码5
’‑3’
核酸外切酶多肽或结构域的多核苷酸、指导核酸和/或逆转录酶(rt)模板)，其中一种或多种多核苷酸与一种或多种控制序列(例如启动子、终止子等)可操作地相关联。因此，在一些实施方案中，可以提供一个或多个表达盒，其被设计成表达例如本发明的核酸构建体(例如编码序列特异性核酸结合结构域的多核苷酸、编码核酸酶多肽/结构域的多核苷酸、编码脱氨酶蛋白/结构域的多核苷酸、编码逆转录酶蛋白/结构域的多核苷酸、编码5
’‑3’
核酸外切酶多肽/结构域的多核苷酸、编码肽标签的多核苷酸和/或编码亲和多肽的多核苷酸等，或者包含指导核酸、延伸的指导核酸和/或rt模板等)。当本发明的表达盒包含不止一个多核苷酸时，所述多核苷酸可以与驱动所有多核苷酸表达的单个启动子可操作地连接，或者所述多核苷酸可以与一个或多个单独的启动子可操作地连接(例如三个多核苷酸可以由一个、两个或三个启动子以任意组合驱动)。当使用两个或更多个不同的启动子时，所述启动子可以是相同的启动子，也可以是不同的启动子。因此，当包含在单个表达盒中时，编码序列特异性核酸结合结构域的多核苷酸、编码核酸酶蛋白/结构域的多核苷酸、编码crispr-cas效应子蛋白/结构域的多核苷酸、编码脱氨酶蛋白/结构域的多核苷酸、编码逆转录酶多肽/结构域的多核苷
酸(例如rna依赖性dna聚合酶)、和/或编码5
’‑3’
核酸外切酶多肽/结构域的多核苷酸、指导核酸、延伸的指导核酸和/或rt模板可以各自与单个启动子或任意组合的独立启动子可操作地连接。
[0175]
包含本发明的核酸构建体的表达盒可以是嵌合的，意味着其至少一个(例如一个或多个)组分相对于其至少一个其它组分是异源的(例如来自宿主生物的启动子可操作地连接到将在该宿主生物中表达的感兴趣多核苷酸，其中所述感兴趣多核苷酸来自不同于宿主的生物体，或者通常被发现不与该启动子相关联)。表达盒也可以是天然存在的，但已经以用于异源表达的重组形式获得的表达盒。
[0176]
表达盒可以任选地包括转录和/或翻译终止区(即终止区)和/或在所选宿主细胞中有功能的增强子区。多种转录终止子和增强子是本领域已知的，并且可获得用于表达盒中。转录终止子负责转录的终止和正确的mrna多聚腺苷酸化。终止区和/或增强子区对于转录起始区可以是天然的，对于例如编码序列特异性核酸结合蛋白的基因、编码核酸酶的基因、编码逆转录酶的基因、编码脱氨酶的基因等可以是天然的，或者可以是宿主细胞天然的，或者可以是另一来源天然的(例如对于例如启动子、编码序列特异性核酸结合蛋白的基因、编码核酸酶的基因、编码逆转录酶的基因、编码脱氨酶的基因等，或对于宿主细胞或其任意组合是外来的或异源的)。
[0177]
本发明的表达盒还可包括编码选择标记的多核苷酸，其可用于选择转化的宿主细胞。如本文中所用，“选择标记”是指这样的多核苷酸序列，当其被表达时，对表达该标记的宿主细胞赋予独特的表型，从而使此类转化的细胞与那些不具有该标记的细胞相区别。这种多核苷酸序列可以编码选择标记或可筛选的标记，这取决于该标记是否赋予可通过化学手段，诸如通过使用选择剂(例如抗生素等)选择的性状，或者取决于该标记是否只是可通过观察或测试，诸如通过筛选(例如荧光)鉴定的性状。合适的选择性标记的许多实例是本领域已知的，并且可用于本文所述的表达盒中。
[0178]
除了表达盒之外，本文所述的核酸分子/构建体和多核苷酸序列也可与载体结合使用。术语“载体”是指用于将核酸(或多种核酸)转移、递送或引入细胞的组合物。载体包含含有待转移、递送或引入的一种或多种核苷酸序列的核酸构建体(例如表达盒)。用于转化宿主生物体的载体是本领域公知的。一般类别的载体的非限制性实例包括呈双链或单链线性或环状形式的病毒载体、质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、粘粒载体、fosmid载体、噬菌体、人工染色体、微环或土壤杆菌(agrobacterium)二元载体，其可以是或可以不是自我传递的或可移动的。在一些实施方案中，病毒载体可以包括但不限于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒载体。本文定义的载体可以通过整合入细胞基因组或存在于染色体外(例如具有复制起点的自主复制质粒)来转化原核或真核宿主。另外还包括穿梭载体，所述穿梭载体是指天然地或通过设计能够在两种不同的宿主生物体中复制的dna媒介物，所述宿主生物体可选自放线菌(actinomycetes)和相关物种、细菌和真核生物(例如高等植物、哺乳动物、酵母或真菌细胞)。在一些实施方案中，载体中的核酸处于合适的启动子或用于在宿主细胞中转录的其他调控元件的控制之下，并与其可操作地连接。载体可以是在多种宿主中起作用的双功能表达载体。在基因组dna的情况下，这可能包含其自身的启动子和/或其它调控元件，而在cdna的情况下，这可能处于合适的启动子和/或其它调控元件的控制之下，以便在宿主细胞中表达。因此，本发明的核酸或多核苷酸和/或包含
其的表达盒可以包括在本文所述和本领域已知的载体中。
[0179]
如本文中所用，“接触(contact)”、“接触(contacting)”、“接触(contacted)”及其语法变型是指在适于进行所需反应(例如转化、转录控制、基因组编辑、产生切口和/或切割)的条件下，将所需反应的组分放置在一起。例如，可在序列特异性dna结合蛋白、逆转录酶和/或脱氨酶被表达并且序列特异性核酸结合蛋白与靶核酸结合的条件下，将靶核酸与序列特异性核酸结合蛋白(例如多核苷酸引导的核酸内切酶、crispr-cas核酸内切酶(例如crispr-cas效应子蛋白)、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(talen)和/或argonaute蛋白))和脱氨酶或编码其的核酸构建体接触，并且可将逆转录酶和/或脱氨酶与序列特异性核酸结合蛋白融合，或者募集到序列特异性核酸结合蛋白(例如通过与序列特异性核酸结合蛋白融合的肽标签和与逆转录酶和/或脱氨酶融合的亲和标签)，因此，脱氨酶和/或逆转录酶位于靶核酸附近，从而修饰所述靶核酸。可以使用利用其他蛋白质-蛋白质相互作用募集逆转录酶和/或脱氨酶的其他方法，并且还可将rna-蛋白质相互作用和化学相互作用用于蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸募集。
[0180]
如本文中所用，涉及靶核酸的“修饰(modifying)”或“修饰(modification)”包括编辑(例如突变)、共价修饰、交换/取代核酸/核苷酸碱基、删除、切割、切刻和/或改变靶核酸的转录控制。在一些实施方案中，修饰可以包括任何类型的一个或多个单碱基改变(snp)。
[0181]
在感兴趣多核苷酸的上下文中，“引入(introducing)”、“引入(introduce)”、“引入(introduced)”(及其语法变型)是指将感兴趣核苷酸序列(例如多核苷酸、rt模板、核酸构建体和/或指导核酸)以使得该核苷酸序列能够进入细胞内部的方式呈递至植物、其植物部分或其细胞。
[0182]
术语“转化”或“转染”可以互换使用，并且如本文中所用，是指将异源核酸导入细胞。细胞的转化可以是稳定的或瞬时的。因此，在一些实施方案中，可用本发明的多核苷酸/核酸分子稳定转化宿主细胞或宿主生物体(例如植物)。在一些实施方案中，可用本发明的多核苷酸/核酸分子瞬时转化宿主细胞或宿主生物体。
[0183]
多核苷酸上下文中的“瞬时转化”意指多核苷酸被引入细胞，但不整合到细胞的基因组中。
[0184]
在引入细胞的多核苷酸的上下文中,“稳定地引入(stably introducing)”或“被稳定地引入(stably introduced)”旨在指引入的多核苷酸被稳定整合到细胞的基因组中，因此细胞被所述多核苷酸稳定地转化。
[0185]
如本文中所用，“稳定的转化”或“被稳定地转化”意指将核酸分子引入细胞并整合到细胞的基因组中。因此，整合的核酸分子能够被其后代遗传，更具体地，被多个连续世代的后代遗传。如本文中所用，“基因组”包括细胞核和质体基因组，因此包括将核酸整合到例如叶绿体或线粒体基因组中。如本文中所用，稳定的转化也可指保持在染色体外的转基因(例如作为微小染色体或质粒)。
[0186]
瞬时转化可以通过例如酶联免疫吸附测定(elisa)或蛋白质印迹来检测，所述测定或蛋白质印迹可以检测由引入生物体的一种或多种转基因编码的肽或多肽的存在。细胞的稳定转化可以通过例如细胞基因组dna与核酸序列的southern印迹杂交分析来检测，所述核酸序列与导入生物体(例如植物)的转基因的核苷酸序列特异性杂交。细胞的稳定转化
可以通过例如细胞的rna与核酸序列的northern印迹杂交测定来检测，所述核酸序列与引入宿主生物体的转基因的核苷酸序列特异性杂交。细胞的稳定转化还可以通过例如聚合酶链式反应(pcr)或本领域公知的其它扩增反应来检测，所述聚合酶链式反应或其它扩增反应使用与转基因的靶序列杂交的特异性引物序列，导致转基因序列的扩增，这可以根据标准方法来检测。转化也可以通过本领域公知的直接测序和/或杂交方案来检测。
[0187]
因此，在一些实施方案中，本发明的核苷酸序列、多核苷酸、核酸构建体和/或表达盒可以瞬时表达，并且/或者它们可被稳定地整合到宿主生物体的基因组中。因此，在一些实施方案中，本发明的核酸构建体(例如包含如本文所述用于编辑的多核苷酸的一个或多个表达盒)可被瞬时引入具有指导核酸的细胞中，因此，细胞中不保留dna。
[0188]
可以通过本领域技术人员已知的任何方法将本发明的核酸构建体引入植物细胞。转化方法的非限制性实例包括通过细菌介导的核酸递送(例如通过土壤杆菌)、病毒介导的核酸递送、碳化硅或核酸晶须介导的核酸递送、脂质体介导的核酸递送、显微注射、微粒轰击、磷酸钙介导的转化、环糊精介导的转化、电穿孔、纳米颗粒介导的转化、超声处理、浸润、peg介导的核酸摄取以及导致核酸引入植物细胞的任何其他电、化学、物理(机械)和/或生物机制(包括其任意组合)的转化。转化真核生物体和原核生物体的方法是本领域公知的常规方法，并在整个文献中有描述(参见例如jiang等人2013.nat.biotechnol.31:233-239；ran等人nature protocols 8:2281
–
2308(2013))。本领域已知的各种植物转化方法的一般指南包括miki等人("procedures for introducing foreign dna into plants"in methods in plant molecular biology and biotechnology,glick,b.r.和thompson,j.e.编辑(crc press,inc.,boca raton,1993)，第67-88页)和rakowoczy-trojanowska(cell.mol.biol.lett.7:849-858(2002))。
[0189]
在本发明的一些实施方案中，细胞的转化可以包括核转化。在其他实施方案中，细胞的转化可以包括质体转化(例如叶绿体转化)。在又一另外的实施方案中，可以通过常规育种技术将本发明的核酸引入细胞。在一些实施方案中，可以通过土壤杆菌转化将多核苷酸、表达盒和/或载体中的一种或多种引入植物细胞。
[0190]
因此，可以以本领域公知的许多方式将多核苷酸引入植物、植物部分、植物细胞。本发明的方法不依赖于将一种或多种核苷酸序列引入植物的特定方法，仅要它们进入细胞内部即可。当要引入不止一种多核苷酸时，它们可以作为单个核酸构建体的一部分装配，或者作为单独的核酸构建体装配，并且可以位于同一或不同的核酸构建体上。因此，所述多核苷酸可以在单个转化事件中或在分开的转化事件中被引入感兴趣细胞中，或者，多核苷酸可以被整合到植物中作为育种方案的一部分。
[0191]
本发明提供了用于降低通常作用于限制分生组织尺寸的基因的影响的方法和组合物，以产生具有较大分生组织的植物，以增加穗行数，任选地基本上不减少穗长，以提供改良的产率性状，以及改善对线虫感染的抗性。在一些实施方式中，本发明的方法提供了显性阴性效果，其中基因功能以遗传显性方式降低，允许被引入的突变在杂交作物系统中有效和/或当遗传冗余可能是一个问题时有效。
[0192]
植物表达多种clavata3/embryo surrounding region-related(clv3/esr-related)clv3样肽(cle)，其在植物的不同部分起作用以控制干细胞功能和生长，包括调节分生组织大小。cle肽由许多富含亮氨酸的重复(lrr)蛋白感测，并且下游信号传导调节植
物中的无数生长过程(fletcher,j.c.,plants 7:87(2018))。cle蛋白被表达为更长的前肽原，其被加工成较短的活性肽，作为细胞外配体发挥功能。
[0193]
因此，如本文所述，编辑技术用于靶向植物中的cle基因，以改变干细胞稳态，从而产生具有较大分生组织、具有增加的穗行数、增加的产量和改善的线虫抗性的植物。可用于生产表现出增加的穗行数的植物的突变包括例如取代、缺失、插入和/或颠换。在一些方面，由编辑技术生成的突变可以是点突变。在一些实施方案中，如本文所述产生的突变可以是显性阴性突变、半显性突变、无效突变、亚效突变或弱的功能损失突变。
[0194]
cle基因/肽包括三种相关基因/肽，cle7(例如，玉米中的zmcle7)，拟南芥中的clv3直系同源物，以及fcp1和cle14(例如，玉米中的zmfcp1和zmcle14)。在一些实施方式中，本发明描述了编辑内源cle基因的成熟肽序列，以介导弱的功能损失或对分生组织生长的显性负面影响，从而增加产量。例如，产生导致弱的功能损失的p9l突变，以及提供显性阴性效果的g6t或d8a突变。
[0195]
在一些实施方案中，本发明提供一种植物或其植物部分，所述植物或植物部分包含编码野生型前体cle多肽的内源clavata3/embryo surrounding region-related(clv3/esr-related)(cle)基因中的至少一个(例如一个或多个)非天然突变。在一些实施方案中，所述至少一个非天然突变提供了显性阴性突变、半显性突变、无效突变、亚效突变和/或弱的功能损失突变。
[0196]
在一些实施方案中，提供了一种植物细胞，所述植物细胞包含编辑系统，所述编辑系统包含：(a)crispr-cas效应子蛋白；和(b)指导核酸(例如grna、gdna、crrna、crdna、sgrna、sgdna)，所述指导核酸包含与编码cle蛋白的内源性靶基因具有互补性的间隔子序列。所述编辑系统可用于在编码cle蛋白的内源性靶基因中产生突变。在一些实施方案中，所述突变是非天然突变。在一些实施方案中，编辑系统的指导核酸可包含seq id no：101-104(例如，seq id no：101(fcp1)、seq id no：102(cle14)、seq id no：103(cle7)、seq id no：104(cle7))中任一个的核苷酸序列(间隔子序列，例如一个或多个间隔子)和seq id no：110-117(例如，seq id no：110(cle7)、seq id no：111(cle7)、seq id no：112(fcp1)、seq id no：113(fcp1)、seq id no：114(fcp1)、seq id no：115(cle14)、seq id no：116(cle14)、seq id no：117(cle14))中任一个的核苷酸序列(间隔子序列)。
[0197]
在一些实施方案中，cle基因的突变在编码成熟cle肽的内源cle基因的部分内，并且该突变导致成熟cle肽与野生型成熟cle肽相比具有氨基酸取代。
[0198]
植物、其植物部分或植物细胞的cle基因中的突变可以是任何类型的突变，包括碱基取代、碱基缺失、碱基插入和/或颠换。在一些实施方案中，非天然突变可以包括对a、t、g或c的碱基取代。在一些实施方案中，非天然突变可以是至少一个碱基对(例如1个碱基对至约5个碱基对，例如1、2、3、4、5个连续碱基对)的缺失或至少一个碱基对(例如1个碱基对至约5个碱基对，例如1、2、3、4、5个连续碱基对)的插入。在一些实施方案中，非天然突变可以是cle基因的约10至约2000个连续碱基对的颠换。
[0199]
在一些实施方案中，cle基因的突变位于编码成熟cle肽的内源cle基因的部分内，并且该突变导致成熟cle肽与野生型成熟cle肽相比具有氨基酸取代。在一些实施方案中，所述突变产生位于位置3、5、6、8或9处的一个或更多个取代的氨基酸残基，所述位置是相对于seq id no：75、seq id no：76或seq id no：77的氨基酸位置编号而言的。
[0200]
可用于本发明的内源cle基因编码fon2-like cle protein1(fcp1)fcp1蛋白、cle7蛋白或cle14蛋白。在一些实施方案中，内源cle基因(例如，靶基因)可以包含与seq id no：78、seq id no：79或seq id no：80的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的序列，包含与seq id no：81、seq id no：82或seq id no：83的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的区域；编码与seq id no：72、seq id no：73或seq id no：74具有至少95％序列同一性的序列，或编码具有与seq id no：75、seq id no：76或seq id no：77有至少95％序列同一性的序列的结构域。在一些实施方式中，所述野生型成熟肽包含具有12个氨基酸的长度和在位置1处的r、在位置3处的v、在位置4处的p、在位置6处的g、在位置9处的p、在位置11处的h和在位置12处的h的氨基酸序列，任选地，其中所述野生型加工肽包含seq id no：75、seq id no：76或seq id no：77的氨基酸序列中的任何一个。cle基因中的示例性非天然突变可以提供突变的cle基因。内源cle基因中的示例性非天然突变可以编码突变的cle蛋白。
[0201]
在一些实施方案中，cle肽包含相对于seq id no：75、seq id no：76或seq id no：77中任一个的氨基酸位置编号而言位于位置3、5、6、8或9处的一个或更多个氨基酸残基的突变。在一些实施方案中，所述突变可以是从c到t(c》t)、g到a(g》a)、a到g(a》g)或t到c(t》c)的碱基取代。在一些实施方案中，相对于seq id no：75、seq id no：76或seq id no：77中的任一个的氨基酸位置编号，突变的cle肽包含位置3处缬氨酸(v)向异亮氨酸(i)或甲硫氨酸(m)、位置5处谷氨酸(e)向赖氨酸(k)、位置6处甘氨酸(g)向苏氨酸(t)、位置8处天冬氨酸(d)向丙氨酸(a)、位置8处天冬氨酸(d)向甘氨酸(g)和/或位置9处脯氨酸(p)向亮氨酸(l)的氨基酸取代(例如，包含v3i、v3m、e5k、g6t、d8a、d8g和/或p9l的突变)。在一些实施方案中，本发明的成熟的突变cle肽可以包含seq id no：84-100的任何一个氨基酸序列的序列。
[0202]
在一些实施方式中，与不具有所述至少一个非天然突变的植物相比，在内源cle基因中包含至少一个(例如一个或多个)非天然突变的植物(例如玉米植物)表现出增加的穗行数(例如增加2、4、6、8、10、12、14或更多行)。在一些实施方案中，在内源cle基因中包含至少一个突变的所述植物是展现增加的穗行数的玉米植物。在一些实施方案中，在内源cle基因中包含至少一个突变的植物是展现增加的产量以及增加的线虫抗性的玉米植物。在一些实施方案中，可以从本发明的植物部分和/或植物细胞再生植物(例如玉米植物)，其中与缺乏相同cle突变的植物相比，所述再生的植物(例如再生的玉米植物)包含内源性cle基因中的所述突变，具有增加的穗行数的表型，任选地没有实质性减少穗的长度。
[0203]
如本文所用，术语“没有实质性减小穗的长度”是指由于如本文所述在一个或多个cle基因中的一个或多个突变而具有增加的穗行数的穗的长度，其中与在相同cle基因中缺乏相同突变的植物的穗相比，穗的长度没有减小超过约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、for、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％。
[0204]
在一些实施方案中，提供了玉米植物细胞，所述玉米植物细胞包含内源cle基因(例如cle7,cle14,fcp1)内的至少一个(例如一个或多个)非天然突变，其中所述突变是使用编辑系统引入的取代、插入、缺失或颠换，所述编辑系统包含与cle基因中的靶位点结合的核酸结合结构域。在一些实施方案中，所述取代、插入、缺失或颠换产生显性阴性等位基因、半显性等位基因、弱的功能损失等位基因或亚效等位基因。在一些实施方案中，所述至
少一个非天然突变是点突变。在一些实施方案中，cle基因内的靶位点位于cle基因的区域内，该区域包含与seq id no：81、seq id no：82或seq id no：83的核苷酸序列具有至少90％序列同一性(例如约90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100％序列同一性)和/或编码与seq id no：75、seq id no：76或seq id no：77的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如约95、96、97、98、99、99.5、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100％序列同一性)的序列的序列。在一些实施方式中，所述cle基因包含与seq id no：72或seq id no：73的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列或者编码与seq id no：74的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方式中，所述突变在由编辑系统切割后生成的，所述编辑系统包含核酸酶和核酸结合结构域，所述核酸结合结构域结合与seq id no：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列内的靶位点。在一些实施方案中，相对于seq id no：75、seq id no：76或seq id no：77的氨基酸位置编号而言，所述至少一个非天然突变产生位于位置3、5、6、8或9处的一个或多个取代的氨基酸残基(例如，v3i、v3m、e5k、g6t、d8a、d8g和/或p9l)。在一些实施方案中，所述玉米植物细胞再生成包含所述至少一个非天然突变的玉米植物，并且所述突变导致显性阴性等位基因。在一些实施方案中，从所述玉米植物细胞再生的玉米植物与不包含/缺乏所述等位基因的野生型植物(例如，等基因的野生型植物)相比展现增加的穗行数的表型(任选地没有实质性减少穗的长度；例如，与不包含所述相同cle突变的植物的穗相比，没有减少穗长度超过约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％)。
[0205]
在一些实施方案中，提供了一种产生/培育无转基因的经编辑的玉米植物的方法，所述方法包括：使本发明的玉米植物(例如在一个或多个cle基因中包含一个或多个突变(例如非天然突变)并且具有增加的穗行数的玉米植物)与无转基因的玉米植物杂交，从而将所述突变引入所述无转基因的玉米植物中；以及选择包含所述突变并且无转基因的后代玉米植物，从而产生无转基因的经编辑的玉米植物。
[0206]
本文还提供了一种具有增加的穗行数的多个玉米植物的方法，该方法包括在生长区域(例如田地(例如耕作田地、农田)、生长室、温室、娱乐区域、草坪和/或路边等)中种植本发明的两株或更多株玉米植物(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多株玉米植物，其在一个或多个cle多肽中包含一个或多个突变(例如非天然突变)并且具有增加的穗行数)，从而提供与缺乏所述突变的多个对照玉米植物相比具有增加的穗行数(任选地，没有实质性减小穗长度(例如穗长没有减小超过5-30％))的多个玉米植物。在一些实施方式中，所述多个植物还可以表现出更大的分生组织、增加的产量和增加的线虫抗性。
[0207]
本发明还提供了一种在成熟玉米cle肽中产生变异的方法，包括：将编辑系统引入玉米植物细胞中，其中所述编辑系统靶向编码所述成熟玉米cle肽蛋白的玉米cle基因的区域，其中所述区域包含与seq id no：81、seq id no：82或seq id no：83中的任一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列，或者所述区域由与seq id no：81-83中的任一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列编码；以及使玉米cle基因的所述区域与编辑系统接触，从而将突变引入玉米植物细胞中成熟玉米cle肽内；以及在所述成熟玉米cle肽中产生变异。在一些实施方式中，所述突变可以在由编辑系统切割之后进行，所述编辑系统包含核酸酶和核酸结合结构域，所述核酸结合结构域结合与seq id no：81-83的任何一个核
苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列内的靶位点。
[0208]
在一些实施方案中，编辑玉米植物细胞的基因组中的特异性位点，所述方法包括：以位点特异性方式切割玉米植物细胞中的内源cle基因内的靶位点，所述内源cle基因(a)包含(i)与seq id no：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列，和/或(ii)与seq id no：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的区域；和/或(b)编码(i)与seq id no：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或(ii)具有与seq id no：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域，从而在编码成熟cle肽的玉米植物细胞的内源基因的部分中产生编辑，并产生在所述内源基因的所述部分中包含所述编辑的植物细胞。
[0209]
在一些实施方案中，所述编辑导致非天然存在的突变，包括但不限于缺失、取代、插入或颠换，其中所述编辑可以导致显性阴性突变、半显性突变、亚效突变或弱的功能损失突变。在一些实施方案中，所述编辑可以是c至t(c》t)、g至a(g》a)、a至g(a》g)或t至c(t》c)的核苷酸取代。在一些实施方案中，编辑导致cle蛋白质的编码区中的氨基酸的变化。例如，相对于seq id no：75、seq id no：76或seq id no：77中任一个的氨基酸位置编号而言，编辑可以导致位于位置3、5、6、8或9处的氨基酸残基的变化。在一些实施方案中，相对于seq id no：75、seq id no：76或seq id no：77中任一个的氨基酸位置编号，所述编辑在cle多肽中产生如下氨基酸取代：位置3处缬氨酸(v)至异亮氨酸(i)或甲硫氨酸(m)、位置5处谷氨酸(e)至赖氨酸(k)、位置6处甘氨酸(g)至苏氨酸(t)、位置8处天冬氨酸(d)至丙氨酸(a)、位置8处天冬氨酸(d)至甘氨酸(g)和/或位置9处脯氨酸(p)至亮氨酸(l)(例如，包含v3i、v3m、e5k、g6t、d8a、d8g和/或p9l的突变)。在一些实施方案中，本发明的经编辑的成熟cle肽可以包含seq id no：84-100的任何一个氨基酸序列的序列。
[0210]
在一些实施方案中，编辑方法可以进一步包括从在内源cle基因中包含所述编辑的玉米植物细胞再生玉米植物，从而产生其内源cle基因中包含该编辑并且与不包含所述编辑的对照玉米植物相比具有增加的穗行数的表型的玉米植物。
[0211]
在一些实施方案中，用于制备玉米植物的方法，包括：(a)使包含编码前体cle多肽的内源cle基因的玉米植物细胞群与连接到核酸结合结构域(例如，dna结合结构域，例如编辑系统)的核酸酶接触，所述核酸结合结构域结合如下序列：其(i)与seq id no：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少90％的序列同一性，(ii)与seq id no：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少90％的序列同一性，(iii)编码与seq id no：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列，或(ii)编码具有与seq id no：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域；(b)从所述群中选择内源cle基因已突变的植物细胞，从而产生在内源cle基因中包含突变的植物细胞；和(c)将所选的植物细胞生长成植物。
[0212]
在一些实施方案中，增加玉米植物中的穗行数的方法包括：(a)使包含内源cle基因的玉米植物细胞与靶向内源cle基因的核酸酶接触，其中所述核酸酶与结合内源cle基因中的靶位点的核酸结合结构域(例如，dna结合结构域，例如编辑系统)连接，其中所述内源cle基因：(i)包含与seq id no：78-80的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的序列；(ii)包含与seq id no：81-83的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的区域；(iii)编码与seq id no：72-74的氨基酸序列中的任一个具有至少95％序列同一性
的序列；和/或(iv)编码具有与seq id no：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域，以产生在内源cle基因中包含突变的玉米植物细胞；和(b)将所述玉米植物细胞生长成在内源cle基因中包含所述突变的玉米植物，从而产生具有突变的内源cle基因和增加的穗行数的玉米植物。
[0213]
在一些实施方案中，用于生产包含具有突变的内源cle基因的至少一个细胞的玉米植物或其部分的方法，该方法包括使玉米植物或植物部分中的内源cle基因中的靶位点与包含切割结构域和核酸结合结构域的核酸酶接触，其中所述核酸结合结构域结合内源cle基因中的靶位点，其中所述内源cle基因(a)包含与seq id no：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(b)包含与seq id no：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少90％5序列同一性的区域；(c)编码与seq id no：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或(d)编码具有与seq id no：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域，从而生产包含在所述内源cle基因中具有突变的至少一个细胞的玉米植物或其部分。
[0214]
本文还提供了一种生产玉米植物或其部分的方法，所述玉米植物或其部分包含突变的内源cle基因并且表现出增加的穗行数，所述方法包括使所述玉米植物或植物部分中的内源cle基因中的靶位点与包含切割结构域和核酸结合结构域的核酸酶接触，其中所述核酸结合结构域与所述内源cle基因中的靶位点结合，其中所述内源cle基因：(a)包含与seq id no：78-80的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的序列；(b)包含与seq id no：81-83的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的区域；(c)编码与seq id no：72-74的氨基酸序列中的任一个具有至少95％序列同一性的序列；和/或(d)编码具有与seq id no：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域，从而生产包含具有突变的内源cle基因并且表现出增加的穗行数的玉米植物或其部分。
[0215]
在一些实施方案中，核酸酶可以切割内源cle基因，从而将突变引入内源cle基因。可用于本发明的核酸酶可以是可用于编辑/修饰靶核酸的任何核酸酶。此类核酸酶包括但不限于锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)、核酸内切酶(例如，fok1)和/或crispr-cas效应子蛋白。同样，可用于本发明的任何核酸结合结构域可以是可用于编辑/修饰靶核酸的任何dna结合结构域或rna结合结构域。此类核酸结合结构域包括但不限于锌指、转录激活因子样dna结合结构域(tal)、argonaute和/或crispr-cas效应物dna结合结构域。
[0216]
在一些实施方案中，提供了编辑玉米植物或植物部分中的内源cle基因的方法，该方法包括使所述玉米植物或植物部分中的cle基因中的靶位点与胞嘧啶碱基编辑系统接触，该胞嘧啶碱基编辑系统包含胞嘧啶脱氨酶和与cle基因中的靶位点结合的核酸结合结构域，所述cle基因(a)包含与seq id no：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(b)包含与seq id no：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的区域；(c)编码与seq id no：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或(d)编码具有与seq id no：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域，从而编辑玉米植物或其部分中的内源cle基因并产生包含在内源cle基因中具有突变的至少一个细胞的玉米植物或其部分。
[0217]
在一些实施方案中，提供了编辑玉米植物或植物部分中的内源cle基因的方法，该
方法包括使所述玉米植物或植物部分中的cle基因中的靶位点与腺苷碱基编辑系统接触，该腺苷碱基编辑系统包含腺苷脱氨酶和与cle基因中的靶位点结合的核酸结合结构域，所述cle基因(a)包含与seq id no：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(b)包含与seq id no：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的区域；(c)编码与seq id no：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或(d)编码具有与seq id no：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域，从而编辑玉米植物或其部分中的内源cle基因并产生包含在内源cle基因中具有突变的至少一个细胞的植物或其部分。
[0218]
在一些实施方案中，提供了检测突变cle基因(内源cle基因中的突变)的方法，所述方法包括在植物的基因组中检测编码seq id no：72-77的氨基酸序列的核酸，其中seq id no：72-77的氨基酸序列包含相对于seq id no：75、seq id no：76或seq id no：77中任一个的氨基酸位置编号而言位于位置3、5、6、8或9处的一个或多个氨基酸残基的突变。在一些具体实施方案中，所述突变是c至t(c》t)、g至a(g》a)、a至g(a》g)或t至c(t》c)的核苷酸取代的结果。在一些实施方案中，突变的cle肽包含至少一个突变，其包含相对于seq id no：75、seq id no：76或seq id no：77中的任一个的氨基酸位置编号而言位于位置3处v至i或m、位置5处e至k、位置6处g至t、位置8处d至a或g和/或位置9处p至l的突变。
[0219]
在一些实施方案中，本发明提供了检测内源cle基因中的突变的方法，其包括在植物的基因组中检测突变的cle基因。作为一个实例，检测的突变的cle基因可以包含与seq id no：105-109中任一个的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列，或者检测的突变的cle基因可以编码seq id no：84-100的任一个氨基酸序列的加工多肽。
[0220]
在一些实施方案中，本发明提供了产生包含内源cle基因中的突变和至少一个感兴趣多核苷酸的植物的方法，所述方法包括使包含内源cle基因中的至少一个突变的本发明植物(第一植物)与包含所述至少一个感兴趣多核苷酸的第二植物杂交以产生后代植物；以及选择包含所述cle基因中的至少一个突变和所述至少一个感兴趣多核苷酸的后代植物，从而产生包含内源cle基因中的突变和至少一个感兴趣多核苷酸的植物。
[0221]
本发明还提供了一种产生包含内源cle基因中的突变和至少一个感兴趣多核苷酸的植物的方法，所述方法包括将至少一个感兴趣多核苷酸引入包含cle基因中的至少一种突变的本发明植物中，从而产生包含cle基因中的至少一个突变和至少一个感兴趣多核苷酸的植物。在一些实施方案中，所述植物是玉米植物。
[0222]
在一些实施方案中，本发明提供了产生包含内源cle基因中的突变和至少一个感兴趣多核苷酸的植物的方法，所述方法包括将至少一个感兴趣多核苷酸引入包含内源cle基因中的至少一个突变的本发明植物中，从而产生包含cle基因中的至少一个突变和至少一个感兴趣多核苷酸的植物。在一些实施方案中，所述植物是玉米植物。
[0223]
感兴趣多核苷酸可以是能够赋予所需表型或以其它方式修饰植物的表型或基因型的任何多核苷酸。在一些实施方式中，感兴趣多核苷酸可以是赋予除草剂耐受性、昆虫抗性、线虫抗性、疾病抗性、产量增加、营养物使用效率增加或非生物胁迫抗性的多核苷酸。
[0224]
可用于本发明的cle包括任何cle，其中如本文所述的突变可以在包含所述突变的植物或其部分中赋予增加的穗行数。在一些实施方案中，可用于本发明的cle基因编码fcp1蛋白、cle7蛋白或cle14蛋白。
[0225]
在一些实施方案中，内源前体cle多肽包含与seq id no：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，约95、96、97、98、99、99.5、100％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，成熟内源cle肽包含与seq id no：75-77的任何一个氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，约95、96、97、98、99、99.5、100％序列同一性)的序列。在一些实施方案中，cle基因可以包含与seq id no：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少约90％序列同一性(例如，约90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、100％序列同一性)的序列，或者cle基因可以在其中包含与seq id no：81-83和101-105的任何一个核苷酸序列具有至少90％同一性(例如，约90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、100％序列同一性)的序列(区域)。
[0226]
在一些实施方案中，玉米植物中的内源cle基因中的所述至少一个非天然突变可以是碱基取代、碱基缺失和/或碱基插入或颠换。在一些实施方案中，与不包含所述编辑/突变的对照玉米植物相比，玉米植物中的内源cle基因中的所述至少一个非天然突变可以是导致显性阴性突变、半显性突变、亚效突变或弱的功能损失突变的取代、缺失、插入和/或颠换，并且植物具有增加的穗行数的表型。例如，所述突变可以是一个或多个氨基酸残基(例如cle多肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的取代、缺失和/或插入，或者突变可以是在编码cle多肽的基因中的至少1个核苷酸至约15个核苷酸(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸、或其中的任何范围或数值)的碱基取代、碱基缺失和/或碱基插入，或者可以是至少10个连续核苷酸至约2000个连续核苷酸(列入约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、1200、1210、1220、1230、1240、1250、1260、1270、1280、1290、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950或2000或更多个连续核苷酸，或者其内的任何范围或数值)的dna颠换。在一些实施方案中，所述至少一个非天然突变可以是对a、t、g或c的碱基取代。在一些实施方案中，所述至少一个非天然突变可以是从c到t(c》t)、g到a(g》a)、a到g(a》g)或t到c(t》c)的碱基取代。突变可以是点突变。在一些实施方案中，相对于seq id no：75、seq id no：76或seq id no：77的氨基酸位置编号，所述突变产生位于位置3、5、6、8或9处的一个或更多个取代的氨基酸残基(例如，v3i、v3m、e5k、g6t、d8a、d8g和/或p9l)。
[0227]
在一些实施方案中，内源cle基因中的突变可以在由编辑系统切割之后生成，所述编辑系统包含核酸酶和与靶核酸(例如，cle基因)内的靶位点结合的核酸结合结构域，所述靶核酸包含与seq id no：78-83的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列，或编码与seq id no：72-77的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列(例如，cle基因)。在一些实施方案中，所述核酸酶切割内源cle基因，并且将突变引入所述内源cle基因中。
[0228]
本文还提供了与cle基因中的靶位点结合的指导核酸(例如，grna、gdna、crrna、crdna)，其中所述内源cle基因：(a)包含与seq id no：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(b)包含与seq id no：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少95％序列同一性的区域；(c)编码与seq id no：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％
序列同一性的序列；和/或(d)编码具有与seq id no：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域。在一些实施方案中，指导核酸包含具有seq id no：101-104和/或seq id no：110-117中任一个的核苷酸序列的间隔子。
[0229]
在一些实施方案中，提供了玉米植物或其植物部分，其包含在至少一个内源性clavata3/embryo surrounding region-related(clv3/esr-related)(cle)基因中的至少一个非天然突变，所述基因位于染色体2上由碱基对(bp)位置235,093,752至碱基对位置235,094,276限定并包括它们的染色体间隔内和/或染色体2上由碱基对(bp)位置40,126,538至碱基对位置40,127,030限定并包括它们的染色体间隔中，并且其中每个染色体间隔对应于maizegdb互联网资源(maizegdb.org/assembly)的b73第4版(b73refgen_v4)、agpv4)的参考玉米基因组。在一些实施方案中，提供了玉米植物或其植物部分，其包含位于至少一个内源cle基因中的至少一个非天然突变，其中所述内源cle基因位于染色体2上由碱基对(bp)位置235,093,752至碱基对位置235,094,276限定并包括它们的染色体间隔，并且其中染色体间隔对应于maizegdb互联网资源(maizegdb.org/assembly)的b73第3版(b73refgen_v3)的参考玉米基因组。
[0230]
在一些实施方案中，提供了与玉米植物中的clavata3/embryo surrounding region-related(clv3/esr-related)(cle)基因中的靶核酸结合的指导核酸，其中所述靶核酸位于染色体2上由碱基对(bp)位置235,093,752至碱基对位置235,094,276限定并包括它们的染色体间隔(zm00001d007576(cle14-clavata3/esr-related14))内，或者位于染色体2上由碱基对(bp)位置40,126,538至碱基对位置40,127,030限定并包括它们的染色体间隔(zm00001d003320(fcp1-fon2-like cle protein1))内，并且其中每个染色体间隔对应于maizegdb互联网资源(maizegdb.org/assembly)的b73第4版(b73_refgen_v4)，agpv4)的参考玉米基因组。在一些实施方案中，提供了与玉米植物中的cle基因中的靶核酸结合的指导核酸，其中所述靶核酸位于内源cle基因位于染色体4上由碱基对(bp)位置7,570,324至碱基对位置7,571,104限定并包括它们的染色体间隔中(grmzm2g372364(cle7-clavata3/esr-related7))，并且其中所述染色体间隔对应于maizegdb互联网资源(maizegdb.org/assembly)的b73参考玉米基因组第3版(b73_refgen_v3)。
[0231]
在一些实施方案中，提供了包含指导核酸的系统，所述指导核酸包含具有seq id no：101-104和/或seq id no：110-117中任一个的核苷酸序列的间隔子(例如，一个或多个间隔子)，以及与指导核酸缔合的crispr-cas效应子蛋白。在一些实施方案中，所述系统还可包含与指导核酸缔合的tracr核酸和crispr-cas效应子蛋白，任选地其中tracr核酸和指导核酸共价连接。如本文所用，“与指导核酸缔合的crispr-cas效应子蛋白”是指在crispr-cas效应子蛋白和指导核酸之间形成的复合物，以将crispr-cas效应子蛋白引导至基因中的靶位点。
[0232]
本发明还提供了一种基因编辑系统，其包含与指导核酸缔合的crispr-cas效应子蛋白，并且所述指导核酸包含与cle基因结合的间隔子序列，所述cle基因(a)包含与seq id no：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(b)包含与seq id no：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少95％序列同一性的区域；(c)编码与seq id no：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或(d)编码具有与seq id no：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域。在一些实施方案
中，指导核酸的间隔子序列可以包含seq id no：101-104和/或seq id no：110-117中任一个的核苷酸序列。在一些实施方案中，基因编辑系统还可包含与指导核酸和crispr-cas效应子蛋白缔合的tracr核酸，任选地其中tracr核酸和指导核酸共价连接。
[0233]
本发明还提供了包含crispr-cas效应子蛋白的复合物，所述crispr-cas效应子蛋白包含切割结构域和指导核酸，其中所述指导核酸结合内源cle基因中的靶位点，其中所述内源cle基因，其中所述内源cle基因：(a)包含与seq id no：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(b)包含与seq id no：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少95％序列同一性的区域；(c)编码与seq id no：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或(d)编码具有与seq id no：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域，其中所述切割结构域切割cle基因中的靶标链。
[0234]
在一些实施方案中，提供了包含下述的表达盒：(a)编码crispr-cas效应子蛋白的多核苷酸，所述crispr-cas效应子蛋白包含切割结构域，和(b)与编码前体cle肽的内源cle基因中的靶位点结合的指导核酸，其中所述指导核酸包含与下述互补并且与之结合的间隔子序列：(i)包含与seq id no：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(ii)包含与seq id no：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少95％序列同一性的区域；(iii)编码与seq id no：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或(iv)编码具有与seq id no：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域。
[0235]
本文还提供了编码突变的cle基因的核酸，当存在于玉米植物或植物部分中时，与不包含所述cle突变的玉米植物或植物部分相比，所述突变的cle基因导致玉米植物包含增加的穗行数的表型。
[0236]
示例性的突变的cle蛋白可以包含与seq id no：84-100中任一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列。示例性的突变的cle基因可以包含与seq id no：105-109中任一个的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
[0237]
本发明的核酸构建体(例如包含序列特异性核酸结合结构域(例如序列特异性dna结合结构域)、crispr-cas效应结构域、脱氨酶结构域、逆转录酶(rt)、rt模板和/或指导核酸等的构建体)和包含其的表达盒/载体可以用作本发明的编辑系统，用于修饰靶核酸(例如内源cle基因)和/或其表达。
[0238]
可以如本文所述(例如使用本发明的多肽、多核苷酸、rnps、核酸构建体、表达盒和/或载体)修饰(例如突变，例如碱基编辑、切割、切口等)包含能够在如本文所述修饰时赋予增加的穗行数的内源cle基因的任何玉米植物，以增加玉米植物中的穗行数。与不包含所述突变的内源cle基因的植物或其部分相比，表现出增加的穗行数的植物(例如玉米植物)中的穗行数可以增加约5％至约100％(例如约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％或更多或其中的任何范围或数值；例如约5％至约10％、约5％至约15％、约5％至约20％、约10％至约50％、约10％至约80％、约10％至约90％、约10％至约100％、约20％至约50％、约20％至约80％、约20％至约90％、约20％至约100％、约30％至
约50％、约30％至约80％、约30％至约90％、约30％至约100％、约50％至约100％、约75％至约100％或更多，或其中的任何范围或数值)。
[0239]
可用于本发明的编辑系统可以是现在已知或以后开发的任何位点特异性(序列特异性)基因组编辑系统，所述系统可以以靶特异性方式引入突变。例如，编辑系统(例如位点特异性或序列特异性编辑系统)可以包括、但不限于crispr-cas编辑系统、大范围核酸酶编辑系统、锌指核酸酶(zfn)编辑系统、转录激活因子样效应子核酸酶(talen)编辑系统、碱基编辑系统和/或先导编辑系统，其中的每一种都可以包含一种或多种多肽和/或一种或多种多核苷酸，当它们在细胞中作为系统表达时，可以以序列特异性方式修饰(突变)靶核酸。在一些实施方案中，编辑系统(例如位点特异性或序列特异性编辑系统)可以包含一种或多种多核苷酸和/或一种或多种多肽，包括但不限于核酸结合结构域(dna结合结构域)、核酸酶和/或其他多肽和/或多核苷酸。
[0240]
在一些实施方案中，编辑系统可以包含一个或多个序列特异性核酸结合结构域(dna结合结构域)，其可以来自例如多核苷酸引导的核酸内切酶、crispr-cas核酸内切酶(例如crispr-cas效应子蛋白)、锌指核酸酶、转录激活因子样效应子核酸酶(talen)和/或argonaute蛋白。在一些实施方案中，编辑系统可包含一个或多个切割结构域(例如核酸酶)，包括、但不限于核酸内切酶(例如fok1)、多核苷酸引导的核酸内切酶、crispr-cas核酸内切酶(例如crispr-cas效应子蛋白)、锌指核酸酶和/或转录激活因子样效应核酸酶(talen)。在一些实施方案中，编辑系统可包含一种或多种多肽，所述多肽包括但不限于脱氨酶(例如胞嘧啶脱氨酶、腺嘌呤脱氨酶)、逆转录酶、dna2多肽和/或5’flap核酸内切酶(fen)。在一些实施方案中，编辑系统可以包含一种或多种多核苷酸，包括但不限于crispr阵列(crispr引导)核酸、延伸的指导核酸和/或逆转录酶模板。
[0241]
在一些实施方案中，修饰或编辑cle基因的方法可包括将靶核酸(例如编码cle的核酸)与和脱氨酶结构域(例如腺嘌呤脱氨酶和/或胞嘧啶脱氨酶)融合的碱基编辑融合蛋白(例如序列特异性dna结合蛋白(例如crispr-cas效应子蛋白或结构域))和指导核酸接触，其中所述指导核酸能够将所述碱基编辑融合蛋白引导/靶向靶核酸，从而编码所述靶核酸内的基因座。在一些实施方案中，碱基编辑融合蛋白和指导核酸可以包含在一种或多种表达盒中。在一些实施方案中，可将靶核酸与碱基编辑融合蛋白和包含指导核酸的表达盒接触。在一些实施方案中，所述序列特异性核酸结合融合蛋白和指导核酸可以以核糖核蛋白(rnp)的形式提供。在一些实施方案中，可将细胞与不止一种碱基编辑融合蛋白和/或一种或多种指导核酸接触，所述指导核酸可以靶向细胞中的一种或多种靶核酸。
[0242]
在一些实施方案中，修饰或编辑cle基因的方法可包括将靶核酸(例如编码cle的核酸)与和肽标签融合的序列特异性核酸结合融合蛋白(例如序列特异性dna结合蛋白(例如crispr-cas效应子蛋白或结构域)、脱氨酶融合蛋白(其包含与能够与肽标签结合的亲和多肽融合的脱氨酶结构域(例如腺嘌呤脱氨酶和/或胞嘧啶脱氨酶))和指导核酸接触，其中所述指导核酸能够将序列特异性核酸结合融合蛋白引导至/靶向靶核酸，序列特异性核酸结合融合蛋白能够通过肽标签-亲和多肽相互作用将脱氨酶融合蛋白募集到靶核酸，从而编辑靶核酸内的基因座。在一些实施方案中，可将序列特异性核酸结合融合蛋白与结合肽标签的亲和多肽融合，以及可将脱氨酶与肽标签融合，从而将脱氨酶募集到所述序列特异性核酸结合融合蛋白和靶核酸处。在一些实施方案中，所述序列特异性结合融合蛋白、脱氨
酶融合蛋白和指导核酸可以包含在一个或多个表达盒中。在一些实施方案中，可将靶核酸与序列特异性结合融合蛋白、脱氨酶融合蛋白和包含指导核酸的表达盒接触。在一些实施方案中，所述序列特异性核酸结合融合蛋白、脱氨酶融合蛋白和指导核酸可以以核糖核蛋白(rnp)的形式提供。
[0243]
在一些实施方案中，诸如先导编辑(prime editing)等方法可用于在内源cle基因中产生突变。在先导编辑中，将rna依赖性dna聚合酶(逆转录酶，rt)和逆转录酶模板(rt模板)与序列特异性dna结合结构域组合使用，所述序列特异性核酸结合结构域赋予以序列特异性方式识别并结合靶标的能力，并且也能够在靶标内引起含pam链的切口。所述核酸结合结构域可以是crispr-cas效应子蛋白，并且在该情况下，crispr阵列或引导rna可以是包含延伸部分的延伸的指导核酸，所述延伸部分包含引物结合位点(primer binding site,psb)和待整合到基因组(模板)中的编辑。类似于碱基编辑，先导编辑可以利用各种将用于编辑的蛋白质募集到靶位点的方法，此类方法包括在基因组编辑的选定过程中使用的蛋白质与核酸之间的非共价和共价相互作用。
[0244]
如本文所用，“crispr-cas效应子蛋白”是切割或切开核酸、结合核酸(例如靶核酸和/或指导核酸)和/或鉴定、识别或结合如本文所定义的指导核酸的蛋白或多肽或其结构域。在一些实施方式中，crispr-cas效应子蛋白可以是酶(例如核酸酶、内切核酸酶、切口酶等)或其部分，和/或可作为酶发挥功能。在一些实施方案中，crispr-cas效应子蛋白是指crispr-cas核酸酶多肽或其结构域，其包含核酸酶活性或其中核酸酶活性已被降低或消除，和/或包含切口酶活性或其中切口酶已被降低或消除，和/或包含单链dna切割活性(ss dnase活性)或其中ssdnase活性已被降低或消除，和/或包含自加工rnase活性或其中自加工rnase活性已被降低或消除。crispr-cas效应子蛋白可以与靶核酸结合。
[0245]
在一些实施方案中，序列特异性核酸结合结构域可以是crispr-cas效应子蛋白。在一些实施方案中，crispr-cas效应子蛋白可以来自i型crispr-cas系统、ii型crispr-cas系统、iii型crispr-cas系统、iv型crispr-cas系统、v型crispr-cas系统或vi型crispr-cas系统。在一些实施方案中，本发明的crispr-cas效应子蛋白可以来自ii型crispr-cas系统或v型crispr-cas系统。在一些实施方案中，crispr-cas效应子蛋白可以是ii型crispr-cas效应子蛋白，例如cas9效应子蛋白。在一些实施方案中，crispr-cas效应子蛋白可以是v型crispr-cas效应子蛋白，例如cas12效应子蛋白。
[0246]
在一些实施方案中，crispr-cas效应子蛋白可包括但不限于cas9、c2c1、c2c3、cas12a(也称为cpf1)、cas12b、cas12c、cas12d、cas12e、cas13a、cas13b、cas13c、cas13d、casl、caslb、cas2、cas3、cas3'、cas3"、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9(也称为csnl和csx12)、cas10、csyl、csy2、csy3、csel、cse2、cscl、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmrl、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csbl、csb2、csb3、csxl7、csxl4、csx10、csx16、csax、csx3、csxl、csxl5、csfl、csf2、csf3、csf4(ding)和/或csf5核酸酶，任选地其中crispr-cas效应子蛋白可以是cas9、cas12a(cpf1)、cas12b、cas12c(c2c3)、cas12d(casy)、cas12e(casx)、cas12g、cas12h、cas12i、c2c4、c2c5、c2c8、c2c9、c2c10、cas14a、cas14b和/或cas14c效应子蛋白。
[0247]
在一些实施方案中，用于本发明的crispr-cas效应子蛋白可在其核酸酶活性位点(例如ruvc、hnh，例如cas12a核酸酶结构域的ruvc位点，例如cas9核酸酶结构域的ruvc位点
和/或hnh位点)包含突变。在其核酸酶活性位点具有突变、因此不再包含核酸酶活性的crispr-cas效应子蛋白通常被称为“无活力的(dead)”，例如dcas。在一些实施方案中，与无突变的相同crispr-cas效应子蛋白(例如切口酶，例如cas9切口酶、cas12a切口酶)相比，在其核酸酶活性位点中具有突变的crispr-cas效应子蛋白结构域或多肽可具有受损的活性或降低的活性。
[0248]
可用于本发明的crispr cas9效应子蛋白或crispr cas9效应结构域可以是任何已知的或以后鉴定的cas9核酸酶。在一些实施方案中，crispr cas9多肽可以是来自例如链球菌属某些种(streptococcus spp.)(例如化脓性链球菌(s.pyogenes)、嗜热链球菌(s.thermophilus))、乳杆菌属某些种(lactobacillus spp.)、双歧杆菌属某些种(bifidobacterium spp.)、坎德勒氏菌某些种(kandleria spp.)、明串珠菌属某些种(leuconostoc spp.)、酒球菌属某些种(oenococcus spp.)、片球菌属某些种(pediococcus spp.)、魏斯氏菌属某些种(weissella spp.)和/或欧陆森氏菌属某些种(olsenella spp.)的cas9多肽。示例性的cas9序列包括、但不限于seq id no：59和seq id no：60的氨基酸序列或者seq id no：61-71的核苷酸序列。
[0249]
在一些实施方案中，crispr-cas效应子蛋白可以是源自化脓性链球菌的cas9多肽，其识别pam序列基序ngg、nag、nga(mali等人，science 2013；339(6121):823-826)。在一些实施方案中，crispr-cas效应子蛋白可以是来源于嗜热链球菌的cas9多肽，其识别pam序列基序nggng和/或nnagaaw(w＝a或t)(参见例如horvath等人，science,2010；327(5962):167-170，以及deveau等人，j bacteriol 2008；190(4):1390-1400)。在一些实施方案中，crispr-cas效应子蛋白可以是源自变形链球菌(streptococcus mutans)的cas9多肽，其识别pam序列基序ngg和/或naar(r＝a或g)(参见例如deveau等人，j bacteriol 2008；190(4):1390-1400)。在一些实施方案中，crispr-cas效应子蛋白可以是源自金黄色葡萄球菌(streptococcus aureus)的cas9多肽，其识别pam序列基序nngrr(r＝a或g)。在一些实施方案中，crispr-cas效应子蛋白可以是源自金黄色葡萄球菌(s.aureus)的cas9蛋白，其识别pam序列基序ngrrt(r＝a或g)。在一些实施方案中，crispr-cas效应子蛋白可以是源自金黄色葡萄球菌的cas9多肽，其识别pam序列基序ngrrv(r＝a或g)。在一些实施方案中，crispr-cas效应子蛋白可以是源自脑膜炎奈瑟氏球菌(neisseria meningitidis)的cas9多肽，其识别pam序列基序n gatt或n gctt(r＝a或g，v＝a、g或c)(参见，例如hou等人，2013，1-6)。在上述实施方案中，n可以是任何核苷酸残基，例如a、g、c或t中的任一个。在一些实施方案中，crispr-cas效应子蛋白可以是源自沙氏纤毛菌(leptotrichia shahii)的cas13a蛋白，其识别单个3’a、u或c的原间隔子侧翼序列(pfs)(或rna pam(rpam))序列基序，所述序列基序可以位于靶核酸内。
[0250]
在一些实施方案中，crispr-cas效应子蛋白可源自cas12a，其是v型成簇的规律间隔的短回文重复序列(crispr)-cas核酸酶。参见例如seq id no：1-20。cas12a在几个方面不同于更广为人知的ii型crispr cas9核酸酶。例如，cas9识别位于其引导rna(grna、sgrna、crrna、crdna、crispr阵列)结合位点(原间隔子、靶核酸、靶dna)3’的富含g的原间隔子邻近基序(pam)(3
’‑
ngg)，而cas12a识别位于靶核酸5’的富含t的pam(5
’‑
ttn、5
’‑
tttn)。事实上，cas9和cas12a结合其引导rna的方向与它们的n和c末端几乎相反。此外，cas12a酶使用单引导rna(grna，crispr阵列，crrna)，而不是天然cas9系统中发现的双引导rna
(sgrna(例如crrna和tracrrna))，并且cas12a加工其自身的grna。另外，cas12a核酸酶活性产生交错的dna双链断裂，而不是由cas9核酸酶活性产生的平端，并且cas12a依赖于单个ruvc结构域来切割两条dna链，而cas9利用hnh结构域和ruvc结构域来切割。
[0251]
可用于本发明的crispr cas12a效应子蛋白/结构域可以是任何已知或后来鉴定的cas12a多肽(以前称为cpf1)(参见，例如美国专利第9,790,490号，就其中cpf1(cas12a)序列的公开内容将其通过引用并入本文)。术语“cas12a”、“cas12a多肽”或“cas12a结构域”是指包含cas12a多肽或其片段的rna引导的核酸酶，其包含cas12a的指导核酸结合结构域和/或cas12a的活性、无活性或部分活性的dna切割结构域。在一些实施方案中，可用于本发明的cas12a可在核酸酶活性部位(例如cas12a结构域的ruvc位点)中包含突变。在其核酸酶活性部位具有突变并因此不再包含核酸酶活性的cas12a结构域或cas12a多肽通常被称为deadcas12a(例如dcas12a)。在一些实施方案中，在其核酸酶活性部位中具有突变的cas12a结构域或cas12a多肽可能具有受损的活性，例如，可能具有切口酶活性。
[0252]
任何可用于碱基编辑的脱氨酶结构域/多肽都可以用于本发明。在一些实施方案中，脱氨酶结构域可以是胞嘧啶脱氨酶结构域或腺嘌呤脱氨酶结构域。可用于本发明的胞嘧啶脱氨酶(或胞苷脱氨酶)可以是来自任何生物体的任何已知或后来鉴定的胞嘧啶脱氨酶(参见，例如美国专利第0,167,457号和thuronyi等人nat.biotechnol.37:1070
–
1079(2019)，其中每一篇都就其胞嘧啶脱氨酶的公开内容通过引用并入本文)。胞嘧啶脱氨酶可分别催化胞苷或脱氧胞苷水解脱氨为尿苷或脱氧尿苷。因此，在一些实施方案中，可用于本发明的脱氨酶或脱氨酶结构域可以是胞苷脱氨酶结构域，催化胞嘧啶水解脱氨为尿嘧啶。在一些实施方案中，胞嘧啶脱氨酶可以是天然存在的胞嘧啶脱氨酶(包括但不限于灵长类动物(例如人、猴、黑猩猩、大猩猩)、狗、牛、大鼠或小鼠)的变体。因此，在一些实施方案中，可用于本发明的胞嘧啶脱氨酶可以与野生型胞嘧啶脱氨酶具有约70％至约100％同一性(例如与天然存在的胞嘧啶脱氨酶具有约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，以及其中的任何范围或数值)。
[0253]
在一些实施方案中，可用于本发明的胞嘧啶脱氨酶可以是载脂蛋白b mrna编辑复合物(apobec)家族脱氨酶。在一些实施方案中，胞嘧啶脱氨酶可以是apobec1脱氨酶、apobec2脱氨酶、apobec3a脱氨酶、apobec3b脱氨酶、apobec3c脱氨酶、apobec3d脱氨酶、apobec3f脱氨酶、apobec3g脱氨酶、apobec3h脱氨酶、apobec4脱氨酶、人活化诱导脱氨酶(haid)、rapobec1、ferny和/或cda1，任选地是pmcda1、atcda1(例如at2g 19570)及其进化形式(例如seq id no：27,seq id no：28或seq id no：29)。在一些实施方案中，胞嘧啶脱氨酶可以是具有seq id no：23的氨基酸序列的apobec1脱氨酶。在一些实施方案中，胞嘧啶脱氨酶可以是具有seq id no：24的氨基酸序列的apobec3a脱氨酶。在一些实施方案中，胞嘧啶脱氨酶可以是cda1脱氨酶，任选地是具有seq id no：25的氨基酸序列的cda1。在一些实施方案中，胞嘧啶脱氨酶可以是ferny脱氨酶，任选地是具有seq id no：26的氨基酸序列的ferny。在一些实施方案中，可用于本发明的胞嘧啶脱氨酶可以与天然存在的胞嘧啶脱氨酶(例如进化的脱氨酶)的氨基酸序列具有约70％至约100％同一性(例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一
性)。在一些实施方案中，可用于本发明的胞嘧啶脱氨酶可与seq id no：23、seq id no：24、seq id no：25或seq id no：26的氨基酸序列具有约70％至约99.5％同一性(例如约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性)(例如与seq id no：23、seq id no：24、seq id no：25、seq id no：26、seq id no：27、seq id no：28或seq id no：29的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性)。在一些实施方案中，可以为了在植物中表达而对编码胞嘧啶脱氨酶的多核苷酸进行密码子优化，并且经密码子优化的多肽可与参考多核苷酸具有约70％至99.5％同一性。
[0254]
在一些实施方案中，本发明的核酸构建体还可编码尿嘧啶糖基化酶抑制剂(ugi)(例如尿嘧啶-dna糖基化酶抑制剂)多肽/结构域。因此，在一些实施方案中，编码crispr-cas效应子蛋白和胞嘧啶脱氨酶结构域(例如编码包含与胞嘧啶脱氨酶结构域融合的crispr-cas效应子蛋白结构域，和/或与肽标签或能够结合肽标签的亲和多肽融合的crispr-cas效应子蛋白结构域，和/或与肽标签或能够结合肽标签的亲和多肽融合的脱氨酶蛋白结构域的融合蛋白)的核酸构建体还可编码尿嘧啶-dna糖基化酶抑制剂(ugi)，任选地其中可以为了在植物中表达而对ugi进行密码子优化。在一些实施方案中，本发明提供了包含crispr-cas效应多肽、脱氨酶结构域和ugi的融合蛋白和/或编码其的一种或多种多核苷酸，任选地，其中可以为了在植物中表达而对所述一种或多种多核苷酸进行密码子优化。在一些实施方案中，本发明提供了融合蛋白，其中可将crispr-cas效应多肽、脱氨酶结构域和ugi与本文所述的肽标签和亲和多肽的任意组合融合，从而将脱氨酶结构域和ugi募集到crispr-cas效应多肽和靶核酸。在一些实施方案中，可将指导核酸与募集rna基序连接，并且可将一个或多个脱氨酶结构域和/或ugi与能够与募集rna基序相互作用的亲和多肽融合，从而将脱氨酶结构域和ugi募集到靶核酸上。
[0255]
可用于本发明的“尿嘧啶糖基化酶抑制剂”可以是能够抑制尿嘧啶-dna糖基化酶碱基-切除修复酶的任何蛋白质。在一些实施方案中，ugi结构域包含野生型ugi或其片段。在一些实施方案中，可用于本发明的ugi结构域可以与天然存在的ugi结构域的氨基酸序列具有约70％至约100％同一性(例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性，以及其中的任何范围或数值)。在一些实施方案中，ugi结构域可包含seq id no：41的氨基酸序列或与seq id no：41的氨基酸序列具有约70％至约99.5％序列同一性(例如与seq id no：41的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性)的多肽。例如，在一些实施方案中，ugi结构域可包含seq id no：41的氨基酸序列的片段，所述片段与seq id no：41的氨基酸序列的一部分连续核苷酸(例如10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80个连续核苷酸；例如约10、15、20、25、30、35、40、45个至约50、55、60、65、70、75、80个连续核苷酸)具有100％同一性。在一些实施方案中，ugi结构域可以是已知ugi(例如seq id no：41)的变体，其与已知ugi具有约70％至约99.5％序列同一性(例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％、99.5％序列同一性，以及其中的任何范围或数值)。在一些实施方案中，可以为了在植物(例如植物)中表达而对编码ugi的多核苷酸进行密码子优化，并且经密码子优化的多肽可与参考多核苷酸具有约70％至约99.5％同一性。
[0256]
可用于本发明的腺嘌呤脱氨酶(或腺苷脱氨酶)可以是来自任何生物体的任何已知的或后来鉴定的腺嘌呤脱氨酶(参见，例如美国专利第10,113,163号，其就其腺嘌呤脱氨酶的公开内容通过引用并入本文)。腺嘌呤脱氨酶可以催化腺嘌呤或腺苷的水解脱氨。在一些实施方案中，腺嘌呤脱氨酶可以分别催化腺苷或脱氧腺苷水解脱氨为肌苷或脱氧肌苷。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶可以催化dna中腺嘌呤或腺苷的水解脱氨。在一些实施方案中，由本发明的核酸构建体编码的腺嘌呤脱氨酶可在靶核酸的有义(例如“ ”；模板)链中产生a
→
g转换或在靶核酸的反义(如
“‑”
，互补)链中产生t
→
c转换。
[0257]
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶可以是天然存在的腺嘌呤脱氨酶的变体。因此，在一些实施方案中，腺苷脱氨酶可以与野生型腺嘌呤脱氨酶具有约70％至100％同一性(例如与天然存在的腺嘌吟脱氨酶具有约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，以及其中的任何范围或数值)。在一些实施方案中，所述脱氨酶不是天然存在的，并且可以被称为工程化的、突变的或进化的腺苷脱氨酶。因此，例如，工程化的、突变的或进化的腺嘌呤脱氨酶多肽或腺嘌呤脱氨酶结构域可以与天然存在的腺嘌呤脱氨酶多肽/结构域具有约70％至99.9％同一性(例如与天然存在的腺嘌呤脱氨酶多肽或腺嘌呤脱氨酶结构域具有约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同一性，以及其中的任何范围或数值)。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶可以来自细菌(例如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae)、新月柄杆菌(caulobacter crescentus)等)。在一些实施方案中，可以对编码腺嘌呤脱氨酶多肽/结构域的多核苷酸进行密码子优化以用于在植物中表达。
[0258]
在一些实施方案中，腺嘌呤脱氨酶结构域可以是野生型trna特异性腺苷脱氨酶结构域，例如trna特异性腺苷脱氨酶(tada)和/或突变/进化的腺苷脱氨酶结构域，例如突变/进化的trna特异性腺苷脱氨酶结构域(tada*)。在一些实施方案中，tada结构域可来自大肠杆菌。在一些实施方案中，tada可以被修饰，例如被截短，可以相对于全长tada缺失一个或多个n-末端和/或c-末端氨基酸(例如，可以相对于全长tada缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、6、17、18、19或20个n-末端和/或c-末端氨基酸残基)。在一些实施方案中，tada多肽或tada结构域不包含n-末端甲硫氨酸。在一些实施方案中，野生型大肠杆菌tada包含seq id no：30的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变/进化的大肠杆菌tada*包含seq id no：31-40(例如seq id no：31、32、33、34、35、36、37、38、39或40)的氨基酸序列。在一些实施方案中，可以对编码tada/tada*的多核苷酸进行密码子优化而用于植物中表达。
[0259]
胞嘧啶脱氨酶催化胞嘧啶脱氨并产生胸苷(通过尿嘧啶中间体)，引起基因组中c至t的转换或互补链内g至a的转换。因此，在一些实施方案中，由本发明的多核苷酸编码的胞嘧啶脱氨酶在靶核酸的有义(例如“ ”；模板)链中产生c
→
t的转换或在靶核酸的反义(如
“‑”
，互补)链中产生g
→
a的转换。
[0260]
在一些实施方案中，由本发明的核酸构建体编码的腺嘌呤脱氨酶在靶核酸的有义(例如“ ”；模板)链中产生a
→
g的转换或在靶核酸的反义(如
“‑”
，互补)链中产生t
→
c的转换。
[0261]
编码包含序列特异性核酸结合蛋白和胞嘧啶脱氨酶多肽的碱基编辑器的本发明核酸构建体，以及编码所述碱基编辑器的核酸构建体/表达盒/载体，可以与指导核酸组合用于修饰靶核酸，包括但不限于在靶核酸中产生c
→
t或g
→
a突变，所述靶核酸包括但不限于质粒序列；在编码序列中产生c
→
t或g
→
a突变以改变氨基酸身份；在编码序列中产生c
→
t或g
→
a突变以产生终止密码子；在编码序列中产生c
→
t或g
→
a突变以破坏起始密码子；在基因组dna中产生点突变以破坏功能；和/或在基因组dna中产生点突变以破坏剪接点。
[0262]
编码包含序列特异性核酸结合蛋白和腺嘌呤脱氨酶多肽的碱基编辑器的本发明的核酸构建体，以及编码所述碱基编辑器的表达盒和/或载体可以与指导核酸组合用于修饰靶核酸，包括但不限于在靶核酸中产生a
→
g或t
→
c突变，所述靶核酸包括但不限于质粒序列；在编码序列中产生a
→
g或t
→
c突变以改变氨基酸身份；在编码序列中产生a
→
g或t
→
c突变以产生终止密码子；在编码序列中产生a
→
g或t
→
c突变以破坏起始密码子；在基因组dna中产生点突变以破坏功能；和/或在基因组dna中产生点突变以破坏剪接点。
[0263]
包含crispr-cas效应子蛋白或其融合蛋白的本发明核酸构建体可与引导rna(grna、crispr阵列、crispr rna、crrna)组合使用，以修饰靶核酸，所述引导rna被设计成与编码的crispr-cas效应子蛋白或结构域一起发挥作用。可用于本发明的指导核酸包含至少一个间隔子序列和至少一个重复序列。指导核酸能够与由本发明的核酸构建体编码和表达的crispr-cas核酸酶结构域形成复合物，并且所述间隔子序列能够与靶核酸杂交，从而将复合物(例如crispr-cas效应子融合蛋白(例如与脱氨酶结构域融合的crispr-cas效应子结构域，和/或与肽标签或亲和多肽融合的crispr-cas效应子结构域，以募集脱氨酶结构域和任选地ugi)引导至靶核酸，其中靶核酸可以被脱氨酶结构域修饰(例如切割或编辑)或调节(例如调节转录)。
[0264]
例如，编码与胞嘧啶脱氨酶结构域连接的cas9结构域(例如融合蛋白)的核酸构建体可与cas9指导核酸组合使用，以修饰靶核酸，其中融合蛋白的胞嘧啶脱氨酶结构域使靶核酸中的胞嘧啶碱基脱氨基，从而编辑靶核酸。在另一个实例中，编码与腺嘌呤脱氨酶结构域连接的cas9结构域(例如融合蛋白)的核酸构建体可与cas9指导核酸组合使用，以修饰靶核酸，其中融合蛋白的腺嘌呤脱氨酶结构域使靶核酸中的腺苷碱基脱氨基，从而编辑靶核酸。
[0265]
同样，编码与胞嘧啶脱氨酶结构域或腺嘌脱氨酶结构域连接的cas12a结构域(或其他选定的crispr-cas核酸酶，例如c2c1、c2c3、cas12b、cas12c、cas12d、cas12e、cas13a、cas13b、cas13c、cas13d、casl、caslb、cas2、cas3、cas3’、cas3"、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9(也称为csnl和csx12)、cas10、csyl、csy2、csy3、csel、cse2、cscl、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmrl、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csbl、csb2、csb3、csxl7、csxl4、csx10、csx16、csax、csx3、csxl、csxl5、csfl、csf2、csf3、csf4(ding)和/或csf5)(例如融合蛋白)的核酸构建体可与cas12a指导核酸(或用于其它选定的crispr-cas核酸酶的指导核酸)组合使用，以修饰靶核酸，其中融合蛋白的胞嘧啶脱氨酶结构域或腺嘌呤脱氨酶
结构域使靶核酸中的胞嘧啶碱基脱氨基，从而编辑所述靶核酸。
[0266]
如本文中所用，“指导核酸”、“引导rna”、“grna”、“crispr rna/dna”、“crrna”或“crdna”意指包含至少一个与靶dna互补(并与之杂交)的间隔子序列(例如原间隔子)和至少一个重复序列(例如v型cas12a crispr-cas系统的重复序列，或其片段或部分；ii型cas9 crispr-cas系统的重复序列，或其片段；v型c2c1 crispr cas系统的重复序列或其片段；例如c2c3、cas12a(也称为cpf1)、cas12b、cas12c、cas12d、cas12e、cas13a、cas13b、cas13c、cas13d、casl、caslb、cas2、cas3、cas3’、cas3"、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9(也称为csnl和csx12)、cas10、csyl、csy2、csy3、csel、cse2、cscl、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmrl、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csbl、csb2、csb3、csxl7、csxl4、csx10、csx16、csax、csx3、csxl、csxl5、csfl、csf2、csf3、csf4(ding)和/或csf5的crispr-cas系统的重复序列或其片段)的核酸，其中重复序列可与间隔子序列的5’末端和/或3’末端连接。本发明的grna的设计可以基于i型、ii型、iii型、iv型、v型或vi型crispr-cas系统。
[0267]
在一些实施方案中，cas12a grna可以从5’至3’包含重复序列(全长或其部分(“柄(handle)”)；例如假结样结构)和间隔子序列。
[0268]
在一些实施方案中，指导核酸可包含不止一个重复序列-间隔子序列(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个重复序列-间隔子序列)(例如重复序列-间隔子序列-重复序列，例如重复序列-间隔子序列-重复序列-间隔子序列-重复序列-间隔子序列-重复序列-间隔子序列-重复序列-间隔子序列，等等)。本发明的指导核酸是合成的、人造的和不是在自然界中发现的。grna可以相当长，可以用作适体(如在ms2募集策略中那样)或其他从间隔子垂悬的rna结构。
[0269]
如本文中所用，“重复序列”是指例如野生型crispr cas基因座(例如cas9基因座、cas12a基因座、c2c1基因座等)的任何重复序列或与本发明核酸构建体编码的crispr-cas效应子蛋白一起发挥功能的合成crrna的重复序列。可用于本发明的重复序列可以是crispr-cas基因座(例如i型、ii型、iii型、iv型、v型或vi型)的任何已知或后来鉴定的重复序列，或者其可以是被设计成在i型、ii型、iii型、iv型、v型或vi型crispr-cas系统中起作用的合成重复序列。重复序列可以包含发夹结构和/或茎环结构。在一些实施方案中，重复序列可以在其5’末端形成假结样结构(即，“柄”)。因此，在一些实施方案中，重复序列可以与来自野生型i型crispr-cas基因座、ii型crispr-cas基因座、iii型crispr-cas基因座、iv型crispr-cas基因座、v型crispr-cas基因座和/或vi型crispr-cas基因座的重复序列相同或实质性相同。来自野生型crispr-cas基因座的重复序列可以通过已建立的算法，诸如使用通过crisprdb提供的crisprfinder(参见，grissa等人nucleic acids res.35(网络服务器发行):w52-7)来确定。在一些实施方案中，重复序列或其部分在其3’末端与间隔子序列的5’末端连接，从而形成重复序列-间隔子序列(例如指导核酸、引导rna/dna、crrna、crdna)。
[0270]
在一些实施方案中，重复序列包含至少10个核苷酸，或基本上由至少10个核苷酸组成，或由至少10个核苷酸组成，这取决于具体的重复序列和包含该重复序列的指导核酸被加工还是未被加工(例如约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50至100个或更多个核苷酸，或其中的任何范围或数值)。在一些实施方案中，重复序列包含约10至
约20、约10至约30、约10至约45、约10至约50、约15至约30、约15至约40、约15至约45、约15至约50、约20至约30、约20至约40、约20至约50、约30至约40、约40至约80、约50至约100个或更多个核苷酸，基本由所述核苷酸组成，或由所述核苷酸组成。
[0271]
与间隔子序列的5’末端连接的重复序列可以包含重复序列的一部分(例如野生型重复序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个或更多个连续核苷酸)。在一些实施方案中，与间隔子序列的5’末端连接的重复序列的一部分在长度上可以是野生型crispr cas重复核苷酸序列的约5至约10个连续核苷酸(例如约5、6、7、8、9、10个核苷酸)，并且与野生型crispr cas重复核苷酸序列的相同区域(例如5’末端)具有至少90％序列同一性(例如至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100％))。在一些实施方案中，重复序列的一部分可在其5’末端包含假结样结构(例如“柄”)。
[0272]
如本文中所用，“间隔子序列”是与靶核酸(例如靶dna)(例如原间隔子)(例如如下序列的连续核苷酸)互补的核苷酸序列，其中所述序列(a)包含与seq id no：78-80中任一核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(b)包含与seq id no：81-83中任一核苷酸序列具有至少90％序列同一性的区域；(c)编码与seq id no：72-74中任一氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或(d)编码具有与seq id no：75-77中任一氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域。在一些实施方案中，间隔子序列(例如一个或多个间隔子)可以包括、但不限于seq id no：101-104和/或seq id nos:110-117中任一个的核苷酸序列。间隔子序列可以与靶核酸完全互补或实质性互补(例如至少约70％(例如约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)(例如99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100％)互补)。因此，在一些实施方案中，与靶核酸相比，间隔子序列可具有一个、两个、三个、四个或五个错配，所述错配可以是连续的或不连续的。在一些实施方案中，间隔子序列可以与靶核酸具有70％的互补性。在其他实施方案中，间隔子核苷酸序列可以与靶核酸具有80％的互补性。在其他实施方案中，间隔子核苷酸序列可与靶核酸(原间隔子)具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的互补性等。在一些实施方案中，间隔子序列与靶核酸100％互补。间隔子序列可具有约15个核苷酸至约30个核苷酸(例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸，或其中的任何范围或数值)的长度。因此，在一些实施方案中，间隔子序列可以在靶核酸(例如原间隔子)的长度为至少约15个核苷酸至约30个核苷酸的区域上具有完全互补性或实质性互补性。在一些实施方案中，间隔子长度约为20个核苷酸。在一些实施方案中，间隔子长度为约21个、22个或23个核苷酸。
[0273]
在一些实施方案中，指导核酸的间隔子序列的5’区域可以与靶dna相同，而所述间隔子的3’区域可以与靶dna(例如v型crispr-cas)实质性互补，或者指导核酸的间隔子序列的3’区域可与靶dna相同，而所述间隔子的5’区域可以与靶dna(例如ii型crispr-cas)实质性互补，因此，间隔子序列与靶dna的总体互补性可以小于100％。因此，例如，在v型crispr-cas系统的指导核酸中，例如20个核苷酸的间隔子序列的5’区域(即，种子区域)中的前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个核苷酸可以与靶dna 100％互补，而间隔子序列的3’区中的其余核苷
酸与靶dna实质性互补(例如至少约70％互补)。在一些实施方案中，间隔子序列5’末端的前1至8个核苷酸(例如前1、2、3、4、5、6、7、8个核苷酸以及其中的任何范围)可以与靶dna 100％互补，而间隔子序列3’区域的其余核苷酸与靶dna实质性互补(例如至少约50％(例如50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)互补)。
[0274]
作为另外的实例，在ii型crispr-cas系统的指导核酸中，例如20个核苷酸的间隔子序列的3’区域(即种子区)中的前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个核苷酸可以与靶dna 100％互补，而间隔子序列的5’区域中的其余核苷酸与靶dna实质性互补(例如至少约70％互补)。在一些实施方案中，间隔子序列3’端的前1至10个核苷酸(例如前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个核苷酸以及其中的任何范围)可以与靶dna 100％互补，而间隔子序列5’区中的其余核苷酸与靶dna实质性互补(例如至少约50％(例如至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多或其中的任何范围或数值)互补)。
[0275]
在一些实施方案中，间隔子的种子区长度可为约8至约10个核苷酸，长度可为约5至约6个核苷酸，或长度可为约6个核苷酸。
[0276]
如本文中所用，“靶核酸”、“靶dna”、“靶核苷酸序列”、“靶区域”或“基因组中的靶区域”是指植物基因组中与本发明的指导核酸中的间隔子序列完全互补(100％互补)或实质性互补(例如至少70％(例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)互补)的区域。对crispr-cas系统有用的靶区域可以紧邻生物体基因组(例如植物基因组)中pam序列的3’(例如v型crispr-cas系统)或5’(例如ii型crispr-cas系统)。靶区域可以选自紧邻pam序列定位的至少15个连续核苷酸(例如16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸等)的任何区域。
[0277]“原间隔子序列”是指靶双链dna，具体是指与crispr重复-间隔子序列(例如指导核酸、crispr阵列、crrna)的间隔子序列完全互补或实质性互补(并杂交)的靶dna的部分(例如，或基因组中的靶区域)。
[0278]
在v型crispr-cas(例如cas12a)系统和ii型crispr-cas(cas9)系统的情况下，原间隔子序列侧接(例如紧邻)原间隔子邻近基序(protospacer adjacent motif,pam)。对于iv型crispr-cas系统，pam位于非靶链的5’末端和靶链的3’末端(例如参见下文)。
[0279][0280]
在ii型crispr-cas(例如cas9)系统的情况下，pam紧邻靶区域的3’。i型crispr-cas系统的pam位于靶链的5’。iii型crispr-cas系统没有已知的pam。makarova等人描述了crispr系统的所有类别、类型和亚型的命名法(nature reviews microbiology 13:722
–
736(2015))。引导结构和pam由r.barrangou(genome biol.16:247(2015))描述。
[0281]
典型的cas12a pam富含t。在一些实施方案中，典型的cas12apam序列可以是5
’‑
ttn、5
’‑
tttn或5
’‑
tttv。在一些实施方案中，典型的cas9(例如化脓性链球菌)pam可以是5
’‑
ngg-3’。在一些实施方案中，可以使用非典型的pam，但是可能效率更低一些。
[0282]
本领域技术人员可以通过已建立的实验和计算方法确定其他pam序列。因此，例如，实验方法包括靶向两侧为所有可能的核苷酸序列的序列，并鉴定不经历靶向的序列成员，诸如通过靶质粒dna的转化(esvelt等人2013.nat.methods 10:1116-1121；jiang等人2013.nat.biotechnol.31:233-239)。在一些方面，计算方法可包括对天然间隔子进行blast搜索以鉴定噬菌体或质粒中的原始靶dna序列，并比对这些序列以确定邻近靶序列的保守序列(briner和barrangou 2014.appl.environ.microbiol.80:994-1001；mojica等人2009.microbiology 155:733-740)。
[0283]
在一些实施方案中，本发明提供了包含本发明核酸构建体的表达盒和/或载体(例如本发明编辑系统的一个或多个组分)。在一些实施方案中，可以提供包含本发明的核酸构建体和/或一种或多种指导核酸的表达盒和/或载体。在一些实施方案中，编码碱基编辑器的本发明的核酸构建体(例如包含crispr-cas效应子蛋白和脱氨酶结构域的构建体(例如融合蛋白))或用于碱基编辑的组分(例如与肽标签或亲和多肽融合的crispr-cas效应子蛋白，与肽标签或亲和多肽融合的脱氨酶结构域，和/或与肽标签或亲和多肽融合的ugi)，可以包含在与包含所述一种或多种指导核酸的表达盒或载体相同的表达盒或载体上或者另外的表达盒或载体上。当编码碱基编辑器的核酸构建体或用于碱基编辑的组分包含在与包含指导核酸的表达盒或载体分开的表达盒或载体上时，可以例如在提供(例如与靶核酸接触)包含指导核酸的表达盒之前、与之同时或之后，将靶核酸以彼此之间的任何顺序与编码碱基编辑器或用于碱基编辑的组分的表达盒或载体和指导核酸接触(例如与其一起提供)。
[0284]
如本领域已知的，本发明的融合蛋白可包含序列特异性核酸结合结构域(例如序列特异性dna结合结构域)、crispr-cas多肽和/或与肽标签或与肽标签相互作用的亲和多肽融合的脱氨酶结构域，用于将脱氨酶募集到靶核酸。募集方法还可包括与rna募集基序和脱氨酶(其与能够与rna募集基序相互作用的亲和多肽融合)连接的指导核酸，从而将脱氨酶募集到靶核酸上。或者，化学相互作用可用于将多肽(例如脱氨酶)募集到靶核酸上。
[0285]
可用于本发明的肽标签(例如表位)可包括、但不限于gcn4肽标签(例如sun标签)、c-myc亲和标签、ha亲和标签、his亲和标签、s亲和标签、甲硫氨酸-his亲和标签、rgd-his亲和标签、flag八肽、strep标签或strep标签ii、v5标签和/或vsv-g表位。可以与多肽连接的以及对于其存在可以与另一种多肽连接的相应的亲和多肽的任何表位，都可以在本发明中用作肽标签。在一些实施方案中，肽标签可包含1个或2个或更多个拷贝的肽标签(例如重复单元、多聚化表位(例如串联重复))(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个重复单元)。在一些实施方案中，与肽标签相互作用/结合的亲和多肽可以是抗体。在一些实施方案中，所述抗体可以是scfv抗体。在一些实施方案中，与肽标签结合的亲和多肽可以是合成的(例如为亲和相互作用而进化的)，包括但不限于亲和体、anticalin、单抗体(monobody)和/或darpin(参见例如sha等人，protein sci.26(5):910-924(2017))；gilbreth(curr opin struc biol 22(4):413-420(2013))，美国专利第9,982,053号，就与亲和体、抗anticalin、单抗体和/或darpin相关的教导将它
们均通过引用整体并入本文。肽标签序列实例及其亲和多肽包括、但不限于氨基酸序列seq id no：45-47。
[0286]
在一些实施方案中，指导核酸可与rna募集基序连接，待募集的多肽(例如脱氨酶)可与和所述rna募集基序结合的亲和多肽融合，其中所述指导核酸与靶核酸结合，并且所述rna募集基序与亲和多肽结合，从而将多肽募集到指导核酸处，并使靶核酸与所述多肽(例如脱氨酶)接触。在一些实施方案中，两种或更多种多肽可被募集到指导核酸，从而使靶核酸与两种或更多种多肽(例如脱氨酶)接触。rna募集基序实例及其亲和多肽包括但不限于seq id no：48-58的序列。
[0287]
在一些实施方案中，与亲和多肽融合的多肽可以是逆转录酶，指导核酸可以是与rna募集基序连接的延伸的指导核酸。在一些实施方案中，rna募集基序可以位于延伸的指导核酸的延伸部分的3’末端(例如5
’‑3’
，重复序列-间隔子-延伸的部分(rt模板-引物结合位点)-rna募集基序)。在一些实施方案中，rna募集基序可以嵌入延伸的部分。
[0288]
在本发明的一些实施方案中，可将延伸的引导rna和/或引导rna与一个或两个或更多个rna募集基序(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个基序，例如至少10至约25个基序)连接，任选地，其中所述两个或更多个rna募集基序可以是相同的rna募集基序或是不同的rna募集基序。在一些实施方案中，rna募集基序和相应的亲和多肽可以包括但不限于端粒酶ku结合基序(例如ku结合发夹)和相应的亲和多肽ku(例如ku异二聚体)、端粒酶sm7结合基序和相应的亲和多肽sm7、ms2噬菌体操纵子茎环和相应的亲和多肽ms2外壳蛋白(mcp)、pp7噬菌体操纵子茎环和相应的亲和多肽pp7外壳蛋白(pcp)、sfmu噬菌体com茎环和相应的亲和多肽com rna结合蛋白、puf结合位点(pbs)和亲和多肽pumilio/fem-3mrna结合因子(puf)，和/或合成的rna-适体和适体配体作为相应的亲和多肽。在一些实施方案中，rna募集基序和相应的亲和多肽可以是ms2噬菌体操纵子茎环和亲和多肽ms2外壳蛋白(mcp)。在一些实施方案中，rna募集基序和相应的亲和多肽可以是puf结合位点(pbs)和亲和多肽pumilio/fem-3mrna结合因子(puf)。
[0289]
在一些实施方案中，用于募集多肽和核酸的组分可以是通过化学相互作用起作用的那些组分，包括但不限于：雷帕霉素诱导的frb
–
fkbp的二聚化；生物素-链霉抗生物素蛋白素；snap标签；halo标签；clip标签；由化合物诱导的dmra-dmrc异二聚体；双功能配体(例如两种蛋白结合化学物质融合在一起，例如二氢叶酸还原酶(dhfr))。
[0290]
在一些实施方案中，为了在植物中表达而优化的本发明的核酸构建体、表达盒或载体可以与包含相同多核苷酸(但其未针对在植物中表达而进行过密码子优化)的核酸构建体、表达盒或载体具有约70％至100％(例如约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％)同一性。
[0291]
本文还提供了包含本发明的一种或多种多核苷酸、指导核酸、核酸构建体、表达盒或载体的细胞。
[0292]
本发明的核酸构建体(例如，包含序列特异性dna结合结构域、crispr-cas效应子结构域、脱氨酶结构域、逆转录酶(rt)、rt模板和/或指导核酸等的构建体)和包含其的表达盒/载体可用作本发明的编辑系统，用于修饰靶核酸和/或其表达。
[0293]
可以使用本发明的多肽、多核苷酸、核糖核蛋白(rnp)、核酸构建体、表达盒和/或
载体修饰(例如突变，例如碱基编辑、切割、切刻等)任何植物或植物部分(或植物的分组，例如分成属或更高级分类)的靶核酸，所述植物包括被子植物、裸子植物、单子叶植物、双子叶植物、c3植物、c4植物、cam植物、苔藓植物、蕨类植物和/或拟蕨类植物、微藻和/或大型藻类。可以如本文所述进行修饰的植物和/或植物部分可以是任何植物物种/品种/栽培品种的植物和/或植物部分。在一些实施方案中，可以如本文所述进行修饰的植物是单子叶植物。在一些实施方案中，可以如本文所述进行修饰的植物是双子叶植物。
[0294]
如本文中所用，术语“植物部分”包括、但不限于生殖组织(例如花瓣、萼片、雄蕊、雌蕊、花托、花药、花粉、花、果实、花芽、胚珠、种子、胚、坚果、谷粒、穗、玉米芯和外壳)；营养组织(例如叶柄、茎(stem)、根、根毛、根尖、髓、胚芽鞘、茎(stalk)、芽、枝、树皮、顶端分生组织、腋芽、子叶、下胚轴和叶)；维管组织(例如韧皮部和木质部)；特化细胞，诸如表皮细胞、薄壁细胞、厚角细胞、厚壁细胞、气孔、保卫细胞、角质层、叶肉细胞；愈伤组织；和插枝。术语“植物部分”还包括植物细胞，包括在植物和/或植物部分中完整的植物细胞、植物原生质体、植物组织、植物器官、植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块等。如本文中所用，“芽”是指包括叶和茎在内的地上部分。如本文中所用，术语“组织培养物”包括组织、细胞、原生质体和愈伤组织的培养物。
[0295]
如本文中所用，“植物细胞”是指植物的结构和生理单位，其通常包括细胞壁，但也包括原生质体。本发明的植物细胞可呈分离的单细胞形式，或者可以是培养的细胞，或者可以是更高组织单位的一部分，例如植物组织(包括愈伤组织)或植物器官。在一些实施方案中，植物细胞可以是藻类细胞。“原生质体”是没有细胞壁或只有部分细胞壁的分离的植物细胞。因此，在本发明的一些实施方案中，包含本发明核酸分子和/或核苷酸序列的转基因细胞是任何植物或植物部分的细胞，包括但不限于根细胞、叶细胞、组织培养物细胞、种子细胞、花细胞、果实细胞、花粉细胞等。在本发明的一些方面，植物部分可以是植物种质。在一些方面，植物细胞可以是不能再生为植物的非繁殖植物细胞。
[0296]“植物细胞培养物”意指植物单位例如原生质体、细胞培养细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子和不同发育阶段的胚的培养物。
[0297]
如本文中所用，“植物器官”是植物的独特且明显结构化和分化的部分，例如根、茎、叶、花蕾或胚。
[0298]
如本文中所用，“植物组织”是指组织成结构和功能单位的一群植物细胞。包括在植物中或培养中的任何植物组织。该术语包括、但不限于完整植物、植物器官、植物种子、组织培养物和组织成结构和/或功能单位的任何植物细胞群。该术语在结合上面列出的或以其它方式由本定义包含的任何特定类型的植物组织使用时，或者在不提及上面列出的或以其它方式由本定义包含的任何特定类型的植物组织而使用时，并不意图排除任何其他类型的植物组织。
[0299]
在本发明的一些实施方案中，提供了转基因组织培养物或转基因植物细胞培养物，其中所述转基因组织或细胞培养物包含本发明的核酸分子/核苷酸序列。在一些实施方案中，可以通过将所述转基因植物与非转基因植物杂交，并在后代中选择包含所需基因编辑但不包含用于产生所述编辑的转基因的植物，从由所述转基因组织或细胞发育的植物中消除所述转基因。
[0300]
可以如本文所述修饰包含内源cle基因的任何植物，以增加穗行数，任选地没有实
质性减少穗的长度(例如，穗长度没有减少超过5-30％)，并且任选地改善植物中的产量性状。可以如本文所述进行修饰的植物的非限制性实例可包括但不限于草坪草(例如，早熟禾(bluegrass)、翦股颖、黑麦草、羊茅草)、羽状苇草(feather reed grass)、丛生毛草、芒草、芦竹、柳枝稷、蔬菜作物，包括洋蓟、大头菜、芝麻菜、韭菜、芦笋、莴苣(例如，头、叶、长叶莴苣)、暗绿叶黄体芋(malanga)、瓜类(例如，甜瓜、西瓜、克伦肖瓜(crenshaw)、白兰瓜、罗马甜瓜)、油菜作物(例如,球芽甘蓝、卷心菜、花椰菜、西兰花、羽衣甘蓝、无头甘蓝、大白菜、小白菜)、刺菜蓟、胡萝卜、纳帕(napa)、秋葵、洋葱、芹菜、欧芹、鹰嘴豆、欧洲萝卜、菊苣、胡椒、马铃薯、葫芦科植物(例如，西葫芦、黄瓜、密生西葫芦、南瓜(pumpkin)、蜜瓜、西瓜、罗马甜瓜)、水萝卜、干球洋葱、芜菁甘蓝、茄子、婆罗门参、宽叶苦苣、青葱、菊苣、大蒜、菠菜、大葱、南瓜、绿叶蔬菜、甜菜(糖用甜菜和饲料用甜菜)、甘薯、牛皮菜、山葵、番茄、芜菁和香料；水果作物，诸如苹果、杏、樱桃、油桃、桃、梨、李子、梅子、樱桃、榅桲(quince)、无花果、坚果(例如，栗子、山核桃、开心果、榛子、开心果、花生、核桃、澳洲坚果、杏仁等)、柑橘(例如，克莱门氏小柑橘、金橘、橙子、葡萄柚、橘子、柑橘、柠檬、酸橙等)、蓝莓、黑树莓、波森莓、蔓越莓、醋栗果、醋栗、罗甘莓、覆盆子、草莓、黑莓、葡萄(葡萄酒和餐桌)、鳄梨、香蕉、奇异果、柿子、石榴、菠萝、热带水果、梨果、甜瓜、芒果、木瓜和荔枝，大田作物诸如三叶草、苜蓿、梯牧草、月见草、草地泡沫(meadow foam)、玉米/玉蜀黍(大田、甜玉米、爆米花)、啤酒花、霍霍巴、荞麦、红花、藜麦、小麦、水稻、大麦、黑麦、小米、高粱、燕麦、黑小麦、高粱、烟草、木棉、豆科植物(豆类(例如绿色和干燥的)、扁豆、豌豆、大豆)、油料植物(油菜(rape)、油菜(canola)、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、落花生、油棕)、浮萍、拟南芥、纤维植物(棉花、亚麻、大麻、黄麻)、大麻(例如，大麻(cannabis sativa)、印度大麻和莠草大麻)、樟科(肉桂、樟脑)或诸如咖啡、甘蔗、茶和天然橡胶植物等植物；和/或诸如开花植物、仙人掌、肉质植物和/或诸如开花植物、仙人掌、肉质植物等花坛植物和/或观赏植物(例如，玫瑰、郁金香、紫罗兰)，以及诸如森林树木(阔叶树和常绿植物，诸如针叶树；例如，榆树、白蜡树、橡树、枫树、冷杉、云杉、雪松、松树、桦树、柏树、桉树、柳树)以及灌木和其他苗木等树木。在一些实施方案中，本发明的核酸构建体和/或编码其的表达盒和/或载体可用于修饰玉米、大豆、小麦、芸苔、水稻、番茄、辣椒或向日葵。
[0301]
在一些实施方案中，可以如本文所述进行修饰的植物可包括但不限于玉米、大豆、油菜、小麦、水稻、棉花、甘蔗、糖用甜菜、大麦、燕麦、苜蓿、向日葵、红花、油棕、芝麻、椰子、烟草、马铃薯、甘薯、木薯、咖啡、苹果、李子、杏、桃、樱桃、梨、无花果、香蕉、柑橘、可可、鳄梨、橄榄、杏仁、胡桃、草莓、西瓜、胡椒、葡萄、番茄、黄瓜或芸苔属某些种(例如欧洲油菜(b.napus)、甘蓝(b.oleracea)、芜菁(b.rapa)、芥菜型油菜(b.juncea)和/或黑芥(b.nigra))。在一些实施方案中，可以如本文所述进行修饰的植物是双子叶植物。在一些实施方案中，可以如本文所述进行修饰的植物是单子叶植物。在一些实施方案中，可以如本文所述进行修饰的植物是玉米(即玉蜀黍)。在一些实施方案中，可以如本文所述进行修饰的植物是小麦(例如小麦属的各个种)。
[0302]
因此，根据本发明优先处理的植物或植物栽培品种包括通过遗传修饰获得遗传物质的所有植物，所述遗传物质赋予这些植物特别有利的有用特性(“性状”)。此类特性的实例是更好的植物生长、活力、胁迫耐受性、站立能力、抗倒伏性、营养吸收、植物营养和/或产量，特别是改善的生长、对高温或低温的增强的耐受性、对干旱或水或土壤盐度水平的增强
120964或wo2002/034946中描述)；事件17053(水稻，除草剂耐受性，以pta-9843保藏，于wo2010/117737中描述的)；事件17314(水稻，除草剂耐受性，以pta-9844保藏，于wo2010/117735中描述的)；事件281-24-236(棉花，昆虫控制-除草剂耐受性，以pta-6233保藏，于wo2005/103266或us-a 2005-216969中描述的)；事件3006-210-23(棉花，昆虫控制-除草剂耐受性，以pta-6233保藏，于us-a 2007-143876或wo2005/103266中描述的)；事件3272(玉米，品质性状，以pta-9972保藏，于wo2006/098952或us-a 2006-230473中描述的)；事件33391(小麦，除草剂耐受性，以pta-2347保藏，于wo2002/027004中描述的)，事件40416(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，以atcc pta-11508保藏，于wo 11/075593中描述的)；事件43a47(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，以atcc pta-11509保藏，于wo2011/075595中描述的)；事件5307(玉米，昆虫控制，以atcc pta-9561保藏，于wo2010/077816中描述的)；事件asr-368(翦股颖，除草剂耐受性，以atcc pta-4816保藏，于us-a 2006-162007或wo2004/053062中描述的)；事件b16(玉米，除草剂耐受性，未保藏，于us-a 2003-126634中描述的)；事件bps-cv127-9(大豆，除草剂耐受性，以ncimb号41603保藏的，于wo2010/080829中描述的)；事件blrl(欧洲油菜，雄性不育的恢复，ncimb 41193保藏，于wo2005/074671中描述的)，事件ce43-67b(棉花，昆虫控制，以dsm acc2724保藏的，于us-a 2009-217423或wo2006/128573中描述的)；事件ce44-69d(棉花，昆虫控制，未保藏，于us-a 2010-0024077中描述的)；事件ce44-69d(棉花，昆虫控制，未保藏，于wo2006/128571中描述的)；事件ce46-02a(棉花，昆虫控制，未保藏，于wo2006/128572中描述的)；事件cot102(棉花，昆虫控制，未保藏，于us-a 2006-130175或wo2004/039986中描述的)；事件cot202(棉花，昆虫控制，未保藏，于us-a 2007-067868或wo2005/054479中描述的)；事件cot203(棉花，昆虫控制，未保藏，于wo2005/054480中描述的)；事件das21606-3/1606(大豆，除草剂耐受性，以pta-11028保藏，于wo2012/033794中描述的)，事件das40278(玉米，除草剂耐受性，以atcc pta-10244保藏，于wo2011/022469中描述的)；事件das-44406-6/pdab8264.44.06.l(大豆，除草剂耐受性，以pta-11336保藏，于wo2012/075426中描述的)，事件das-14536-7/pdab8291.45.36.2(大豆，除草剂耐受性，以pta-11335保藏，于wo2012/075429中描述的)，事件das-59122-7(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，以atcc pta 11384保藏，于us-a 2006-070139中描述的)、玉米事件das-59132(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，未保藏，于wo2009/100188中描述的)；事件das68416(大豆，除草剂耐受性，以atcc pta-10442保藏，于wo2011/066384或wo2011/066360中描述的)；事件dp-098140-6(玉米，除草剂耐受性，以atcc pta-8296保藏，于us-a 2009-137395或wo08/112019中描述的)；事件dp-305423-1(大豆，质量性状，未保藏，于us-a 2008-312082或wo2008/054747中描述的)；事件dp-32138-1(玉米，杂交系统，以atcc pta-9158保藏，于us-a 2009-0210970或wo2009/103049中描述的)；事件dp-356043-5(大豆，除草剂耐受性，以atcc pta-8287保藏，于us-a 2010-0184079或wo2008/002872中描述的)；事件ee-i(brinjal，昆虫控制，未保藏，于wo07/091277中描述的)；事件fil 17(玉米，除草剂耐受性，以atcc 209031保藏，于us-a 2006-059581或wo98/044140中描述的)；事件fg72(大豆，除草剂耐受性，以pta-11041保藏，于wo2011/063413中描述的)，事件ga21(玉米，除草剂耐受性，以atcc 209033保藏，于us-a 2005-086719或wo98/044140中描述的)；事件gg25(玉米，除草剂耐受性，以atcc 209032保藏，于us-a 2005-188434或wo98/044140中描述的)；事件ghb119(棉花，昆虫控制-除草剂耐受性，以atcc pta-8398保
藏，于wo2008/151780中描述的)；事件ghb614(棉花，除草剂耐受性，以atcc pta-6878保藏，于us-a 2010-050282或wo2007/017186中描述的)；事件gj11(玉米，除草剂耐受性，以atcc 209030保藏，于us-a 2005-188434或wo98/044140中描述的)；事件gm rz13(糖用甜菜，病毒抗性，以ncimb-41601保藏，于wo2010/076212中描述的)；事件h7-l(糖用甜菜，除草剂耐受性，以ncimb 41158或ncimb 41159保藏，于us-a 2004-172669或wo2004/074492中描述的)；事件joplinl(小麦，疾病耐受性，未保藏，于us-a 2008-064032中描述的)；事件ll27(大豆，除草剂耐受性，以ncimb41658保藏，于wo2006/108674或us-a 2008-320616中描述的)；事件ll55(大豆，除草剂耐受性，以ncimb 41660保藏，于wo2006/108675或us-a 2008-196127中描述的)；事件llcotton25(棉花，除草剂耐受性，以atcc pta-3343保藏，于wo2003/013224或usa 2003-097687中描述的)；事件llrice06(水稻，除草剂耐受性，以atcc 203353保藏，于美国专利第6,468,747号或wo2000/026345中描述的)；事件llrice62(水稻，除草剂耐受性，以atcc 20335保藏，于wo2000/026345中描述的)，事件llrice601(水稻，除草剂耐受性，以atcc pta-2600保藏，于us-a 2008-2289060或wo2000/026356中描述的)；事件ly038(玉米，品质性状，以atcc pta-5623保藏，于us-a 2007-028322或wo2005/061720中描述的)；事件mir162(玉米，昆虫控制，以pta-8166保藏，于us-a 2009-300784或wo2007/142840中描述的)；事件mir604(玉米，昆虫控制，未保藏，于us-a 2008-167456或wo2005/103301中描述的)；事件mon15985(棉花，昆虫控制，以atcc pta-2516保藏，于us-a 2004-250317或wo2002/100163中描述的)；事件mon810(玉米，昆虫控制，未保藏，于us-a 2002-102582中描述的)；事件mon863(玉米，昆虫控制，以atcc pta-2605保藏，于wo2004/011601或us-a 2006-095986中描述的)；事件mon87427(玉米，授粉控制，以atcc pta-7899保藏，于wo2011/062904中描述的)；事件mon87460(玉米，胁迫耐受性，以atcc pta-8910保藏，于wo2009/111263或us-a 2011-0138504中描述的)；事件mon87701(大豆，昆虫控制，以atcc pta-8194保藏，于us-a 2009-130071或wo2009/064652中描述的)；事件mon87705(大豆，品质性状-除草剂耐受性，以atcc pta-9241保藏，于us-a 2010-0080887或wo2010/037016中描述的)；事件mon87708(大豆，除草剂耐受性，以atcc pta-9670保藏，于wo2011/034704中描述的)；事件mon87712(大豆，产量，以pta-10296保藏，于wo2012/051199中描述的)，事件mon87754(大豆，品质性状，以atcc pta-9385保藏，于wo2010/024976中描述的)；事件mon87769(大豆，品质性状，以atcc pta-8911保藏，于us-a 2011-0067141或wo2009/102873中描述的)；事件mon88017(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，以atcc pta-5582保藏，于us-a 2008-028482或wo2005/059103中描述的)；事件mon88913(棉花，除草剂耐受性，以atcc pta-4854保藏，于wo2004/072235或us-a 2006-059590中描述的)；事件mon88302(欧洲油菜，除草剂耐受性，以pta-10955保藏，于wo2011/153186中描述的)，事件mon88701(棉花，除草剂耐受性，以pta-11754保藏，于wo2012/134808中描述的)，事件mon89034(玉米，昆虫控制，以atcc pta-7455保藏，于wo 07/140256或us-a 2008-260932中描述的)；事件mon89788(大豆，除草剂耐受性，以atcc pta-6708保藏，于us-a 2006-282915或wo2006/130436中描述的)；事件msl 1(欧洲油菜，授粉控制-除草剂耐受性，以atcc pta-850或pta-2485保藏号，于wo2001/031042中描述的)；事件ms8(欧洲油菜，授粉控制-除草剂耐受性，以atcc pta-730保藏，于wo2001/041558或us-a 2003-188347中描述的)；事件nk603(玉米，除草剂耐受性，以atcc pta-2478保藏，于us-a 2007-292854中描述的)；事件pe-7(水稻，昆虫控制，未保藏，于
wo2008/114282中描述的)；事件rf3(欧洲油菜，授粉控制-除草剂耐受性，以atcc pta-730保藏，于wo2001/041558或us-a 2003-188347中描述的)；事件rt73(欧洲油菜，除草剂耐受性，未保藏，于wo2002/036831或us-a 2008-070260中描述的)；事件syht0h2/syn-000h2-5(大豆，除草剂耐受性，以pta-11226保藏，于wo2012/082548中描述的)，事件t227-1(糖用甜菜，除草剂耐受性，未保藏，于wo2002/44407或us-a 2009-265817中描述的)；事件t25(玉米，除草剂耐受性，未保藏，于us-a 2001-029014或wo2001/051654中描述的)；事件t304-40(棉花，昆虫控制-除草剂耐受性，以atcc pta-8171保藏，于us-a 2010-077501或wo2008/122406中描述的)；事件t342-142(棉花，昆虫控制，未保藏，于wo2006/128568中描述的)；事件tc1507(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，未保藏，于us-a 2005-039226或wo2004/099447中描述的)；事件vip1034(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，以atcc pta-3925保藏，于wo2003/052073中描述的)，事件32316(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，以pta-11507保藏，于wo2011/084632中描述的)，事件4114(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，以pta-11506保藏，于wo2011/084621中描述的)，任选地与事件ee-gm1/ll27或事件ee-gm2/ll55(wo2011/063413a2)叠加的事件ee-gm3/fg72(大豆，除草剂耐受性，atcc登录号pta-11041)，事件das-68416-4(大豆，除草剂耐受性，atcc录号pta-10442，wo2011/066360al)，事件das-68416-4(大豆，除草剂耐受性，atcc登录号pta-10442，wo2011/066384al)，事件dp-040416-8(玉米，昆虫控制，atcc登录号pta-11508,wo2011/075593al)，事件dp-043a47-3(玉米，昆虫控制，atcc登录号pta-11509，wo2011/075595al)，事件dp-004114-3(玉米，昆虫控制，atcc登录号pta-11506，wo2011/084621al)，事件dp-032316-8(玉米，昆虫控制，atcc登录号pta-11507，wo2011/084632a1)、事件mon-88302-9(欧洲油菜，除草剂耐受性，atcc登录号pta-10955，wo2011/153186al)，事件das-21606-3(大豆，除草剂耐受性，atcc登录号pta-11028，wo2012/033794a2)，事件mon-87712-4(大豆，品质性状，atcc登录号pta-10296，wo2012/051199a2)，事件das-44406-6(大豆，叠加的除草剂耐受性，atcc登录号pta-11336，wo2012/075426al)，事件das-14536-7(大豆，叠加的除草剂耐受性，atcc登录号pta-11335，wo2012/075429al)，事件syn-000h2-5(大豆，除草剂耐受性，atcc登录号pta-11226，wo2012/082548a2)，事件dp-061061-7(欧洲油菜，除草剂耐受性，无保藏号可用，wo2012071039al)，事件dp-073496-4(欧洲油菜，除草剂耐受性，无保藏号可用，us2012131692)，事件8264.44.06.1(大豆，叠加的除草剂耐受性，登录号pta-11336，wo2012075426a2)，事件8291.45.36.2(大豆，叠加的除草剂耐受性，登录号登录号pta-11335，wo2012075429a2)，事件syht0h2(大豆，atcc登录号号pta-11226，wo2012/082548a2)，事件mon88701(棉花，atcc登录号pta-11754，wo2012/134808al)，事件kk179-2(苜蓿，atcc登录号pta-11833，wo2013/003558al)，事件pdab8264.42.32.1(大豆，叠加的除草剂耐受性，atcc登录号pta-11993，wo2013/010094al)，事件mzdt09y(玉米,atcc登录号pta-13025，wo2013/012775al)。
[0307]
赋予所述所需性状的基因/事件(例如，目标多核苷酸)也可以在转基因植物中彼此组合存在。可以提及的转基因植物的实例是重要的作物植物，诸如谷类(小麦、水稻、黑小麦、大麦、黑麦、燕麦)、玉米、大豆、马铃薯、糖用甜菜、甘蔗、番茄、豌豆和其他类型的蔬菜、棉花、烟草、欧洲油菜以及水果植物(水果苹果、梨、柑橘类水果和葡萄)，其中特别强调的是玉米、大豆、小麦、水稻、马铃薯、棉花、甘蔗、烟草和欧洲油菜。特别强调的性状是植物对昆
虫、蛛形类、线虫类、蛞蝓和蜗牛的增强的抗性，以及植物对一种或多种除草剂的增强的抗性。
[0308]
可根据本发明优先处理的此类植物、植物部分或植物种子的商购可得的实例包括以以ribroundupvtdoublevt triplebollgardroundup ready 2roundup2xten
dtm
、intacta rr2vistive和/或xtendflex
tm
商品名销售或分销的商品，诸如植物种子。
[0309]
现在将参考以下实施例描述本发明。应该理解的是，这些实施例并不旨在限制本发明的权利要求的范围，而是意图作为某些实施方案的示例。技术人员想到的示例性方法的任何变化都落入本发明的范围内。
[0310]
实施例
[0311]
实施例1设计编辑构建体用于cle编辑
[0312]
在专有的玉蜀黍系中鉴定cle7、cle14和fcp1的基因组序列。根据这些参考序列，设计间隔子序列(seq id no：101-104和110-117)用于编辑构建体。将间隔子与cas-效应子切割酶或cas-效应子碱基编辑复合物一起安置。设计包含crispr-cas效应物和间隔子序列的编辑构建体以产生四种不同的编辑结果。1)安置cas-效应子碱基编辑复合物以修饰成熟cle肽的氨基酸序列，产生cle7中的d》g变化，cle14中的v》i或m和e》k变化，以及fcp1中的v》i或m和p》l变化。2)部署cas-效应子切割酶复合物以产生框架外碱基对缺失，导致通过破坏成熟cle肽序列，在cle7、cle14和fcp1编码区中产生提前终止功能丧失突变。4)部署cas效应子切割酶复合物以在编码cle7、cle14和fcp1成熟肽的序列中产生框架内缺失。5)部署cas效应子切割酶复合物以在cle7、cle14和fcp1编码区内产生小dna颠换，导致当处于het状态时来自编辑过和未编辑过的基因拷贝的基因转录都显性敲低。这些小dna重排导致cle功能的显性降低，这可能是多个cle基因被靶向进行基于rna干扰的转录减少的结果。
[0313]
实施例2被编辑的e0植物的转化和选择
[0314]
使用土壤杆菌将编码实施例1中产生的间隔子以及选择的crispr-cas效应子的载体引入干燥的切下的玉米胚中。在体外用抗生素选择维持转化的组织以再生阳性转化体。选择健康的非嵌合植物(e0)并插入生长盘中。从再生植物收集组织(e0代)用于dna提取，随后进行分子筛选来鉴定编辑。将选择的e0植物自交以产生e1代。将所选择的e1自交以产生e2代，回交，以产生e2子代，或者与专有的杂合测试系杂交以在杂合状态下测试。
[0315]
实施例3性状活性的表型评估
[0316]
将e1、e2、回交的和杂交的材料的种子在平板上种植，然后在出苗后转移到罐中。所有材料在标准温室条件下栽培并生长至繁殖成熟。根据标准实践，在丝出现之前用小纸袋覆盖出现的穗，并且在花期覆盖穗以便基于植物靠植物捕获花粉。
[0317]
在穗收获和干燥之后，对所有穗手动计数穗行数。数据表示从最明确的行谱线的穗的中间部分取得的每个穗三行计数的平均值。为了防止对行的双重计数，在计数开始的行之间插入标记(例如纸夹)，并且指定行计数应该停止的位置。
[0318]
用佳能数码相机和eos应用对所有穗进行光记录。随后将图像导入imagej中，并使用线轨迹函数测量所有的穗。在图像分析程序中通过设定比例以厘米为单位确定穗长，以
输出在用沿着穗的长度从其尖端到穗的基部的线跟踪穗之后以厘米为单位的距离。未被编辑的种质和用gus质粒转化的品系被用作表型分型的野生型对照。
[0319]
前述内容对本发明进行了说明，它们不应被解释为对本发明的限制。本发明由所附权利要求书限定，其中各权利要求的等同方式被包括在其中。