控制分生组织大小以改良作物的方法与流程

技术特征：
1.一种植物或其植物部分，其包含在编码野生型前体cle多肽的内源性clavata3/embryo surrounding region-related(clv3/esr-related)(cle)基因中的至少一个非天然突变。2.根据权利要求1所述的植物或其部分，其中所述突变位于编码成熟cle肽的内源cle基因的部分内，并且所述突变导致所述成熟cle肽与野生型成熟cle肽相比具有氨基酸取代。3.根据权利要求1或2所述的植物或其部分，其中所述cle基因编码fon2-like cle protein1(fcp1)fcp1蛋白、cle7蛋白或cle14蛋白。4.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中所述至少一个非天然突变产生显性阴性等位基因、半显性等位基因、弱的功能损失等位基因、无效等位基因或亚效突变。5.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中所述至少一个非天然突变是碱基取代、碱基缺失、碱基插入和/或反转。6.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中所述至少一个非天然突变包括对a、t、g或c的碱基取代。7.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中所述至少一个非天然突变是至少一个碱基对(例如1、2、3、4或5个碱基对)的取代。8.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中所述至少一个非天然突变产生位置3、5、6、8或9处的一个或多个取代的氨基酸残基，所述位置是相对于seq id no：75、seq id no：76或seq id no：77的氨基酸位置编号而言的。9.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中所述至少一个非天然突变导致在位置3处缬氨酸(v)取代为异亮氨酸(i)或甲硫氨酸(m)，在位置5处谷氨酸(e)取代为赖氨酸(k)，在位置6处甘氨酸(g)取代为苏氨酸(t)，位置8处天冬氨酸(d)取代为丙氨酸(a)，在位置8处天冬氨酸(d)取代为甘氨酸(g)，和/或在位置9处脯氨酸(p)取代为亮氨酸(l)，所述位置是相对于seq id no：75、seq id no：76或seq id no：77的氨基酸位置编号而言的。10.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中所述内源cle基因包含与seq id no：78、seq id no：79或seq idno：80的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的序列，包含与seq id no：81、seq id no：82或seq id no：82的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的区域；编码与seq idno：72、seq id no：73或seq id no：74具有至少95％序列同一性的序列，或编码具有与seq id no：75、seq id no：76或seq id no：77具有至少95％序列同一性的序列的结构域。11.根据权利要求2-9中任一项所述的植物或其部分，其中所述野生型成熟肽包含具有12个氨基酸的长度、以及在位置1处的r、在位置3处的v、在位置4处的p、在位置6处的g、在位置9处的p、在位置11处的h和在位置12处的h的氨基酸序列，任选地其中所述野生型加工的肽包含seq id no：75、seq id no：76或seq id no：77的氨基酸序列中的任一个。12.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中包含至少一个非天然突变的cle基因包含seq id no：105-109中任一个的序列。13.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中包含至少一个非天然突变的成熟cle肽包含seq id no：84-100的氨基酸序列中的任一个。
14.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中所述植物是玉米。15.根据前述权利要求中任一项所述的玉米植物或其部分，其中在内源cle基因中包含所述至少一个非天然突变的玉米植物的穗行数增加，任选地没有实质性减少穗的长度。16.一种植物细胞，其中包含编辑系统，所述编辑系统包含：(a)crispr-cas效应子蛋白；和(b)指导核酸，其具有与编码前体cle多肽的内源靶基因的区域具有互补性的间隔子序列。17.根据权利要求16所述的植物细胞，其中所述内源靶基因包含与seq id no：78、seq id no：79或seq id no：80的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列。18.根据权利要求16或17所述的植物细胞，其中所述内源靶基因编码前体cle多肽，所述前体cle多肽包含与seq id no：72、seq id no：73或seq id no：74的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列。19.根据权利要求16-18中任一项所述的植物细胞，其中所述指导核酸包含间隔子序列，所述间隔子序列包含seq id no：101-104和/或seq id no：110-117的核苷酸序列中的任一个。20.根据权利要求16-19中任一项所述的植物细胞，其中所述植物细胞为玉米细胞。21.由权利要求1-15中任一项所述的植物部分或权利要求16-20中任一项所述的植物细胞再生的植物。22.根据权利要求21所述的植物，其中所述植物是玉米植物并且包含增加的穗行数的表型，任选地没有实质性减少穗的长度。23.一种玉米植物细胞，其在编码前体cle多肽的cle基因内包含至少一个非天然突变，其中所述突变是使用编辑系统引入的取代、插入或缺失，所述编辑系统包含与cle基因中的靶位点结合的核酸结合结构域。24.根据权利要求23所述的玉米植物细胞，其中所述cle基因编码fcp1蛋白、cle7蛋白或cle14蛋白。25.根据权利要求23或权利要求24所述的玉米植物细胞，其中所述至少一个非天然突变是显性阴性等位基因(dominant negative allele)、半显性等位基因、弱的功能损失等位基因或亚效等位基因。26.根据权利要求23-25中任一项所述的玉米植物细胞，其中所述靶位点在cle基因的区域内，所述区域包含与seq id no：81-83的核苷酸序列中的任何一个具有至少90％序列同一性的序列。27.根据权利要求23-26中任一项所述的玉米植物细胞，其中所述靶位点编码与seq id no：75-77的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列。28.根据权利要求23-27中任一项所述的玉米植物细胞，其中所述突变是在由编辑系统切割之后生成的，所述编辑系统包含核酸酶和核酸结合结构域，所述核酸结合结构域结合与seq id no：81-83中的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列内的靶位点。29.根据权利要求28所述的玉米植物细胞，其中所述核酸酶是锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)、内切核酸酶(例如fok1)或crispr-cas效应子蛋白。
30.根据权利要求23-29中任一项所述的玉米植物细胞，其中所述核酸结合结构域是锌指、转录激活因子样dna结合结构域(tal)、argonaute或crispr-cas效应子dna结合结构域。31.根据权利要求23-30中任一项所述的玉米植物细胞，其中cle基因内的所述至少一个非天然突变是点突变。32.根据权利要求23-31中任一项所述的玉米植物细胞，其中所述至少一个非天然突变导致位于位置3、5、6、8或9处的一个或多个取代的氨基酸残基，所述位置是参考seq id no：75、seq id no：76或seq id no：77的氨基酸位置编号而言的。33.由根据权利要求23-32中任一项所述的玉米植物细胞再生的玉米植物，其中所述植物包含所述至少一个非天然突变，并且所述突变产生显性阴性等位基因。34.根据权利要求33所述的玉米植物，其中当与不包含所述等位基因的野生型植物(例如等基因的野生型植物)相比时，所述玉米植物表现出增加的穗行数的表型，任选地没有实质性减少穗的长度。35.一种产生/培育无转基因的编辑过的玉米植物的方法，其包括：用无转基因的玉米植物与权利要求1-15、21、22、33或34中任一项所述的玉米植物杂交，从而将所述至少一个非天然突变引入所述无转基因的玉米植物中；和选择包含所述至少一个非天然突变并且无转基因的后代玉米植物，从而产生无转基因的编辑过的玉米植物。36.一种提供具有增加的穗行数的多个玉米植物的方法，所述方法包括在生长区域中种植权利要求1-15、21、22或33-35中任一项所述的两个或更多个植物，从而提供与不包含所述突变的多个对照玉米植物相比具有增加的穗行数的多个玉米植物。37.一种在成熟玉米cle肽中产生变异的方法，所述方法包括：将编辑系统引入玉米植物细胞中，其中所述编辑系统靶向编码成熟玉米cle肽蛋白的玉米cle基因的区域，其中所述区域包含与seq id no：75、seq id no：76或seq id no：77的氨基酸序列中的任一个具有至少95％序列同一性的序列，或者所述区域由与seq id no：81-83的任一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列编码；以及使所述玉米cle基因的区域与所述编辑系统接触，从而在玉米植物细胞的成熟玉米cle肽中引入突变；并在成熟玉米cle肽中产生变异。38.根据权利要求37所述的方法，其中所述突变是在由所述编辑系统切割之后引入的，所述编辑系统包含核酸酶和核酸结合结构域，所述核酸结合结构域结合到与seq id no：81-83中的任一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列内的靶位点。39.一种用于编辑玉米植物细胞的基因组中的特异性位点的方法，所述方法包括：以位点特异性方式切割所述玉米植物细胞中的内源cle基因内的靶位点，所述内源cle基因：(a)包含(i)与seq id no：78-80中的任一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列，和/或(ii)与seq id no：81-83中的任一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的区域；和/或(b)编码(i)与seq id no：72-74中的任一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或(ii)具有与seq id no：75-77中的任一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列的结构域，从而在编码成熟cle肽的玉米植物细胞的内源基因的部分中产生编辑并产生在所述内源基因的部分中包含所述编辑的植物细胞。
40.根据权利要求38至39中任一项所述的方法，还包括从在所述内源cle基因中包含所述编辑或突变的玉米植物细胞再生玉米植物，以产生在其内源cle基因中包含所述编辑或突变的玉米植物。41.根据权利要求37-40中任一项所述的方法，其中所述cle基因编码fcp1蛋白、cle7蛋白或cle14蛋白。42.根据权利要求39-41中任一项所述的方法，其中所述编辑导致非天然突变。43.根据权利要求42所述的方法，其中所述非天然突变导致位于位置3、5、6、8或9处的一个或多个取代的氨基酸残基，所述位置是参考seq id no：75、seq id no：76或seq id no：77的氨基酸位置编号而言的。44.一种用于制造玉米植物的方法，其包括：(a)使包含编码前体cle多肽的内源cle基因的玉米植物细胞群与连接到核酸结合结构域的核酸酶(例如编辑系统)接触，所述核酸结合结构域结合以下序列：(i)与seq id no：78-80中的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性，(ii)与seq id no：81-83中的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性，(iii)编码与seq id no：72-74中的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列，或(ii)编码与seq id no：75-77中的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列的结构域；(b)从所述群体中选择其中内源cle基因已经被突变的植物细胞，从而产生在内源cle基因中包含突变的植物细胞；和(c)将所选择的植物细胞生长成植物。45.一种用于增加玉米植物中的穗行数的方法，其中包括：(a)使包含内源cle基因的玉米植物细胞与靶向所述内源cle基因的核酸酶接触，其中所述核酸酶与核酸结合结构域(例如，编辑系统)连接，所述核酸结合结构域结合所述内源cle基因中的靶位点，其中所述内源cle基因：(i)包含与seq id no：78-80中的任一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(ii)包括与seq id no：81-83中的任一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的区域；(iii)编码与seq id no：72-74中的任一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或(iv)编码具有与seq id no：75-77中的任一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域，以产生在内源cle基因中包含突变的玉米植物细胞；和(b)将所述玉米植物细胞生长成在所述内源cle基因中包含所述突变的玉米植物，由此生产具有突变的内源性cle基因和增加的穗行数的玉米植物。46.生产包含具有突变的内源cle基因的至少一个细胞的玉米植物或其部分的方法，所述方法包括：使所述玉米植物或植物部分中的内源cle基因中的靶位点与包含切割结构域和核酸结合结构域的核酸酶接触，其中所述核酸结合结构域结合所述内源cle基因中的靶位点，其中所述内源cle基因：(a)包含与seq id no：78-80的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的序列；
(b)包含与seq id no：81-83的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的区域；(c)编码与seq id no：72-74的氨基酸序列中的任一个具有至少95％序列同一性的序列；和/或(d)编码具有与seq id no：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域，从而产生包含在所述内源cle基因中具有突变的至少一个细胞的所述玉米植物或其部分。47.生产包含突变的内源cle基因并显示增加的穗行数的玉米植物或其部分的方法，该方法包括：使所述玉米植物或植物部分中的内源cle基因中的靶位点与包含切割结构域和核酸结合结构域的核酸酶接触，其中所述核酸结合结构域结合所述内源cle基因中的靶位点，其中所述内源cle基因：(a)包含与seq id no：78-80的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的序列；(b)包括与seq id no：81-83的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的区域；(c)编码与seq id no：72-74的氨基酸序列中的任一个具有至少95％序列同一性的序列；和/或(d)编码具有与seq id no：75-77的氨基酸序列中的任一个有至少95％序列同一性的序列的结构域，从而产生包含具有突变的内源cle基因并且表现出增加的穗行数的玉米植物或其部分。48.根据权利要求44-47中任一项所述的方法，其中所述核酸酶切割所述内源cle基因，从而将所述突变引入所述内源cle基因。49.根据权利要求44-48中任一项所述的方法，其中所述cle基因编码fcp1蛋白、cle7蛋白或cle14蛋白。50.根据权利要求44-49中任一项所述的方法，其中所述突变是显性阴性突变、半显性突变、弱的功能损失突变、亚效突变或无效突变。51.根据权利要求44-50中任一项所述的方法，其中所述突变是碱基取代、碱基缺失和/或碱基插入。52.根据权利要求44-51中任一项所述的方法，其中所述突变包括点突变。53.根据权利要求43-52中任一项所述的方法，其中所述突变产生位于位置3、5、6、8或9处的一个或多个取代的氨基酸残基，所述位置是相对于seq id no：75、seq id no：76或seq id no：77的氨基酸位置编号而言的。54.根据权利要求44-53中任一项所述的方法，其中所述核酸酶是锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)、核酸内切酶(例如fok1)或crispr-cas效应子蛋白。55.根据权利要求44-54中任一项所述的方法，其中所述核酸结合结构域是锌指、转录激活因子样dna结合结构域(tal)、argonaute或crispr-cas效应物dna结合结构域。
56.一种与编码前体cle肽的cle基因中的靶位点的部分结合的指导核酸，所述靶位点包含与seq id no：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列或编码与seq id no：75-77的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列。57.根据权利要求56的指导核酸，其中所述指导核酸包含含有seq id no：101-104和/或seq id no：110-117的任一核苷酸序列的间隔子。58.一种系统，其包含权利要求56或权利要求57的指导核酸和与所述指导核酸缔合的crispr-cas效应子蛋白。59.根据权利要求58所述的系统，其还包含与所述指导核酸缔合的tracr核酸和crispr-cas效应子蛋白，任选地其中所述tracr核酸和所述指导核酸共价连接。60.一种基因编辑系统，其包含与指导核酸缔合的crispr-cas效应子蛋白，其中所述指导核酸包含与编码前体cle肽的内源cle基因结合的间隔子序列。61.根据权利要求60所述的基因编辑系统，其中所述cle基因编码fcp1蛋白、cle7蛋白或cle14蛋白。62.根据权利要求60或61所述的基因编辑系统，其中所述cle基因：(a)包含与seq id no：78-80的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的序列；(b)包括与seq id no：81-83的核苷酸序列中的任一个具有至少95％序列同一性的区域；(c)编码与seq id no：72-74的氨基酸序列中的任一个具有至少95％序列同一性的序列；和/或(d)编码具有与seq id no：75-77的氨基酸序列中的任一个有至少95％序列同一性的序列的结构域。63.根据权利要求60-62中任一项所述的基因编辑系统，其中所述指导核酸包含具有seq id no：101-104和/或seq id no：110-117中任一所示的核苷酸序列的间隔子序列。64.根据权利要求60-63中任一项所述的基因编辑系统，其还包含与所述指导核酸和crispr-cas效应子蛋白缔合的tracr核酸，任选地其中所述tracr核酸和所述指导核酸共价连接。65.一种复合物，其包含含有切割结构域的crispr-cas效应子蛋白和指导核酸，其中所述指导核酸结合编码前体cle多肽的内源cle基因中的靶位点，其中所述内源cle基因:(a)包含与seq id no：78-80的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的序列；(b)包括与seq id no：81-83的核苷酸序列中的任一个具有至少95％序列同一性的区域；(c)编码与seq id no：72-74的氨基酸序列中的任一个具有至少95％序列同一性的序列；和/或(d)编码具有与seq id no：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域，其中所示切割结构域切割cle基因中的靶链。66.一种表达盒，其包含(a)编码包含切割结构域的crispr-cas效应子蛋白的多核苷
酸，和(b)与编码前体cle肽的内源cle基因中的靶位点结合的指导核酸，其中所述指导核酸包含与以下序列互补并与之结合的间隔子序列：(i)包含与seq id no：78-80的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的序列；(ii)包括与seq id no：75-77的核苷酸序列中的任一个具有至少95％序列同一性的区域；(iii)编码与seq id no：72-74的氨基酸序列中的任一个具有至少95％序列同一性的序列；和/或(iv)编码具有与seq id no：75-77的氨基酸序列中的任一个有至少95％序列同一性的序列的结构域。67.编码玉米cle基因的显性阴性等位基因的核酸，其中所述玉米cle基因编码前体cle多肽。68.根据权利要求67所述的核酸，其中所述核酸包含seq id no：105-109中任一个的核苷酸序列。69.根据权利要求67所述的核酸，其中所述核酸包含编码seq id no：84-100的任一个氨基酸序列的序列。70.包含权利要求67-69中任一项所述的核酸的玉米植物或其部分。71.一种在植物中的内源cle基因中产生突变的方法，其包含：(a)将基因编辑系统靶向cle基因的部分，所述部分编码具有与seq id no：75-71的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域，和(b)选择在位置3、5、6、8或9之一处包含氨基酸残基取代的植物，其中所述位置是参考seq id no：75、seq id no：76或seq id no：77的氨基酸位置编号而言的。72.一种玉米植物或其植物部分，其包含位于至少一个内源cle基因中的至少一个非天然突变，其中所述内源cle基因位于染色体2上由碱基对(bp)位置235,093,752至碱基对位置235,094,276限定并包括它们的染色体间隔和/或染色体2上由碱基对(bp)位置40,126,538至碱基对位置40,127,030限定并包括它们的染色体间隔中。73.一种玉米植物或其植物部分，其包含在至少一个内源cle基因中的至少一个非天然突变，其中所述内源cle基因位于染色体4上由碱基对(bp)位置7,570,324至碱基对位置7,571,104限定并包括它们的染色体间隔中。74.根据权利要求72所述的玉米植物或其部分，其中所述染色体间隔对应于b73第4版(b73 refgen_v4)的参考玉米基因组。75.根据权利要求73所述的玉米植物或其部分，其中所述染色体间隔对应于b73第3版(b73 refgen_v3)的参考玉米基因组。76.一种与玉米植物中的cle基因中的靶核酸结合的指导核酸，其中所述靶核酸位于染色体2上由碱基对(bp)位置235,093,752至碱基对位置235,094,276限定并包括它们的染色体间隔和/或染色体2上由碱基对(bp)位置40,126,538至碱基对位置40,127,030限定并包括它们的染色体间隔中。76.一种与玉米植物中的cle基因中的靶核酸结合的指导核酸，其中所述靶核酸位于位于染色体2上由碱基对(bp)位置235,093,752至碱基对位置235,094,276限定并包括它们的
染色体间隔内。77.根据权利要求75所述的指导核酸，其中所述染色体间隔对应于b73第4版(b73 refgen_v4)的参考玉米基因组。78.根据权利要求76所述的指导核酸，其中所述染色体间隔对应于b73第3版(b73 refgen_v3)的参考玉米基因组。

技术总结
本发明涉及用于修饰植物中的CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION-RELATED(CLV3/ESR-RELATED)(CLE)基因以增加穗行数、任选地没有实质性减小穗长度的组合物和方法。本发明还涉及使用本发明的方法和组合物生产的具有增加的穗行数、任选地没有实质性减小穗长度的植物。植物。植物。


技术研发人员：D
受保护的技术使用者：成对植物服务股份有限公司
技术研发日：2021.04.16
技术公布日：2023/2/3