一种白术内生真菌及其在促进白术种子萌发、幼苗生长中的应用

1.本发明涉及植物内生菌资源利用与植物生长发育技术领域，具体地说，是一种白术内生真菌及其对促进白术种子萌发，加快幼苗生长的应用。


背景技术：

2.中药白术系菊科苍术属植物白术atractylodes macrocephala koidz.的干燥根茎，为浙江省著名道地药材“浙八味”之一，性温，味苦、甘，归脾、胃经，具有健脾益气，燥湿利水，止汗，安胎等功效。白术临床应用广泛，被誉为“健脾补气第一要药”，素有“十方九用”、“南术北参”之称。现代化学与药理学研究表明，白术中富含多糖、萜类、酚酸类、黄酮类、香豆素类、甾醇类等多种活性成分，具有抗肿瘤、调节胃肠道、抗骨质疏松、抗炎、抗衰老、抗氧化、免疫调节等作用，是临床常用的大宗药材。
3.植物内生真菌(endophytic fungus)是指存在于健康植物根茎叶等组织内部，不会对宿主植物造成明显伤害或者引起宿主植物组织明显病症的真菌。内生真菌能促进植物生长发育与次生代谢产物积累，提高植物抗病原微生物与非生物胁迫的能力。同时，内生真菌能产多种具有生物活性的代谢物质。有学者报道，广谱内生真菌枫香拟茎点霉b3接种可以缓解连作花生叶片衰老，增加根部生长素积累，生长素的积累增强了花生根部碳代谢和糖转运基因的表达，进而促进了糖向根部的转运和积累，为花生结瘤固氮提供了更多的能量，促进了结瘤固氮，增加植株氮素水平。张捷等从春砂仁内生真菌letendraea helminthicola a696的发酵液中分离得到了一种新的倍半萜类化合物11-hydroxyl tricinonoic acid，对其进行了抗菌和抗肿瘤活性试验，结果表明该化合物在100μg/ml浓度下无抗菌和抗肿瘤活性。马建苹等从百合内生真菌fusarium sp.(gbh2j7)的发酵产物中分离得到对羟基苯乙醇和水杨酸两种酚类物质，其中对羟基苯乙醇是活性指导分离得到的化合物，有dpph自由基清除活性。总之，植物内生真菌是一种重要的微生物资源，其合理开发利用对植物(药用植物)的生产与发展具有重要意义。
4.内生真菌诱导子是内生真菌产生的诱导植物细胞合成次生代谢产物的一类物质，真菌诱导子能够启动信号转导途径，激活基因转录及表达，一定程度提高了关键酶活性，从而促进某些次生代谢物的生物合成，促进植株生长发育，增强植株自身抗性。如丹参中分离得到的深绿木霉trichoderma atroviride d16产生的psf蛋白多糖诱导子，可以促进丹参毛状根的生长，并刺激丹参酮含量积累，深入分析发现d16菌丝psf主要是通过亮氨酸重复元件、ca
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、过氧化物、蛋白磷酸化和茉莉酸合成等信号转导途径调节丹参毛状根糖类和氨基酸的合成与代谢以及基因的转录和蛋白质的翻译过程，进而导致次生代谢相关酶蛋白表达量的变化，最终影响丹参毛状根的整体代谢轮廓发生变化。罗琳等研究报道多孔菌科(polyporaceae)毛栓菌(trametes hirsuta)制备的真菌诱导子能显著缩短白芨种子的萌发时间，而且其幼苗鲜重增长量是对照组的5.4倍，株高是对照组的3.7倍。因此，真菌诱导子是一类重要的活性因子，在植物生长发育与次生代谢等方面具有广阔的应用前景。
5.但是，关于白术内生真菌诱导子促进白术种子萌发与幼苗生长的应用目前还未见报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种白术内生真菌及其对促进白术种子萌发、幼苗生长的应用。
7.本发明的第一方面，提供了一种药用植物内生真菌，命名为am90。所述的内生真菌是从菊科苍术属植物白术活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，经微生物分类学鉴定为子囊菌门竹黄菌属竹黄菌am90(shiraia sp.)。该菌株已保藏，菌株保藏编号为cgmcc no.40299，保藏日期为2022年9月5日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101。
8.本发明所述的内生真菌的固体培养特征为：在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)上26℃暗培养，生长较快，菌落整体白色，底部见淡红色分泌物，菌丝显见，前缘整齐，密度大，边缘呈圆状，见图1。
9.本发明所述的内生真菌在光学显微镜下的菌丝形态为：菌丝较细，表面平展光滑，无隔膜，壁薄，半透明，直径5-20μm，无分生孢子，见图2。
10.本发明所述的内生真菌的its序列扩增电泳图见图3，碱基序列如seq id no.1所示。
11.将上述序列于ncbi网站进行序列比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)，发现同shiraia sp.(jx875938)菌株处于同一末端分支，且同源性均为99.78％。下载同源与近属序列，以jahnula appendiculata(jn819280)做外群，用mega7.0做多序列比对，用邻接法(neighbor-joining，nj)分析，重复比对1000次。本发明所述内生真菌的系统进化树见图4。
12.本发明所述的内生真菌在马铃薯葡萄糖液体培养基(pdb)上26℃培养，生长较快，发酵液整体呈暗红色，中等粘稠，隐约可见菌丝团，数量众多，团块较小，见图5。
13.本发明的第二方面，提供上述内生真菌发酵制备的粗多糖诱导子在促进白术种子萌发，加快幼苗生长中的应用。
14.所述的上述应用，am90粗多糖通过喷洒的方式，促进白术种子萌发，并加快幼苗生长，所述诱导子是采用所述的内生真菌通过pdb培养基制备得到，pdb培养基的配方是：200g土豆，20g葡萄糖，1000ml蒸馏水，ph自然。
15.进一步地，am90多糖诱导子是按照以下步骤制备：(1)取所述的内生真菌菌种，在无菌条件下，挑取菌丝，接入已灭菌的pda培养基，26℃，65％湿度条件下暗培养7d。(2)无菌条件下，在菌落边缘打取菌饼接种于已灭菌的pdb培养基中，在26℃，180r/min条件下恒温震荡培养7d，得种子液。将种子液倒入pdb培养基中，在26℃，180r/min条件下震荡培养14d，将制备好的发酵液经布氏漏斗抽滤，得到干燥固体菌丝块。(3)将菌丝置于40℃烘箱中烘干至恒重，取20g菌丝按料液比(w/v)等于1:20加入纯水，高压蒸汽灭菌锅121℃高温提取90min，旋转蒸发浓缩，然后加入4倍体积无水乙醇，室温过夜。(4)4000r/min离心10min，取沉淀，旋涡溶解后冻干至粉末。(5)取粉末，加入无菌水溶解，即得。
16.进一步地，pda培养基的配方是：200g土豆，20g葡萄糖，1000ml蒸馏水，15g琼脂，ph
自然；pdb培养基的配方是：200g土豆，20g葡萄糖，1000ml蒸馏水，ph自然。
17.进一步地，am90多糖诱导子是采用浸种的方式对白术种子进行施用，施用量为10ml，浓度为0.10mg/ml，持续2h。
18.进一步地，am90多糖诱导子是采用喷洒的方式对白术幼苗进行施用，施用量为5ml/次/2d，浓度为0.10mg/ml，持续培养21d。
19.进一步地，白术种子萌发与幼苗生长的促进作用表现为种子萌发率的提升、幼苗鲜重与芽长的增长。
20.进一步地，am90多糖诱导子促进白术种子萌发与幼苗生长的作用是通过上调白术isp、hsp22.7、yfmj基因表达而实现的。
21.本发明的有益效果在于：
22.本发明所述的内生真菌竹黄菌am90，通过液体培养基制备的粗多糖诱导子溶液，能显著促进白术种子萌发和/或幼苗的生长：提升种子萌发率，促进幼苗鲜重与芽长的增长。竹黄菌am90对白术种子与幼苗的作用在农业领域内的推广应用具有较大价值。
附图说明
23.下面结合附图和实施例对本发明进一步说明；
24.图1：竹黄菌am90(shiraia sp.)在pda固体培养基上的菌落形态(a：正面；b：反面)；
25.图2：竹黄菌am90(shiraia sp.)在光学显微镜下的菌丝形态；
26.图3：am90(shiraia sp.)pcr产物的凝胶电泳图；
27.图4：基于rrna-its基因序列的白术内生真菌am90系统发育树；
28.图5：am90(shiraia sp.)在pdb液体培养基上的发酵液形态；
29.图6：am90(shiraia sp.)干燥固体菌丝块；
30.图7：am90(shiraia sp.)菌丝制备的粗多糖粉末；
31.图8：am90(shiraia sp.)制备的粗多糖诱导子溶液；
32.图9：am90粗多糖诱导子促进白术种子萌发结果图；
33.图10：am90粗多糖诱导子促进白术幼苗生长结果图(a：鲜重；b：芽长；c：am90处理组白术幼苗；d：对照组白术幼苗)；
34.图11：am90粗多糖诱导子上调白术isp、hsp22.7、yfmj基因表达结果图。
具体实施方式
35.本发明的内生真菌是从浙江新昌白术活体中分离得到的菌株。
36.实施例1：
37.所述内生真菌按以下步骤分离获得：取浙江新昌健康新鲜白术的根茎，在清水下冲洗去除表面杂质。剪取适宜大小根茎，包裹纱布后进行三步表面消毒处理，75vol％乙醇溶液1min，1vol％次氯酸钠溶液3min，75vol％乙醇溶液30s。消毒完成后取出，用小刀将白术根切成约1cm
×
1cm的组织块，将白术组织块置于pda培养基中(200g土豆，20g葡萄糖，琼脂15g，1000ml蒸馏水，ph自然)，在26℃霉菌培养箱中暗培养2-3d。对白术内生真菌进行纯化，定期观察，直至分离得到单一菌落，最终得到本发明的内生真菌菌株am90，菌落整体白
色，底部见淡红色分泌物，菌丝显见，前缘整齐，密度大，边缘呈圆状，如图1所示；在显微镜下，菌丝较细，表面平展光滑，无隔膜，壁薄，半透明，直径5-20μm，无分生孢子，见图2，于低温4℃冰箱保存。
38.取am90菌株的冻存管，在无菌条件下，用接种针挑取少许菌体置于新制的pda培养基中活化，26℃遮光培养至成熟。使用真菌基因组dna提取试剂盒,以无菌水冲洗3次菌丝体,进行冷冻干燥,用以提取am90菌株的dna。采用通用引物its4(5
′‑
ggaagtaa aagtcgtaagg-3
′
)与its5(5
′‑
tcctccgcttat tgatatgc-3
′
)进行pcr扩增。将经琼脂糖凝胶电泳检测后的pcr产物(图3)送至上海生工生物工程公司进行序列测定。以pcr产物测得序列作为靶序列，在ncbi中的genbank数据库搜索同源序列，下载与形态型序列相似的参考序列，用邻接法(neighbor-joining，nj)用于系统发育分析，来确定待鉴定菌株的系统发育地位，发现同shiraia sp.(jx875938)菌株处于同一末端分支，且同源性均为99.78％。以jahnula appendiculata(jn819280)做外群，用mega7.0做多序列比对，重复比对1000次。本发明所述内生真菌的系统进化树见图4。所述内生真菌菌株分类命名为竹黄菌am90(shiraia sp.)，菌株于2022年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.40299。
39.实施例2：
40.将保存的am90菌丝于新鲜pda培养基中在26℃条件下活化7d，再用打孔器获得直径6mm的菌饼，取15个菌饼接种于含有150ml pdb培养基(200g土豆，20g葡萄糖，1000ml蒸馏水，ph自然)的锥形瓶中，重复3次，在26℃，180r/min条件下恒温震荡培养7d，得种子液。将每50ml种子液倒入1l pdb中，共接种9l，在26℃，180r/min条件下震荡培养14d(图5)。将制备好的发酵液经布氏漏斗抽滤，得到干燥固体菌丝块(图6)，40℃烘干备用。将菌丝研磨至粉碎，称重，取20g菌丝按料液比(w/v)等于1:20(g/ml)加入纯水，高压蒸汽灭菌锅121℃条件下提取90min，将提取液旋转蒸发浓缩至约200ml，加入4倍体积的无水乙醇(使整体成为80vol％的醇溶液)，室温过夜。取醇溶液适量，4000r/min离心10min，弃上清液，得粗多糖沉淀，置于冷冻干燥器中过夜，干燥至恒重，得粗多糖粉末(图7)。
41.用无菌水将粗多糖粉末配制成0.10mg/ml的am90粗多糖诱导子溶液(图8)，用浸种的方式对白术种子进行施用，施用量为10ml，持续2h，结果显示am90粗多糖诱导子溶液能促进白术种子萌发，萌发率达96.67％，较对照组提升38.14％(图9)。白术种子萌发率的提升按照公式计算：提升率＝(诱导子处理组种子萌发率－对照组种子萌发率)/对照组种子萌发率
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100％。将am90粗多糖诱导子溶液采用喷洒的方式对白术幼苗进行施用，施用量为5ml/次/2d，共培养21d，结果显示诱导子溶液能促进白术幼苗的生长，表现为白术幼苗鲜重的增长与芽长的增长，较对照组分别提高31.78％与34.63％，并上调了白术isp、hsp22.7、yfmj基因表达(图10、图11)。白术鲜重与芽长的增长率按照公示计算：增长率＝[诱导子处理组幼苗鲜重(芽长)－对照组幼苗鲜重(芽长)]/对照组幼苗鲜重(芽长)
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100％。
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以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。