木聚糖在制备预防或治疗骨质疏松的药物或食品中的应用

木聚糖在制备预防或治疗骨质疏松的药物或食品中的应用
1.本技术是申请日为2018年06月11日、申请号为201810594637.6、发明名称为《木聚糖在制备预防或治疗骨质疏松的药物或食品中的应用》的分案申请。
技术领域
2.本发明属于骨质疏松的防治技术领域，具体涉及木聚糖在制备预防或治疗骨质疏松的药物或食品中的应用。


背景技术：

3.骨质疏松(osteoporosis，op)是以骨量减少，骨组织显微结构退化，进而导致骨的脆性增加，骨力学强度下降，载荷承受力降低，易发生骨折的一种全身性骨骼疾病。
4.任何年龄段都有可能发生骨质疏松，但老年人为主要发病群体。据不完全统计，我国60岁以上人群患骨质疏松比例达到59.89％。按照我国老龄化进程，预测至2050年，我国60岁以上的老龄人口将占总人口的20％。骨质疏松的人口将占总人口的13.2％。骨质疏松已经成为了严重的社会健康问题，是继肿瘤和心血管疾病后又一严重危害人类健康的疾病。采取有效的方法预防和治疗骨质疏松具有重要的社会意义。
5.骨质疏松没有根治的方法，当前预防的措施主要是日常补充维生素d和钙剂，治疗的措施主要是采用激素类、双磷酸类等药物抑制老年人过快的骨质流失速度和甲状旁腺激素、氟制剂等骨形成促进药。最新的研究表明，补充钙剂，维生素d均不能降低50岁以上中老年人骨折的发生率，大剂量补充维生素d还增加骨折风险。因此，开发新的更安全有效的制剂，从长远上对骨质代谢进行改善，并对骨质疏松进行预防或治疗显得极其重要。
6.骨质疏松症虽然是中老年最常见的骨骼疾病，但其产生并非仅仅老年骨质代谢的失衡，同时也与少年、青壮年时期骨质的积累密切相关。在生命的各个时期，保持骨骼的健康对预防老年骨质疏松均具有重要的意义。人们早已认识，提高膳食纤维摄入水平能够改善骨质健康。专利申请号为201380021560.9的中国专利公开了一种来自谷物中的葡聚糖和阿拉伯糖木聚糖的缔合物，作为平衡肠道微生物的用途，以及作为便秘、炎性肠综合症、炎性肠疾病、骨质疏松症、肥胖受试者的体重管理、癌症特别是结肠癌、糖尿病、以及与氧化应激和/或心血管疾病有关联的病状的预防或治疗。但是该专利并未解释其中任何的作用机理。来自2016年的研究文献，关于膳食纤维对骨质健康作用的肠道微生物机理进行了部分阐明，即肠道微生物，以及肠道微生物发酵膳食纤维生成的短链脂肪酸，通过提高机体类胰岛素生长因子1的合成水平，从而促进骨髂的形成与生长，改善骨髂健康。也即，肠道微生物是改善骨质健康的重要手段。但人们仍然并不清楚是什么微生物在促进骨髂健康方面发挥主要作用，也不清楚是哪一类膳食纤维对于改善骨质健康最有效。
7.在骨质疏松症与临床生化指标的关联研究中，已经发现如雌激素水平，尿钙水平，vd水平，pinp、balp、ctx-i、尿液羟脯氨酸等代谢指标与骨质健康密切相关，但目前为止也未有任何膳食纤维与骨质代谢指标之间联系的报道。人们并不清楚膳食纤维能否影响这些指标的水平，以及哪一类膳食纤维能够最有效正向调节哪些指标的水平，进而显著地改善
骨髂健康。
8.食物中的膳食纤维是指那些不被人体消化酶消化，能够进入大肠为共生在肠道中的微生物发酵分解的多糖的总称。膳食纤维的种类繁多，在人类日常膳食中摄入的主要是纤维素、半纤维素和果胶，这三大类膳食纤维是构成植物细胞壁的主要成分，其中半纤维素是指植物细胞壁中除纤维素、果胶以外，由两种或三种以上的单糖基构成，没有特定的化学结构的一类物质的总称，构成半纤维素的糖基有d-木糖基、d-甘露糖基、d-葡萄糖基、d-半乳糖基、l-阿拉伯糖基、4-o-甲基-d-葡萄糖醛酸基，d-半乳糖醛酸基和d-葡萄糖醛酸基等，还有少量的l-鼠李糖、l-岩藻糖等。半纤维素主要分为三类，即聚木糖类(即木聚糖)、聚葡萄甘露糖类(即葡甘露聚糖)和聚半乳糖葡萄甘露糖类。
9.膳食纤维是支撑肠道微生物生长与发酵的基础碳源，是影响肠道微生态结构进而影响人体正常生理代谢的食物成分，但由于不同膳食纤维种类的结构不同，某一类膳食纤维只能选择增殖特定类型的肠道微生物，并形成特定的代谢产物谱，对机体特定的代谢侧面产生正向调节作用。因此，确证人类基本食物中对于改善骨质健康最有效，而日常膳食摄入又显著欠缺的成分，然后将其用于强化现代人对该成分的摄入水平，对于改善公众的骨质健康水平显然是有十分重要的意义。
10.在膳食纤维的大家族中，没有一种膳食纤维像木聚糖那样与人类饮食如此密切。木聚糖是半纤维素的主要成分，在禾本科作物的茎秆穗中含量达到20～40％，在谷物表皮中含量也达到15～50％。自人类进入农业社会开始，如同粮食在人类膳食中的作用地位一样，粮食表皮中所含的木聚糖也担当了人类膳食纤维总量的50％以上。工业文明之后人类饮食结构发生了剧烈变化，食物不仅高能量化，粮食普遍的精加工使得富含木聚糖的表皮被去除，其结果是膳食纤维的摄入总量不足，以及膳食纤维中最重要的成分——木聚糖的缺失。营养结构失衡引起的肠道菌群的紊乱，是许多现代疾病流行的诱因。
11.由于木聚糖提取技术和商业化生产的难度，长久以来缺乏对木聚糖生理功能的深入研究，人们对木聚糖的认识更多仅限于是膳食纤维的组成成分之一，并未对其作为一种独立成分的具体生理作用有更多深入的了解。


技术实现要素：

12.本发明的目的在于提供一种木聚糖(聚木糖)在制备预防或治疗骨质疏松的药物或食品中的应用，木聚糖(聚木糖)可以显著改善骨质代谢，提高血液维生素d、pinp、balp水平，降低血液ctxi、尿液羟脯氨酸水平，降低尿钙流失，从而起到起到抑制骨吸收和促进骨形成、防止骨质丢失的作用，摄入木聚糖的动物表现出更高的骨密度(骨质疏松诊断的金标准)和更优异的骨力学性能(最直接和直观的指标)。木聚糖(聚木糖)适合进一步开发成为预防或治疗骨质疏松症的药物或食品。
13.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
14.木聚糖(聚木糖)在制备预防或治疗骨质疏松的药物或者食品中的应用。
15.进一步的，所述的木聚糖在制备提高骨量、增加骨矿密度、增强骨骼最大载荷以及增强骨骼的抗骨折能力的药物或者食品中的应用。
16.进一步的，所述的木聚糖在制备抑制骨吸收、提高骨形成，减少骨质丢失，改善骨质代谢的药物或者食品中的应用。
17.进一步的，所述的木聚糖在制备具有降低尿钙流失作用的药物或者食品中的应用。
18.上述的木聚糖在制备预防或治疗骨质疏松的药物或者食品中的应用，所述的木聚糖具有降低血液中标志物ctxi水平的作用、具有降低血液和尿液中脯羟脯氨酸水平和日排出总量的作用；所述的木聚糖具有提高血液标志物pinp水平、balp水平的作用、具有提高血液维生素d水平的作用。
19.上述的木聚糖在制备预防或治疗骨质疏松的药物或者食品中的应用，所述的木聚糖可以作为单独制剂，也可以和其它药物配伍形成复方制剂，或者配伍其它食品，以此制成具有预防或者治疗骨质疏松作用的药物或食品。
20.上述的木聚糖在制备预防或治疗骨质疏松的药物或者食品中的应用，所述的木聚糖包括含有各种侧链基团的异聚型木聚糖也包括无取代基团的同聚型木聚糖，所述的木聚糖是指聚合度大于10的多糖聚合物。
21.进一步的，所述的木聚糖是指以d-吡喃式木糖残基为结构单元，通过β-(1
→
4)糖苷键或者β-(1
→
3)糖苷键链接而成的主链，在主链的不同位置上分布多种不等侧链基团的一类多聚糖；其结构通式如下：
[0022][0023]
其中r代表侧链基团，该侧链基团包括d-葡萄糖醛酸基、4-o-甲基-d-葡萄糖醛酸基、d-葡萄糖基、l-阿拉伯糖基、d-木糖基、d或l半乳糖基、鼠李糖基、乙酰基、阿魏酸基中的一种或多种。例如：
[0024]
少部分植物中存在无取代基的均一性木聚糖。如绿藻木聚糖是β-(1
→
3)糖苷键连接的线性均一聚木糖；某些红海藻中是以β-(1
→
3)和β-(1
→
4)糖苷键连接的线性均一聚木糖；羽状草、烟草茎、瓜儿豆外壳中存在β-(1
→
4)糖苷键连接均一性木聚糖。
[0025]
阔叶木木聚糖侧链主要基团有乙酰基。4-o-甲基-α-d-吡喃式葡萄糖醛酸基，乙酰基一般在c3位，4-o-甲基-α-d-吡喃式葡萄糖醛酸基通常在c2位，通常每10个木糖基有一个4-o-甲基-α-d-吡喃式葡萄糖醛酸侧链，总称为聚-o-乙酰基-4-o-甲基葡萄糖醛酸木糖。
[0026]
针叶木木聚糖侧链基团主要是阿拉伯糖基和4-o-甲基葡萄糖醛酸基，α-l-呋喃式阿拉伯糖基通常连接在主链木糖基的c3位上，而同时4-o-甲基-α-d-葡萄糖醛酸基通常连接在c2位上，通常每5～6木糖基中有一个4-o-甲基-α-d-葡萄糖醛酸基侧链，总称为聚阿拉伯糖-4-o-甲基葡萄糖醛酸木糖。
[0027]
禾本科植物木聚糖侧链基团主要有l-呋喃式阿拉伯糖基、乙酰基和4-o-甲基-吡喃式葡萄糖醛酸基，典型的形式是l-呋喃式阿拉伯糖基和4-o-甲基-吡喃式葡萄糖醛酸基分别连接在木糖主链的c2和c3位置上，乙酰基连接在c2或者c3上，也称为葡萄糖醛酸阿拉
伯糖基木聚糖。小麦、黑麦、大麦、燕麦、玉米、高粱等谷物胚乳和黑麦草及竹笋中主要是阿拉伯木聚糖，存在主链木糖残基的c(o)-2或c(o)-3被l-阿拉伯糖基单取代或者同时在c(o)-2,3位被l-阿拉伯糖基双取代两种形式。
[0028]
所述的木聚糖会因为不同植物来源、不同植物部位、不同的提取工艺、甚至不同合成工艺而导致在分子的聚合度、侧链基团种类、取代程度不同，最终在分子量和结构方面表现出差异。
[0029]
所述的木聚糖在制备预防或治疗骨质疏松的药物或者食品中的应用，采用木聚糖进行制备预防或治疗骨质疏松的药物或者食品时，木聚糖的添加以粗品的形式加入或以各种纯度的提取品形式加入，所述的粗品主要包括以木聚糖为生理作用成分的麦麸、玉米皮以及各种秸秆粉碎物。
[0030]
本发明经过研究证实，在人类自然摄入食物所包含的主要膳食纤维种类中，木聚糖是最主要的改善骨质健康的成分，在改善与骨质疏松相关的临床生化指标，提高抗骨折强度方面，木聚糖都显著地优于其它膳食纤维成分以及无膳食纤维对照组。木聚糖对青年期的动物和老年期的动物作用均显著，具体包括：
[0031]
(1)木聚糖可以显著增加大鼠血清中骨形成标志物ⅰ型前胶原氨基末端肽(procollagentypein-terminalpeptide，pinp)和骨碱性磷酸酶(bone alkalinephosphatease，balp)的水平。pinp和balp是骨组织形成过程中由成骨细胞分泌的，标志着成骨细胞成熟和新骨形成的特异性指标。木聚糖提高该标志物水平反映了木聚糖对成骨细胞活性具有促进作用。
[0032]
(2)木聚糖降低骨吸收标志物ⅰ型胶原羧基末端肽(ctx
‑ⅰ
)和羟脯氨酸的水平。ctx
‑ⅰ
和羟脯氨酸是骨组织ⅰ型胶原在破骨细胞作用下被分解的产物之一，是反映骨吸收过程应用最广泛和最有价值的的标志物。木聚糖降低该标志物水平说明木聚糖可以显著的抑制骨质的分解。
[0033]
(3)木聚糖提高维生素d3的吸收。维生素d3是调节骨代谢重要的激素，可促进钙的吸收和骨密度的增加，木聚糖提高该因子水平说明其具有促进骨钙吸收的作用。
[0034]
(4)木聚糖可以增加骨量。骨质疏松主要是以骨量减少为主要特征，木聚糖对骨形成和骨吸收的双重调节结果是骨量的增加，从而具有抗骨质疏松作用。
[0035]
(5)木聚糖可以显著减少尿钙流失。尿钙流失是引起骨矿丢失的一个重要原因之一，木聚糖显著的减少尿钙流失也是抑制骨吸收的标志。
[0036]
(6)木聚糖可以显著增加骨密度。骨密度是骨骼强度的一个重要指标，是骨质疏松诊断和评价疗效的金标准。经过双能x射线骨密度仪检验，摄入木聚糖的大鼠骨骼显著增加骨密度，有效的预防和改善骨质疏松。
[0037]
(7)木聚糖提高骨骼的生物力学性能。骨量和骨密度的增加，最直接的结果是提高骨骼的最大载荷和折断载荷，是木聚糖最终作用的主要体现。
[0038]
相对于现有技术，本发明所取得的实质性进步体现在：
[0039]
1.本发明提供了木聚糖在制备预防或治疗骨质疏松的药物或者食品中的应用，为骨质疏松的治疗和预防提供了新的药物和食物。
[0040]
2.本发明通过研究比较人类摄入的主要膳食纤维种类，从骨密度、骨生物力学性能，生化代谢指标多个角度有力证明，人类主要膳食纤维当中抗骨质疏松的主成分是木聚
糖，人类摄入木聚糖有助于改善骨质代谢和形成良好的骨质结构，从而提高骨质的生物力学性能，预防骨质疏松。
[0041]
3.本实验使用高纯度木聚糖，充分排除了其它纤维成分干扰，保证了发明结论充分可靠，这是使用低含量木聚糖进行的膳食纤维研究所不可能实现的。
[0042]
4.本发明同时在青壮年与老年两个年龄段的大鼠进行验证，证实无论青年期还是老年期，木聚糖有助于形成更高的骨量和骨密度，并因此获得更好的骨力学性能，木聚糖对终生的骨质健康均有良好的改善作用，这也是前人研究所没有的。
[0043]
5.本发明同时证明，与含有天然状态木聚糖的麦麸相比，提取的木聚糖对骨质改善的作用更显著，说明提纯的过程去除杂质的阻碍作用以及结构疏松更有利用肠道微生物发酵，可以实现更少剂量木聚糖获取较大的骨质健康收益。
[0044]
6.本发明公开了木聚糖的预防和治疗骨质疏松的药物和食品中的应用和部分作用机理，为指导人们如何建造终生骨质健康提供了方向。
[0045]
提供人类必须木聚糖摄入量的主要食物在于没有经过精加工的粗粮中。但现代社会粮食精细化成为饮食的主流，人们很难像古人一样摄入足量粗粮以保证足够的木聚需求量。为弥补木聚糖在膳食中的缺口，加工食品添加木聚糖是一个重要的途径。这些加工食品可以包括任何的淀粉类、奶制品、豆制品、肉制品、饮料、糖果饼干等。木聚糖进入一切商业食品当中从而赋予了该种食品具有预防骨质疏松的保健功能。
[0046]
本发明所述的木聚糖，和人类维持正常生理代谢所必需的其它营养元素一样，安全无毒。木聚糖的终生足量摄入，是从根本上改善骨代谢，营造和维持一生各个时期最佳骨质，预防和治疗骨质疏松不可缺少的预防营养剂和治疗剂。
[0047]
木聚糖可以作为药物的主成分，或者作为辅助成分与其它具有抗骨质疏松作用的药物配伍，从而制备成具有预防和抗骨质疏松的药品。
具体实施方式
[0048]
以下结合具体实施方式，对本发明的内容做进一步详细说明，但应理解以下实例仅是为了阐释发明而不是限制本发明的范围。
[0049]
实施例1
[0050]
木聚糖对中老年雌性大鼠骨质的影响
[0051]
体内雌激素水平对女性骨质代谢有着重大的影响，中年之后，随着雌性激素逐步水平的下降，骨吸收呈上升的趋势，骨质流失加速，患骨质疏松的风险显著增加。本实施例目的是以中年雌性大鼠作为模型动物，研究自然状态下添加各种膳食成分对生育期以后大鼠骨质代谢的影响。所添加的木聚糖、木质素、纤维素、果胶、菊粉代表人类摄入膳食纤维中最主要存在的组分，混合组为木聚糖、纤维素、果胶、菊粉的混合物，芝麻为民间传统和文献报道中具有抗骨质疏松作用的天然食物，壳寡糖是壳聚糖通过降解产生的一种分子量低、易溶于水、天然带正电的糖类。大量文献报道壳寡糖有促进成骨、抗骨质疏松的作用。木聚糖、木质素、纤维素均为发明人自制，其余购自市售商品。
[0052]
1.材料
[0053]
1.1试验动物
[0054]
sfp级雌性sd大鼠(湖南，斯莱克景达)，鼠龄8个月，体重375
±
37g，已完成数次生
育任务。
[0055]
1.2木聚糖、木质素和纤维素
[0056]
木聚糖的制备方法：采用甘蔗渣为原料，原料经过自来水喷淋堆沤3个月至1年，清水洗涤去除黄水和杂质，然后用ph12.0的稀碱100℃蒸煮2h，将乙酰基和部分木质素去除，压榨后反复洗涤，渣部分用8％(w/v)的naoh溶液，固液比为1:10进行提取6h，提取温度80℃，压榨固液分离，液体部分经过静置澄清，澄清液采用膜分离将10000道尔顿以下小分子透过膜分离出去，并且截留液持续加入清水反复透析除碱加入清水反复将碱液透析直至ph12.0左右，截留液加入少量食品级h2o2进行漂白，然后中和，然后用95％酒精沉淀并用75％酒精反复洗涤，直至洗去所有的游离木质素，产品变白，最后干燥所得，木糖基部分含量占总质量的90％。
[0057]
所得木聚糖为截留分子量为10000道尔顿分子量的膜截留物并且经过乙醇沉淀的产物，为大分子物质，核磁共振检测平均分子量为80000，物理特性：溶于水为白色乳浊液，不溶于酸，溶于碱，无味，白色或者灰白色、淡黄色。该木聚糖的侧链基团主要有乙酰基、阿拉伯糖基、葡萄糖醛酸基和4-o-甲基-葡萄糖醛酸基，其中木糖基：阿拉伯糖基＝9～10：1。
[0058]
纤维素制备方法：甘蔗渣用10％(w/v)naoh溶液提取木聚糖和木质素，经过固液分离，残渣即为纤维素粗品。再次用15％(w/v)naoh溶液100℃浸提12～24h，然后再次固液分离并将固体部分洗涤至中性，最后再用2％的h2so4(w/v)溶液，121℃蒸煮30min，将剩下固体洗涤至中性，烘干粉碎，即为纯度＞95％的纤维素。
[0059]
木质素制备方法：甘蔗渣为原料，以10％(w/v)的naoh溶液为提取溶媒将木聚糖和木质素从原料中溶解出来，将溶解液以100000道尔顿截留分子量的超滤膜将木聚糖截留，滤出液中的木质素溶液再一次经过截留分子量为1000道尔顿的纳滤膜滤除碱液，截留部分反复加入纯水纳滤至接近中性，然后加入酸性乙醇，沉降离心分离出上清液，上清液通过精馏将乙醇去除，精馏残渣部分然后中和，喷雾干燥所得。
[0060]
1.3药品与试剂
[0061]
cusabio试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)。
[0062]
1.4仪器与设备
[0063]
ag-201型电子式万能试验机(日本，岛津制作所)；sp-max3500fl多功能荧光酶标仪(上海闪谱生物科技有限公司)；hologicdiscoverya双能x线骨密度检测仪(美国)。
[0064]
2.实验方法
[0065]
2.1分组和给药
[0066]
购买回来的雌性大鼠，适应性饲养2周，然后分组，分别为空白对照组(无膳食纤维组)、木聚糖组、木质素组、纤维素组、果胶组、菊粉组、芝麻组、壳寡糖组、混合组。基础饲料配方为ain-96m，空白组饲喂基础饲料，其余各组在基础饲料中添加5％的试验成分。饲养温度25℃，湿度40～60％，自由摄食、饮水，光照周期12h/12h。
[0067]
2.2指标测定
[0068]
宰杀前用代谢笼收集48h尿液，检测尿液中羟脯氨酸含量并计算24h排出总量。
[0069]
宰杀时直接从颈部放血处死大鼠，并收集血液，室温下静置凝固1h析出血清，3000rmp离心10min，将血清分装，保存至-80℃。用cusabio试剂盒按说明书测定血清维生素d、pinp、ctx-i、羟脯氨酸和balp标志物。大鼠处死后剥离后肢左、右股骨，称重，用双能x射
线骨密度仪扫描左股骨，测定骨密度。右股骨，在万能机上进行三点弯曲试验测定右股骨生物力学性能。测试条件为：跨距为20mm，加载速度为5mm/min，记录载荷变形曲线，在曲线上读出最大载荷等参数。
[0070]
2.3数据处理
[0071]
采用spss19.0统计软件包进行分析，计算结果以
±
s表示，组间比较采用单因素方差分析，差异p＜0.05为具有统计学意义。
[0072]
3实验结果
[0073]
3.1骨重量
[0074]
骨质疏松的一个特征是骨量的减少，与所有组别相比(如下表1)，木聚糖组显示了较高的骨量。
[0075]
表1骨重量
[0076]
组别n右股骨重量(g)对照10(死亡5只)0.96
±
0.39**木聚糖101.26
±
0.09纤维素10(死亡5只)1.10
±
0.09木质素10(死亡5只)1.25
±
0.11果胶101.13
±
0.07菊粉101.00
±
0.13*芝麻101.13
±
0.06寡聚糖101.12
±
0.06混合膳食纤维101.20
±
0.14
[0077]
注：与木聚糖对比：*p＜0.05，**p＜0.01。
[0078]
3.2维生素d水平
[0079]
维生素d是骨代谢重要的调节激素，在生理剂量下，可促进肠道钙的吸收、肾小管对钙磷的重吸收和骨骼钙化，因此有利于骨密度的增加。木聚糖组血液维生素d水平均高于其它组(除了芝麻组以外)，其中和对照组、壳寡糖组相比差异显著性p＜0.01，与木质素、果胶、菊粉、混合膳食纤维组相比差异显著性为p＜0.05。
[0080]
表2血清维生素d水平
[0081]
组别n血清维生素d(ng/ml)对照1032.57
±
4.01**木聚糖1039.15
±
3.48纤维素1038.5
±
3.9木质素1033.55
±
5.51*果胶1033.95
±
4.77*菊粉1033.55
±
3.66*芝麻1039.57
±
2.97寡聚糖1031.9
±
4.51**混合膳食纤维1033.6
±
5.69*
[0082]
注：与木聚糖对比：*p＜0.05，**p＜0.01。
[0083]
3.3血液pinp水平
[0084]ⅰ型前胶原氨基末端肽(pinp)是i型前胶原形成胶原时被切下的n端多余肽链，pinp在血清中的含量反映成骨细胞合成骨胶原的能力，是新骨形成的特异性敏感指标。从下表3可见，木聚糖组血清中pinp的水平高于其余各组，果胶、壳寡糖显著程度p＜0.01，纤维素、菊粉显著程度p＜0.05，说明木聚糖具有促进成骨的作用。
[0085]
表3血液pinp水平
[0086]
组别npinp(pg/ml)对照10110.56
±
11.77木聚糖10196.68
±
62.58纤维素1056.22
±
15.88*木质素10104.18
±
46.29果胶1030.34
±
6.17**菊粉1075.20
±
66.30*芝麻10143.70
±
148.06寡聚糖1041.28
±
70.79**混合膳食纤维10101.06
±
45.40
[0087]
注：与木聚糖对比：*p＜0.05，**p＜0.01。
[0088]
3.4血液balp水平
[0089]
骨特异性碱性磷酸酶(balp)是成骨细胞的一种胞外酶，主要作用是水解无机磷酸盐，进而降低焦磷酸盐的浓度，有利于成骨。balp活性与成骨和前成骨细胞活性呈线性关系，被认为是最精确的骨形成标志物，是成骨细胞成熟和具有活性的标志。木聚糖的balp活性均高于各组别，显然木聚糖的成骨作用最为优异。
[0090]
表4血液balp水平
[0091][0092][0093]
注：与木聚糖对比：*p＜0.05，**p＜0.01。
[0094]
3.5血液ctx
‑ⅰ
水平
[0095]ⅰ型胶原羧基末端肽(ctx
‑ⅰ
)是占骨骼有机物90％的ⅰ型胶原分解进入血液的短肽片段，是使用最为广泛的胶原降解标志物。下表5，除了芝麻组，木聚糖组的血清ctx-i水平低于其它各组膳食纤维和对照，说明木聚糖具有抑制骨吸收作用。
[0096]
表5血液ctx
‑ⅰ
水平
[0097]
组别nctx
‑ⅰ
(pg/ml)对照10955.21
±
76.14木聚糖10953.45
±
117.77纤维素10963.45
±
117.87木质素101026.55
±
182.17果胶101075.47
±
156.89菊粉101045.68
±
172.84芝麻10827.64
±
133.12寡聚糖10990.55
±
102.29混合膳食纤维101052.91
±
202.36
[0098]
注：与木聚糖对比：*p＜0.05，**p＜0.01。
[0099]
3.6血液和尿液羟脯氨酸水平
[0100]
羟脯氨酸是骨基质中的氨基酸，血液和尿液中的羟脯氨酸是骨胶原分解后的产物，与骨吸收率有显著关系(下表6)，木聚糖与其它各组相比均明显降低，说明木聚糖可以抑制骨质分解。
[0101]
表6血液和尿液羟脯氨酸水平
[0102]
组别n血液羟脯氨酸水平(μg/ml)尿液羟脯氨酸水平(μg)对照1053.58
±
14.02**113.01
±
32.16木聚糖1035.40
±
6.3770.61
±
53.65纤维素1026.20
±
5.1184.91
±
26.82木质素1038.76
±
5.7171.58
±
40.19果胶1038.34
±
4.18195.43
±
32.16**菊粉1037.26
±
5.62120.26
±
56.95芝麻1048.22
±
14.15267.11
±
193.74**寡聚糖1049.98
±
13.95108.81
±
20.85混合膳食纤维1032.52
±
13.19227.91
±
57.13**
[0103]
注：与木聚糖对比：*p＜0.05，**p＜0.01。
[0104]
3.7骨密度结果
[0105]
骨密度是衡量骨质疏松国际上公认的金标准，从表7可知，木聚糖组骨密度高于所有的膳食纤维组和对照组，木聚糖是膳食纤维中最有效预防骨质疏松的营养因子。
[0106]
表7骨密度
[0107]
组别大鼠数量(只)左股骨骨密度(g/cm2)对照100.2617
±
0.02*木聚糖100.2916
±
0.018
纤维素100.2602
±
0.00**木质素100.2823
±
0.011果胶100.2792
±
0.013*菊粉100.2870
±
0.015芝麻100.2838
±
0.009寡聚糖100.2633
±
0.004*混合膳食纤维100.2837
±
0.013
[0108]
注：与木聚糖对比：*p＜0.05，**p＜0.01。
[0109]
3.8三点弯曲测试结果
[0110]
骨骼的作用主要是满足机体的生物力学要求，对机体起着保护和支持的作用。三点弯曲试验最主要指标是最大载荷，反映的是骨骼的内在质量，而与骨的尺寸大小无关。下表8可见，木聚糖比其它种类的膳食纤维和对照组相比具有更高的最大载荷，更优异的抗骨折性能。并且从趋势上看，三点弯曲最大载荷的结果(下表8)与骨密度对应，更高的骨密度具有更高的抗折断能力。
[0111]
表8三点弯曲测试结果
[0112]
组别大鼠数量(只)右股骨最大载荷(牛)对照10142.03
±
31.52**木聚糖10174.50
±
27.53纤维素10122.80
±
8.42**木质素10154.04
±
19.87*果胶10148.29
±
20.74*菊粉10160.96
±
20.95芝麻10155.27
±
21.76*寡聚糖10140.04
±
18.87**混合膳食纤维10160.44
±
32.21
[0113]
注：与木聚糖对比：*p＜0.05，**p＜0.01。
[0114]
4结论
[0115]
从综合数据来看，木聚糖无论从骨的重量、血液中维生素d水平，还是血液或者尿液中成骨和破骨标志物水平，以及骨质代谢积累的结果——骨密度和最终表现出来的实际抗骨折能力的检验，木聚糖呈现整体优异表现的水平，说明人类主要膳食纤维当中或者膳食成分当中抗骨质疏松的最有效成分是木聚糖。预防老年性骨质疏松最有效的膳食或者膳食纤维成分也是木聚糖。
[0116]
实施例2木聚糖对生长期大鼠骨质的影响
[0117]
膳食纤维是食物中不能被人体消化酶所消化，但是可以在肠道(主要是大肠)被肠道微生物分泌的酶降解为微生物可利用的小分子的一类多糖的总称。膳食纤维的主要成分包括：纤维素、木聚糖、果胶、果聚糖或葡聚糖、甘露聚糖。本实施例的目的是验证不同膳食纤维成分或者组合对生长期大鼠骨质生长的影响。其中纤维素和木聚糖为发明人所制备，纤维素纯度≥95％，木聚糖纯度≥85％，果胶、菊粉、魔芋胶、麦麸均为购于商业生产公司。菊粉主要成分是果聚糖；魔芋胶主要成分是甘露聚糖；麦麸是木聚糖、纤维素、果聚糖、甘露
聚糖的天然混合物，其中木聚糖占总麦麸总量的50％以上；混合膳食纤维组是将木聚糖、纤维素、果聚糖、甘露聚糖混和而得。
[0118]
1.材料
[0119]
1.1试验动物
[0120]
spf级雄性大鼠(湖南，斯莱克景达)，鼠龄2个月，体重约200
±
20g。
[0121]
1.2木聚糖和纤维素
[0122]
木聚糖的制备方法：采用玉米芯为原料，原料经过堆沤变软，清水洗涤去除杂质，然后用8％(w/v)的naoh溶液，固液比为1:8进行提取12h，提取温度80℃，压榨固液分离，液体部分经过静置澄清，澄清液采用膜分离将10000以下小分子透过膜分离出去，并且加入清水反复将碱液透析直至ph12.0左右，截留液加入少量食品级h2o2进行漂白，然后中和，乙醇沉淀，然后用75％酒精反复沉淀洗涤，直至洗去所有的游离木质素，最后干燥所得。产物戊糖基部分占总质量的85％。制成的木聚糖的主要侧链基团为乙酰基、阿拉伯糖基、葡萄糖醛酸基、4-o-甲基葡萄糖醛酸基。其中木糖基：阿拉伯糖基＝7～9：1。
[0123]
纤维素制备份方法：甘蔗渣用10％(w/v)naoh浸提6～24h，溶解木聚糖和木质素，通过压榨或离心方式固液分离并洗涤残渣，所得残渣再次用15％(w/v)naoh溶液100℃下浸泡12h，再次固液分离，固体部分清水洗涤至中性，烘干，然后用2％(w/v)的h2so4溶液，在121℃下蒸煮30min以彻底去除木聚糖，蒸煮完毕将纤维素渣洗涤至中性，烘干粉碎，即为纯度＞95％的纤维素。
[0124]
1.3药品与试剂
[0125]
cusabio试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)。
[0126]
1.4仪器和设备
[0127]
ag-201型电子式万能试验机(日本，岛津制作所)；novaa400p原子吸收分光光谱仪(德国耶拿分析仪器股份有限公司)。
[0128]
2.实验方法
[0129]
2.1分组和给药
[0130]
spf级雄性大鼠70只，买进后适应饲养2周，然后随机分为7组，每组10只。基础饲料配方为ain-96m，每组在基础饲料的基础上分别添加5％的木聚糖、果胶、纤维素、魔芋、菊粉、麦麸、膳食纤维组合。大鼠饲养温度25℃，湿度40～60％，自由摄食、饮水，光照周期12h/12h。
[0131]
2.2指标测定
[0132]
大鼠饲养至12月龄，宰杀前用代谢笼收集48h尿样，进行尿钙测定并计算24h尿钙排出量，测定方法为火焰原子吸收光谱法。宰杀时颈部放血处死大鼠，收集血液静置30min以上低速离心分离血清，检测各项指标；剥离右股骨，称重，进行三点弯曲试验测定其生物力学性能在万能机上进行三点弯曲试验测定右股骨生物力学性能。测试条件为：跨距为20mm，加载速度为5mm/min，记录载荷变形曲线，在曲线上读出最大载荷等参数。用双能x射线骨密度仪扫描左股骨，测定骨密度。
[0133]
2.3数据处理
[0134]
用spss19.0统计软件进行分析，计算结果以
±
s表示，组间比较采用单因素方差分析，差异p&lt；0.05为具有统计学意义。
[0135]
3.实验结果
[0136]
3.124h尿钙排出量
[0137]
钙是骨骼的主要组成成分，高尿钙和骨量减少、骨质疏松具有密不可分的关系，调查尿钙排泄情况可以反映骨质的流失情况。从下表9可以看出，木聚糖与人类膳食中最常摄入的膳食纤维种类或者混合组合相比较，24h尿钙排出量显著降低，p＜0.01。
[0138]
表924h尿钙排出量
[0139][0140][0141]
注：与木聚糖对比：*p＜0.05，**p＜0.01。
[0142]
3.2骨重量
[0143]
老年期的骨质疏松不仅在于老年期过快的骨质流失速度，也与成长期建立的骨峰值密切相关，从下表10可见，对于生长期的试验动物，木聚糖膳食可以获得更高的骨量，显然青少年长期摄入木聚糖有助于预防老年期的骨质疏松。
[0144]
表10骨重
[0145]
组别n左股骨重量(g)木聚糖101.684
±
0.117纤维素101.60
±
0.119果胶101.486
±
0.142**菊粉101.68
±
0.143魔芋101.54
±
0.145*麦麸101.56
±
0.105*混合组101.62
±
0.07
[0146]
注：与木聚糖对比：*p＜0.05，**p＜0.01。
[0147]
3.3三点弯曲测试结果
[0148]
下表11可见，木聚糖组与其它种类的膳食纤维相比具有更高的最大载荷，说明生长期摄入木聚糖最直接的结果是提高骨骼的生物力学性能。
[0149]
表11三点弯曲测试结果
[0150]
组别n右股骨最大载荷(牛)木聚糖10212.16
±
27.83纤维素10188.68
±
43.91
果胶10154.03
±
29.10**菊粉10176.87
±
29.01魔芋10174.13
±
41.45麦麸10183.66
±
17.27混合组10178.75
±
35.52
[0151]
注：与木聚糖对比：*p＜0.05，**p＜0.01。
[0152]
4.结论
[0153]
大鼠骨质生长的高峰期在12月龄之前，生长期长期摄入木聚糖，其产生的结果是与摄入其它单一种类的膳食纤维或者某些混合纤维相比，具有更优越的生物力学指标、更优越的抗骨折能力。木聚糖促进成长期动物的骨质生长和骨峰值的建立，有效的预防老年性骨质疏松。
[0154]
实施例3木聚糖对去卵巢骨质疏松大鼠骨密度的影响
[0155]
绝经后的骨质疏松是中老年女性最常见的慢性病。本实施例用切除卵巢大鼠模拟绝经女性，目的是考察木聚糖和各种膳食纤维对去卵巢大鼠骨质的影响。
[0156]
1.试验动物
[0157]
sfp级雌性sd大鼠80只(湖南，斯莱克景达)，鼠龄8个月，体重375
±
37g，已完成数次生育任务。
[0158]
2.骨质疏松大鼠模型制备
[0159]
采用摘除大鼠双侧卵巢建立骨质疏松大鼠模型。用10％水合氯醛注射液(3ml/kg体重)麻醉，在腰背部脊柱两侧做纵行切口暴露卵巢组织，丝线结扎周围组织后，将桑葚样的卵巢完整切除，逐层缝合伤口，假手术组以同样的方式暴露双侧卵巢，但不摘除，后注射青霉素4万u/只三天以防感染。
[0160]
3.分组和给药
[0161]
分为非手术组、假手术组、手术空白组、手术给药组各20只。基础饲料配方为ain-96m，手术给药组在基础饲料中添加5％木聚糖(木聚糖：来源于甘蔗渣，其侧链基团主要有乙酰基、阿拉伯糖基、葡萄糖醛酸基和4-o-甲基-葡萄糖醛酸基，其中木糖基：阿拉伯糖基＝10～15：1。)，其余各组均只饲喂基础饲料。实验期间大鼠自由进食、饮水。
[0162]
4.指标检测
[0163]
饲喂4个月后禁食处死大鼠，剥离后肢双侧股骨，用浸满生理盐水纱布包裹，置于-80℃冰箱保存。测定时自然解冻至室温，在万能机上进行三点弯曲试验测定右股骨生物力学性能。测试条件为：跨距为20mm，加载速度为52mm/min，记录载荷变形曲线，在曲线上读出最大载荷等参数。用双能x射线骨密度仪扫描左股骨，测定骨密度。
[0164]
5.数据处理
[0165]
采用spss19.0统计软件包进行分析，计算结果以
±
s表示，组间比较采用单因素方差分析，以p&lt；0.05作为具有显著差异标准。
[0166]
6.实验结果
[0167]
如表12所示。切除卵巢4个月后手术对照组骨密度低于非手术组和假手术组，且差异具有统计意义，说明骨质疏松模型建造成功。手术给药组骨密度显著高于手术对照组，说明卵巢切除引起的骨质流失被木聚糖抑制。
[0168]
表12骨密度和三点弯曲试验结果
[0169]
组别数量(只)骨密度(g/cm2)最大载荷(牛)非手术组200.2838
±
0.009##161.21
±
10.05##假手术组200.2802
±
0.012##160.96
±
8.14##手术对照组200.2602
±
0.007**141.68
±
14.53**手术给药组200.2829
±
0.016##159.10
±
15.52#
[0170]
注：与非手术组相比，*p＜0.05，**p＜0.01；与手术对照组相比，#p＜0.05，##p＜0.01。
[0171]
7.结论
[0172]
木聚糖可以抑制去势大鼠骨质流失，从而具有防止雌性大鼠骨质疏松的作用。
[0173]
实施例4
[0174]
本发明中所述的木聚糖是指以d-吡喃式木糖残基为结构单元，通过β-(1
→
4)糖苷键或者β-(1
→
3)糖苷键链接而成的主链，在主链的不同位置上分布多种不等侧链基团的一类多聚糖；其中以玉米皮为原料制备木聚糖的制备方法为：采用玉米皮为原料，清水洗涤去除杂质，然后用8％(w/v)的naoh溶液，固液比为1:8进行提取12h，提取温度80℃，压榨固液分离，液体部分经过静置澄清，澄清液采用膜分离将10000以下小分子透过膜分离出去，并且加入清水反复将碱液透析直至ph12.0左右，截留液加入少量食品级h2o2进行漂白，然后中和，乙醇沉淀，然后用75％酒精反复沉淀洗涤，直至洗去所有的游离木质素，最后干燥所得。制成的木聚糖的侧链基团主要有乙酰基、阿拉伯糖基、葡萄糖醛酸基和4-o-甲基-葡萄糖醛酸基，其中木糖基：阿拉伯糖基＝1～2:1。
[0175]
实施例5
[0176]
本发明中所述的木聚糖是指以d-吡喃式木糖残基为结构单元，通过β-(1
→
4)糖苷键或者β-(1
→
3)糖苷键链接而成的主链，在主链的不同位置上分布多种不等侧链基团的一类多聚糖；其中以小麦麸皮为原料制备木聚糖的制备方法为：采用小麦麸皮为原料，清水洗涤去除杂质，然后用8％(w/v)的naoh溶液，固液比为1:9进行提取10h，提取温度80℃，压榨固液分离，液体部分经过静置澄清，澄清液采用膜分离将10000以下小分子透过膜分离出去，并且加入清水反复将碱液透析直至ph12.0左右，截留液加入少量食品级h2o2进行漂白，然后中和，乙醇沉淀，然后用75％酒精反复沉淀洗涤，直至洗去所有的游离木质素，最后干燥所得。制成的木聚糖的侧链基团主要有乙酰基、阿拉伯糖基、葡萄糖醛酸基和4-o-甲基-葡萄糖醛酸基，其中木糖基：阿拉伯糖基＝1～3:1。
[0177]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。