一种25-羟基维生素D的检测方法及试剂盒与流程

一种25-羟基维生素d的检测方法及试剂盒
技术领域
1.本发明属于25-羟基维生素d检测相关技术领域，具体涉及一种25-羟基维生素d的检测方法及试剂盒。


背景技术：

2.维生素d是人体不可缺少的维生素，它有以下生理功能：1提高肌体对钙、磷的吸收；2、促进生长和骨骼钙化，促进牙齿健全；3、通过肠壁增加磷的吸收，并通过肾小管增加磷的再吸收；4、防止氨基酸通过肾脏损失。人体缺乏维生素d会引起佝偻病、手足抽搐和软骨病。长期摄入过多的维生素d(5000iu/日)，将引起高血钙和高尿钙。
3.维生素d在肝脏和肾脏转化成为有生物活性的25-羟基维生素d(25-ohd)和25-二羟基维生素d。由于25-羟基维生素d是人体内维生素d的主要储存形式。因此通过检测25-羟基维生素d(包括25-羟基维生素d2与25-羟基维生素d3)可以评估人体维生素d水平，进而评价钙吸收水平、协助临床疾病的诊断和监测并确定钙和维生素d的补充方案。
4.25-ohd的主要理化检测方法有高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，hplc)和液相色谱质谱法(liquid chromatography mass spectrometry，lc-ms)。hplc技术具有良好的精密度和准确度，但由于其操作复杂，反应时间长，所需样本量大，故不适于临床应用。lc-ms是在hplc基础上发展起来的一项新的检测技术，现为色谱法中最为常用的25-ohd检测方法。lc-ms技术可完全满足临床检测方法要求的准确性，灵敏度，特异性，该方法已经被美国国家疾控中心采用的参考方法，被认为是检测25-ohd的金标准。虽然lc-ms具有以上优点，但同时也存在着样品前处理繁琐，技术操作复杂，需要专业人员，仪器昂贵，检测周期长，自动化程度不高等缺点，限制着lc-ms在临床检测中的应用。
5.因此，当前亟需设计一种操作简便、特异性高、灵敏度好的用于检测人血清中25-羟基维生素d的方法。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种25-羟基维生素d的检测方法及试剂盒，其采用化学发光竞争法，操作简便、特异性高、灵敏度好，能够满足现有的检测需求。
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案。
8.一种25-羟基维生素d的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：
9.步骤1、进行第一次孵育：加入30μl被测样本和150μl孵育缓冲液到化学发光微孔板中一起孵育，使与维生素d结合蛋白结合的25-羟基维生素d转换成游离态，并与化学发光微孔板中的固相抗体结合；
10.步骤2、进行第一次清洗：吸取350μl清洗液加入到化学发光微孔板中，清洗4次，洗去未结合在固相上的物质；
11.步骤3、进行第二次孵育：加入100μl的酶结合物溶液一起孵育，与化学发光微孔板上尚未结合的25-羟基维生素d抗体结合；
12.步骤4、进行第二次清洗：吸取350μl清洗液加入到化学发光微孔板中，清洗4次，洗去未结合在固相上的物质；
13.步骤5、进行读数，加入化学发光底物a、化学发光底物b，酶催化底物发光，通过光电倍增器测量发光强度；
14.步骤6、利用已知浓度的定标品绘制发光强度标准曲线，根据步骤5得到的发光强度对照所述发光强度标准曲线，计算得出待测样本中的25-羟基维生素d含量。
15.进一步的，所述孵育缓冲液的配置方式为：取9.55ml卡松、38.2g牛血清白蛋白、133.64ml丙二醇加入1l水中，调ph为7.0进行配制。
16.进一步的，所述化学发光微孔板为包被有25-羟基维生素d抗体。
17.进一步的，所述25-羟基维生素d抗体的浓度为3μg/ml。
18.进一步的，所述酶结合物溶液的配置方式为：取60.55g蔗糖、6.05g 2-氯乙酰胺、1.21g牛血清白蛋白、0.12g铁氰化钾、1.21ml proclin300，调ph为7.0进行配置，再加入0.25％25-羟基维生素d-hrp偶联物。
19.进一步的，所述化学发光底物a为含有0.4％鲁米诺，ph9.0的水溶液；所述化学发光底物b为含有0.06％四硼酸钠，ph5.0的水溶液；所述清洗液为含1％吐温20和0.1％proclin300的0.05m、ph值为7.5的tris-hcl溶液。
20.进一步的，所述定标品的配置方式为：将25-羟基维生素d抗原添加至马血清中，配置成浓度约为0ng/ml、7.5ng/ml、15ng/ml、30ng/ml、60ng/ml和120ng/ml的定标品。
21.进一步的，所述步骤1和步骤3中的孵育时间均为15分钟。
22.基于上述检测方法，本发明还提供了一种25-羟基维生素d的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括化学发光微孔板、孵育缓冲液、酶结合物溶液、定标品、化学发光底物a、化学发光底物b和清洗液。
23.进一步的，所述化学发光底物a、化学发光底物b和清洗液均为独立包装。
24.与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：
25.1、本发明检测样品中25-羟基维生素d的免疫学方法为化学发光竞争法。首先用纯化的25-羟基维生素d抗体包被化学发光微孔板制成固相抗体，然后往化学发光微孔板的微孔中依次加入样本与孵育缓冲液，使与维生素d结合蛋白结合的25-羟基维生素d转换成游离态，游离态的25-羟基维生素d与微孔中的固相抗体结合；洗涤除去未结合物质后加入浓度一定的hrp标记过的25-羟基维生素d偶联物,与微孔中未与样本中25-羟基维生素d结合的抗体结合；洗涤除去未结合物质后加入化学发光底物a和b。化学发光底物在hrp酶的催化下发光，然后用化学发光免疫分析仪读取相对发光强度(rlu)，最后通过校准曲线计算样品中25-羟基维生素d的浓度，实现了检测样品中25-羟基维生素d含量的功能。
26.2、本发明采用将样本与释放剂同时加入微孔板中的方法，使样本、释放剂与微孔板中的抗体同时孵育，以便于样本中的25-羟基维生素d释放出来后直接与固相抗体结合，省去了样本单独处理的过程，节约了时间，操作简便、特异性高、灵敏度好，能够满足现有的检测需求。
附图说明
27.图1为计算本试剂的线性拟合曲线。
28.图2为计算对比试剂的线性拟合曲线。
具体实施方式
29.实施例：基于本发明的检测方法，制作试剂盒进行以下各种性能指标的检测。将本试剂盒作为实验组，对比试剂为市售试剂盒。
30.性能指标1、最低检测限：
31.用零浓度稀释液作为样本进行检测，重复测定20次，计算其rlu值(相对发光值)平均值(m)和标准差(sd)，得出m 2sd。利用剂量-反应曲线计算出(m 2sd)对应的浓度值为最低检测限。
32.表1最低检测限结果
33.[0034][0035]
通过检测数据可知，本试剂盒具有较好的最低检测线且设定的最低检测限6ng/ml合理。
[0036]
性能指标2、准确度：
[0037]
各重复检测3次，将每次检测结果记为(mi)，分别计算每次检测结果的相对偏差(bi)。如果3次结果的相对偏差都在
±
10％范围内，即判定为符合要求；如果大于等于2次结果的相对偏差不在
±
10％范围内，即判定为不符合要求；如果有1次结果的相对偏差不在
±
10％范围内，则应重新连续测试20次，并分别计算相对偏差，如果大于等于19次结果的相对
偏差在
±
10％范围内，即判定为符合要求。
[0038]
表2本试剂准确度测试
[0039][0040]
表3对比试剂准确度测试
[0041][0042]
由结果可知，本试剂盒测定质控品的结果更接近于标识浓度，证明本试剂的相对偏差均小于对比试剂盒，因此本试剂的准确度更好，更能准确测定出样本中待测物的真实浓度。
[0043]
性能指标3、精密度：
[0044]
以本试剂盒对比试剂各重复检测10次，计算各参考品10次测量浓度结果的平均值m和标准差sd，根据公式cv＝sd/m
×
100％，计算变异系数。
[0045]
表4精密度测试
[0046][0047]
本试剂盒测定控品1和质控品2的cv分别为2.80％和5.61％，均小于对比试剂盒的5.90％和7.05％，证明本试剂的精密度更高，测定样本的重复性更好。性能指标4、线性范围：
[0048]
取接近线性范围上限的高值样本按一定比例稀释为5种浓度，其中低值浓度的样本须接近线性范围的下限。对每一浓度的样本均重复检测3次，计算其平均值，将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数r，r不小于0.99。
[0049]
表5线性范围测试
[0050][0051]
如图1和图2所示，试剂盒获得的拟合直线线性相关系数r2大于0.990，并且高于对比试剂的0.98，因此本试剂盒线满足预期设定的线性范围。