用于分析物的弹性元件的制作方法

1.本发明涉及一种用于分析分析物的弹性元件。具体地，本发明涉及具有检测器区域的微型弹性元件，特异性结合病毒抗原的结合分子联接到该检测器区域，并涉及包括这些弹性元件的装置以及检测病毒的相应方法。


背景技术：

2.迄今为止，还没有可用的可靠且成本有效的即时筛选测试，用于在治疗时实时诊断sars-cov-2病毒感染。最常用的测试基于逆转录酶pcr方法(corman vm,landt o,kaiser m,et al.detection of 2019 novel coronavirus(2019-ncov)by real-time rt-pcr.euro surveill.2020；25(3):2000045.doi:10.2807/1560-7917.es.2020.25.3.2000045)，这种方法由于在专业诊断实验室中进行分析而导致相对高的工作量，并在取样和医务人员或患者可获得结果之间需要多达3天的相关时间。这种延迟导致患者长期的不确定性，并导致患者的针对性治疗和采取适当的措施控制流行病的应用的严重延迟。
3.现有的现场护理测试方法基于通过测量igg和igm抗体来测定抗病毒免疫反应(li z,yi y,luo x,et al.development and clinical application of a rapid igm-igg combined antibody test for sars-cov-2 infection diagnosis[2020年2月27日在线发布，].j med virol.2020；10.1002/jmv.25727.doi:10.1002/jmv.25727)，通过基于侧向流的免疫层析方法进行。然而，仅在感染后7至10天在血浆中可以检测到病毒特异性抗体。然而，在sars-cov-2的情况下，患者在感染后的第一周已经是高度感染性的。这构成了covid-19流行病快速全球蔓延的主要原因之一。
[0004]
wo 2007/088018a1提出了用于生物传感器的弹性元件，例如用于dna分析。没有公开用于检测病毒的弹性元件的任何应用。


技术实现要素：

[0005]
在这种背景下，本发明的目的是克服已提及的现有技术的缺点。更具体地说，本发明基于提供一种弹性元件，该弹性元件用于将样品中的分析物的化学和/或生物化学信息转换成电信号，特别是提供一种能够不依赖于pcr地检测病毒的装置的目的。
[0006]
该目的通过根据权利要求的弹性元件以及通过根据权利要求的装置和方法来实现。
[0007]
在第一方面，本发明涉及一种用于分析样品中分析物的存在的弹性元件，包括柔性主体，该柔性主体具有电导率检测器区域和结合区域，其中，电导率检测器区域的电导率通过电子隧道、电离或跳跃过程来测定，并且其中电导率检测器区域由嵌入基质中的纳米颗粒形成，该纳米颗粒具有比基质材料更高的电导率，并且其中结合区域包括至少一个结合分子，该结合分子特异性地结合分析物并联接到主体。
[0008]
在本说明书中，诸如结合分子、抗原等的元件的单数和复数通常可互换使用。
[0009]
本文所述的弹性元件可以是微型弹性元件。
[0010]
本领域技术人员从wo 2007/088018a1中已知具有柔性主体的微型弹性元件及其制造，该柔性主体具有检测器区域，该检测器区域的电导率(σ)由电子隧道、电离或跳跃过程测定。另外，本领域技术人员还从us 4,426,768、us 4,510,178和us 7,963,171 b2中获知基于铬层的相应检测器区域的生产方法，该铬层在生产过程中被破坏，从而形成具有嵌入其中的铬颗粒的非导电氧化铬/氮化铬层。
[0011]
在优选的实施方式中，电导率检测器区域通过在弹性元件的顶侧或底侧上具有纳米颗粒的单侧涂层形成。因此，优选地，弹性元件的仅一侧具有电导率检测器区域和结合区域。
[0012]
弹性元件的主体可以包括各种不同的材料，并可以包括例如低导电性的材料，例如聚合物，例如聚酰亚胺、碳材料或硅基材料。优选的硅基材料是氧化硅、碳化硅或氮化硅。主体的材料也可以是夹芯材料。
[0013]
所提及的弹性元件通常具有的优点是，电导率检测器区域的电导率以非常灵敏的方式依赖于长度的微小变化。这种长度变化例如由弹性元件的近表面区域的局部收缩或膨胀引起。特别地，由于结合区域的表面张力的最终变化，分子在结合区域上的结合可导致弹性元件的弯曲。
[0014]
在本公开内容的上下文中，结合分子可以是特异性结合病毒抗原的分子，例如抗体和抗体衍生物、抗体片段如单链抗体、抗原结合片段或(抗原结合)2片段。同样可以使用备选的蛋白质构架，例如抗环蛋白、脂质运载蛋白、受体及其片段、锚蛋白、微体或适体。
[0015]
在一个优选的实施方案中，所述至少一种结合分子是抗体或抗体片段。在本公开的上下文中，表述“至少一种结合分子”涉及至少一种分子种类，例如抗体种类。或者，也可以使用结合不同抗原的多种不同抗体种类。通常，一个种类的大量抗体分子联接到结合区域。
[0016]
在本公开的上下文中，特异性结合病毒抗原的结合分子是以至少kd＝1x10-5
mol/l的亲和力(kd＝k
off
/k
on
)结合抗原的结合分子，更优选至少1x10-7
mol/l或至少1x10-8
mol/l和最优选至少1x10-9
mol/l。结合剂分子和抗原的结合可以例如通过生物大分子相互作用分析系统(biacore)方法来测定。
[0017]
在优选的实施方案中，抗体是单克隆抗体、多克隆抗体或多克隆抗体，最优选单克隆抗体或抗体片段。抗体优选igg抗体，但也可以使用其它免疫球蛋白类型。另外，抗体优选为重组抗体。
[0018]
所提出的弹性元件通常可以针对所有病毒的抗原设计。在特别优选的方面，结合分子特异性地结合冠状病毒的抗原，特别是新型冠状病毒(sars-cov-2)病毒的抗原。抗原优选肽抗原，特别是sars-cov-2病毒的刺突蛋白(s蛋白)、包膜蛋白(e蛋白)、膜蛋白(m蛋白)或核壳蛋白(n蛋白)中含有的抗原。在本公开的上下文中，蛋白质中包含的抗原由所讨论的蛋白质的氨基酸序列中包含的氨基酸序列定义。然而，本公开的上下文中的抗原也可以是构象抗原。
[0019]
刺突蛋白(s蛋白)中所含的抗原优选具有基因库(genbank)登录号qii57161.1、qic53213.1、qhr63290.2、qhr63280.2、qhr63270.2、qhr63260.2、qhr63250.2、yp_009724390.1或qia20044.1鉴定的序列之一中所含的氨基酸序列。
[0020]
包膜蛋白(e蛋白)中所含的抗原优选具有基因库登记号qia98556.1、bca87373.1、bca87363.1、qim47478.1、qim47469.1、qim47459.1、qii87842.1、qii87832.1、qii87820.1、qii87808.1、qii87796.1、qii87784.1、qik50450.1、qik50440.1、qik50429.1、qie07483.1、qie07473.1、qie07463.1或qih55223.1中所标识的序列之一中所含的氨基酸序列。
[0021]
核壳蛋白(n蛋白)中所含抗原优选具有基因库登录号qic53221.1、qii87776.1、qii87775.1、qhr63298.1、qhr63288.1、qhr63278.1、qhr63268.1、qhr63258.1、qho62115.1或qho62110.1所鉴定的序列之一中所含氨基酸序列。
[0022]
膜蛋白(m蛋白)中所含抗原优选具有基因库登记号qic53216.1、qhr63293.1、qhr63283.1、qhr63273.1、qhr63263.1、qhr63253.1所鉴定序列之一中所含氨基酸序列。
[0023]
在特别优选的实施方案中，结合分子结合刺突蛋白中含有的抗原。刺突蛋白从病毒表面突出到特定程度。因此，刺突蛋白中的抗原具有良好的空间可接近性，以结合分子，例如抗体。
[0024]
结合分子可以直接联接到主体的材料。
[0025]
在优选的实施方式中，主体在结合区域的区域中用涂层涂覆。在该实施方案中，结合分子与涂层联接，使得涂层位于主体和结合分子之间。
[0026]
涂层可以包括例如贵金属，例如au或pt。此外，涂层可以包括纳米颗粒。
[0027]
结合分子可以共价或非共价地联接到结合区域。本领域技术人员知道用于结合分子如抗体的各种联接方法(jazayeri mh,amani h,pourfatollah aa,pazoki-toroudi h,sedighimoghaddam b.various methods of gold nanoparticles(gnps)conjugation to antibodies.sensing and bio-sensing research.2016；9:17-22)。在结合区域的金(au)涂层的情况下，例如对于共价联接和对于非共价联接，在第一步中，可以用硫醇-聚乙二醇化合物(硫醇-peg)，例如用硫醇-聚乙二醇酸或硫醇-聚乙二醇酯将其聚乙二醇化到au涂层上。然后，例如，通过已知方法，利用n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和n-乙基-n-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺(edc)，可以实现抗体的共价联接。
[0028]
在优选的实施方案中，抗体通过抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白结合与au涂层联接。为此，在前述方法中，链霉抗生物素蛋白可以通过n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和n-乙基-n-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺(edc)共价联接到聚乙二醇化的au涂层包被上，或者硫醇-peg-生物素可以在第一步中直接联接到au包被上，然后链霉抗生物素蛋白可以非共价结合到au涂层联接的硫醇-peg-生物素上。在这两种情况下，在最后一步中，生物素化抗体通过连接子非共价结合到联接到au涂层的链霉亲和素上。
[0029]
在结合区域未被涂覆的实施方案中，本领域技术人员将能够采用特定的联接方法直接联接至主体材料。在硅基材料的情况下，联接可以例如基于peg硅烷进行。
[0030]
在优选的实施方案中，生物素化抗体在fc结构域中，优选在fc结构域的c-末端生物素化。相应的生物素化有利地以这样的方式指导抗体，即可变结构域在周围介质的方向上被指导远离弹性元件，并因此以空间上不受阻碍的方式结合到其中病毒待检测的介质中的抗原。
[0031]
结合到结合分子上的抗原可以存在于完整的病毒、病毒片段或单个病毒蛋白中。
[0032]
例如，在激活的弹性元件中的结合分子可以包括单链dna(ssdna)和/或特异性结合样品中的dna片段的其它dna片段。在惰性弹性元件中，结合分子可包括单链dna和/或其
它dna片段，该dna片段不与样品中的任何化学和/或生化和/或物理种类结合，但在特征参数(例如链长、化学结构)上与激活的弹性元件的结合分子匹配。
[0033]
例如，在激活的弹性元件中的结合分子可以包括单链rna和/或特异性结合样品中rna片段的其它rna片段。在惰性弹性元件中，结合分子可包括单链rna和/或其它rna片段，该rna片段不与样品中的任何化学和/或生化和/或物理种类结合，但在特征参数(例如链长、化学结构)上与活性弹性元件的结合分子匹配。
[0034]
例如在激活的弹性元件中的结合分子可以包括抗体和/或其它和/或其它特异性结合靶蛋白的蛋白。在惰性弹性元件中，结合分子可以包括特异性同种型对照抗体和/或不与样品中的任何化学和/或生化和/或物理种类结合的其它蛋白质。
[0035]
结合分子可以包含scfv抗体组分。该scfv抗体是合成产生的抗体片段。通过将抗体分成多个片段，可以增强传感器对低样品浓度的反应性。
[0036]
结合区域优选包含至少一种水凝胶。
[0037]
电导率检测器区域的纳米颗粒优选地是金属的。更优选地，纳米颗粒由化学稳定的材料形成，最优选由au和/或pt和/或cr形成。纳米颗粒的平均颗粒大小可优选具有至多100nm，更优选至多10nm，条件是该纳米颗粒在电导率检测器区域中彼此充分电绝缘，并该纳米颗粒的间隔足够小以致可以在纳米颗粒之间建立隧道效应。
[0038]
电导率检测器区域的基质尤其由有机、无机或介电材料形成，例如由有机金属复合物、单体、低聚物、聚合物或这些单体、低聚物和聚合物的混合物形成。用于制造上述包括嵌入基质中的纳米颗粒的电导率检测器区域的方法是本领域技术人员已知的，例如从wo 2007/088018a1中得知。
[0039]
结合区域不需要覆盖超出电导率检测器区域的弹性元件的整个表面。相反，本领域技术人员可以根据由电导率检测器区域产生的信号来调整和优化结合区域的大小和位置。
[0040]
弹性元件可以被配置为使得分析物和优选地病毒抗原与结合区域的结合分子的结合引起结合区域的表面张力的变化。
[0041]
弹性元件可以进一步被配置为使得结合区域的表面张力的变化引起弹性元件的弯曲。
[0042]
此外，弹性元件因此可以被配置为使得分析物和优选病毒抗原与结合区域中的结合分子的结合，引起电导率检测器区域中的电导率的变化。因此，通过测定电导率检测器区域的电导率，可以测定分析物的结合，优选地，抗原与结合分子的结合。
[0043]
在一个方面，弹性元件被配置为使得分析物和优选病毒抗原与结合区域中的结合分子的结合，引起弹性元件的弯曲。
[0044]
在将所提出的弹性元件与含有待测病毒抗原的介质接触时，因此可以通过电导率检测器区域的电导率的变化来测定病毒抗原与弹性元件的结合区域中的结合分子的结合。
[0045]
为此，在第一种方法中，可以在弹性元件与待测试的介质接触之前和在弹性元件与待测试的介质接触之后测定电导率检测器区域的电导率。通过测定电导率的变化，可以推断并因此检测待测培养基中病毒抗原的存在。
[0046]
在另一种方法中，使用了上述弹性元件，该弹性元件包括结合分析物，优选抗原的结合分子，在下文中称为激活的弹性元件，以及相应的弹性元件，但使用了至少不包括任何
上述结合分子的弹性元件，在下文中称为惰性弹性元件。在该方法中，激活的弹性元件和惰性弹性元件都与待测试的介质接触。激活的和惰性弹性元件被配置为使得存在于介质中的分析物该分析物优选为抗原)，与激活的弹性元件的电导率检测器区域中的激活的弹性元件的结合分子的结合，通过仅存在介质而不是分析物，优选抗原的特异性结合，引起比惰性弹性元件的电导率检测器区域中更大的电导率变化。通过测定激活的和惰性弹性元件的电导率检测器区域的电导率的差异，可以推断并因此检测待测试的介质中的分析物的存在，优选病毒抗原的存在。
[0047]
因此，弹性元件能够以简单和快速的方式检测介质中的分析物，优选病毒抗原。弹性元件还具有这样的优点，即，该弹性元件可以利用已知的方法相对廉价地大量生产。
[0048]
弹性元件可以用于各种检测病毒的装置。
[0049]
此外，本发明还涉及一种用于检测分析物的装置，该分析物优选为病毒，该装置包括至少一个上述激活的弹性元件、至少一个用于测定弹性元件的电导率检测器区域的电导率的电传感器以及至少一个比较器。比较器可以被配置为使得该比较器将与介质接触的弹性元件的实际电导率值与预定目标值进行比较。比较器还被配置为使得该比较器可以从电导率的实际值和目标值之间的差异推断介质中分析物的存在，并优选地推断介质中抗原的存在，并将相应的信号传递到输出装置或处理器。此外，该装置包括用于电传感器、比较器和可选的其它元件的电源。
[0050]
用于检测分析物的另一装置，该分析物优选为病毒，该装置包括至少一个上述激活的弹性元件和至少一个惰性弹性元件、用于测定激活的和惰性弹性元件的电导率检测器区域的电导率的至少电传感器、以及至少一个比较器。比较器可以被配置为使得该比较器将与介质接触的激活的和惰性弹性元件的电导率彼此进行比较。比较器还被配置为使得该比较器可以从激活的和惰性弹性元件的电导率的变化推断分析物的存在，并优选地推断介质中抗原的存在，并将相应的信号传递到输出装置或处理器。此外，该装置包括用于电传感器、比较器和可选的其它元件的电源。
[0051]
在优选实施例中，激活的和惰性弹性元件以惠斯通测量电桥的形式互连。
[0052]
在另一方面，提出了一种用于检测样品中分析物的存在、优选用于检测病毒的存在的微流体芯片形式的装置，该装置包括被配置为用于接收液体介质中的样品的区域，至少一个微流体通道，该微流体通道被配置为使得该微流体通道将液体介质引导到至少一个测量腔室中，以及至少一个测量腔室，该测量腔室包括至少一个第一弹性元件和至少一个第二弹性元件。第一弹性元件是如本文所述的激活的弹性元件。第二弹性元件是如本文所述的惰性弹性元件。此外，该装置包括电触点，该电触点连接到第一弹性元件和第二弹性元件的电导率检测器区域。当芯片被引入评估装置中时，触点被配置为使得可以连接到评估装置的对应触点。
[0053]
评估装置的触点连接到电传感器，该电传感器配置为测定微流体芯片的激活的和惰性弹性元件的电导率检测器区域的电导率。此外，评估装置包括至少一个比较器。比较器可以被配置为使得该比较器将与液体介质接触的微流体芯片的激活的和惰性弹性元件的电导率彼此进行比较。比较器还被配置为使得该比较器可以从激活的和惰性弹性元件的电导率的变化推断介质中分析物的存在，优选地是抗原的存在，并将相应的信号传递到输出装置或处理器。
[0054]
输出装置可以被配置为使得在测试的介质中存在的分析物，优选病毒，显示为二进制是/否。然而，输出装置还可以输出与结合的分析物的量成比例的信号，优选抗原结合的量。
[0055]
通过相应的着色，该装置可以被配置为通过输出装置显示分析物的浓度，优选地显示抗原浓度。
[0056]
此外，评估装置可以包括电源，该电源用于电传感器、比较器和可选的其它元件。
[0057]
此外，评估装置可以包括传输单元，例如无线电传输单元，通过该传输单元可以将数据从处理器传递到接收装置。因此，该评估装置能够实现快速分发相关流行病学数据。
[0058]
在另一方面，提出了一种用于检测分析物、优选病毒的系统，包括微流体芯片和评估装置。
[0059]
在多个方面的病毒优选是冠状病毒，特别是sars-cov-2。
[0060]
另外，本发明还提供了一种检测病毒的方法，包括使含有分析物的样品与该弹性元件接触，该分析物优选为病毒。样品优选是人或动物的体液，例如唾液、血液、淋巴液、胃液、汗液、身体排泄物，例如尿或粪便，或至少一种细胞。作为样品的细胞和唾液优选以粘膜拭子的形式获得。
[0061]
根据样品的类型，样品与弹性元件的接触可以是直接的或间接的。通常，接触是间接的，因为样品被吸收、溶解或悬浮在上述介质中，并液体介质与弹性元件接触，如上描述。
[0062]
本文所述的弹性元件或本文所述的装置可用于诊断个体感染病毒的方法中。因此，本文所述的装置还涉及在诊断个体感染病毒的方法中的使用。该方法至少包括使来自个体的含有体液或细胞的样品与本发明的弹性元件接触的步骤。与弹性元件的接触导致检测到分析物，最好是如上所述的病毒。因此，可以推断出个体感染了病毒。此外，该方法可以包括采样的步骤。
[0063]
借助于所描述的装置，可以是用于直接为诸如家庭医生、护理人员或护理人员的医务人员快速测试病毒以进行提供的小型且移动的装置，其可以在没有任何大的先验知识的情况下使用。与其它检测方法相比，所提出的方法在感染过程中的任何时间都非常可靠地反应，并且产生关于检测样品中病毒存在的清晰的电子“是”或“否”信息。在几分钟内就可得到结果，并且不需要将样品耗时地运输到实验室。
[0064]
诊断平台的技术可扩展性使得能够快速测试数百万人，并因此能够实时监测和匿名控制疾病在人群中的传播。评估装置与云的连接，允许实时识别病毒扩散的新的区域热点并将立即遏制。因此，可以以更加有针对性和有效的方式利用对行动自由的限制以及稀缺的健康管理和医院资源。
附图说明
[0065]
在图中示出了示例性实施例，并在下文中详细描述。
[0066]
图1示出了在将病毒结合到弹性元件之前(图1a)和之后(图1b)连接到电传感器的弹性元件。
具体实施方式
[0067]
下面，将参考附图对优选实施例进行描述。在不同的附图中，相同、相似或具有相
同效果的元件被给予相同的附图标记，并在一定程度上避免了对这些元件的重复描述，以避免重复。
[0068]
图1a)示出了具有柔性主体2的微型弹性元件1的示意图，该柔性主体具有电导率检测器区域3和结合区域4，其中，电导率检测器区域的电导率(σ)通过电子隧道、电离或跳跃过程来测定，并且其中电导率检测器区域由嵌入在基质中的纳米颗粒形成，该纳米颗粒具有比基质材料更高的电导率，并且其中结合区域4包括至少一个结合分子5，该结合分子特异性地结合到分析物，优选地结合到病毒抗原，并被联接到主体。
[0069]
电导率检测器区域连接到用于测定电导率检测器区域3电导率的电传感器6。
[0070]
弹性元件1被配置为使得分析物，优选病毒抗原7，与结合区域4中的结合分子5的结合引起结合区域4的表面张力的变化。
[0071]
如图1b)所示，弹性元件1被配置为使得结合区域的表面张力的变化引起弹性元件1的弯曲。此外，弹性元件1被配置为使得分析物(优选病毒抗原7)，与结合区域4中的结合分子5的结合引起电导率检测器区域3的电导率的变化。电导率检测器区域3的电导率由电传感器6测定。因此可以通过测定电导率检测器区域3的电导率来测定抗原7与结合分子5的结合。
[0072]
尽管在前面的描述中仅公开了说明性实施例，但是可以对其进行各种不同的改变和修改。所提及的实施例仅仅是示例，并不旨在以任何方式限制弹性元件的有效性、适用性或配置的范围。
[0073]
附图标记
[0074]
1弹性元件
[0075]
2主体
[0076]
3电导率检测器区域
[0077]
4结合区域
[0078]
5结合分子
[0079]
6电传感器
[0080]
7病毒抗原。