水晶兰苷在促进骨折愈合中的应用

1.本发明涉及医药领域，具体涉及水晶兰苷在促进骨折愈合中的应用。


背景技术：

2.骨折是常见疾病，愈合时间长。而长期卧床静养及制动会导致肌肉萎缩、坠积性肺炎、静脉血栓等多种并发症的发生。此外，老年、肝肾功能不全、绝经、肠道疾病等基础性疾病，不仅可能导致骨质疏松症，造成骨质疏松性骨折，也常常从疾病本身影响骨折的愈合，导致骨折愈合和修复延迟，从而显著延长了整个病程，造成并发症发生率大大增加。
3.因此，骨折对于患有严重基础疾病的中老年患者有严重甚至致命的危险。尤其是骨质疏松性骨折，具有较高的致死率和致残率，且容易出现二次骨折。大约40％-50％的女性和13％-22％的男性在一生中至少发生过一次骨质疏松性骨折。2010年，我国约投入100亿美元医疗卫生支出用于opf患者的治疗。预计到2050年，opf患者数量将超过600万例，每年为此投入的医疗卫生支出将超过254亿美元，给我国医疗卫生体系带来巨大的经济负担。
4.目前常用于opf的治疗手段有手术治疗和非手术治疗。手术治疗创伤大，存在感染风险，且opf患者多为老年人，常合并其他基础病，无法满足手术适应症，存在局限性。目前opf的药物干预主要有双磷酸盐类、活性维生素d类及重组人甲状旁腺激素等，这些药物主要是通过提高骨密度、改善骨质或抑制骨丢失来降低再骨折发生率，而针对骨折愈合过程的药物却很少见。
5.因此，本领域急需开发能够促进骨质疏松性骨折快速愈合，提高愈合骨质量，减少并发症的药物。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供水晶兰苷在促进骨折愈合中的应用。
7.本发明第一方面，提供了水晶兰苷、或其生理学上可接受盐、或包含其的提取物在制备促进骨折愈合的药物组合物或保健品组合物中的用途
8.9.水晶兰苷。
10.在另一优选例中，所述骨折选自下组：机械性骨折、疲劳性骨折、病理性骨折。
11.在另一优选例中，所述病理性骨折包括：骨质疏松性骨折、骨髓炎性骨折。
12.在另一优选例中，所述骨折选自下组：完全骨折或不完全骨折(如裂纹骨折)。
13.在另一优选例中，所述促进骨折愈合包括一个或多个选自下组的特征：
14.(i)促进bmscs成骨分化；
15.(ii)促进bmscs矿化；
16.(iii)加速骨痂形成；
17.(iv)加速骨折线消失；
18.(v)提高骨矿密度(bmd)；
19.(vi)提高骨体积分数(bv/tv)；
20.(vii)提高骨小梁数目(tb.n)。
21.在另一优选例中，所述组合物还包括药学上或保健品学上可接受的赋形剂和/或载体。
22.在另一优选例中，所述组合物的剂型选自下组：固体制剂、液体制剂或半固体制剂。
23.在另一优选例中，所述组合物的剂型选自下组：凝胶剂、贴剂、片剂、胶囊剂、散剂、膏剂、粉剂、针剂、口服液、肠溶缓释制剂或注射剂。
24.在另一优选例中，所述药学上可接受的载体包括支架材料，如骨科植入物，如接骨板、接骨螺钉、髓内钉、脊柱内固定植入物、人工关节等。所述药物可以通过涂覆等方法修饰在所述支架表面。
25.在另一优选例中，所述提取物提取来自红花鹿蹄草(pyrola incarnata)(如红花鹿蹄草全草提取物)或巴戟天(morinda officinalis)(如巴戟天干燥根提取物)。
26.在另一优选例中，所述的提取物中，水晶兰苷含量c1≥1wt％，其中所述含量c1按提取物干重计。
27.在另一优选例中，所述提取物中，水晶兰苷的含量c1≥2wt％，较佳地≥5wt％，如≥10wt％、≥20wt％、30wt％、40wt％、50wt％、60wt％、70wt％、80wt％、850wt％、90wt％或≥95％，按提取物的干重计。
28.本发明第二方面，提供了一种用于促进骨折愈合药物组合物，其特征在于，所述组合物包括：
29.(a)活性成分：水晶兰苷、或其生理学上可接受盐、或包含其的提取物；
30.(b)药学上可接受的载体。
31.在另一优选例中，所述组合物的剂型选自下组：固体制剂、液体制剂或半固体制剂。
32.在另一优选例中，所述组合物的剂型选自下组：凝胶剂、贴剂、片剂、胶囊剂、散剂、膏剂、粉剂、针剂、口服液、肠溶缓释制剂或注射剂。
33.在另一优选例中，所述药学上可接受的载体包括支架材料，如骨科植入物，如接骨板、接骨螺钉、髓内钉、脊柱内固定植入物、人工关节等。所述药物可以通过涂覆等方法修饰在所述支架表面。
34.在另一优选例中，所述提取物提取来自红花鹿蹄草(pyrola incarnata)(如红花鹿蹄草全草提取物)或巴戟天(morinda officinalis)(如巴戟天干燥根提取物)。
35.在另一优选例中，所述的提取物中，水晶兰苷含量c1≥1wt％，其中所述含量c1按提取物干重计。
36.在另一优选例中，所述提取物中，水晶兰苷的含量c1≥2wt％，较佳地≥5wt％，如≥10wt％、≥20wt％、30wt％、40wt％、50wt％、60wt％、70wt％、80wt％、850wt％、90wt％或≥95％，按提取物的干重计。
37.本发明第三方面，提供了一种用于促进骨折愈合保健品组合物，其特征在于，所述组合物包括：
38.(a)活性成分：水晶兰苷、或其生理学上可接受盐、或包含其的提取物；
39.(b)保健品学上可接受的载体。
40.本发明第四方面，提供了一种促进骨折愈合的方法，包括步骤：给予骨折的对象水晶兰苷、或其生理学上可接受盐、或包含其的提取物，或包含其的组合物，从而促进所述对象的骨折愈合。
41.在另一优选例中，所述对象为哺乳动物，如人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、牛、绵羊、猴等。
42.在另一优选例中，水晶兰苷的施用浓度为1μm-100μm。
43.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
44.图1是不同浓度的水晶兰苷(1μm-100μm)干预原代骨髓间充质干细胞(bmscs)，检测水晶兰苷是否有细胞毒性。证明100μm以下浓度的水晶兰苷对原代bmscs无明显毒性作用。
45.图2是不同浓度的水晶兰苷(1μm-100μm)干预原代bmscs，(a)alp染色显示细胞成骨分化能力，(b)茜素红染色显示细胞矿化能力。表明水晶兰苷具有剂量依赖性促进bmscs成骨分化和矿化的能力。
46.图3是小鼠经水凝胶局部缓释水晶兰苷分别治疗2周和4周后肝肾组织he染色。表明骨折局部缓释水晶兰苷对全身无显著肝肾毒性作用。
47.图4是小鼠经水凝胶局部缓释水晶兰苷治疗4周后骨折部位x线平片。模型组小鼠骨折部位附近仍可见较大骨痂，仍未完成重塑，而假手术组和水晶兰苷组骨折部位骨痂较小，重塑接近完成。
48.图5是小鼠经水凝胶局部缓释水晶兰苷分别治疗2周和4周后左侧胫骨骨痂组织的micro-ct三维重建图(a)和骨小梁微结构数据(b)。相较于模型组，水凝胶局部缓释水晶兰苷可以提高骨痂组织的骨密度(bmd)和骨体积分数(bv/tv)，还能提高2周时骨痂组织的骨小梁数量(tb.n)。
49.图6是小鼠经水凝胶局部缓释水晶兰苷分别治疗2周和4周后左侧胫骨骨痂组织he染色图。骨折术后14天时，假手术组和水晶兰苷组骨痂组织较大，模型组小鼠骨痂组织不连
续，断端仍明显，骨折术28天，假手术组和水晶兰苷组骨痂极小，骨皮质连续，模型组小鼠骨痂巨大且骨皮质不连续。水凝胶局部缓释水晶兰苷能改善小鼠骨痂组织病理学状态，促进骨折愈合。
50.图7是小鼠经水凝胶局部缓释水晶兰苷治疗4周后左侧胫骨生物力学性能检测。水晶兰苷组小鼠胫骨的最大应力(a)和滞回曲线的面积(b、c)显著高于模型组，提示水凝胶局部缓释水晶兰苷能提高小鼠愈合的胫骨的最大负载能力和抗骨折性能。
51.图8小鼠经水凝胶局部缓释水晶兰苷治疗2周时骨痂组织中成骨相关蛋白runx2(a)和osterix(b)的表达。模型组骨痂组织中的阳性表达明显少于假手术组，水凝胶局部缓释水晶兰苷治疗后，成骨相关蛋白阳性表达占比升高。
具体实施方式
52.本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，提供了水晶兰苷在促进骨折愈合中的用途。本发明人意外的发现，水晶兰苷能够加速骨折愈合，而且能够提高愈合骨的质量，且安全性高，非常适合制备用于促进骨折愈合的药物组合物或保健品组合物。在此基础上完成了本发明。
53.术语
54.除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
55.如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
56.如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由
…
构成”、或“由
…
构成”。
57.如本文所用，术语“室温”或“常温”是指温度为4-40℃，较佳地，25
±
5℃。
58.如本文所用，术语“多个”或“多种”指2个/种或以上，如2、3、4、5或6个/种。
59.活性成分
60.本发明的活性成分为水晶兰苷、或其生理学上可接受盐。
[0061][0062]
水晶兰苷
[0063]
本发明中，活性成分可以为包含水晶兰苷的植物提取物形式。所述提取物可以来自：红花鹿蹄草(pyrola incarnata)(如红花鹿蹄草全草提取物)或巴戟天(morinda officinalis)(如巴戟天干燥根提取物)。
[0064]
优选地，所述提取物中，水晶兰苷的含量c1≥1wt％、≥2wt％，较佳地≥5wt％，如≥10wt％、≥20wt％、30wt％、40wt％、50wt％、60wt％、70wt％、80wt％、850wt％、90wt％或≥95％，按提取物的干重计。
[0065]
本发明中，水晶兰苷的消旋体、非对映体、几何异构体、区域异构体和单独的异构体(例如，分离的对映体)均应包括在本发明范围内。当本文提供的化合物具有确定的立体化学(表示为r或s，或具有虚线或楔形键指明)时，被本领域技术人员将理解那些化合物为基本上不含其他异构体(例如至少80％，90％，95％，98％，99％和至多100％不含其他异构体)。
[0066]
本发明中，水晶兰苷可以被一个或多个氘(d)取代。
[0067]
本发明的化合物可能含有的酸性片段，包括但不限于羧基、羟基、酚羟基，可能会和各种有机或无机碱形成生理学上可接受的盐。典型的碱形成的盐包括铵盐、碱金属盐如钠、锂、钾盐，碱土金属盐如钙、镁盐和有机碱形成的盐(如有机胺)，如苄星、二环已基胺、海巴胺(与n,n-二(去氢枞基)乙二胺形成的盐)、n-甲基-d-葡糖胺、n-甲基-d-葡糖酰胺、叔丁基胺，以及和氨基酸如精氨酸、赖氨酸等等形成的盐。
[0068]
如本文所用，术语“药学上、保健品上可接受的”成分是指适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。
[0069]
如本文所用，术语“有效量”，是指对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。本领域的普通技术人员应该理解，所述的“有效量”可随着药物组合物、保健品组合物或食品组合物的形式、所用的辅料、疾病的严重程度以及与其他药物、保健物或食物联合等情况的不同而有所不同。
[0070]
本发明所述的“促进”、“加速”、“提高”包括加速骨折愈合的速度、缩短愈合时间或提高愈合骨质量，并不必需要100％愈合。在一些实施方案中，与不存在本发明所述组合物时相比，本发明所述组合物将骨折愈合速度加快了例如至少约10％、至少约30％、至少约50％、或至少约80％。
[0071]
骨折
[0072]
骨折是指骨的完整性破坏或连续性中断。当骨骼承受的力量超过自身能承受的最大强度时，就会发生骨折。
[0073]
本发明中，对骨折的种类没有特别要求，各个部位或各种类型的骨折。例如，机械性骨折、疲劳性骨折、病理性骨折等。所述病理性骨折包括：骨质疏松性骨折、骨髓炎性骨折。所述骨折可以为完全骨折或不完全骨折(如裂纹骨折)。
[0074]
特别地，所述骨折为骨质疏松性骨折(opf)。骨质疏松症(osteoporosis)是由于多种原因导致的骨密度和骨质量下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，从而容易发生骨折的全身性骨病。因此，骨质疏松性骨折的治疗更为困难，且对患者危害更大。
[0075]
组合物、用途
[0076]
本发明的组合物包含水晶兰苷、或其生理学上可接受的盐作为活性成分。发明的活性成分可以为包含水晶兰苷的植物提取物形式。
[0077]
本发明的活性成分不仅能够缩短骨折愈合时间，还能提高愈合骨的质量，非常适合用于制备促进骨愈合的药物或保健品组合物。特别地，实验证明本发明的活性成分对于骨质疏松性骨折也具有优异的促进治疗作用。
[0078]
特别地，本发明的活性成分为红花鹿蹄草(pyrola incarnata)或巴戟天(morinda officinalis)的包含水晶兰苷的提取物。所述提取物特别适合用于制备促进骨折愈合、提高骨质量的保健品或保健食品组合物。
[0079]
本发明的组合物包含安全有效量范围内的本发明水晶兰苷或其生理学上可接受的盐，以及药学上或保健品学上可接受的赋形剂或载体。
[0080]
通常，本发明的组合物含有1-2000mg本发明活性成分/剂，更佳地，含有10-500mg本发明活性成分/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。
[0081]“药学上或保健品学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。药学上或保健品学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
[0082]
本发明活性成分或组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药(骨折部位)。
[0083]
用于口服施用的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性活性成分与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
[0084]
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性活性成分的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性活性成分也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
[0085]
用于口服施用的液体剂型包括药学上或保健品学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性活性成分外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
[0086]
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味
剂、矫味剂和香料。
[0087]
除了活性活性成分外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
[0088]
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
[0089]
用于局部施用的本发明活性成分的剂型包括凝胶剂(如可注射水凝胶)、贴剂、软膏剂、散剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
[0090]
本发明活性成分可以单独施用，或者与其他治疗剂联合给药。在另一优选例中，所述组合物还包含一种或多种其他的治疗剂。优选地，所述治疗剂选自下组：非甾体抗炎止痛药物(如罗非昔布、阿司匹林、萘普生、布洛芬、消炎痛，吲哚美辛等)、抗感染剂、补钙剂、维生素d、甲状旁腺激素、双膦酸盐类(如羟乙膦酸盐、氯膦酸盐、帕米膦酸盐、替鲁膦酸盐、阿仑膦酸盐、利塞膦酸盐、ibandronate、zoledronic acid等)，或其组合。
[0091]
在某些实施方式中，本发明的活性成分在相同或分开的制剂中与作为联合治疗方案的部分的其它试剂同时使用，或与所述其它试剂依次使用。
[0092]
本发明的活性成分或组合物还可以与外科手术(如正骨、接骨手术)、介入/植入材料一起使用(如接骨板、接骨螺钉、髓内钉、脊柱内固定植入物、人工关节等)。
[0093]
本发明的活性成分的组合物的治疗有效剂量的一般范围将是：约1-2000mg/天、约10-约1000mg/天、约10-约500mg/天、约10-约250mg/天、约10-约100mg/天，或约10-约50mg/天。治疗有效剂量将以一个或多个剂量给予。然而，应理解，对于任何特定患者的本发明化合物的特定剂量将取决于多种因素，例如，待治疗的患者的年龄、性别、体重、一般健康状况、饮食、个体响应，给予时间、待治疗的疾病的严重性、施用的具体化合物的活性、剂型、应用模式和伴用药物。给定情况的治疗有效量能用常规实验测定，并在临床医生或医师能力和判断范围内。在任何情况中，所述活性成分或组合物将基于施用对象的个体情况以多个剂量给予并以允许递送治疗有效量的方式给予。
[0094]
本发明的活性成分或组合物的施用对象的实例包括哺乳动物(例如，人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、牛、绵羊、猴等)。
[0095]
本发明的主要优点包括：
[0096]
本发明提供了一种能够促进骨折(尤其是骨质疏松性骨折)愈合的药物组合物或保健品组合物，从而缩短疗程，减少并发症。
[0097]
本发明的药物组合物或保健品组合物能够提高骨痂组织的骨密度，有效促进骨折愈合，改善愈合骨组织生物力学性能。
[0098]
本发明的活性成分水晶兰苷安全性高，功效好，非常适合长期安全服用。
[0099]
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0100]
本发明以下实施例中，双侧卵巢切除术(ovariectomy，ovx)为本领域国际通用的op动物模型，胫骨中段骨折模型为常用骨折模型，ovx复合胫骨中段骨折模型为常用opf动
物模型。未特别标示的实验方法，即micro-ct扫描、生物力学性能评估、he染色、alp染色、茜素红染色为本领域通用的实验方法。
[0101]
实施例
[0102]
一、体外研究
[0103]
1、bmscs的分离培养
[0104]
采用3周龄c57bl/6雄鼠，颈椎脱臼法处死后用75％乙醇溶液浸泡2min。超净台下取下股骨和胫骨，去除肌肉等多余组织，用1ml注射器吸取α-mem完全培养基将骨髓腔内的骨髓细胞冲出，收集冲洗液，即得新鲜骨髓细胞。细胞培养于含10％胎牛血清及1％(v/v)青霉素-链霉素的α-mem完全培养基中，在37℃、5％co2及饱和湿度条件下培养24h。弃去原培养基，底部贴壁细胞加入新鲜α-mem完全培养基继续培养7天，每2天更换一次培养基。
[0105]
2、细胞传代及铺板
[0106]
bmscs置于显微镜下观察，待细胞密度达到80％时可进行传代或铺板。弃去原有培养基，10cm细胞培养皿中加入2ml pbs溶液轻柔洗涤细胞2次，加入1.5ml胰蛋白酶消化液，轻微摇晃培养皿，使消化液浸满皿底，放入培养箱中消化1min后，显微镜下观察，细胞漂浮游动，将悬液吸入离心管中，1400rpm离心3min，弃上清，留细胞沉淀。传代：细胞沉淀中加入20ml新鲜完全培养基重悬混匀，平均分配至两个新10cm培养皿中，放入培养箱中培养。铺板：细胞沉淀中加入4ml新鲜完全培养基重悬混匀，吸取20μl打入细胞计数板中，上机检测细胞密度。根据细胞密度和实验需要，选择不同的细胞密度和培养板。
[0107]
3、细胞增殖测定
[0108]
bmscs按照每孔5
×
103个的密度接种到96孔培养板中。24h后，细胞用含不同浓度水晶兰苷(0μm，1μm，10μm，50μm，100μm)的完全培养基继续培养24h或96h后，弃去原有培养基，每孔加入100μl新鲜α-mem完全培养基和10μl cck-8溶液，培养箱中继续培养1h后，在450nm波长处测定od值。
[0109]
4、细胞alp染色及茜素红染色
[0110]
bmscs按照每孔104个的密度接种到48孔培养板，细胞用200μl含成骨诱导液(10-2
mβ-甘油磷酸钠、10-8
m地塞米松、50μg/ml维生素c)和不同浓度的水晶兰苷(0μm，1μm，10μm，50μm，100μm)的完全培养基继续培养，每2天更换一次培养液。干预7天(alp染色)或21天(茜素红染色)后，弃去原有培养基，pbs溶液清洗1遍。每孔加入10％中性缓冲福尔马林固定液200μl，固定15分钟。固定完成后，弃去组织固定液，pbs溶液清洗3遍。避光条件下，每孔加入100μl alp染液或茜素红染液，37℃恒温箱中避光反应30min后，取出拍照。
[0111]
二、体内研究
[0112]
1、小鼠骨质疏松性骨折模型的建立：
[0113]
取2月龄spf级成年雌性c57bl/6j小鼠，采用双侧卵巢切除术(ovariectomy，ovx)进行造模。小鼠麻醉后，待角膜反射消失、肌力下降后，取俯卧位，备皮消毒。随后将小鼠俯卧位置于操作台上。在小鼠肋弓下至髂后上嵴处备皮，左侧肋脊点与髂后上嵴连线的中点处，沿平行脊柱方向，作一长约0.5cm的纵行切口，切开皮肤与肌肉，寻找卵巢与输卵管(卵巢外观呈菜花状，切口内可见一小团白色脂肪，脂肪附近菜花状组织即为卵巢)。使用细线结扎卵巢周围输卵管后切除卵巢。回纳输卵管及其周围组织后依次缝合肌层及皮肤。右侧手术方法相同。假手术组仅切除卵巢周围部分脂肪组织，保留卵巢。待小鼠苏醒后，放回笼
内饲养，每日观察其饮食饮水及活动情况。术后各组小鼠每2周检测体重。ovx术后8周各组小鼠建立左侧胫骨中段骨折模型；小鼠麻醉后，待角膜反射消失、肌力下降后，左后肢备皮，于外侧前缘作一1cm纵行切口。将1ml注射器针头从胫骨平台前外侧沿胫骨长轴刺入胫骨约1.5cm后剪断针头，锯断胫骨中段，进行髓内固定，注射凝胶，待凝胶基本凝固后缝合皮肤。
[0114]
2水凝胶骨折局部缓释水晶兰苷干预骨质疏松性骨折小鼠：
[0115]
小鼠随机分为：假手术组、模型组、水晶兰苷组。水晶兰苷组将壳聚糖溶液与葡聚糖溶液混合形成水凝胶溶液，迅速用1ml一次性注射器抽取等体积的水凝胶溶液与浓度为100μm的水晶兰苷dmso溶液，来回抽动注射器混匀30秒后，连接插入胫骨的针头，推动针头进至胫骨远端，缓慢后退针头的同时注射水凝胶，完成注射后，再次将针头插入固定，每只小鼠约注射30μl，模型组小鼠按同样方法注射凝胶包裹dmso溶液30μl(等体积水凝胶溶液与dmso溶液混合)，待凝胶凝固后缝合皮肤。剪去针头塑料部分，随后将金属针头完全插入胫骨内进行髓内固定，缝合皮肤。假手术组不进行注射，直接剪去针头塑料部分，将金属针头完全插入胫骨内进行髓内固定。
[0116]
3实验结果：
[0117]
3.1水晶兰苷的细胞毒性测定
[0118]
bmscs在不同浓度梯度水晶兰苷dmso溶液(1μm、10μm、50μm、100μm)干预下的细胞活性，发现不同浓度水晶兰苷dmso溶液干预72小时后的bmscs活性与空白对照组相比无明显差异(图1)，证明100μm以下浓度的水晶兰苷对原代bmscs无明显毒性作用，亦无明显促进细胞增殖的作用。
[0119]
3.2水晶兰苷对bmscs成骨分化和矿化的作用
[0120]
alp是检测bmscs成骨分化能力重要标志之一。不同浓度水晶兰苷干预7天后，alp着色深度显著高于control组和dmso组，并呈剂量依赖性，100μm水晶兰苷作用最为显著(图2a)。表明水晶兰苷具有促进bmscs成骨分化的能力。矿化是成骨细胞的重要功能之一，通过茜素红染色，可以检测bmscs矿化结节的形成情况。茜素红染色结果表明，与control组和dmso组相比，不同浓度水晶兰苷干预21天后，bmscs的矿化结节形成明显增多，并呈剂量依赖性，100μm水晶兰苷作用最为显著(图2b)。
[0121]
3.3水凝胶局部缓释水晶兰苷对骨质疏松性骨折小鼠肝肾组织的影响
[0122]
如图3所示，相较于假手术组，模型组与水晶兰苷组小鼠的肝脏、肾脏形态未见明显病理改变，表明骨折局部水晶兰苷干预对全身无显著肝肾毒性作用。
[0123]
3.4水凝胶局部缓释水晶兰苷对骨质疏松性骨折小鼠骨折愈合的作用
[0124]
临床判断骨折愈合情况的标准，包括骨折线模糊与连续性骨痂通过骨折线，骨折线清晰，骨痂不连续提示愈合缓慢。
[0125]
骨折术后28天，通过x线片观察比较各组小鼠骨痂大体形态。骨折术后28天时，模型组小鼠骨折部位附近仍可见较大骨痂，而假手术组和水晶兰苷组骨折部位骨痂较小(图4)。
[0126]
分别在骨折术后14天和28天，通过micro-ct分析观察小鼠左侧胫骨骨折愈合情况(图5a)。骨折术后14天，假手术组左侧胫骨骨折线消失，骨痂组织较大，模型组小鼠骨痂组织不连续，断端仍明显，水晶兰苷组小鼠骨痂组织明显，骨折线模糊。骨折术后28天，假手术组小鼠骨折线消失，骨痂极小，模型组小鼠骨痂巨大且不连续，水晶兰苷组小鼠骨痂组织较
小，骨折线消失。胫骨骨量参数和骨小梁结构参数表明(图5b)，骨折术后14天和28天时，与假手术组相比，模型组小鼠胫骨的bmd、bv/tv、tb.n、tb.th均明显下降(p《0.01)，tb.sp明显上升(p《0.01)，而水晶兰苷组相较于模型组，其bmd(14天p《0.01，28天p《0.05)、bv/tv(p《0.01)明显升高，tb.n(14天p《0.01)在骨折术后14天时明显升高。
[0127]
小鼠左侧胫骨骨痂he染色如图6所示，骨折术后14天时，假手术组左侧胫骨骨痂组织较大且连续，模型组小鼠骨痂组织不连续，断端仍明显，水晶兰苷组小鼠骨痂组织明显。骨折术28天，假手术组小鼠骨痂极小，骨皮质连续，模型组小鼠骨痂巨大且骨皮质不连续，水晶兰苷组小鼠骨痂组织较小。
[0128]
上述研究表明，提示水凝胶局部缓释水晶兰苷能提高骨质疏松性骨折小鼠骨痂组织的骨形成，改善组织病理学状态，促进骨折愈合。
[0129]
3.5水凝胶局部缓释水晶兰苷对骨质疏松性骨折小鼠愈合骨组织生物力学性能的影响
[0130]
由三点弯曲实验所得的胫骨最大应力是衡量胫骨最大负载能力的重要参数之一，动态弹性测试得出的滞回曲线所围成的椭圆面积可表征胫骨的耗散能，反应了胫骨对负载的吸收能力，面积越大，胫骨的抗骨折性能越强。如图7所示，与假手术组比较，模型组小鼠胫骨的最大应力(p《0.05)和滞回曲线的面积(p《0.01)在骨折术后28天时显著低于假手术组；水晶兰苷组小鼠胫骨的最大应力和滞回曲线的面积显著高于模型组(p《0.01)。提示卵巢切除后，小鼠胫骨的最大负载能力抗骨折性能降低，而水凝胶局部缓释水晶兰苷能提高卵巢切除小鼠胫骨的最大负载能力和抗骨折性能。
[0131]
3.6水凝胶局部缓释水晶兰苷对骨质疏松性骨折小鼠骨痂组织中成骨相关蛋白表达的影响
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小鼠左侧胫骨骨痂组织中成骨相关蛋白runx2和osterix的免疫组织化学染色如图8所示，骨折术后14天，模型组骨痂组织中的runx2和osterix的阳性表达占比均明显少于假手术组(p《0.01)，而水晶兰苷干预后，成骨相关蛋白runx2和osterix的阳性表达占比显著升高(p《0.01)。
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综上所述，水晶兰苷不仅能够缩短骨折愈合时间，还能提高愈合骨的质量，减少并发症，非常适合用于制备促进骨愈合的药物或保健品组合物。进一步地，实验证明水晶兰苷对于病理性骨折，如骨质疏松性骨折，也具有优异的促进治疗效果，具有良好的应用前景。
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